JPH0859694A - ペプチドおよびこれを固定化した医療材料 - Google Patents
ペプチドおよびこれを固定化した医療材料Info
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- JPH0859694A JPH0859694A JP7172737A JP17273795A JPH0859694A JP H0859694 A JPH0859694 A JP H0859694A JP 7172737 A JP7172737 A JP 7172737A JP 17273795 A JP17273795 A JP 17273795A JP H0859694 A JPH0859694 A JP H0859694A
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Abstract
(57)【要約】
【構成】一般式：H X A1 A2 Cys A3 Cys A4 Y Z （Ｘお
よびＹは酸性アミノ酸残基、塩基性アミノ酸残基、非荷
電極性アミノ酸残基からなる群より選択される単一のア
ミノ酸残基を又はこれらのアミノ酸残基の２〜１０個か
ら構成されるペプチド断片を表わす。Ａ１は中性アミノ
酸残基又は塩基性アミノ酸残基、Ａ２は任意のアミノ酸
残基、Ａ３は中性アミノ酸残基又は塩基性アミノ酸残
基、Ａ４は塩基性アミノ酸残基又は非荷電極性アミノ酸
残基を表わし、Ｚは水酸基またはアミノ基を表わす。）
で表され、かつ、該ペプチドにおける２つのCys 残基が
ジスルフィド結合しているペプチド及び該ペプチドを血
液接触部に固定化した医療材料。 【効果】本発明のペプチドは、血液凝固に対する高い阻
害活性を有しており、医療材料に適している。また、当
該ペプチドを固定化した医療材料を用いた抗血栓性医療
用具もあらゆる医療用具として好適なものである。
よびＹは酸性アミノ酸残基、塩基性アミノ酸残基、非荷
電極性アミノ酸残基からなる群より選択される単一のア
ミノ酸残基を又はこれらのアミノ酸残基の２〜１０個か
ら構成されるペプチド断片を表わす。Ａ１は中性アミノ
酸残基又は塩基性アミノ酸残基、Ａ２は任意のアミノ酸
残基、Ａ３は中性アミノ酸残基又は塩基性アミノ酸残
基、Ａ４は塩基性アミノ酸残基又は非荷電極性アミノ酸
残基を表わし、Ｚは水酸基またはアミノ基を表わす。）
で表され、かつ、該ペプチドにおける２つのCys 残基が
ジスルフィド結合しているペプチド及び該ペプチドを血
液接触部に固定化した医療材料。 【効果】本発明のペプチドは、血液凝固に対する高い阻
害活性を有しており、医療材料に適している。また、当
該ペプチドを固定化した医療材料を用いた抗血栓性医療
用具もあらゆる医療用具として好適なものである。
Description
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は、抗血栓性を有するぺプ
チドに関するものである。さらに詳しくは、血液中の凝
固因子に作用し、血液凝固に対する阻害作用を示すぺプ
チドおよびこれを固定化してなる抗血栓性を有する医療
材料（以下、抗血栓性医療材料ともいう。）に関するも
のであり、さらに詳しくは医薬品用途または医療用具の
抗血栓化処理用途に使用するぺプチドおよび血液と接触
する医療材料に関する。
チドに関するものである。さらに詳しくは、血液中の凝
固因子に作用し、血液凝固に対する阻害作用を示すぺプ
チドおよびこれを固定化してなる抗血栓性を有する医療
材料（以下、抗血栓性医療材料ともいう。）に関するも
のであり、さらに詳しくは医薬品用途または医療用具の
抗血栓化処理用途に使用するぺプチドおよび血液と接触
する医療材料に関する。
【０００２】
【従来の技術】抗血栓性作用を有するタンパクおよびペ
プチドとして、多くの研究がなされている。例えば、ヒ
ルから分泌されるヒルジンが血液凝固を阻害する働きの
あることが報告されており（S . R. Stoneら Biochemis
try, 25, 4622,(1986) ）、また、その55-65 位あるい
は54-65 位に相当するフラグメントにも血液凝固を阻害
する作用のあることが報告されている（J. L. Krstenan
ski ら FEBS Letters 211, 10,(1987) ）。他にも、血
液凝固系プロテアーゼを阻害するインヒビター、例えば
尿中トリプシンインヒビターのフラグメント（特開平６
−２５２８９号公報）などが報告されている。
プチドとして、多くの研究がなされている。例えば、ヒ
ルから分泌されるヒルジンが血液凝固を阻害する働きの
あることが報告されており（S . R. Stoneら Biochemis
try, 25, 4622,(1986) ）、また、その55-65 位あるい
は54-65 位に相当するフラグメントにも血液凝固を阻害
する作用のあることが報告されている（J. L. Krstenan
ski ら FEBS Letters 211, 10,(1987) ）。他にも、血
液凝固系プロテアーゼを阻害するインヒビター、例えば
尿中トリプシンインヒビターのフラグメント（特開平６
−２５２８９号公報）などが報告されている。
【０００３】
【発明が解決しようとする課題】これまで研究開発され
てきた抗血栓作用を有するタンパクやペプチドは血液凝
固阻害活性の安定性が十分ではなく、医薬品用途または
医療材料の抗血栓化用途に使用するためには、血液凝固
阻害活性のより高活性で安定なぺプチドの提供が望まれ
ている。本発明の目的は、医薬品用途または医療材料の
抗血栓化用途に使用する、血液凝固作用に対して阻害作
用を有する安定なペプチドを提供することにある。そし
て、本発明の他の目的は、それを固定化した抗血栓性医
療材料を提供することにある。
てきた抗血栓作用を有するタンパクやペプチドは血液凝
固阻害活性の安定性が十分ではなく、医薬品用途または
医療材料の抗血栓化用途に使用するためには、血液凝固
阻害活性のより高活性で安定なぺプチドの提供が望まれ
ている。本発明の目的は、医薬品用途または医療材料の
抗血栓化用途に使用する、血液凝固作用に対して阻害作
用を有する安定なペプチドを提供することにある。そし
て、本発明の他の目的は、それを固定化した抗血栓性医
療材料を提供することにある。
【０００４】
【課題を解決するための手段】即ち、本発明の要旨は、
（１） 一般式： Ｈ−Ｘ−Ａ１−Ａ２−Ｃｙｓ−Ａ３−Ｃｙｓ−Ａ４−Ｙ
−Ｚ （式中、ＸおよびＹは酸性アミノ酸残基、塩基性アミノ
酸残基、非荷電極性アミノ酸残基からなる群より選択さ
れる単一のアミノ酸残基を又はこれらのアミノ酸残基の
２〜１０個から構成されるペプチド断片を表わす。Ａ１
は中性アミノ酸残基又は塩基性アミノ酸残基、Ａ２は任
意のアミノ酸残基、Ａ３は中性アミノ酸残基又は塩基性
アミノ酸残基、Ａ４は塩基性アミノ酸残基又は非荷電極
性アミノ酸残基を表わし、Ｚは水酸基またはアミノ基を
表わす。）で表され、かつ、Ａ２とＡ３の間のＣｙｓ残
基、Ａ３とＡ４の間のＣｙｓ残基がジスルフィド結合し
ていることを特徴とするペプチド、（２） 前記（１）
記載のペプチドを血液接触部に固定化した医療材料、に
関する。
（１） 一般式： Ｈ−Ｘ−Ａ１−Ａ２−Ｃｙｓ−Ａ３−Ｃｙｓ−Ａ４−Ｙ
−Ｚ （式中、ＸおよびＹは酸性アミノ酸残基、塩基性アミノ
酸残基、非荷電極性アミノ酸残基からなる群より選択さ
