JPH03232895A - 甘味タンパク質 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 産業上の利用分野 本発明は新規タンパク質およびこれを含有する甘味剤に
関する。

従来勿肢徘 強い甘味を呈するタンパク質モネリンは、Ｄｉｏｓｃｏ
ｒｅｏｐｈｙｌｌｕｍ　Ｃｔ＋ｍｍｆｎｓｊｉ　（Ｓｔ
ａｐｆ）　Ｉ）ｉｅｌｓの果実から得られ、ショ糖の３
０００倍の甘味を呈する（Ｍｏｒｒｉｓ、　　Ｊ、八、
　　＆　　Ｃａｇａｒ＋、　　Ｒ，Ｈ，（１９７２）　
　Ｂｉｏｃｈｉｍ。

Ｂｉｏｐｈｙｓ、　Ａｃｔａ、　２６Ｌ　　１１４−１
２２およびＶａｎ　ｄｅｒＷｅｌ、　　Ｈ，（１９７２
）　ＦＥＢＳ　Ｌｅｔｔ、　２１．　８８−９０参照）
。

モネリンはアミノ酸残基４４のＡ鎖とアミノ酸残基５０
のＢ鎖から成り、これまでに、Ａ鎖、Ｂ鎖のそれぞれに
２種の一次構造式が提出されていた（Ｂｏｈａｋ、　Ｚ
、　＆　Ｌｉ、　Ｓ、−Ｌ、　　（１９７６）　Ｂｉｏ
ｃ旧ｍ。

Ｂｉｏｐｈｙｓ、　　八ｃｔａ、　　　４２７．　１５
３−１７０．　　Ｆｒａｎｋ、　　Ｇ、　　＆Ｚｕｂｅ
ｒ、　Ｈ，（１９７６）　Ｈｏｐｐｅ−Ｓｅｙｌｅｒ’
　ｓ　Ｚ、　Ｐｈｙｓｉｏｌ。

Ｃｈｅｍ、　３５７．５８５　５９２およびＨｕｄｓｏ
ｎ、　　Ｇ、　＆Ｂｉｅｍａｎｎ、　Ｋ、　（１９７６
）　Ｂｉｏｃｈｅｍ、　Ｂｉｏｐｈｙｓ、　Ｒｅｓ。

Ｃｏ＋ｕ＋ｕｎ、　７Ｌ　　２１２−２２０参照）が、
真の一次構造式は我々が決定した（未発表）。

一方、これまでタンパク質は一般に遺伝子工学的手法に
よって合成されており、化学的固相合成法により、純粋
なタンパク質が合成された前例は無い。

゛　しよ゛と　る 本発明は固相合成法により簡便にタンパク質を合成しモ
ネリンの真の一次構造式を決定し、さらに固相法による
タンパク質化学合成法を確立することを目的としている
。

ラ　を′ｎ２　−るための 前記課題を解決すべく鋭意検討を重ねた結果、本発明者
らは、α−アミノ基の保護には弱塩基で除去できるＦｍ
ｏｃ基を、側鎖の保護基としては酸処理で除去できる保
護基、詳しくは、水酸基およびカルボキシル基の保護に
はＢｕｔ基を、アルギニンのグアニジノ基にはＭｔｒｉ
を、リジンのε−アミノ基にはＢｏｃ基を、アスパラギ
ン、グルタミンのアミド基にはＭｂｈ基を、システィン
のスルフィドリル基にはＭＢｚｌ基を用いて保護し、メ
チオニンはメチオニンオキシドとして導入し、脱保護の
最終段階で還元し、メチオニン残基にもどすことにより
、下記構造式で示されるモネリンのアナログであるＡ鎖
およびＢ鎖を化学固相法により合成することに成功し、
これらを含有するタンパク質が甘味を呈することを見出
し、本発明を完成した。

