HU221730B1 - Eljárás nagy aktivitású peptideket tartalmazó peptidkeverékek előállítására - Google Patents

Abstract

A találmány tárgya eljárás peptidkeverékek előállítására szilárdfázisú módszerrel, melynek során olyan keveréket nyernek, melyben azegyes peptidek egyenértéknyi mennyiségben vannak jelen, ahol azeljárás során legalább egy szintézisciklusban a keveréket azonosmennyiségekre választják szét, azzal jellemezve, hogy A) egy elsőszintézisszakaszban n számú szintézislépéssel az n számú, ismertaminosavból vagy aminosavcsoportból felépülő peptidek keverékétállítják elő, melynek első lépésében az aminosavakat vagyaminosavcsoportokat külön-- külön szilárd hordozógyanta aliquotmennyiségeihez kapcsolják, és valamennyi további lépés során agyantához kötött aminosavak vagy aminosavcsoportok aliquotjaitalaposan összekeverik; a kapott elegyet azonos mennyiségű aliquotrészekre osztják szét; valamennyi aliquothoz egymástól függetlenülismert aminosavakat vagy aminosavcsoportokat kapcsolnak; kívántesetben a peptideket minden egyes keverékben lehasítják a gyantákról,így olyan peptidkeveréket kapnak, melynek minden tagja az utolsókapcsolási helyen ismert aminosavat tartalmaz; majd az elsőszintézislépés befejezésénél minden egyes peptidkeverék biológiaiaktivitását meghatározzák; B) egy második peptidszintézist hajtanakvégre az első szintézisnél alkalmazottakkal azonos aminosavak vagyami- nosavcsoportok felhasználásával az első szintézis n lépésétalkalmazva, ahol az n–1. lépésig az első szintézist megismételik, majdaz n-edik lépésben minden egyes peptidkeverékhez azt az ismertaminosavat vagy aminosavcso- portot kapcsolják teljesen végrehajtottkapcsolási reakció segítségével, amely azon peptidkeverék terminálisántalálható, amely az első biológiai vizsgálatban biológiai aktivitástmutatott; kívánt esetben minden egyes keverékben a peptideket agyantáról lehasítják; majd a második szintézislépés befejezésekéntminden egyes peptidkeverék biológiai aktivitását meghatározzák, és C)a szintézisciklus lépéseit összesen n alkalommal végrehajtva teljesenismert szekvenciájú peptidet állítanak elő. ŕ

Description

A találmány tárgya eljárás nagy aktivitású peptideket tartalmazó peptidkeverékek előállítására.

A találmány tárgya gyors, szintetikus eljárás nagyszámú, kis tömegű peptid előállítására, amelyek a nagyobb természetes ligandumok, enzimek és sejtreceptorok iránti nagyfokú kötőaffinitását modellezik. Az ilyen jellemzőkkel rendelkező molekulákat „mimetikumoknak” nevezik, amelyek számos potenciális felhasználással rendelkeznek. Például a mimetikumok igen előnyös terápiás hatóanyagok lehetnek, mivel ezek könnyen szintetizálható molekulák. A találmány szerinti eljárás egy új stratégiát jelent a természetes ligandumok tervezett megváltoztatására, amely eljárás egyébként lassú és nehézkes, továbbá a kis valószínűségű, esetleges vegyületvizsgálattal szemben új eljárást jelent, amely előbbi olyan vegyületekre vonatkozott, amelyek semmilyen ismert szerkezeti hasonlóságot nem mutattak a természetes ligandumokkal. A találmány szerinti eljárás lehetővé teszi peptidek gyors és párhuzamos előállítását nagyobb számban, mint amit korábban a szokásos szilárd fázisú szintetikus eljárásokkal elértek, továbbá olyan specifikus szekvenciák meghatározását és szintetizálását teszi lehetővé tiszta formában, amely szekvenciák a kívánt aktivitásért felelősek.

A találmány szerinti eljárás a szakirodalomban közölt eljárásokkal összehasonlítva számos fontos előnnyel rendelkezik. Számos szakirodalomban leírt összehasonlítható szilárd fázisú eljárást alkalmazó szintézis csak gyakorlatilag néhány száz pepiidre limitált lehetőséget hordoz egy adott időben, a jelen találmány szerinti eljárás pedig gyakorlatilag nem limitált számú peptid szintézisét teszi lehetővé.

Más módszerek szerint igen nagyszámú, kisméretű peptid előállítását végzik rövid időn belül szilárd fázisú technológia alkalmazásával és ezt aminosavkeverékek kapcsolásával érik el, amelyekből ezután növekvő peptidlánc alakul ki. Ez az eljárás megköveteli, hogy az aminosavak koncentrációját a keverékekben szabályozzák aszerint, hogy az egyes aminosavak eltérő kapcsolási sebessége mennyiben különbözik abból a célból, hogy a kapott peptidek koncentrációja azonos legyen. Ezen túlmenően ez az eljárás szükségessé teszi többféle analitikai mérés alkalmazását abból a célból, hogy a kívánt aktivitást hordozó pontos szekvenciát meghatározzák. A találmány szerinti eljárás abban különbözik a fentitől, hogy itt minden egyes kapcsolási lépésben egyetlen aminosav vagy aminosavcsoport kapcsolódik és ez kiküszöböli azt, hogy figyelembe kelljen venni az aminosavak eltérő kapcsolódási sebességét, továbbá biztosítja, hogy a peptidek keletkezése ekvimoláris mennyiségben történik. A találmány szerinti eljárás továbbá biztosítja, hogy a kívánt szekvenciát kémiai analízis nélkül meghatározzuk és tiszta formában előállítsuk.

Ugyancsak ismert, hogy esetlegesen szintetizált oligonukleotidokat szálas bakteriofágokba inzertálnak. Ez a bioszintetikus eljárás potenciálisan lehetővé teszi több millió kisméretű peptid előállítását, azonban ez limitált a genetikusán kódolt aminosavakra, és csak lineáris konfigurációt képes előállítani. A jelen találmány szerinti eljárás lehetővé teszi D-aminosavak beépítését, illetve másképpen módosított aminosavak beépítését, valamint elágazó láncú szekvenciák szintézisét, amely nem lehetséges a rekombináns DNS-eljárások segítségével.