れる単一のアミノ酸残基を又はこれらのアミノ酸残基の
２〜１０個から構成されるペプチド断片を表わす。Ａ１
は中性アミノ酸残基又は塩基性アミノ酸残基、Ａ２は任
意のアミノ酸残基、Ａ３は中性アミノ酸残基又は塩基性
アミノ酸残基、Ａ４は塩基性アミノ酸残基又は非荷電極
性アミノ酸残基を表わし、Ｚは水酸基またはアミノ基を
表わす。）で表され、かつ、Ａ２とＡ３の間のＣｙｓ残
基、Ａ３とＡ４の間のＣｙｓ残基がジスルフィド結合し
ていることを特徴とするペプチド、（２） 前記（１）
記載のペプチドを血液接触部に固定化した医療材料、に
関する。
【０００５】本明細書においてアミノ酸残基の略号は下
記の通りのものである。 Ａｌａ：Ｌ−アラニン残基 Ａｒｇ：Ｌ−アルギニン残基 Ａｓｎ：Ｌ−アスパラギン残基 Ａｓｐ：Ｌ−アスパラギン酸残基 Ｃｙｓ：Ｌ−システイン残基 Ｇｌｎ：Ｌ−グルタミン残基 Ｇｌｕ：Ｌ−グルタミン酸残基 Ｇｌｙ：Ｌ−グリンン残基 Ｈｉｓ：Ｌ−ヒスチジン残基 Ｉｌｅ：Ｌ−イソロインン残基 Ｌｅｕ：Ｌ−ロイシン残基 Ｌｙｓ：Ｌ−リジン残基 Ｍｅｔ：Ｌ−メチオニン残基 Ｐｈｅ：Ｌ−フェニルアラニン残基 Ｐｒｏ：Ｌ−プロリン残基 Ｓｅｒ：Ｌ−セリン残基 Ｔｈｒ：Ｌ−スレオニン残基 Ｔｒｐ：Ｌ−トリプトファン残基 Ｔｙｒ：Ｌ−チロシン残基 Ｖａｌ：Ｌ−バリン残基
記の通りのものである。 Ａｌａ：Ｌ−アラニン残基 Ａｒｇ：Ｌ−アルギニン残基 Ａｓｎ：Ｌ−アスパラギン残基 Ａｓｐ：Ｌ−アスパラギン酸残基 Ｃｙｓ：Ｌ−システイン残基 Ｇｌｎ：Ｌ−グルタミン残基 Ｇｌｕ：Ｌ−グルタミン酸残基 Ｇｌｙ：Ｌ−グリンン残基 Ｈｉｓ：Ｌ−ヒスチジン残基 Ｉｌｅ：Ｌ−イソロインン残基 Ｌｅｕ：Ｌ−ロイシン残基 Ｌｙｓ：Ｌ−リジン残基 Ｍｅｔ：Ｌ−メチオニン残基 Ｐｈｅ：Ｌ−フェニルアラニン残基 Ｐｒｏ：Ｌ−プロリン残基 Ｓｅｒ：Ｌ−セリン残基 Ｔｈｒ：Ｌ−スレオニン残基 Ｔｒｐ：Ｌ−トリプトファン残基 Ｔｙｒ：Ｌ−チロシン残基 Ｖａｌ：Ｌ−バリン残基
【０００６】また、本明細書においては、常法にしたが
ってペプチドのアミノ酸配列を、そのＮ末端のアミノ酸
残基が左側に位置し、Ｃ末端のアミノ酸残基が右側に位
置するように記述する。
ってペプチドのアミノ酸配列を、そのＮ末端のアミノ酸
残基が左側に位置し、Ｃ末端のアミノ酸残基が右側に位
置するように記述する。
【０００７】本発明のペプチドは、一般式： Ｈ−Ｘ−Ａ１−Ａ２−Ｃｙｓ−Ａ３−Ｃｙｓ−Ａ４−Ｙ
−Ｚ で表わされる。ここで、ＸおよびＹは酸性アミノ酸残
基、塩基性アミノ酸残基、非荷電極性アミノ酸残基から
なる群より選択される単一のアミノ酸残基を又はこれら
のアミノ酸残基の２〜１０個から構成されるペプチド断
片を表わす。Ａ１は中性アミノ酸残基又は塩基性アミノ
酸残基、Ａ２は任意のアミノ酸残基、Ａ３は中性アミノ
酸残基又は塩基性アミノ酸残基、Ａ４は塩基性アミノ酸
残基又は非荷電極性アミノ酸残基を表わし、Ｚは水酸基
またはアミノ基を表わす。
−Ｚ で表わされる。ここで、ＸおよびＹは酸性アミノ酸残
基、塩基性アミノ酸残基、非荷電極性アミノ酸残基から
なる群より選択される単一のアミノ酸残基を又はこれら
のアミノ酸残基の２〜１０個から構成されるペプチド断
片を表わす。Ａ１は中性アミノ酸残基又は塩基性アミノ
酸残基、Ａ２は任意のアミノ酸残基、Ａ３は中性アミノ
酸残基又は塩基性アミノ酸残基、Ａ４は塩基性アミノ酸
残基又は非荷電極性アミノ酸残基を表わし、Ｚは水酸基
またはアミノ基を表わす。
【０００８】酸性アミノ酸残基とは側鎖に中性で負電荷
をもつ官能基（カルボキシル基）を有するアミノ酸残基
で、Asp 、Glu が含まれる。塩基性アミノ酸残基とは側
鎖に中性で正電荷をもつ官能基（アミノ基、イミノ基
等）を有するアミノ酸残基で、Lys 、Arg 、His が含ま
れる。また、中性アミノ酸残基とは側鎖が中性で電荷を
もたないアミノ酸残基で、非荷電極性アミノ酸残基と非
極性アミノ酸残基を含む。非荷電極性アミノ酸残基はAs
n 、Gln 、Ser 、Thr 、Tyr 、Gly 、Cys が含まれ、非
極性アミノ酸残基はAla 、Val 、Leu 、Ile 、Pro 、Ph
e 、Met 、Trp が含まれる。
をもつ官能基（カルボキシル基）を有するアミノ酸残基
で、Asp 、Glu が含まれる。塩基性アミノ酸残基とは側
鎖に中性で正電荷をもつ官能基（アミノ基、イミノ基
等）を有するアミノ酸残基で、Lys 、Arg 、His が含ま
れる。また、中性アミノ酸残基とは側鎖が中性で電荷を
もたないアミノ酸残基で、非荷電極性アミノ酸残基と非
極性アミノ酸残基を含む。非荷電極性アミノ酸残基はAs
n 、Gln 、Ser 、Thr 、Tyr 、Gly 、Cys が含まれ、非
極性アミノ酸残基はAla 、Val 、Leu 、Ile 、Pro 、Ph
e 、Met 、Trp が含まれる。
【０００９】ＸおよびＹは酸性アミノ酸残基、塩基性ア
ミノ酸残基、非荷電極性アミノ酸残基からなる群より選
択される単一のアミノ酸残基またはこれらのアミノ酸残
基の２〜１０個から構成されるペプチド断片であれば特
に限定されないが、塩基性アミノ酸残基から構成される
ペプチド断片であることが好ましい。また、ＸおよびＹ
がペプチド断片である場合において、アミノ酸残基数が
この範囲より多いとペプチド合成が煩雑となり、また人
体に対する抗原性が発現する危険性があり、好ましくな
い。
ミノ酸残基、非荷電極性アミノ酸残基からなる群より選
択される単一のアミノ酸残基またはこれらのアミノ酸残
基の２〜１０個から構成されるペプチド断片であれば特
に限定されないが、塩基性アミノ酸残基から構成される
ペプチド断片であることが好ましい。また、ＸおよびＹ
がペプチド断片である場合において、アミノ酸残基数が
この範囲より多いとペプチド合成が煩雑となり、また人
体に対する抗原性が発現する危険性があり、好ましくな
い。
【００１０】Ａ１は中性又は塩基性アミノ酸残基である
が、その中でも側鎖にベンゼン環を有するアミノ酸残基
が好ましくPhe 、Tyr をあげることができる。Ａ２は任
意のアミノ酸残基が使用可能であるが、非極性アミノ酸
残基や塩基性アミノ酸残基が好ましく、Ile 、Val 、Ly
s 、Arg が特に好ましい。Ａ３は中性または塩基性アミ
ノ酸残基であるが、側鎖に炭素原子が４個以上含まれる
アミノ酸残基が好ましい。Ａ４は塩基性アミノ酸残基ま
たは非荷電極性アミノ酸残基であるが、Lys 、Ser が特
に好ましい。
が、その中でも側鎖にベンゼン環を有するアミノ酸残基
が好ましくPhe 、Tyr をあげることができる。Ａ２は任
意のアミノ酸残基が使用可能であるが、非極性アミノ酸
残基や塩基性アミノ酸残基が好ましく、Ile 、Val 、Ly
s 、Arg が特に好ましい。Ａ３は中性または塩基性アミ
ノ酸残基であるが、側鎖に炭素原子が４個以上含まれる
アミノ酸残基が好ましい。Ａ４は塩基性アミノ酸残基ま
たは非荷電極性アミノ酸残基であるが、Lys 、Ser が特
に好ましい。
【００１１】Ａ２とＡ３の間にあるＣｙｓ残基、Ａ３と
Ａ４の間にあるＣｙｓ残基の側鎖がＳＨ基の状態であれ
ば血液凝固阻害活性は小さい。そのため、ペプチドがよ
り高い血液凝固阻害活性を有するには、Ｃｙｓ残基の側
鎖がＳＨ基でない状態、すなわちこれらのＣｙｓ残基が
ジスルフィド結合していることが必要である。このと
き、Ａ２とＡ３の間にあるＣｙｓ残基、Ａ３とＡ４の間