Ａ鎖　：　八ｒｇ−Ｇｌｕ−１１ｅ−Ｌｙｓ−Ｇｌｙ−
Ｔｙｒ−Ｇｌｕ−Ｔｙｒ−Ｇｌｎ−Ｌｅｕ−Ｔｙｒ−Ｖ
ａｌ−Ｔｙｒ−八ｌａ−Ｓｅｒ−Ａｓｐ−Ｌｙｓ−Ｌｅ
ｕ−Ｐｈｅ−Ａｒｇ−Ａｌａ−Ａｓｎ−１１ｅ−５ｅｒ
−Ｇｌｎ−Ａｓｎ−Ｔｙｒ−Ｌｙｓ−Ｔｈｒ−Ａｒｇ−
Ｇｌｙ−八ｒｓ−Ｌｙｓ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ａｒｇ−Ｐ
ｈｅ−Ａｓｎ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｖａｌ−Ｐｒｏ−Ｐｒ
ｏ−Ｐｒ。

Ｂ鎖：　Ｇｌｙ−Ｇｌｕ−Ｔｒｐ−Ｇｌｕ−１１ｅ−１
１ｅ−Ａｓｐ−１１ｅ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｐｈｅ−Ｔｈ
ｒ−Ｇｌｎ−八５ｎ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−Ｌｙｓ−Ｐｈｅ
−八ｌａ−Ｖａｌ−Ａｓｐ−Ｇｌｕ−Ｇｌｕ−Ａｓｎ−
Ｌｙｓ−１１ｅ−Ｇｌｙ−Ｇｌｎ−Ｔｙｒ−Ｇｌｙ−Ａ
ｒｇ−Ｌｅｕ−Ｔｈｒ−Ｐｈｅ−Ａｓｎ−Ｌｙｓ−Ｖａ
ｌ−１１ｅ−Ａｒｇ−Ｐｒｏ−Ｃｙｓ−Ｍｅｔ−Ｌｙｓ
−Ｌｙｓ−Ｔｈｒ−１１ｅ−Ｔｙｒ−Ｇｌｕ−Ａｓｎ−
Ｇｌｕ本発明における固相合成法では、縮合反応は、Ｄ
ＣＣ等の縮合剤の存在下、あるいは保護アミノ酸とＤＣ
Ｃから合成した対称酸無水物を用いて実施する。縮合反
応終了後、保護基は除去され、更にペプチドのＣ端と樹
脂との結合を切断する。更に本発明のペプチドＡ鎖、Ｂ
鎖は通常の方法に従い精製される。例えば、イオン交換
クロマトグラフィー、逆相液体クロマトグラフィー、ア
フィニティークロマトグラフィー等が挙げられる。

上記のようにして合成されたＡ鎖とＢ鎖は等モルづつ水
溶液中でまぜ合わせ複合体とし、上記のようなりロマト
グラフィーによって分離精製する。

このようにして得られたタンパク質は、重量比でショ糖
の約５５０倍の甘味を有している。この甘味の程度は、
天然物とは異なるタンパク質が合成されたことを証明し
ている。

また、本発明のタンパク質は一般の低カロリー甘味剤と
同様に使用することができる。

実施例 以下実施例により本発明を具体的に説明する。

なお、本明細書中で用いた略号は、次の意味を有する。

Ａｌａ　　　アラニン（以下アミノ酸は全てＬ体）Ａ　
ｒ　ｇ　　　アルギニン Ａｓｎ　　　アスパラギン Ａｓｐ　　　アスパラギン酸 Ｃｙｓ　　　システィン Ｇｉｎ　　　グルタミン Ｇｌｕ　　　グルタミン酸 Ｇ１　ｙ １１ｅ ｅｕ ｙｓ ｅｔ ｈｅ Ｐｒ。