Furka és munkatársai, 14* International Congress of Biochemistry, Prága, 1988. július 10-15, Abstracts Vol. V., Xth International Symposium on Medicinái Chemnistiy Budapest, 1988 augusztus 15-19, Abstractes, 288. oldal, és Int. J. Peptide Protein Rés. 37:1991, 487-493 peptidkeverékek előállítását ismertetik, és ezt a módszert ajánlják különálló peptidek előállítása helyett. Ezen eljárások szerint a szilárd gyantához kapcsolt görgőket részekre osztják; minden részt más aminosavval kapcsolnak; az aliquotokat egyesítik; és a kapott peptidkeveréket adott esetben további, fenti ciklusnak vetik alá. Ezek a dolgozatok azonban nem adnak kitanítást a találmány szerinti eljárás léptékeit akár csak nagyságrendben megközelítő mennyiségű peptid előállítására, és nem is ajánlanak olyan módszert, amely alkalmas volna egy ilyen nagyszámú, komplex peptidkeverék hatékony komponenseinek azonosítására. Ténylegesen a leírt eljárások lényege, hogy szilárd fázisú szintézist végeznek, a kapott, szilárd fázishoz kötött terméket egyenlő részekre osztják és más-más ami-; nosawal reagáltatják. Ezzel a módszerrel ténylegesen * 27 tetrapeptid és 180 pentapeptid előállítását írták le.

A technikának ugyanakkor korlátot szabott az azonosí-» tási módszer hiánya.

A szakirodalomban leírt eljárásokkal ellentétben az < jelen találmány szerinti eljárás lehetővé tesziazt^hogy értékeljük, hogy a peptidek milyen mértékbeiEképesek kölcsönhatásba lépni a célkötőhellyel anélküOhogy a hordozógyanta potenciális kölcsönhatásávaDszámol- « nunk kellene. Összefoglalva: a találmány szerinti eljárás lehetővé teszi igen nagy számú, kisméretűt peptid előállítását, továbbá lehetővé teszi, hogy könnyen meg-, határozzuk azt a specifikus peptidet vagy azokat a peptideket, amelyek a kívánt aktivitást mutatják, továbbá lehetővé teszi ezek tiszta formában történő előállítását. í

A találmány tárgya eljárás igen nagy számú kis peptid gyors, aktivitás-ellenőrzött előállítására. A találmány szerinti eljárás megjavítja annak lehetőségét, hogy olyan molekulát állítsunk elő, amely a természetes ligandumok enzimekkel és receptorokkal szembeni magas kötődési affinitásával és specifításával rendelkezik. Az eljárás természetéből következően, a keverék minden egyes helyzetében választott aminosavkoncentráció és ennélfogva az egyes peptidek koncentrációja közel megfelel az előírt arányoknak. Az eljárás lehetővé teszi peptidkeverékek előállítását, amelyek a hordozó gyanta nélkül tesztvizsgálatnak vethetők alá anélkül, hogy elvesztenénk azt a lehetőséget, hogy könnyen meghatározzuk a kívánt aktivitásért felelős adott peptidet vagy peptideket. Az eljárással olyan peptidkeverékeket állíthatunk elő, amelyek közös aminosavat tartalmaznak a legutolsó kapcsolt helyzetben, és esetlegesen más, pontosan megválasztott helyzetekben, de az összes többi aminosavmaradék tetszőlegesen választott. A találmány szerinti eljárással előállított peptidszekvencia a célnak megfelelően lehet lineáris vagy elágazó láncszerkezetű.

HU 221 730 Bl

A találmány tárgya eljárás peptidkeverékek előállítására szilárd fázisú módszerrel, melynek során olyan keveréket nyerünk, melyben az egyes peptidek egyenértéknyi mennyiségben vannak jelen, ahol az eljárás során legalább egy szintézisciklusban a keveréket azonos mennyiségekre választjuk szét.

Az eljárás szerint

A) egy első szintézisszakaszban n számú szintézislépéssel az n számú, ismert aminosavból vagy aminosavcsoportból felépülő peptidek keverékét állítjuk elő, melynek első lépésében az aminosavat vagy aminosavakat külön-külön szilárd hordozógyanta aliquot mennyiségeihez kapcsoljuk, és valamennyi lépés során a gyantához kötött aminosavak vagy aminosavcsoportok aliquotjait alaposan összekeverjük;

a kapott elegyet azonos mennyiségű aliquot részekre osztjuk szét;

valamennyi aliquothoz egymástól függetlenül ismert aminosavakat vagy aminosavcsoportokat kapcsolunk;

kívánt esetben a peptideket minden egyes keverékben lehasitjuk a gyártókról olyan peptidkeverék előállítására, melynek minden tagja az utolsó kapcsolási helyen ismert aminosavat tartalmaz, és az első szintézislépés befejezésénél minden egyes peptidkeverék biológiai aktivitását meghatározzuk;

B) egy második peptidszintézist hajtunk végre az első szintézisnél alkalmazottakkal azonos aminosavak vagy aminosavcsoportok felhasználásával az első szintézis n lépését alkalmazva, ahol az n-1. lépésig az első szintézist megismételjük, majd az n-edik lépésben minden egyes peptidkeverékhez azt az ismert aminosavat vagy aminosavcsoportot kapcsoljuk teljesen végrehajtott kapcsolási reakció segítségével, amely azon peptidkeverék terminálisán található, amely az első biológiai vizsgálatban biológiai aktivitást mutatott;

kívánt esetben minden egyes keverékben a peptideket a gyantáról lehasítjuk; majd a második szintézislépés befejezéseként minden egyes peptidkeverék biológiai aktivitását meghatározzuk, és

C) a szintézisciklus lépéseit összesen n alkalommal végrehajtva teljesen ismert szekvenciájú peptidet állítunk elő.

Megemlítendő, hogy a találmány szerinti gyors szintetikus eljárás lehetővé teszi elágazó oldalláncú peptidek előállítását.

Az ilyen elágazó láncú molekulák, amelyeket keverékek formájában állítunk elő, ugyancsak vizsgálhatók aktivitás szempontjából és az aktivitással rendelkező adott molekula vagy molekulák szekvenciája lényegében ugyanolyan módon állapítható meg, mint a lineáris peptidek esetében.

A találmány szerinti eljárás leírásában és a szabadalmi igénypontokban az alábbi elnevezéseket és rövidítéseket alkalmazzuk.

Elnevezések Rövidítések

Ac acetilcsoport

Bzl benzilcsoport

O-Bzl benzil-észter-csoport

Bőm benzil-oxi-metil-csoport

Tos tozilcsoport (4-toluolszulfonilcsoport)

2C1-Z 2-klór-benzil-oxi-karbonil-csoport

2,6C1-Z 2,6-diklór-benzil-oxi-karbonil-csoport

2Br-Z 2-bróm-benzil-oxi-karbonil-csoport

X aminosav, amelynek szerkezete nem ismert.