にあるＣｙｓ残基は同一ペプチド内においてジスルフィ
ド結合していてもよく、複数のペプチド間においてジス
ルフィド結合していてもよく、その両方であってもよ
い。血液凝固阻害活性の発現のために、ジスルフィド結
合は分子間でかかるのが好ましく、Ａ２とＡ３の間にあ
るＣｙｓ残基、Ａ３とＡ４の間にあるＣｙｓ残基が他の
ペプチドとジスルフィド結合を形成している場合に、本
発明におけるペプチドはより強い血液凝固阻害活性を有
する。
Ａ４の間にあるＣｙｓ残基の側鎖がＳＨ基の状態であれ
ば血液凝固阻害活性は小さい。そのため、ペプチドがよ
り高い血液凝固阻害活性を有するには、Ｃｙｓ残基の側
鎖がＳＨ基でない状態、すなわちこれらのＣｙｓ残基が
ジスルフィド結合していることが必要である。このと
き、Ａ２とＡ３の間にあるＣｙｓ残基、Ａ３とＡ４の間
にあるＣｙｓ残基は同一ペプチド内においてジスルフィ
ド結合していてもよく、複数のペプチド間においてジス
ルフィド結合していてもよく、その両方であってもよ
い。血液凝固阻害活性の発現のために、ジスルフィド結
合は分子間でかかるのが好ましく、Ａ２とＡ３の間にあ
るＣｙｓ残基、Ａ３とＡ４の間にあるＣｙｓ残基が他の
ペプチドとジスルフィド結合を形成している場合に、本
発明におけるペプチドはより強い血液凝固阻害活性を有
する。
【００１２】また、上記の一般式において、Ｚは水酸基
またはアミノ基のいずれでもよい。即ち、Ｃ末端のアミ
ノ酸が通常のアミノ酸でもアミノ酸アミドでも血液凝固
阻害活性を有する。
またはアミノ基のいずれでもよい。即ち、Ｃ末端のアミ
ノ酸が通常のアミノ酸でもアミノ酸アミドでも血液凝固
阻害活性を有する。
【００１３】本発明により提供されるぺプチドの代表例
を次に示すが、本発明のペプチドはこれらに何ら限定さ
れるものではない。 式（１）Lys His Ile Cys Ile Cys Lys Lys （配列番
号：１） 式（２）Lys Lys Lys Lys His Ile Cys Ile Cys Lys Ly
s Lys Lys （配列番号：２） 式（３）Asp Asp Asp Asp Tyr Ile Cys Ile Cys Lys Ly
s Lys Lys Lys （配列番号：３） 式（４）Asn Asn Asn Asn His Leu Cys Ile Cys Lys Ly
s Lys Lys （配列番号：４） 式（５）Lys Lys Lys Ser Tyr Ile Cys Ile Cys Lys Ly
s Lys Lys （配列番号：５） 式（６）Asp Asp Lys Lys His Ile Cys Ile Cys Lys Ly
s Asp Asp （配列番号：６） 式（７）Asn Asn Lys Lys Phe Ile Cys Ile Cys Lys Ly
s Asn Asn （配列番号：７） 式（８）Lys Lys Lys Lys Lys Lys Lys Lys Lys Lys Hi
s Ile Cys Ile Cys LysLys Lys Lys （配列番号：８） 式（９）Lys Lys Lys Lys His Ile Cys Ile Cys Lys Ly
s Lys Lys Lys Lys LysLys Lys Lys Lys （配列番号：
９） 式（１０）Asp Lys Asp Lys Asp Lys Lys Lys Lys Lys
His Ile Cys Ile Cys Lys Lys Asn Lys （配列番号：１
０） 式（１１）Asp Asp Asp Asn Asn Asn Asn Asn Asn Asn
His Ile Cys Ile Cys Lys Lys Asp Lys Lys Lys Lys Ly
s Lys Lys Lys Lys （配列番号：１１） 式（１２）Lys His Ile Cys Ile Cys Lys Lys Lys （配
列番号：１２） 式（１３）Asp Lys His Ile Cys Ile Cys Lys Lys （配
列番号：１３） 式（１４）Lys Lys Lys Lys His Leu Cys Phe Cys Lys
Lys Lys Lys （配列番号：１４） 式（１５）Lys Lys Lys Lys Phe Arg Cys Val Cys His
Lys Lys （配列番号：１５） 式（１６）Lys Lys Lys Lys Val Leu Cys Phe Cys Lys
Lys Lys Lys （配列番号：１６） 式（１７）Lys Lys Lys Lys Tyr Leu Cys Ile Cys Arg
Lys Lys Lys （配列番号：１７） 式（１８）Lys Lys Lys Lys Phe Asp Cys Phe Cys Lys
Lys Lys Lys （配列番号：１８） 式（１９）Lys Lys Lys Lys Tyr Ile Cys Lys Cys Lys
Lys Lys Lys （配列番号：１９） 式（２０）Lys Lys Lys Lys Phe Ile Cys Lys Cys Lys
Lys Lys Lys （配列番号：２０） 式（２１）Lys Lys Lys His Ile Cys Ile Cys Ser Lys
Lys Lys （配列番号：２１） 式（２２）Lys Lys Lys Lys Lys Tyr Ile Cys Phe Cys
Ser Ser Ser Ser Ser （配列番号：２２） 式（２３）Ser Ser Lys Lys Lys Phe Arg Cys Thr Cys
Ser Ser Ser Lys （配列番号：２３）
を次に示すが、本発明のペプチドはこれらに何ら限定さ
れるものではない。 式（１）Lys His Ile Cys Ile Cys Lys Lys （配列番
号：１） 式（２）Lys Lys Lys Lys His Ile Cys Ile Cys Lys Ly
s Lys Lys （配列番号：２） 式（３）Asp Asp Asp Asp Tyr Ile Cys Ile Cys Lys Ly
s Lys Lys Lys （配列番号：３） 式（４）Asn Asn Asn Asn His Leu Cys Ile Cys Lys Ly
s Lys Lys （配列番号：４） 式（５）Lys Lys Lys Ser Tyr Ile Cys Ile Cys Lys Ly
s Lys Lys （配列番号：５） 式（６）Asp Asp Lys Lys His Ile Cys Ile Cys Lys Ly
s Asp Asp （配列番号：６） 式（７）Asn Asn Lys Lys Phe Ile Cys Ile Cys Lys Ly
s Asn Asn （配列番号：７） 式（８）Lys Lys Lys Lys Lys Lys Lys Lys Lys Lys Hi
s Ile Cys Ile Cys LysLys Lys Lys （配列番号：８） 式（９）Lys Lys Lys Lys His Ile Cys Ile Cys Lys Ly
s Lys Lys Lys Lys LysLys Lys Lys Lys （配列番号：
９） 式（１０）Asp Lys Asp Lys Asp Lys Lys Lys Lys Lys
His Ile Cys Ile Cys Lys Lys Asn Lys （配列番号：１
０） 式（１１）Asp Asp Asp Asn Asn Asn Asn Asn Asn Asn