ｅｒ ｈｒ ｙｒ ａｌ Ｆｍｏｃ ｕｔ Ｂｕｔ ｔｒ ｏｃ ｂｈ Ｂｚｌ グリシン イソロイシン ロイシン リジン メチオニン フェニルアラニン プロリン セリン スレオニン チロシン バリン フルオレン−９−イルメトキシカルボ ニル 第三ブチル 第三ブチルエステル ４−メトキシ−２，３，６−）リメチルベンゼンスルホ
ニル 第三ブトキシカルボニル ４．４′−ジメトキシベンズヒドリル ｐ−メトキシベンジル ＤＣＣジシクロへキシルカルボジイミドＴＦＡ　　　）
リフルオロ酢酸 ＨＯＢｔ　　１−ヒドロキシベンゾトリアゾールＴＭＳ
Ｂｒｌ−リメチルシリルブロミドＤＭＦ　　　Ｎ、Ｎ−
ジメチルホルムアミドＮＭＰ　　　Ｎ−メチルピロリド
ン ）ＩＰＬｃ　　高性能液体クロマトグラフィーＦＳＣＥ
　　フリーソリューションキャピラリー電気泳動 〔実施例１）　　Ａ鎖の合成 Ｆｍｏｃ−Ｐｒｏ−樹脂（Ｆｍｏｃ−Ｐｒｏが０．６５
ミリモル／ｇの割合で導入されているｐ−アルコキシベ
ンジルアルコール樹脂）１９２■を５０ｍｆｆ１の反応
容器にとり、ＤＭＦ　（１５ｍＩ！、）を加えて懸濁し
、１５５分間振うしてＦｍｏｃ−Ｐｒｏ−樹脂を膨潤さ
せた。

ペプチド合成は、３当量（０，３７５ミリモル）の保護
アミノ酸、３．３当量（０，４１３ミリモル）のＤＣＣ
，３，６当量（０，４５０ミリモル）のＨＯＢｔを用い
るＤＣＣ／ＨＯＢｔ法、あるいは６当量（０，７５０ミ
リモル）の保護アミノ酸と３当量（０，３７５ミリモル
）のＤＣＣを塩化メチレン−ＤＭＦ中、０°Ｃで２０分
間処理してつくった対称酸無水物を用いて行った。それ
ぞれの縮合反応はＫａｉｓｅｒ試験（Ｋａｉｓｅｒ＋Ｅ
、、　　Ｃｏ１ｅｓｃｏｔｔ、　Ｒ，Ｌ、、　Ｂｏｓｓ
ｉｎｇｅｒ、　ｃ、ｎ、　＆　Ｃｏｏｋ。

Ｐ、１．　（１９７０）　Ａｎａｌ、　Ｂｉｏｃｈｅｍ
、　３４．５９５−５９８参照）が陰性になるまで行っ
た。もし、縮合反応を繰り返しても陰性にならないとき
は、無水酢酸とピリジンで処理した未反応ペプチドの伸
長を停止する「キャッピング」を行った。

次の合成サイクルが用いられた。

ＨＦｍｏ（、除去：　（ｉ）樹脂を膨潤させるためにＤ
ＭＦ　（１５ｎｕ）中で１分間振とう。（ｉｉ）振とう
しつつＤＭＦ　（１５ｍｆ）中の５０％ピペリジンで２
回処理（４４，４２〜２９残基；３分＋１０分、２８〜
１７残基；３分＋１５分、１６〜ｌ残基；３分＋２０分
） Φ）洗浄：　　（ｉ）ＤＭＦ　（１５ｍｊ２）で４回。

（１１）イソプロパツール（１５ｎｌ）で２回。

（ｉｊ　）　Ｋａｉｓｅｒ試験で完全に陽性であること
を確認する。もし、脱Ｆｍｏｃが不完全なときは、（ａ
）と（ｂ）の操作を繰り返す。

（Ｃ）　　縮合：　（ｉ）樹脂を膨潤させるために、Ｄ
ＭＦ（１５ｎｌ）中で１分間振とうする。この操作を２
回行う。（ｉｉ　）　　Ｐｍｏｃアミノ酸誘導体（０，
３７５ミリモル）とＨＯＢｔ　　（０，４５０ミリモル
）を塩化メチレン（９ｎｕ）とＤＭＦ　（１＋ｎＩ！、
）の混合溶媒に溶かし、ＩＭ　　ＤＣＣ溶液（０，４１
３ｍＩ！、、塩化メチレン中）を加える。（ｉｉｉ）７
００分間振うする。