Az alábbiakban az L-konfígurációjú aminosavakat úgy jelöljük, hogy a standard hárombetűs kódjuk első betűjét nagybetűvel újuk, a D-konfigurációjú aminosavakat pedig úgy jelöljük, hogy valamennyi hárombetűs kódbetűjüket kisbetűvel újuk.

A találmány szerinti eljárást végrehajthatjuk úgy, hogy a peptidszintézisben szokásosan alkalmazott szilárd fázisú szintetikus eljárást alkalmazzuk. Általában az előállítandó peptid C-terminális aminosavjának megfelelő egységét egy oldhatatlan gyantához kötjük egy kovalens kötés segítségével, amelyet a Cterminális maradék karboxilcsoportja és a gyanta mátrixkötési helyen található speciális funkciós csoportja között képezünk. Ezután a peptidet képezzük úgy, hogy a gyantához kötött C-terminális aminosavhoz Nterminális maradékot (ill. maradékokat) kötünk az aminocsoporton mégpedig megfelelő sorrendben. Amennyiben elágazó szerkezetről van szó, akkorrtöbb mint egy N-terminális maradék is lehetséges. A peptid a teljes szintézis során a gyantához kötött marad, azonban a teljes peptidszekvencia összeállítása után lehasítható a gyantáról.

A találmány szerinti előnyös eljárás olyan, amely í

2-körülbelül 8 aminosavat vagy aminosavcsoportot tartalmazó peptidek előállítását szolgáltatja. ;

Az új, találmány szerinti eljárás azon alapul;Tiogy ismételten elegyítjük, szétosztjuk és kapcsoljuk a;gyan- : tához kötött aminosavakat vagy peptideket. Az első lé- > pésben a szilárd hotdozó gyantát aliquot részekre osztjuk, amelyek ekvivalens mennyiségű kapcsolási hellyel rendelkeznek. Ezek után az egyes választott aminosavakat az egyes aliquot részekhez kapcsoljuk úgy, hogy a kapcsolás teljes mértékben megtörténjen és úgy, hogy valamennyi aliquot gyantát eltérő aminosavhoz kapcsolunk. Ennek eredményeképpen az első lépés végén minden egyes aliquot részben található gyanta ugyanolyan moláris mennyiségű aminosavhoz kapcsolt, mint bármely másik aliquot rész, amely eltérő aminosavat tartalmaz kapcsolt formában. A gyantákat ezután alaposan elkeverjük és így gyantához kötött aminosavak ekvimoláris elegyét nyerjük. Ezután az elegyet egyenlő aliquot részekre osztjuk, majd további választott aminosavakat kapcsolunk a gyantához kötött aminosavakhoz az egyes aliquot részekben. Ez az ismételt keverés, szétosztás és kapcsolólépés-sorozat olyan peptidkeveréket eredményez, amelyben az utolsó kapcsolt aminosavmaradék valamennyi pepiidben egy adott keveréken belül megegyező, azonban amelyben valamennyi egyéb helyzetben található aminosavmaradék az egyes peptidekben, amelyek a keverékben találhatók, az ekvimoláris választott sorozata azon aminosavaknak, amelyeket az adott kapcsolási lépésben alkalmaztunk.

Más eljárás szerint egyetlen aminosav kapcsolható bármely adott kapcsolási lépésben abból a célból, hogy valamennyi előállított pepiidben ugyanaz az aminosav fe

HU 221 730 Bl legyen jelen egy adott helyzetben. Amennyiben így járunk el, a kapcsolási lépést közvetlenül megelőző szétosztást lépés, illetve az ezt közvetlenül követő keverési lépés elhagyható. így olyan peptidelegyeket kapunk, mint korábban, azonban ezekben az utolsó kapcsolt helyzetben található aminosavon kívül egy adott helyzetben található másik aminosav is pontosan ismert.

A találmány szerinti eljárással nagyszámú peptidet állíthatunk elő olyan mennyiségben, amely alkalmas biológiai tesztvizsgálatra úgy, hogy kisszámú kapcsolási lépést alkalmazunk. Az eljárás eredményeként minden lehetséges szekvenciát előállítunk, amelyet az adott választott aminosavakból képezni lehet. Például, amennyiben a peptidszintézis céljára 25 aminosavat választunk ki, 625 dipeptidet állíthatunk elő, összesen 50 kapcsolólépés után 25 reakció kétszeri ciklusban való megismétlésével, továbbá 15 625 tripeptidet állíthatunk elő 75 kapcsolólépés segítségével, amelyet három reakcióciklusban végzünk; és végül 390 625 tetrapeptidet állíthatunk elő mindössze 100 kapcsolási lépés után, amelyet négy reakcióciklusban végzünk. Amennyiben nagyobb számú kapcsolólépést alkalmazunk, hogy hoszszabb peptideket állítsunk elő, még ennél nagyobb számú peptidet állíthatunk elő egy keverékben.

A szintézisben alkalmazott aminosavak száma és típusa az egyes ciklusok során változtatható és ez a választás lehet véletlenszerű, anélkül, hogy bármilyen feltételezésünk lenne arról, hogy mely aminosav a legalkalmasabb, illetve bizonyos aminosawálasztás lehet célzott is, a kívánt hatást ismert módon befolyásoló jellemzők alapján.

Az eljárással végrehajtható egymást követő kapcsolások száma csak azon tényezők függvénye, amelyek a szakirodalomban ismertek, és amelyek a peptidek szilárd fázisú szintézisét limitálják. Azonban megjegyzendő, hogy amennyiben egy keveréken belül a peptidek számát megnöveljük, ez csökkenti a teljes peptidmennyiségre számítva az egyes peptidek koncentrációját, illetve mennyiségét Ennélfogva, amennyiben olyan peptidkeverékek szintézisét végezzük, amelyeket biológiai tesztvizsgálattal kívánunk vizsgálni abból a célból, hogy meghatározzuk az aktív peptid szekvenciáját a fent leírtaknak megfelelően, a tesztvizsgálat érzékenységét figyelembe kell venni, amikor meghatározzuk, hogy milyen számú kapcsolási lépést végezhetünk el. A tesztvizsgálat érzékenysége, azt mutatja, hogy a vizsgálat felismeri-e akárcsak egyetlen peptidmolekula aktivitásjelét az úgynevezett „zaj” fölött, amely utóbbit a nagy feleslegü, inaktív keverék alkotóelemek szolgáltatnak. Ez a küszöbérték limitáló faktor lehet abból a szempontból, hogy meghatározza azt, milyen számú peptid lehet jelen egy adott keverékben ahhoz, hogy ezt aktivitás szempontjából tesztvizsgálatnak vethessük alá. Az adott keverékben található peptidek oldhatósága ugyancsak ilyen limitáló tényező, amely gyakorlati szempontból meghatározza a szintetizálható peptidek számát, amennyiben az adott keverékben található peptidek aktivitását meghatározó tesztvizsgálatot kívánunk elvégezni.