His Ile Cys Ile Cys Lys Lys Asp Lys Lys Lys Lys Ly
s Lys Lys Lys Lys （配列番号：１１） 式（１２）Lys His Ile Cys Ile Cys Lys Lys Lys （配
列番号：１２） 式（１３）Asp Lys His Ile Cys Ile Cys Lys Lys （配
列番号：１３） 式（１４）Lys Lys Lys Lys His Leu Cys Phe Cys Lys
Lys Lys Lys （配列番号：１４） 式（１５）Lys Lys Lys Lys Phe Arg Cys Val Cys His
Lys Lys （配列番号：１５） 式（１６）Lys Lys Lys Lys Val Leu Cys Phe Cys Lys
Lys Lys Lys （配列番号：１６） 式（１７）Lys Lys Lys Lys Tyr Leu Cys Ile Cys Arg
Lys Lys Lys （配列番号：１７） 式（１８）Lys Lys Lys Lys Phe Asp Cys Phe Cys Lys
Lys Lys Lys （配列番号：１８） 式（１９）Lys Lys Lys Lys Tyr Ile Cys Lys Cys Lys
Lys Lys Lys （配列番号：１９） 式（２０）Lys Lys Lys Lys Phe Ile Cys Lys Cys Lys
Lys Lys Lys （配列番号：２０） 式（２１）Lys Lys Lys His Ile Cys Ile Cys Ser Lys
Lys Lys （配列番号：２１） 式（２２）Lys Lys Lys Lys Lys Tyr Ile Cys Phe Cys
Ser Ser Ser Ser Ser （配列番号：２２） 式（２３）Ser Ser Lys Lys Lys Phe Arg Cys Thr Cys
Ser Ser Ser Lys （配列番号：２３）
【００１４】ペプチドは、公知の方法によって合成され
る。例えば、化学的合成法としては固相合成法、または
段階的伸張法、フラグメント縮合法のような液相合成法
などが用いられるが、固相合成法により行うのが操作上
簡便である。［Journal of the American Chemical Soc
iety 85 2149（1963）；日本生化学会編「生化学実験
講座１ タンパク質の化学IV 化学修飾とペプチド合
成」（昭和52年11月15日（株）東京化学同人発行）；日
本生化学会編「続生化学実験講座２ タンパク質の化学
（下）」（昭和62年５月20日（株）東京化学同人発行）
参照］。また、遺伝子操作による生物学的な合成法も可
能である。
る。例えば、化学的合成法としては固相合成法、または
段階的伸張法、フラグメント縮合法のような液相合成法
などが用いられるが、固相合成法により行うのが操作上
簡便である。［Journal of the American Chemical Soc
iety 85 2149（1963）；日本生化学会編「生化学実験
講座１ タンパク質の化学IV 化学修飾とペプチド合
成」（昭和52年11月15日（株）東京化学同人発行）；日
本生化学会編「続生化学実験講座２ タンパク質の化学
（下）」（昭和62年５月20日（株）東京化学同人発行）
参照］。また、遺伝子操作による生物学的な合成法も可
能である。
【００１５】ペプチドを人為的な方法（即ち、上記の固
相合成法、液相合成法、生物学的合成法等）で合成する
と、システイン残基のＳＨ基が還元状態で合成されてく
ることがある。この場合、公知の方法によってＳＨ基を
酸化させ、ジスルフィド結合を形成させることができ
る。本発明におけるペプチドも、求める効果を得るため
にＳＨ基を酸化させ、ジスルフィド結合を形成させる必
要がある。たとえば、ペプチドをアルカリ性の溶液また
は金属塩が存在する溶液に溶解した後、室温に４時間以
上放置することによりジスルフィド結合を形成させるこ
とができる。ペプチドを溶解する溶液としては、ｐＨ
８．０のトリス緩衝液などが好ましい。
相合成法、液相合成法、生物学的合成法等）で合成する
と、システイン残基のＳＨ基が還元状態で合成されてく
ることがある。この場合、公知の方法によってＳＨ基を
酸化させ、ジスルフィド結合を形成させることができ
る。本発明におけるペプチドも、求める効果を得るため
にＳＨ基を酸化させ、ジスルフィド結合を形成させる必
要がある。たとえば、ペプチドをアルカリ性の溶液また
は金属塩が存在する溶液に溶解した後、室温に４時間以
上放置することによりジスルフィド結合を形成させるこ
とができる。ペプチドを溶解する溶液としては、ｐＨ
８．０のトリス緩衝液などが好ましい。
【００１６】こうして得られる本発明のペプチドは、ヒ
ト血液の凝固を顕著に阻害することができる。従って、
医療において、血液に微量添加することにより、または
血液と接触する医療用具の材料の接触面に本発明のペプ
チドを固定化することにより、血液の凝固を防止するの
に有用である。即ち、使用に際して血液と接触する表面
に本発明のぺプチドを固定化することにより、血液の凝
固を防止するのに有用な抗血栓性医療材料を作成するこ
とができる。
ト血液の凝固を顕著に阻害することができる。従って、
医療において、血液に微量添加することにより、または
血液と接触する医療用具の材料の接触面に本発明のペプ
チドを固定化することにより、血液の凝固を防止するの
に有用である。即ち、使用に際して血液と接触する表面
に本発明のぺプチドを固定化することにより、血液の凝
固を防止するのに有用な抗血栓性医療材料を作成するこ
とができる。
【００１７】また、本発明において血液の凝固性は公知
の方法、即ち、活性化部分トロンボプラスチン時間、血
漿カルシウム再加時間又は全血凝固時間の測定により評
価することができる。具体的には、活性化部分トロンボ
プラスチン時間（以下、これをＡＰＴＴと略記すること
がある）は、ヒト血漿１００μｌ（ペプチドの効果を測
定する際には１５ｎモルのペプチドを加える。）をガラ
ス製試験管に加え、３７℃で１０分間インキュベーショ
ンした後、活性化部分トロンボプラスチン（オーソ社
製）１００μｌを加え、更に３分間インキュベーション
し、２５ｍＭ塩化カルシウム液１００μｌを加えた後、
凝固するまでの時間を測定することで求めることができ
る。また、血漿カルシウム再加時間は、ヒト血漿１００
μｌ（ペプチドの効果を測定する際には１５ｎモルのペ
プチドを加える。）をガラス製試験管に加え、３７℃で
１０分間インキュベーションし、２５ｍＭ塩化カルシウ
ム液１００μｌを加えた後、凝固するまでの時間を測定
することで求めることができる。全血凝固時間は、採血
直後のヒト全血１ｍｌ（ペプチドの効果を測定する際に
は１５０ｎモルのペプチドを加える。）をガラス製試験
管に入れ、凝固するまでの時間を測定することにより求
めることができる。
の方法、即ち、活性化部分トロンボプラスチン時間、血
漿カルシウム再加時間又は全血凝固時間の測定により評
価することができる。具体的には、活性化部分トロンボ
プラスチン時間（以下、これをＡＰＴＴと略記すること
がある）は、ヒト血漿１００μｌ（ペプチドの効果を測
定する際には１５ｎモルのペプチドを加える。）をガラ
ス製試験管に加え、３７℃で１０分間インキュベーショ
ンした後、活性化部分トロンボプラスチン（オーソ社
製）１００μｌを加え、更に３分間インキュベーション