（ｄ）　　洗浄：　　（ｉ）ＤＭＦ　（１５ｒｎｌ＞で
１回（ｉｉ）イソプロパツール（１５ｎｌ）で２回。

（ｉｉｉ）縮合はＫａｉｓｅｒ試験が陰性になるまで行
う。

もし、陽性のときは（Ｃ）を繰り返す。もし反応を繰り
返しても陽性のときは、対称酸無水物法を用いるか、キ
ャッピングを行う。

上記のサイクルに於て、Ｆｍｏｃ−Ｐｒｏ−樹脂からＦ
ｍｏｃを除去した後にＦｍｏｃ−Ｐｒｏを導入したＦｍ
ｏｃＰｒｏ−Ｐｒｏ−樹脂からＦｍｏｃ基をピペリジン
で除去しようとするとジペプチドは樹脂から容易に切断
されてしまうことがわかった。従ってこの部分の合０ 成はＰｍｏｃ−Ｐｒｏ−樹脂の脱保護後にＰｍｏｃ−Ｐ
ｒｏ−Ｐｒ。

（０，３７５ミリモル）を導入し、Ｆｍｏｃ−Ｐｒｏ−
Ｐｒｏ−Ｐｒ。

樹脂として次の脱保護工程に供した。

最後の縮合工程が終了後に、次のような処理によって脱
保護、精製を行った。

ペプチド−樹脂は塩化メチレン（１５ｍＩ！、）で３回
洗浄後、塩化メチレン−アニソール−チオフェノール−
ＴＦＡ（１２，３：２．０：０．７：２０；ｖ／ｖ、　
　３５　ｍｊ２）で２時間室温で攪拌。濾過後、濾液は
湯浴の温度５０°Ｃで減圧下に濃縮して少量とし、エー
テルを加えて沈澱物を得た。濾取、乾燥して収量７３０
■。このようにして得られたペプチドは更に千オフエノ
ールーチオアニソールＴＦＡ　（０，５：　１．５　：
　１３．５　；　ｖ／ｖ、　１５．５＋ｎｊ２）に溶か
し、室温で５時間攪拌した。反応後、十分量のエーテル
を加え、生成した沈澱を濾取し、乾燥した。収量８２０
ｍｇ、このようにして得られた粗ペプチドは、ＨＰ　Ｌ
　Ｃ（Ｉｎｅｒｔｓｉｌ、　ＯＤＳ、　　ガスクロ工業
社カラム使用）に供し、求めるＡ鎖の両分を分取し、濃
縮して少量とし、ついで凍結乾燥１ した。収量８８，２■。

ＦＡＢ質量分析器による分子量測定はｍ　／　ｚ　：５
２４５、９　（Ｍ　十Ｈ）＋を与え、理論値ｍ　／　ｚ
　５２４５．８（Ｍ＋Ｈ）＋と一致した。更に、６Ｎ−
Ｈ（ｌ水溶液中で加水分解し、アミノ酸分析に供したと
ころ、Ａｓｐ、　４．０３　（４）　；　Ｔｈｒ、　０
．９７　（１）　；　Ｓｅｒ、　１．８１　（２）；　
Ｇｌｕ、　３．８２　（４）　；　Ｐｒｏ、　３．８２
　（４）　：　Ｇｌｙ、　　２．９６（３）　；　八Ｉ
ａ、　　２．０８　　（２）　　；　　Ｖａｎ、　　１
．９３　　（２）　　；　　　ｌ１ｅ１．９２　（２）
　；　Ｌｅｕ、　４．０９　（４）　；　Ｔｙｒ、　４
．７６　（５）　；Ｐｈｅ、　　２．０４　　（２）　
　；　　Ｌｙｓ、　　３．９０　　（４）　　；　　八
ｒｇ、　　４．８１　　（５）の比となり、これもまた
理論値と一致した。（）内は理論値を示す。従って求め
るペプチドが合成されていることが確認された。

純度は、ＦＳＣＥとＨＰＬＣで純度よく合成されている
ことを確認した。

〔実施例２）Ｂ鎖の合成 Ｆｍｏｃ−Ｇｌｕ（ＯＢｕｔ）−樹脂（Ｆｍｏｃ−Ｇｌ
ｕ（ＯＢｕｔ）が０．６１ミリモル／ｇの割合で導入さ
れているｐ−アルコキシベンジルアルコール樹脂）　　
３２８ｍｇを２５ｍｊ２の反応容器にとり、ＤＭＦ　（
１０ｍｆｌ）を加えて２ 懸濁し、１５分分間上うして樹脂を膨潤させた。