Amennyiben azt az eljárást alkalmazzuk, hogy a peptid-előállítást biológiai tesztvizsgálattal kombináljuk, a keveréken belül található azon peptid vagy peptidek szekvenciája, amelyek aktivitással rendelkeznek könnyen meghatározható, majd ezek ezt követően tiszta formában könnyen előállithatók. A peptideket a biológiai aktivitással kapcsolatos tesztvizsgálat előtt a gyantáról lehasíthatjuk. A peptidek gyantáról történő lehasítása kiküszöböli a gyanta kölcsönhatásának befolyását, amikor a peptidek aktivitását mérjük, amely kölcsönhatás lehet például szférikus gátlás. A lehasítás után a peptideket keverékként visszük a biológiai tesztvizsgálatba. Egy adott keverékben található valamennyi peptid ismert aminosavmaradékot tartalmaz az utolsó kapcsolt helyzetben, ha egy tesztvizsgálatban valamely keverék aktívnak bizonyul, ebből meghatározható, hogy mely aminosav található az aktív peptid megfelelő helyzetében. A teljes peptidkeverék szintézisét és aktivitástesztvizsgálatát „szintetikus ciklusnak” nevezzük.

Abból a célból, hogy egy adott keverékben meghatározzuk a peptid vagy peptidek pontos szekvenciáját amelyek a megfigyelt aktivitást okozzák, a keverékben található valamennyi aktivitással rendelkező peptidet, amely az első szintetikus ciklusban aktivitást mutatott, újraszintetizáljuk ugyanazzal a keverő-, szétosztó- és kapcsolóeljárással, azonban ebben a második szintetikus ciklusban a peptidkeverékeket az utolsó előtti kapcsolás után nem elegyítjük. Ennélfogva, egy adott keverékben az utolsó előtti kapcsolt aminosav ismertt&válik. Az utolsóként kapcsolt aminosav már meghatóra- t zott a biológiai próba által az előző szintetikus ciklusban. Ezután ezt kapcsoljuk hozzá minden egyes keverékben a peptidekhez úgy, hogy most már ismertetjük az utolsó két kapcsolt aminosavat, minden egyesipep- i tidre vonatkozóan az adott peptidkeverékben. Ezután a >

keverékeket ismét biológiai próbának vetjük alá abból a célból, hogy meghatározzuk, melyik keverék mutat aktivitást. Ennek eredményeképpen megismerjük a megfigyelt aktivitást okozó peptid két aminosavmaradékát. A kívánt aktivitással rendelkező peptidkeverék újraszintetizálási eljárása és a keverék biológiai tesztvizsgálatát addig ismételjük, amíg ezen az úton újra meghatározunk egy további aminosavmaradékot. Erre a célra annyi szintetikus ciklust alkalmazunk, amíg az elegyben található aktivitásért felelős peptid teljes szekvenciáját megismerjük.

A kiindulási gyantákat az alábbiakban leírtak szerint állíthatjuk elő, vagy pedig kereskedelemben beszerezhetjük úgy, hogy rajtuk már aminosavak találhatók. A gyantához kötött kereskedelemben kapható aminosavak egyben helyettesítik az első szintetikus kapcsolási lépést, amelyet a találmány leírásában ismertettünk. Azon túlmenően, hogy úgy állítunk elő peptideket, hogy egyes aminosavakat kapcsolunk, aminosavcsoportokat is kapcsolhatunk bármely vagy valamennyi kapcsolási lépésben. Az aminosavcsoport alatt egy peptidet értünk, amely ismert szekvenciával rendelkezik és ezt a leírásban megadott kapcsolási eljárással kapcsolhatjuk a gyantához vagy szekvenciához. Ezen az úton többszörös peptidszintézis és biológiai tesztvizsgálat végezhető és peptidkeverékek állíthatók elő úgy, hogy ismert peptidszekvenciákat az N-terminális helyzetben a C-terminális

HU 221 730 Bl helyzetben, vagy mindkettőben meghosszabbíthatunk; és így meghatározhatjuk azt a kapott szekvenciát, amely aktivitással rendelkezik. Ezen túlmenően - mint ahogy ezt már említettük - az ilyen módon előállított peptidszekvenciák elágazó konfigurációjúak is lehetnek.

Az aminosavak kapcsolását a szakirodalomban peptidkötések képzésére leírt ismert eljárásokkal végezhetjük. Az egyik ilyen eljárás során az aminosavat olyan származékká alakítjuk, amely a karboxilcsoportot aktívabbá teszi a peptidfragmens N-terminális aminosayján található szabad aminocsoporttal szemben. Például az aminosav vegyes anhidriddé alakítható úgy, hogy a védett aminosavat etil-klór-formiáttal, fenil-klór-formiáttal, szek-butil-klór-formiáttal vagy izobutil-klórformiáttal reagáltatjuk. Más eljárással az aminosavat aktív észterré alakíthatjuk, amely lehet például 2,4,5-triklór-fenil-észter, pentaklór-fenil-észter, pentafluor-fenil-észter, p-nitro-fenil-észter, N-butil-oxi-karbonil-észter (t-Boc), N-hidroxi-szukcinimid-észter vagy 1-hidroxi-benzotriazolból képzett észter.

Más kapcsolási eljárásban alkalmas kapcsoló reagenst alkalmazhatunk, amely lehet például N,N’-diciklohexil-kaibodiimid (DCC) vagy N,N’-diizopropilkarbodiimid (DIC). Egyéb alkalmas kapcsoló reagensek a szakember előtt ismeretesek (lásd például Schröder és Lubke, The Peptides, Academic Press, 1965, Hl. fejezet és a 4 259 234 számú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi leírás).

Megjegyzendő, hogy a peptidszintézisben alkalmazott minden egyes aminosavon az alfa-aminocsoport 30 védőcsoporttal látandó el a kapcsolási reakció során abból a célból, hogy a reaktív alfa-aminocsoporttal lezajló mellékreakciókat kiküszöböljük. Ugyancsak megjegyzendő, hogy bizonyos aminosavak reaktív oldallánc funkciós csoportokat tartalmaznak (például szulfhidrilcsoport, 35 epszilon-aminocsoport, béta- és gamma-karboxilcsoport, imidazolcsoport, guanidinocsoport és hidroxilcsoport), és ezeket is védőcsoporttal kell ellátni a kezdeti és ezt követő kapcsolási lépések során. Az alkalmazandó védőcsoportok a szakirodalomban ismertek (lásd például Protec- 40 tive Groups in Organic Chemistry, M. McOmie, E., Plenum Press, N. Y.,(1973) és a 4 617 149 számú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi leírásokat).