し、２５ｍＭ塩化カルシウム液１００μｌを加えた後、
凝固するまでの時間を測定することで求めることができ
る。また、血漿カルシウム再加時間は、ヒト血漿１００
μｌ（ペプチドの効果を測定する際には１５ｎモルのペ
プチドを加える。）をガラス製試験管に加え、３７℃で
１０分間インキュベーションし、２５ｍＭ塩化カルシウ
ム液１００μｌを加えた後、凝固するまでの時間を測定
することで求めることができる。全血凝固時間は、採血
直後のヒト全血１ｍｌ（ペプチドの効果を測定する際に
は１５０ｎモルのペプチドを加える。）をガラス製試験
管に入れ、凝固するまでの時間を測定することにより求
めることができる。
【００１８】本発明におけるペプチドのＳＨ基の定量も
公知の方法で行うことができる。即ち、４，４’−ジチ
オピリジンを生食化リン酸緩衝液に１ｍｇ／ｍｌになる
ように溶解した溶液（以下、４ＰＤＳ液と略記すること
もある。）を作製する。０．１ｍｇ／ｍｌのペプチド溶
液２ｍｌに対して、当該４ＰＤＳ液２ｍｌを加え、直ち
に攪拌し、３２４ｎｍの吸光度を測定することによりペ
プチド中のＳＨ基量を求めることができる。
公知の方法で行うことができる。即ち、４，４’−ジチ
オピリジンを生食化リン酸緩衝液に１ｍｇ／ｍｌになる
ように溶解した溶液（以下、４ＰＤＳ液と略記すること
もある。）を作製する。０．１ｍｇ／ｍｌのペプチド溶
液２ｍｌに対して、当該４ＰＤＳ液２ｍｌを加え、直ち
に攪拌し、３２４ｎｍの吸光度を測定することによりペ
プチド中のＳＨ基量を求めることができる。
【００１９】本発明のぺプチドを固定化する抗血栓性医
療材料の基材としては、公知の医療用の基材である合成
樹脂等の高分子材料であれば問題なく、特に表面に水酸
基、アミノ基、カルボキシル基を有しているものが好ま
しい。また、表面にこれらの官能基を有しないものに、
表面処理により水酸基、アミノ基、カルボキシル基を導
入したものも使用することができる。
療材料の基材としては、公知の医療用の基材である合成
樹脂等の高分子材料であれば問題なく、特に表面に水酸
基、アミノ基、カルボキシル基を有しているものが好ま
しい。また、表面にこれらの官能基を有しないものに、
表面処理により水酸基、アミノ基、カルボキシル基を導
入したものも使用することができる。
【００２０】このような医療材料の基材としては、例え
ば、ポリウレタン類やポリ塩化ビニル類、ポリカーボネ
ート類、メチルメタクリレート等のアクリル類、または
ポリプロピレン等のポリオレフィン類、ナイロン等のポ
リアミド類、ポリスルホン類、セルロース、セルロース
アセテート等のセルロース類、エチレンービニルアルコ
ール等のポリビニルアルコール類を挙げることができ
る。
ば、ポリウレタン類やポリ塩化ビニル類、ポリカーボネ
ート類、メチルメタクリレート等のアクリル類、または
ポリプロピレン等のポリオレフィン類、ナイロン等のポ
リアミド類、ポリスルホン類、セルロース、セルロース
アセテート等のセルロース類、エチレンービニルアルコ
ール等のポリビニルアルコール類を挙げることができ
る。
【００２１】これらの基材を原料とした医療材料で製造
された、抗血栓性を有する医療用具としては、血液バッ
グ、血液回路、カテーテル、注射器、医療用容器、人工
血管、人工腎臓等の血液処理膜等を挙げることができ
る。
された、抗血栓性を有する医療用具としては、血液バッ
グ、血液回路、カテーテル、注射器、医療用容器、人工
血管、人工腎臓等の血液処理膜等を挙げることができ
る。
【００２２】また、本発明においては上記の抗血栓性医
療用具に限定されるものではなく、使用に際して血液と
接触することのある医療用の各種の素材に本発明のペプ
チドを固定化して抗血栓性材料としたものも本発明の態
様に含まれる。この場合、抗血栓性材料はそのままで、
あるいは所望の形状に加工して適宜使用することができ
る。
療用具に限定されるものではなく、使用に際して血液と
接触することのある医療用の各種の素材に本発明のペプ
チドを固定化して抗血栓性材料としたものも本発明の態
様に含まれる。この場合、抗血栓性材料はそのままで、
あるいは所望の形状に加工して適宜使用することができ
る。
【００２３】上記の抗血栓性医療材料の表面処理は、公
知の方法により行うことができる。例えば、酸素ガス、
または窒素ガスおよびアンモニアガスを含む気体中でプ
ラズマ処理する方法、または過マンガン酸塩を含む硫酸
溶液等で化学処理する方法が挙げられる。プラズマ処理
する方法は、医療材料を短時間で大量に処理することが
でき、さらにガス中で処理するために医療材料を清浄に
保つことができるため好ましい。化学処理する方法は、
複雑な形状を有するもの、容器内面などのプラズマ処理
できないものをも処理することができ、適用範囲が広
い。一般に使用に際して血液と接触する医療材料は、チ
ューブ、中空糸およびボトルなどの複雑な形状をしたも
のが多く、化学処理する方法が有利である。
知の方法により行うことができる。例えば、酸素ガス、
または窒素ガスおよびアンモニアガスを含む気体中でプ
ラズマ処理する方法、または過マンガン酸塩を含む硫酸
溶液等で化学処理する方法が挙げられる。プラズマ処理
する方法は、医療材料を短時間で大量に処理することが
でき、さらにガス中で処理するために医療材料を清浄に
保つことができるため好ましい。化学処理する方法は、
複雑な形状を有するもの、容器内面などのプラズマ処理
できないものをも処理することができ、適用範囲が広
い。一般に使用に際して血液と接触する医療材料は、チ
ューブ、中空糸およびボトルなどの複雑な形状をしたも
のが多く、化学処理する方法が有利である。
【００２４】酸素ガス中でプラズマ処理した場合には、
主に水酸基が表面に導入され、窒素ガスおよびアンモニ
アガス中でプラズマ処理した場合には、主にアミノ基が
表面に導入され、過マンガン酸塩を含む硫酸溶液等で化
学処理した場合には、主に水酸基とカルボキシル基が導
入される。
主に水酸基が表面に導入され、窒素ガスおよびアンモニ
アガス中でプラズマ処理した場合には、主にアミノ基が
表面に導入され、過マンガン酸塩を含む硫酸溶液等で化
学処理した場合には、主に水酸基とカルボキシル基が導
入される。
【００２５】上記のように処理すれば、両末端にエポキ
シ基を有する試薬、エポキン基を有するシランカップリ
ング剤等を介して、基材表面にぺプチドを固定化するこ
とができる。基材表面に水酸基が存在する場合には、両
末端にエポキシ基を有する試薬やエポキシ基を有するシ
ランカップリング剤を用いることにより共有結合で固定
化でき、基材表面にアミノ基やカルボキシル基が存在す
る場合には、両末端にエポキシ基を有する試薬を用いる
ことにより同様に共有結合で固定化することが可能であ
る。
シ基を有する試薬、エポキン基を有するシランカップリ
ング剤等を介して、基材表面にぺプチドを固定化するこ
とができる。基材表面に水酸基が存在する場合には、両
末端にエポキシ基を有する試薬やエポキシ基を有するシ
ランカップリング剤を用いることにより共有結合で固定
化でき、基材表面にアミノ基やカルボキシル基が存在す
る場合には、両末端にエポキシ基を有する試薬を用いる
ことにより同様に共有結合で固定化することが可能であ
る。
【００２６】具体的には、シランカップリング剤を用い
る場合には、通常エポキシ基を有するシランカップリン
グ剤（例えば、（３−グリシドキシプロピル）トリメト