合成サイクルはＡ鎖の合成法と基本的には同じであるが
、Ｂ鎖の予備的合成で得られた知見を参考にして少し改
変しである。

（ａ）　　Ｆ　ｍ　ｏ　ｃ除去：（ｉ）４９位の八ｓｎ
　（Ｍｂｈ）のＦｍｏｃはＤＭＦ中の２０％ピペリジン
で除去。（ｉｉ）反応時間は、５０．４８〜４１残基は
３分＋１０分。

３９〜２５．２３〜１５前記は３分＋１５分。

４０．２４．１４〜２残基は３分＋２０分。

（ｂ）　　縮合：（ｉ）４９〜４０．３６〜３４，３２
残基はＤＣＣ／）ＨＯＢｔ法で行った。即ち、Ｐｍｏｃ
−アミノ酸誘導体（０，６００ミリモル）と）ｌＯＢｔ
　（０，７２ミリモル）を塩化メチレン（６，３ｍｆ）
とＤＭＦ（０，７ｎ／りの混合溶媒に溶かし、ＩＭ　　
ＤＣＣ（０，６６ｎ＋ｊ２、塩化メチレン中）を加え、
室温で９０分間振とうした。３９〜３７，３３，３１．
１２〜１０．８〜２残基は対称酸無水物法で行った。対
称酸無水物はＦｍｏｃ−アミノ酸誘導体（０，８０ミリ
モル）をＤＭＦ　（３，５ｍｆｆ１）と塩化メチレン（
３，５ｍｆりの混合溶媒に溶かし、ＩＭ　　ＤＣＣ（０
，４ｍｊ２゜３ 塩化メチレン中）を加え、０°Ｃで２０分間処理して調
製した。３９，３３，３１，５残基については反応は４
時間行った。３９．３８，３３，３１゜５残基はＫａｉ
ｓｅｒ試験が陽性であったので、第２回目の縮合反応が
必要であった。第２回目の縮合反応はＤＣＣ／ＨＯＢｔ
法で行った。即ち、Ｆｍｏｃ−アミノ酸誘導体（０，６
ミリモル）とＨＯＢｔ　（０，７２ミリモル）をＮＭＰ
　（７ｍｊ２）に熔かし、ＩＭＤＣＣ（０，６６ｍＩ！
、、塩化メチレン中）を加え、２時間振とうしたのち１
夜放置した。３０〜１３，９残基はＤＣＣ／ＦＩＯＢ　
を法で溶媒をＮＭＰにして行った。即ち、Ｆｍｏｃ−ア
ミノ酸誘導体（０，６０ミリモル）と１１０Ｂｔ　（０
，７２ミリモル）をＮＭＰ　（７ｍＡ）に溶かし、Ｉ　
Ｍ　　ＤＣＣ（０，６６ｔｎＩ！、、塩化メチレン）を
加え３時間振とうした。最後に、Ｂｏｃ−Ｇａｙ　（０
，６０ミリモル）をＮＭＰ　（７ｍｊ２）中でＨＯＢｔ
　（０，７２ミリモル）とＩ　Ｍ　　Ｄ　ＣＣ（０，６
６ｍ１１塩化メチレン中）と処理し、３時間振とうした
。

最後の縮合工程の後、次のような処理によって脱保護精
製を行った。

工４ ペプチド−樹脂は、ＤＭＦ　（１０ｍｆｆ）で２回。

イソプロパツール（１０ｍｆｆｉ）で４回洗い、乾ｉし
た。収量１．６０ｍｇ。これに、塩化メチレン−アニソ
ール−ｍ−クレゾール−Ｌ２−エタンジチオール−ＴＦ
Ａ　（１２，３：　２．０　：　０．５　：　０．２　
：　２０　；ｖ／ｖ、　　３５　ｍｆｆ１）を加え、室
温で２時間振とうした。濾過し、炉液は少量になるまで
減圧下に濃縮し、エーテルを加えた。こうして得られた
沈澱を炉取し、乾燥した。収量１０４０ｍｇ、この粗ペ
プチドをチオアニソール−ｍ−クレゾール−１，２−エ
タンジチオール−ＴＦＡ　（３，５２：　０．７５　：
　０．３：　２１．４７　；　ｖ／ｖ、　　２６．０４
　ｍｌ２）に溶かし、室温で１０分間攪拌し、次に氷冷
した。この溶液を攪拌しつつＴＭＳＢｒ　（３，９６ｍ
　ｌ　）を滴下し、水冷下に６時間攪拌をつづけた。反
応液に十分量のエーテルを加え、生じた沈澱物を炉取、
乾燥した。このものは水（２０ｍｆりに溶かし、水冷下
に攪拌しつつトリエチルアミンでｐＨ８に調節した。こ
の溶液にβ−メルカプトエタノール（４００μりと１Ｍ
フッ化アンモニウム（８００μりを加え、５ 水冷下３０分攪拌した後酢酸を加えｐＨ５に調節した。