Az adott védőcsoport megválasztásakor bizonyos feltételeket figyelembe kell venni. Az alfa-aminocso- 45 port védőcsoport olyan legyen, amely az alfa-aminocsoportot a kapcsolási reakció körülményei között inért állapotban tartja, ugyanakkor könnyen eltávolítható a kapcsolási reakció után olyan körülmények között, amelyek az oldallánc védőcsoportjait nem távolítják el, illet- 50 ve nem befolyásolják a peptidfragmens szerkezetét. Továbbá, az alfa-aminocsoport védőcsoport olyan legyen, ami kiküszöböli a racemizálódás veszélyét a kapcsolás előtti aktiválási reakciólépésben. Az oldallánc funkciós csoportjának védőcsoportja olyan legyen, amely ezt a 55 csoportot a kapcsolási reakciókörülmények között inért állapotban tartja, ugyanakkor stabil az alfa-aminocsoport védőcsoportjának eltávolítási körülményei között, és könnyen eltávolítható szükség esetén a peptid előállításának befejezése után olyan reakciókörülmények al- 60 kalmazásával, amelyek nem változtatják meg a peptidlánc szerkezetét.

A szakember számára nyilvánvaló, hogy a peptidszintézisben alkalmazható védőcsoportok nagyban változóak abból a szempontból, hogy az eltávolításukra alkalmazott reagens aktivitása milyen mértékű. Például bizonyos védőcsoportok, mint például a trifenil-metilcsoport és a 2-(p-bifenilil)-izopropil-oxi-kaibonil-csoport igen labilis védőcsoportok és enyhe körülmények között eltávolithatók. Más védőcsoportok, mint például a terc-butoxi-karbonil-csoport, a terc-amil-oxi-karbonilcsoport, az adamantil-oxi-karbonil-csoport és a p-metoxi-benzil-oxi-karbonil-csoport kevésbé labilis csoportok, és közepesen erős savak alkalmazását igénylik, amely lehet trifluor-ecetsav, sósav vagy bór-trifluorid ecetsavban alkalmazott elegye, az eltávolításukhoz. Más védőcsoportok, mint például a benzil-oxi-karbonil-csoport, a halo-benzil-oxi-karbonil-csoport, a p-nitro-benzil-oxi-karbonil-csoport, a cikloalkil-oxi-karbonil-csoport és az izopropil-oxi-karbonil-csoport még ezeknél is ellenállóbb csoportok, és erős savakat, mint például hidrogén-fluoridot (HF), hidrogén-bromidot vagy bór-trifluor-acetát trifluor-ecetsavas oldatát igénylik eltávolításukhoz. A 9-fluorenil-metil-oxi-karbonil-csoport (Fmoc) olyan védőcsoport, amely ugyancsak könnyen eltávolitható például piperidin segítségével olyan körülmények között, amelyek az egyéb reakcióban alkalma- t zott védőcsoportokat érintetlenül hagyják.

A kapcsolási lépések végrehajtása után, a védethpeptid lehasítható a gyantahordozóról és valamennyi védőcsoport eltávolítható. A hasítási reakció és a védőcsoportok eltávolítása párhuzamosan vagy lépésenként is végre- > hajtható. Amennyiben az alkalmazott gyantahordozóegy klór-metilezett polisztirolgyanta, a peptidet a gyantához rögzítő kötés észterkötés, amely C-terminális egység karboxilcsoportja és a gyantamátrixban jelen lévő számos klór-metil-csoport egyike között képződött. Könnyen felismerhető, hogy a rögzítőkötést olyan reagensekkel lehet elhasítani, amelyek észterkötés-hasításra képesek, valamint be tudnak hatolni a gyantamátrixba. Egyik ilyen különösen előnyös eljárás a folyékony, vízmentes hidrogén-fluoriddal történő kezelés. Ez a reagens nemcsak lehasítja a peptidet a gyantáról, hanem valamennyi védőcsoportot is eltávolítja. Ennélfogva a reagens alkalmazása közvetlenül teljesen védőcsoportmentes peptidet szolgáltat. Amennyiben kívánatos, hogy a peptidet úgy hasítsuk le a gyantáról, hogy a védőcsoportok a molekulán maradjanak, a védett peptidgyantát metanolízissel hasíthatjuk és ennek során olyan védett peptidet nyerünk, amelynek C-terminális kaiboxilcsoportja metilezett. Ezután a metil-észter enyhe alkálikus körülmények között hidrolizálható és így szabad C-terminális karboxilcsoport állítható elő. Ezt követően a védőcsoportok a peptidláncról erős savval, mint például folyékony hidrogén-fluoriddal történő kezeléssel távolíthatók el. Különösen előnyös eljárást irt le a találmány szerinti peptidek előállítására Hűi, K. Y. és munkatársai 1988, J. Med. Chem. 31, 1679-1686 közleményében.

Más eljárás a védett peptid gyantáról történő lehasítására az ammonolizis vagy a hidrazinnal történő reak5

HU 221 730 Bl ció. Ugyancsak felismerhető, hogy az N-terminális alfa-aminocsoporton jelen lévő védőcsoport ugyancsak eltávolítható, előnyösen a védett peptid gyantahordozóról való lehasítása előtt, vagy ezzel párhuzamosan.

A szakember felismeri, hogy a találmány szerinti el- 5 járás során bármely ismert vagy újonnan kifejlesztett szilárd fázisú eljárás alkalmazható, és alkalmazhatunk bármely aminosav- vagy aminosavszármazék-kombinációt, hogy bármely hosszúságú vagy szekvenciájú pepiidet állítsunk elő. Abból a célból, hogy elágazó mole- 10 kulákat állítsunk elő, aminosavakat vagy aminosavláncokat kapcsolhatunk az első lánc valamely részén található második aminocsoporthoz. Például a növekvő peptid bármely pontjához lizin-aminosavat kapcsolhatunk abból a célból, hogy az ebben az ami- 15 nosavban található második aminocsoporthoz valamely aminosavat vagy aminosavcsoportot kapcsoljunk. Más eljárás szerint módosított aminosavakat állíthatunk elő, amelyek két vagy több aminocsoportot tartalmaznak abból a célból, hogy ez az aminosav szolgáljon elágazási 20 pontként. Az oldalelágazások ezután ugyanúgy meghosszabbíthatók a lineáris molekulákra leirt keverési, szétosztást és kapcsolási eljárással. Amennyiben többszörösen elágazó molekulákat készítünk, az oldalágakon található védőcsoportok eltérőek kell hogy legye- 25 nek az első elágazásnál alkalmazott védőcsoportoktól. Például az egyik ágon alkalmazhatunk t-Boc védőcsoportokat, a másik ágon Fmoc védőcsoportokat, és ez lehetővé teszi a különböző ágakon a szelektív szintézist úgy, hogy eltérő reakciókörülményeket és védőcső- 30 port-eltávolító reagenseket alkalmazunk.