キシシラン）の０．５〜５％溶液（水または有機溶媒溶
液）に高分子材料を１〜３０分接触させ、それを１分〜
２日間加熱乾燥後、架橋していないシランカップリング
剤を洗浄除去し、エポキシ基を導入した高分子材料を作
製する。また両末端にエポキシ基を有する試薬を用いる
場合には、両末端にエポキシ基を有する試薬（例えば、
１，４−ブタンジオールジグリシジルエーテル）の１〜
２０％水溶液（ｐＨ１０〜１３）に高分子材料を１時間
〜２日間接触させ、そのあと洗浄し、エポキシ基を導入
した高分子材料を作製する。
る場合には、通常エポキシ基を有するシランカップリン
グ剤（例えば、（３−グリシドキシプロピル）トリメト
キシシラン）の０．５〜５％溶液（水または有機溶媒溶
液）に高分子材料を１〜３０分接触させ、それを１分〜
２日間加熱乾燥後、架橋していないシランカップリング
剤を洗浄除去し、エポキシ基を導入した高分子材料を作
製する。また両末端にエポキシ基を有する試薬を用いる
場合には、両末端にエポキシ基を有する試薬（例えば、
１，４−ブタンジオールジグリシジルエーテル）の１〜
２０％水溶液（ｐＨ１０〜１３）に高分子材料を１時間
〜２日間接触させ、そのあと洗浄し、エポキシ基を導入
した高分子材料を作製する。
【００２７】このようにして作製した高分子材料に０．
００１〜２％ぺプチド水溶液（ｐＨ１０〜１２）を１時
間〜２日間接触させ、ぺプチドのアミノ基またはカルボ
キシル基と高分子材料に導入されたエポキシ基とを共有
結合し、ぺプチド固定化材料を得る。本発明のぺプチド
の固定化量は、特に限定されるものではないが、通常１
ｃｍ2 当たり０．０１ｎモル〜２０ｎモルであり、好ま
しくは０．１ｎモル〜５ｎモルである。
００１〜２％ぺプチド水溶液（ｐＨ１０〜１２）を１時
間〜２日間接触させ、ぺプチドのアミノ基またはカルボ
キシル基と高分子材料に導入されたエポキシ基とを共有
結合し、ぺプチド固定化材料を得る。本発明のぺプチド
の固定化量は、特に限定されるものではないが、通常１
ｃｍ2 当たり０．０１ｎモル〜２０ｎモルであり、好ま
しくは０．１ｎモル〜５ｎモルである。
【００２８】
【実施例】以下、本発明を実施例、比較例および参考例
に基づいて説明するが、本発明はこれらの実施例等によ
りなんら限定されるものではない。 実施例１ Lys His Ile Cys Ile Cys Lys Lys （配列番号：１）を
以下に示す方法で合成した。ペプチドの合成は自動ぺプ
チド合成装置（米国アプライドバイオシステムズ社製）
を用いて固相合成法により合成した。ベンジルオキシべ
ンジルアルコールタイプ樹脂にＦｍｏｃ−Lys を結合さ
せたＦｍｏｃ−Lys （Ｂｏｃ）−レジン（島津社製）を
０．２９ｇ用い、これに表１に示す一連の操作に従っ
て、目的とするペプチドのＣ末端側からＮ末端方向に向
かって対応する順序で結合させた。尚、本実施例、及び
以下の実施例、比較例において用いたアミノ酸は、全て
Ｌ−アミノ酸で、α位アミノ基をＦｍｏｃ（９−フルオ
レニルメトキシカルボニル）基で保護されたものであ
り、更に他の置換基の保護を必要とするアミノ酸につい
ては、Arg は４−メトキシ−２，３，６−トリメチルベ
ンゼンスルホニル（Ｍｔｒ）基、 Asp、Cys 、Ser はｔ
−プチル（ｔＢｕ）基、His はトリチル（Ｔｒｔ）基、
Lys はｔ−ブトキシカルボニル（Ｂｏｃ）基でそれぞれ
保護されたもの（ペプチド研究所製）を用いた。
に基づいて説明するが、本発明はこれらの実施例等によ
りなんら限定されるものではない。 実施例１ Lys His Ile Cys Ile Cys Lys Lys （配列番号：１）を
以下に示す方法で合成した。ペプチドの合成は自動ぺプ
チド合成装置（米国アプライドバイオシステムズ社製）
を用いて固相合成法により合成した。ベンジルオキシべ
ンジルアルコールタイプ樹脂にＦｍｏｃ−Lys を結合さ
せたＦｍｏｃ−Lys （Ｂｏｃ）−レジン（島津社製）を
０．２９ｇ用い、これに表１に示す一連の操作に従っ
て、目的とするペプチドのＣ末端側からＮ末端方向に向
かって対応する順序で結合させた。尚、本実施例、及び
以下の実施例、比較例において用いたアミノ酸は、全て
Ｌ−アミノ酸で、α位アミノ基をＦｍｏｃ（９−フルオ
レニルメトキシカルボニル）基で保護されたものであ
り、更に他の置換基の保護を必要とするアミノ酸につい
ては、Arg は４−メトキシ−２，３，６−トリメチルベ
ンゼンスルホニル（Ｍｔｒ）基、 Asp、Cys 、Ser はｔ
−プチル（ｔＢｕ）基、His はトリチル（Ｔｒｔ）基、
Lys はｔ−ブトキシカルボニル（Ｂｏｃ）基でそれぞれ
保護されたもの（ペプチド研究所製）を用いた。
【００２９】
【表１】
【００３０】全てのアミノ酸についての反応操作が終了
した後、得られた樹脂をグラスフィルター上でジクロロ
メタン及びメタノールを用いて順次洗浄し、次いで真空
乾燥することにより約６００ｍｇの乾燥樹脂を得た。バ
イアル瓶中で乾燥樹脂６００ｍｇとトリフルオロ酢酸１
０ｍｌ、水０．５ｍｌ、チオアニソール０．５ｍｌ、エ
タンジオール０．２５ｍｌおよびフェノール０．７５ｇ
を混合した。室温で２０時間放置後混合物をグラスフィ
ルターで濾過し、濾液にジエチルエーテルを加え遠心分
離することにより白い沈殿物を得た。得られた沈殿物を
真空乾燥した後、２規定の酢酸水溶液で抽出し、抽出液
を凍結乾燥することによりぺプチドを得た。
した後、得られた樹脂をグラスフィルター上でジクロロ
メタン及びメタノールを用いて順次洗浄し、次いで真空
乾燥することにより約６００ｍｇの乾燥樹脂を得た。バ
イアル瓶中で乾燥樹脂６００ｍｇとトリフルオロ酢酸１
０ｍｌ、水０．５ｍｌ、チオアニソール０．５ｍｌ、エ
タンジオール０．２５ｍｌおよびフェノール０．７５ｇ
を混合した。室温で２０時間放置後混合物をグラスフィ
ルターで濾過し、濾液にジエチルエーテルを加え遠心分
離することにより白い沈殿物を得た。得られた沈殿物を
真空乾燥した後、２規定の酢酸水溶液で抽出し、抽出液
を凍結乾燥することによりぺプチドを得た。
【００３１】得られたぺプチドを分取用高速液体クロマ
トグラフィー［装置：ミリポアウォータズ社製］で精製
した。得られたぺプチドについてＦＡＢ法マススぺクト
ルにより求めた分子量は９７１（理論値は９７２．３）
であった。得られたペプチドをｐＨ８．０のトリス緩衝
液（１００ｍＭ ＮａＣｌ、５０ｍＭ トリス−ＨＣ
ｌ、１０ｍＭ ＣａＣｌ2 ）に溶解させて２４時間放置
し、ジスルフィド結合を形成させた。このペプチドのCy
s 残基のＳＨ基を定量したところ、１分子あたり０．２
〜０．３であり、ジスルフィド結合が形成されているこ
とが確認できた。このぺプチド１５ｎモルをヒト血漿１
００μｌに加え、血漿カルシウム再加時間を測定した結
果、２９２秒であった。また全血凝固時間（全血１ｍｌ
に対し１５０ｎモルのペプチドを加えた。）は７２０
秒、ＡＰＴＴは７０秒以上であった。この結果は下記参
考例１の結果と比較すると、本発明のぺプチド（配列番
号：１）が血液凝固を顕著に阻害することを示してい
る。尚、ペプチド中のＳＨ基量は、０．１ｍｇ／ｍｌの
ペプチド溶液２ｍｌに対して４ＰＤＳ液２ｍｌを加え、
直ちに攪拌し、３２４ｎｍの吸光度を測定することによ
り求めた。
トグラフィー［装置：ミリポアウォータズ社製］で精製
した。得られたぺプチドについてＦＡＢ法マススぺクト
ルにより求めた分子量は９７１（理論値は９７２．３）