生成した沈澱物を決取し、ＴＦＡ１０ｍｊ２に溶解し、
ミリポアフィルタ−で濾過後、炉液をＨＰＬＣに供し、
求めるＢ鎖の分画を分取し、減圧下に少量になるまで濃
縮し、次いで凍結乾燥した。収量１９５．１ｍｇ０更に
このものを同じＩ（ＰＬＣに供し精製して純粋なり鎖を
得た。収量６５．２　ｍｇ０ＦＡＢ質量分析器による分
子量の測定はｍ／ｚ５８３２．１　（Ｍ十Ｈ）”を与え
、理論値ｍ／　ｚ　５２３２．０（Ｍ＋Ｈ）”　と一致
した。更に、６Ｎ−ＨＣＩ水溶液中で加水分解し、アミ
ノ酸分析に供したところ、Ａｓｐ、　６．０７　（６）
　；　Ｔｈｒ、　２．８６　（３）　；　Ｇｌｕ、　７
．８０　（８）；　Ｐｒｏ、　２．１１　（２）　；　
Ｇｌｙ、　５．２３　（５）　；　Ａｌａ、　　１．０
７（１）　；　Ｖａｎ、　１．８５　（２）　；　Ｍｅ
ｔ、　０．８７　（１）　；　　Ｉｌｅ。

５．６２　（６）　；　Ｌｅｕ、　２．０８　（２）　
；　Ｔｒｙ、　２．０５　（２）　；Ｐｈｅ、　　７．
０３　　（３）　　；　　Ｌｙｓ、　　４．８８　　（
５）　　；　　八ｒｇ、　　２．０２　　（２）の比と
なり、これもまた理論値と一致した。（）内は理論値を
示す。

従って求めるペプチドが合成されていることが確認され
た。ＴｒｐとＣｙｓは分解するので測定して６ いない。

〔実施例３〕タンパク質の合成 上記で合成したＡ鎖（２，３３ｍｇ）を０．１％酢酸（
２９１μｌ）に溶かし、そこから２７１μ！とり出した
。Ｂ鎖（２，１７ｍｇ）をこのＡ鎖を含む溶液（２７１
μりに溶かし、室温で２０時間静置した。この混合物を
ＨＰ　Ｌ　Ｃ（ＴＳＫ　ｇｅｌ　Ｐｈｅｎｙ１５ＰＷ、
東ソー社カラム使用）に供し、求めるタンパク質分画を
分取し、次いで凍結乾燥した。このタンパク質を水（１
００μりに溶かし、室温で２時間振とうした後、凍結乾
燥した。収量１．３５ｍｇｏ　このタンパク質はＨＰＬ
Ｃで単一ピークを示した。

〔実施例４〕甘味試験 上記で得られたタンパク質を水に溶かし、５人のパネラ
−により、０６６％ショ糖水溶液と比較したところ、シ
ョ糖の約５５０倍（重量比）の甘味をもつことがわかっ
た。

７ として有用であり、 本発明は食品、 医薬品産業上 重要である。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １）下記構造式で示されるＡ鎖およびＢ鎖を含有するタ
   ンパク質およびその塩。 Ａ鎖：【遺伝子配列があります。】 Ｂ鎖：【遺伝子配列があります。】 ２）化学的固相合成法により合成されたものである請求
   項１記載のタンパク質に使用可能なＡ鎖またはＢ鎖。 ３）下記構造式で示されるＡ鎖およびＢ鎖から成るタン
   パク質および／またはその塩を含有することを特徴とす
   る甘味剤。 Ａ鎖：【遺伝子配列があります。】 Ｂ鎖：【遺伝子配列があります。】