Számos, természetes és természetben nem előforduló aminosav kapható a kereskedelemben védőcsoporttal ellátott, illetve védőcsoport nélküli formában. Egyéb aminosavakat, amelyek kereskedelemben nem 35 kaphatók, szintetizálhatunk. Valamennyi, a találmány szerinti eljárásban szükséges reagens és kiindulási anyag rendelkezésre áll az Advanced ChemTech (PO Box 1403, Louisville, KY. vagy Applied Biosystems (850 Lincoln Center dr., Foster City, CA) forrásokból, 40 hacsak másként nem jelezzük.

A találmány szerinti eljárásban nem szükséges valamely biológiai aktivitást meghatározó speciális tesztvizsgálatot alkalmazni. Bármely tesztvizsgálat, amely a peptidek kívánt aktivitását képes kimutatni, alkalmazha- 45 tó a találmány szerinti eljárásban abból a célból, hogy a peptidkeveréken belül egy adott peptidet vagy peptideket állítsunk elő és azonosítsunk, mely peptidek vagy peptid felelősek a kívánt aktivitásért. A szokásosan alkalmazható tesztvizsgálatok például a recep- 50 torligandum-kötési, az immunológiai reaktivitás vagy enzimaktivitásra kifejtett hatás tesztvizsgálatok.

A találmány szerinti eljárást az alábbi példákon részletesen bemutatjuk. A példák illusztratív jellegűek, és nem jelentik a találmány tárgyának korlátozását. 55

1. példa

C-terminálisan amidéit peptideket állítunk elő p-metil-benzhidril-amin (p-MBHA)-gyantán RaMPS™ (DuPont, 549 Albany St., Boston, MA) peptidszintézis be- 60 rendezésben. Az alkalmazott aminosavak t-Boc alfaaminocsoport védőcsoportot tartalmaznak, az oldalláncok pedig az alábbiak szerint védettek:

Asp(O-Bzl), Glu(O-Bzl), Ser(Bzl), His(Bom), Lys(2Cl-Z), D-Tyr(2,6Cl-Z), és Arg(Tos).

Az RaMPS™ berendezés lényegében egy csőrendszer, és ennélfogva vákuum alkalmazható párhuzamosan több polipropilén reakcióedényben arra a célra, hogy az oldószereket és az oldható reagenseket, mint például a nem kapcsolt aminosavakat beszívjuk. Ezek a reakcióedények, amelyeket patronoknak nevezünk, szeleppel rendelkeznek, amelyek a vákuum alkalmazását szabályozzák, illetve egy „poligolyóval” rendelkeznek, amely visszatartja a hordozógyantát a hozzákötött bármely aminosavakkal vagy peptiddel együtt a patronban a beszivás alatt, így megkönnyíti a szintézis során az elválasztási, mosási, semlegesítési és védőcsoporteltávolitási lépések végrehajtását.

A berendezésbe 22 kamrát helyezünk, amelyek mindegyikében 0,2 g p-MBHA gyanta található, amely körülbelül 0,6 mmol amin kapcsolására alkalmas hellyel rendelkezik grammonként. Az aminkötési helyeket dimetil-formamidban készült 10%-os diizpropiletil-aminnal (DIEA) semlegesítjük. 4 ekvivalens (4 mól amin/mol gyanta) az I. táblázatban felsorolt tBoc-aminosavakat oldunk 1-1 ml dimetil-formamidban, majd az oldatot az egyes patronkamrákba adagoljuk úgy, hogy az egyes kamrákba eltérő t-Boc-aminosavat mérünk. Ezután a kamrákba 4 ekvivalens 0,5 mól 1-hidroxi-benzotriazol (HOBt) dimetil-formamidban készült oldatot, majd ezt követően 4 ekvivalens diizopropil-karbodiimidet (DIC) adagolunk. Az egyes kamrákat 60 percen át fel-le mozgatjuk, majd mosást, semlegesítést végzünk, és végül ugyanezen aminosavval azonos körülmények és koncentrációk alkalmazásával újrakapcsolást végzünk. Ez a második kapcsolás szükséges ahhoz, hogy biztosítsuk, hogy a gyantán valamennyi kötési hely kapcsolt legyen. A kötési, kapcsolási reakciót ninhidrinpróbával ellenőrizzük, hogy tökéletesen megtörtént-e, mielőtt a következő aminosavat alkalmaznánk. A t-Boc-aminosavakról a védőcsoportot eltávolítjuk úgy, hogy a reakció eredményeként kapott anyagot 30 percen át 50% trifluor-ecetsav (TFA), 5% anizol és 45% diklór-metán elegyével reagáltatjuk. A kapcsolt gyantákat minden egyes kamrából eltávolítjuk és alaposan elkeverjük. így egy olyan elegyet kapunk, amelyben az első helyzetben kapcsolt egyes aminosavak moláris mennyisége megegyezik.

A gyantához kötött aminosavkeveréket ezután 23 kamrába egyenlő részekben elosztjuk. A 22 darab I. táblázatban felsorolt t-Boc-aminosavat plusz az átmeneti állapot t-Boc-aminosav sztatint (Sta) kapcsoljuk ezután az aminosavkeverék aliquot részekhez úgy, hogy minden aliquot részt eltérő t-Boc-aminosawal kapcsolunk. Ezt a kapcsolást a fentiek szerint végezzük és így 23 peptidkeveréket kapunk, amelyek mindegyike 22 különféle gyantához kötött dipeptidet tartalmaz, amelyekben az N-terminális aminosavmaradéka ismert. A két cikluskapcsolás 506 különféle dipeptidet eredményez. A kapcsolási reakciót ismét ellenőrizzük abból a szem6

HU 221 730 Bl pontból, hogy teljesen lezajlott-e, mielőtt a védőcsoportot eltávolítanánk. Ezután a gyantához kötött dipeptideket a kamrákból kivesszük és alaposan elegyíljük, így olyan dipeptidkeveréket kapunk, amelyben az egyes helyzetekhez kötött minden egyes aminosav moláris mennyisége megegyező.