であった。得られたペプチドをｐＨ８．０のトリス緩衝
液（１００ｍＭ ＮａＣｌ、５０ｍＭ トリス−ＨＣ
ｌ、１０ｍＭ ＣａＣｌ2 ）に溶解させて２４時間放置
し、ジスルフィド結合を形成させた。このペプチドのCy
s 残基のＳＨ基を定量したところ、１分子あたり０．２
〜０．３であり、ジスルフィド結合が形成されているこ
とが確認できた。このぺプチド１５ｎモルをヒト血漿１
００μｌに加え、血漿カルシウム再加時間を測定した結
果、２９２秒であった。また全血凝固時間（全血１ｍｌ
に対し１５０ｎモルのペプチドを加えた。）は７２０
秒、ＡＰＴＴは７０秒以上であった。この結果は下記参
考例１の結果と比較すると、本発明のぺプチド（配列番
号：１）が血液凝固を顕著に阻害することを示してい
る。尚、ペプチド中のＳＨ基量は、０．１ｍｇ／ｍｌの
ペプチド溶液２ｍｌに対して４ＰＤＳ液２ｍｌを加え、
直ちに攪拌し、３２４ｎｍの吸光度を測定することによ
り求めた。
【００３２】参考例１ 本発明のペプチドを添加していないヒト血漿の血漿カル
シウム再加時間は１２４秒、全血凝固時間は３３０秒、
ＡＰＴＴは２６秒であった。
シウム再加時間は１２４秒、全血凝固時間は３３０秒、
ＡＰＴＴは２６秒であった。
【００３３】以下の実施例において、ペプチド合成は、
実施例１のＦｍｏｃ−Lys （Ｂｏｃ）−レジンの代わり
にそれぞれのペプチドのＣ末端のアミノ基をすでに結合
させたベンジルオキシベンジルアルコール樹脂（島津
製、例えば実施例６の場合はＦｍｏｃ−Asp −レジン）
を用いて行ない、他の合成操作及び前述のジスルフィド
結合を形成させる操作は実施例１と同様である。
実施例１のＦｍｏｃ−Lys （Ｂｏｃ）−レジンの代わり
にそれぞれのペプチドのＣ末端のアミノ基をすでに結合
させたベンジルオキシベンジルアルコール樹脂（島津
製、例えば実施例６の場合はＦｍｏｃ−Asp −レジン）
を用いて行ない、他の合成操作及び前述のジスルフィド
結合を形成させる操作は実施例１と同様である。
【００３４】実施例２〜２３ 表２、表３のアミノ酸配列からなるペプチドを合成し、
実施例１と同様にしてジスルフィド結合を形成させた
後、血漿カルシウム再加時間、全血凝固時間およびＡＰ
ＴＴを測定した。その結果を表２及び表３に示す。
実施例１と同様にしてジスルフィド結合を形成させた
後、血漿カルシウム再加時間、全血凝固時間およびＡＰ
ＴＴを測定した。その結果を表２及び表３に示す。
【００３５】
【表２】
【００３６】
【表３】
【００３７】比較例１ 表４のアミノ酸配列からなるペプチドを合成し、実施例
１と同様にしてジスルフィド結合を形成させた後、血漿
カルシウム再加時間及び全血凝固時間を測定した。その
結果を表４に示す。
１と同様にしてジスルフィド結合を形成させた後、血漿
カルシウム再加時間及び全血凝固時間を測定した。その
結果を表４に示す。
【００３８】
【表４】
【００３９】ここで実施例２、６、８〜１３の例から、
ＸおよびＹが酸性アミノ酸残基、塩基性アミノ酸残基、
非荷電極性アミノ酸残基からなる群より選択される単一
のアミノ酸残基またはこれらのアミノ酸残基の２〜１０
個から構成されるペプチド断片であれば効果を発現する
ことが分かる。
ＸおよびＹが酸性アミノ酸残基、塩基性アミノ酸残基、
非荷電極性アミノ酸残基からなる群より選択される単一
のアミノ酸残基またはこれらのアミノ酸残基の２〜１０
個から構成されるペプチド断片であれば効果を発現する
ことが分かる。
【００４０】また、Ａ１、Ａ２、Ａ３、Ａ４のアミノ酸
残基を変えて合成した実施例１４〜２３、実施例２及び
比較例１から、Ａ１が中性または塩基性アミノ酸残基、
Ａ２が任意のアミノ酸残基、Ａ３が中性または塩基性ア
ミノ酸残基、Ａ４が塩基性アミノ酸残基または非荷電極
性アミノ酸残基であれば効果を発現することが分かる。
残基を変えて合成した実施例１４〜２３、実施例２及び
比較例１から、Ａ１が中性または塩基性アミノ酸残基、
Ａ２が任意のアミノ酸残基、Ａ３が中性または塩基性ア
ミノ酸残基、Ａ４が塩基性アミノ酸残基または非荷電極
性アミノ酸残基であれば効果を発現することが分かる。
【００４１】比較例２ 実施例２のペプチドを、前述のジスルフィド結合を形成
させる操作を行うことなく、生食化リン酸緩衝液（ｐＨ
７．４）に溶解し、溶解後すみやかに実施例２と同様の
ペプチド濃度で血漿カルシウム再加時間の測定を行なっ
た結果１２９秒であった。このときのペプチドのCys 残
基のＳＨ基を定量した結果、１分子あたり１．９であ
り、ジスルフィド結合はほとんど形成されていなかっ
た。
させる操作を行うことなく、生食化リン酸緩衝液（ｐＨ
７．４）に溶解し、溶解後すみやかに実施例２と同様の
ペプチド濃度で血漿カルシウム再加時間の測定を行なっ
た結果１２９秒であった。このときのペプチドのCys 残
基のＳＨ基を定量した結果、１分子あたり１．９であ
り、ジスルフィド結合はほとんど形成されていなかっ
た。
【００４２】比較例３ 実施例１６のペプチドを、前述のジスルフィド結合を形
成させる操作を行うことなく、生食化リン酸緩衝液（ｐ
Ｈ７．４）に溶解し、溶解後すみやかに実施例１６と同
様のペプチド濃度で血漿カルシウム再加時間の測定を行
なった結果１２７秒であった。このときのペプチドのCy
s 残基のＳＨ基を定量した結果、１分子あたり１．９で
あり、ジスルフィド結合はほとんど形成されていなかっ
た。以上、比較例１、２の結果は、ジスルフィド結合が
本発明のペプチドにおいて抗血栓性作用発現に必要であ
ることを示している。
成させる操作を行うことなく、生食化リン酸緩衝液（ｐ
Ｈ７．４）に溶解し、溶解後すみやかに実施例１６と同
様のペプチド濃度で血漿カルシウム再加時間の測定を行
なった結果１２７秒であった。このときのペプチドのCy
s 残基のＳＨ基を定量した結果、１分子あたり１．９で
あり、ジスルフィド結合はほとんど形成されていなかっ
た。以上、比較例１、２の結果は、ジスルフィド結合が
本発明のペプチドにおいて抗血栓性作用発現に必要であ
ることを示している。
【００４３】比較例４ Lys Lys Lys Lys Gly Gly Gly Gly Lys Lys Lys Lys
（配列番号：２７）のペプチドを合成し、実施例１と同
様の方法で血漿カルシウム再加凝固時間の測定を行なっ
た結果１２４秒であった。このことは、Lys の存在のみ
では抗血栓性作用は発現しないことを示している。
（配列番号：２７）のペプチドを合成し、実施例１と同
様の方法で血漿カルシウム再加凝固時間の測定を行なっ
た結果１２４秒であった。このことは、Lys の存在のみ
では抗血栓性作用は発現しないことを示している。
【００４４】実施例２４ 内径１０ｍｍの塩化ビニル製のチューブ内面を、０．４
％過マンガン酸カリウムを含む濃硫酸溶液で処理（２５
℃で５分間浸漬）した後、蒸留水で３０分間洗浄した。
この処理により、チューブ内面には水酸基が導入された
ことがＸ線光電子分光法（ＥＳＣＡ法）で確認された。
次に、２％（３−グリシドキシプロピル）トリメトキシ
シラン水溶液をチューブ内面に２５℃で５分間接触させ
た後、５０℃で２時間乾燥させ、蒸留水で２時間洗浄し
た。実施例１６で得られた配列番号：１６のペプチド１
０ｍｇを蒸留水１０ｍｌに溶解しｐＨを１１に調整して
得た液をチューブ内に入れ、３７℃で１２時間放置し
て、ペプチド固定化チューブを得た。このチューブを１