A gyantához kötött dipeptidet egyenlően 22 kamrába osztjuk. Az I. táblázatban leírt 22 darab t-Boc-aminosavat kapcsoljuk ezután a dipeptidelegy aliquot részekhez úgy, hogy minden egyes aliquot részhez másmás t-Boc-aminosavat kapcsolunk. A kapcsolást a fentiek szerint végezzük azzal az eltéréssel, hogy a t-Bocaminosavat utoljára adagoljuk az elegyhez abból a célból, hogy elkerüljük a diketo-piperazin-képződést, amely a védőcsoport elhasadása miatt történhet. így 22 peptidkeveréket nyerünk, amelyek mindegyike 506 eltérő, gyantához kötött tripeptidet tartalmaz, ahol az N-terminális aminosavmaradék ismert. A három ciklusos reakció 11132 különböző tripeptidet szolgáltat. Ismét ellenőrizzük, hogy a kapcsolási reakció tökéletesen végbement-e, majd a védőcsoportot eltávolítjuk. A gyantához kötött dipeptideket eltávolítjuk a kamrákból és alaposan elegyítjük, így olyan tripeptidkeveréket kapunk, ahol az egyes helyzetekhez kötött egyes aminosavak moláris mennyisége azonos.

A gyantához kötött tripeptidkeveréket egyenlő részekben 22 kamrába töltjük. Az I. táblázatban leírt 22 darab t-Boc-aminosavat kapcsoljuk ezután a tripeptidkeverék aliquot részekhez úgy, hogy minden egyes aliquot részt eltérő t-Boc-aminosawal kapcsolunk. A kapcsolási reakciót a fentiek szerint végezzük, amint ezt az első kapcsolásnál leírtuk. így 22 peptidkeveréket kapunk, amelyek mindegyike külön-külön 11 132 különféle gyantához kötött tetrapeptidet tartalmaz, amelyekben az N-terminális aminosavmaradék ismert. A négy ciklusos kapcsolási reakcióban 244 904 különféle tetrapeptidet nyerünk. Ismét ellenőrizzük, hogy a kapcsolási reakció tökéletesen megtörtént-e. A tetrapeptideket 2 órán át 10 ekvivalens ecetsavval, HOBt- és DIC-reagenssel reagáltatjuk abból a célból, hogy az Nterminális maradékot acetilezzük. A gyantához kötött acetilezett tetrapeptideket ezután az egyes kamrákból eltávolítjuk, de a korábbi lépésektől eltérően a kamrák tartalmát nem elegyítjük, hanem külön tároljuk. így az adott kamrából kikerült tetrapeptidek ugyanazon aminosavat tartalmazzák az N-terminális helyzetben, azonban valamennyi egyéb maradék a láncban véletlenszerű eloszlásban és ekvimoláris mennyiségben az alkalmazott kapcsolt aminosavakból tevődnek össze. Ennélfogva, az egyes kamrákból nyert tetrapeptidek ekvimoláris keverékét jelentik a lehetséges valamennyi szekvenciának, amit a választott aminosavakból képezhetünk, de ugyanakkor N-terminális egységük állandó.

A tetrapeptideket diklór-metánnal mossuk és szobahőmérsékleten megszáritjuk. Ezután a tetrapeptideket az MBHA gyantáról lehasítjuk 90% folyékony vízmentes hidrogén-fluorid/5% p-tiokrezol/5% m-krezol 70 percen át 0 °C hőmérsékleten történő reagáltatásával. A kezelés során egyben valamennyi oldalláncon található védőcsoportot is eltávolítunk. Ezután a hidrogén-fluoridot elpárologtatjuk és a lehasított tetrapeptideket 50 ml dietil-éterrel 30 percen át 0 °C hőmérsékleten csapadékként leválasztjuk. A lehasított tetrapeptidek és az elhasznált gyanták elkülönítésére üvegszűrőt alkalmazunk, majd 4x20 ml dietil-éterrel történő mosást alkalmazunk abból a célból, hogy a tetrapeptideket csapadékként leválasszuk. A csapadékként leválasztott tetrapeptideket 50% ecetsav/30% acetonitril elegyében oldjuk, majd gömblombikba szűrjük. Az oldószer térfogatának körülbelül 70%-át vákuumdesztilláció segítségével eltávolítjuk, majd a maradékot vízzel hígítjuk és liofilizáljuk. A száraz tömeg peptidet kinyerjük és tömegét meghatározzuk, majd az elegyeket újra 50% ecetsav/30% acetonitril elegyben oldjuk, mielőtt kis aliquot részekre osztjuk.

I. táblázat

L-aminosavak	D-aminosavak
arginin	alanin
aszparaginsav	aszparagin
glutamin	glutaminsav
hisztidin	leucin
izoleucin	lizin
lizin	fenil-alanin
fenil-alanin	prolin
prolin	triptofán
metionin	tirozin
szerin	valin
tirozin
triptofán

2. példa

Az 1. példában nyert tetrapeptidkeverékeket biológiai vizsgálatnak vetjük alá, amelyben mérjük, hogy a peptidek milyen mértékben képesek inhibiálni a humán immunhiány vírus (HIV-1) aszpartil-proteáz fehéijebontó aktivitását. A HIV-1 replikációs ciklusának kritikus lépése a vírus génje által kódolt bizonyos poliproteintermékek fehérjebontása. A prekurzorproteinek hasadnak és így érett fehérjék keletkeznek, amelyek a retrovírusos életciklushoz szükségesek. Ennélfogva azok a vegyületek, amelyek képesek a HIV-1 proteázt inhibiálni, igen fontosak lehetnek mint terápiás szerek a szerzett immunhiány betegség (AIDS) kezelésében.

Az egyes tetrapeptidkeverékeket egyenként dimetilszulfoxiddal hígítjuk a tesztvizsgálat előtt úgy, hogy a teljes peptidkoncentráció körülbelül 15 585 μΜ legyen. Mivel az egyes keverékekben egyenként 11132 különféle tetrapeptid található, minden egyes tetrapeptid egyenkénti koncentrációja a tesztvizsgálatban 1,4 μΜ. Az eredményeket az enziminhibiálás %-ában adjuk meg összehasonlítás alapján, amelyet fehérjebontó enzimmel kezelt és nem kezelt lehasított szubsztrát kontrollmérésével végzünk. Mint a II. táblázatban bemutatjuk, számos tetrapeptidkeverék jelentős fehérjebontó aktivitást inhibiáló ha7

HU 221 730 Bl tást mutatott. Az N-terminális helyzetben Phe-maradékot tartalmazó tetrapeptidelegy a proteázaktivitást 103%-ban inhibiálta, és ezt választottuk az újraszintetizálási eljárásban való alkalmazásra abból a célból, hogy pontosan meghatározzuk a megfigyelt aktivitásért felelős adott pép- 5 tid vagy peptidek pontos szekvenciáját.

Ezután az 1. példa szerinti eljárással ugyanazon aminosavkészletet alkalmazva, az N-terminális helyzetben Phe-maradékot tartalmazó tetrapeptideket újra szintetizáljuk azzal az eltéréssel, hogy a harmadik kapcsolási lépés után a tripeptidelegyeket nem keveijük egymással. így tripeptidelegyeket nyerünk, amelyekben a harmadik helyzetbe kapcsolt aminosavak ismertek. Ezután valamennyi tripeptidkeveréket Phe-maradékkal kapcsolunk és így 22 gyantához kötött tetrapeptidelegyet kapunk, amelyekben egyenként az N-terminális utolsó két aminosavat ismerjük. Ezeket a tetrapeptidelegyeket az 1. példa szerinti eljárásnak megfelelően lehasítjuk és biológiai tesztvizsgálatra előkészítjük. A tetrapeptidelegyeket egyenként dimetil-szulfoxiddal hígítjuk, 20 mielőtt a proteáz-tesztvizsgálatba visszük. A teljes peptidkoncentráció 5060 μΜ a kísérletben, így az 506 adott tetrapeptidkoncentrációja egyenként 10 μΜ. AII. táblázatban láthatjuk, hogy a N-terminális helyzetben Phe-Ile egységeket tartalmazó tetrapeptidkeverék a proteázaktivitást 68%-ban inhibiálja.

Ezután az N-terminális helyzetben Phe-Ile egységet tartalmazó tetrapeptideket lényegében az 1. példa szerinti eljárás szerint, de a fentieknek megfelelően újraszin10 tetizáljuk, azonban azzal az eltéréssel, hogy most már az N-terminális helyzetben a három utolsó aminosav szekvenciáját ismerjük. Az így kapott 23 tetrapeptidelegyet, amelyek mindegyike 22 adott tetrapeptidet tartalmaz, ismét a korábbiak szerinti proteáz-tesztvizsgálatokba 15 visszük. Az összes peptidkoncentráció a vizsgálatokban 220 μΜ volt, így a 22 adott tetrapeptidkoncentráció az egyes keverékekben 10-10 μΜ. Az N-terminális helyzetben Phe-Ile-Sta maradékokat tartalmazó tetrapeptidelegyek a proteázaktivitást 83%-ban inhibiálják, amint ez a U. táblázat adataiból kitűnik.

II. táblázat

Meghatározott tetrapeptidkeverékek tesztvizsgálati eredményei

KWN=ismert maradék	KWN-X-X-X	Phe-KWN-X-X	Phe-üe-KWN-X	Phe-Ile-Sta-KWN
Arg	17	0	8	8
Alá	11	0		6
Asp	117	0	15	0
Gin	58	0	18	0
His	8	0	21	0
lle	102	68,0	21	0
Leu	51	0	18	68
Lys	29	0	16	0
Val	30	28	15	1
Phe	57	23	15	43
Phe	103	7	16	0
Pro	9	0	17	0
Met	96	5	19	0
Ser	17	0	18	0
Tyr	98	8	4	0
Trp	65	6	7	19
Trp	81	9	1	0
Lys	5	0	0	0
Pro	9	0	21	0
Tyr	68	5	14	0
Glu	78	0	15	9
Asn	27	0	14
Sta			83,0

A 22 darab N-terminális helyzetben Phe-Ile-Sta egységet tartalmazó tetrapeptidet újra szintetizáljuk lényegében az 1. példa szerinti eljárásnak megfelelően, és 60 l

proteáz-tesztvizsgálatba visszük. Mint a II. táblázat adataiból kitűnik, a leghatásosabb tetrapeptid a Phe-Ile- r

Sta-Leu és ezt a proteázaktivitást 68%-ban inhibiálja.

Claims (2)

1. SZABADALMI IGÉNYPONTOK

   1. Eljárás peptidkeverékek előállítására szilárd fázisú módszerrel, melynek során olyan keveréket nyerünk, melyben az egyes peptidek egyenértéknyi 5 mennyiségben vannak jelen, ahol az eljárás során legalább egy szintézisciklusban a keveréket azonos mennyiségekre választjuk szét, azzal jellemezve, hogy A) egy első szintézisszakaszban n számú szintézislépéssel az n számú, ismert aminosavból vagy aminosavcsoportból felépülő peptidek keverékét állítjuk elő, melynek első lépésében az aminosavakat vagy aminosavcsoportokat külön-külön szilárd hordozógyanta aliquot mennyiségeihez kapcsoljuk, és valamennyi további lépés során a gyantához kötött ami- 15 nosavak vagy aminosavcsoportok aliquotjait alaposan összekeveijük;

   a kapott elegyet azonos mennyiségű aliquot részekre osztjuk szét;

   valamennyi aliquothoz egymástól függetlenül is- 20 mert aminosavakat vagy aminosavcsoportokat kapcsolunk;

   kívánt esetben a peptideket minden egyes keverékben lehasítjuk a gyantákról, így olyan peptidkeveréket kapunk, melynek minden tagja az utolsó kapcsolási helyen ismert aminosavat tartalmaz; majd az első szintézislépés befejezésénél minden egyes peptidkeverék biológiai aktivitását meghatározzuk;

   B) egy második peptidszintézist hajtunk végre az első szintézisnél alkalmazottakkal azonos aminosavak vagy aminosavcsoportok felhasználásával az első szintézis n lépését alkalmazva, ahol az n-1. lépésig az első szintézist megismételjük, majd az n-edik lépésben minden

   10 egyes peptidkeverékhez azt az ismert aminosavat vagy aminosavcsoportot kapcsoljuk teljesen végrehajtott kapcsolási reakció segítségével, amely azon peptidkeverék terminálisán található, amely az első biológiai vizsgálatban biológiai aktivitást mutatott;

   kívánt esetben minden egyes keverékben a peptideket a gyantáról lehasítjuk; majd a második szintézislépés befejezéseként minden egyes peptidkeverék biológiai aktivitását meghatározzuk, és

   C) a szintézisciklus lépéseit összesen n alkalommal végrehajtva teljesen ismert szekvenciájú peptidet állítunk elő.
2. 2. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy n jelentése 4.