０ｃｍの長さに切り、その片端を閉じて試験用のチュー
ブを作製した。その中に健常人の新鮮血２ｍｌを注ぎ、
２５℃において３０秒毎に血液の状態を観察し、血液の
流動性が失われる時間（凝固時間）を測定したところ、
約２０分であった。この結果と比較例４の結果とを比較
すると、本発明のペプチド固定化チューブの血液凝固阻
害能は顕著であるといえる。
％過マンガン酸カリウムを含む濃硫酸溶液で処理（２５
℃で５分間浸漬）した後、蒸留水で３０分間洗浄した。
この処理により、チューブ内面には水酸基が導入された
ことがＸ線光電子分光法（ＥＳＣＡ法）で確認された。
次に、２％（３−グリシドキシプロピル）トリメトキシ
シラン水溶液をチューブ内面に２５℃で５分間接触させ
た後、５０℃で２時間乾燥させ、蒸留水で２時間洗浄し
た。実施例１６で得られた配列番号：１６のペプチド１
０ｍｇを蒸留水１０ｍｌに溶解しｐＨを１１に調整して
得た液をチューブ内に入れ、３７℃で１２時間放置し
て、ペプチド固定化チューブを得た。このチューブを１
０ｃｍの長さに切り、その片端を閉じて試験用のチュー
ブを作製した。その中に健常人の新鮮血２ｍｌを注ぎ、
２５℃において３０秒毎に血液の状態を観察し、血液の
流動性が失われる時間（凝固時間）を測定したところ、
約２０分であった。この結果と比較例４の結果とを比較
すると、本発明のペプチド固定化チューブの血液凝固阻
害能は顕著であるといえる。
【００４５】比較例５ 本発明のペプチドによる表面処理をしていない内径１０
ｍｍの塩化ビニル製のチューブを１０ｃｍの長さに切
り、その片端を閉じて試験用のチューブを作製した。そ
の中に健常人の新鮮血２ｍｌを注ぎ、実施例２４と同様
の方法で凝固時間を測定したところ、約１２分であっ
た。
ｍｍの塩化ビニル製のチューブを１０ｃｍの長さに切
り、その片端を閉じて試験用のチューブを作製した。そ
の中に健常人の新鮮血２ｍｌを注ぎ、実施例２４と同様
の方法で凝固時間を測定したところ、約１２分であっ
た。
【００４６】実施例２５ 実施例１６で合成した、前述のジスルフィド結合を形成
させる操作を行ったペプチドをオートクレーブ滅菌（１
２１℃、３０分間）した後、ペプチド１５ｎモルをヒト
血漿１００μｌに加えたところ、血漿カルシウム再加時
間は３００秒以上、全血凝固時間は７５０秒であった。
この結果は、本発明のペプチド（配列番号：１６）が１
２１℃、３０分間の条件下でも血液凝固阻害活性をほぼ
完全に保持していることを示す。この性質は、本発明の
ペプチドを血液と接触させる前に滅菌処理することを可
能とするものであり、また使用前の滅菌処理を不可欠と
する医療用具に固定化して使用する場合にも極めて有利
な特長といえる。
させる操作を行ったペプチドをオートクレーブ滅菌（１
２１℃、３０分間）した後、ペプチド１５ｎモルをヒト
血漿１００μｌに加えたところ、血漿カルシウム再加時
間は３００秒以上、全血凝固時間は７５０秒であった。
この結果は、本発明のペプチド（配列番号：１６）が１
２１℃、３０分間の条件下でも血液凝固阻害活性をほぼ
完全に保持していることを示す。この性質は、本発明の
ペプチドを血液と接触させる前に滅菌処理することを可
能とするものであり、また使用前の滅菌処理を不可欠と
する医療用具に固定化して使用する場合にも極めて有利
な特長といえる。
【００４７】
【発明の効果】本発明のペプチドは、血液凝固に対する
高い阻害活性を有しており、この活性は滅菌条件下でも
極めて安定であり、医薬品用途または医療用具の抗血栓
化処理用途に使用する医療材料に適している。また、本
発明の上記ペプチドを固定化した医療材料を用いた抗血
栓性医療用具も、高い抗凝固活性と安定性を有してお
り、カテーテル、血液回路、血液バッグ、血液透析膜、
人工血管等のように、長期にわたって血液と接触して使
用されるあらゆる医療用具として好適なものである。
高い阻害活性を有しており、この活性は滅菌条件下でも
極めて安定であり、医薬品用途または医療用具の抗血栓
化処理用途に使用する医療材料に適している。また、本
発明の上記ペプチドを固定化した医療材料を用いた抗血
栓性医療用具も、高い抗凝固活性と安定性を有してお
り、カテーテル、血液回路、血液バッグ、血液透析膜、
人工血管等のように、長期にわたって血液と接触して使
用されるあらゆる医療用具として好適なものである。
【００４８】
【配列表】配列番号：１ 配列の長さ：８ 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド
【００４９】配列番号：２ 配列の長さ：１３ 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド 配列 Lys Lys Lys Lys His Ile Cys Ile Cys Lys Lys Lys Lys 1 5 10
【００５０】配列番号：３ 配列の長さ：１４ 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド 配列 Asp Asp Asp Asp Tyr Ile Cys Ile Cys Lys Lys Lys Lys Lys 1 5 10
【００５１】配列番号：４ 配列の長さ：１３ 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド 配列 Asn Asn Asn Asn His Leu Cys Ile Cys Lys Lys Lys Lys 1 5 10
【００５２】配列番号：５ 配列の長さ：１３ 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド 配列 Lys Lys Lys Ser Tyr Ile Cys Ile Cys Lys Lys Lys Lys 1 5 10
【００５３】配列番号：６ 配列の長さ：１３ 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド 配列 Asp Asp Lys Lys His Ile Cys Ile Cys Lys Lys Asp Asp 1 5 10
【００５４】配列番号：７ 配列の長さ：１３ 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド 配列 Asn Asn Lys Lys Phe Ile Cys Ile Cys Lys Lys Asn Asn 1 5 10
【００５５】配列番号：８ 配列の長さ：１９ 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド 配列 Lys Lys Lys Lys Lys Lys Lys Lys Lys Lys His Ile Cys Ile Cys Lys 1 5 10 15 Lys Lys Lys
【００５６】配列番号：９ 配列の長さ：２０ 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド 配列 Lys Lys Lys Lys His Ile Cys Ile Cys Lys Lys Lys Lys Lys Lys Lys 1 5 10 15 Lys Lys Lys Lys 20
【００５７】配列番号：１０ 配列の長さ：１９ 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド 配列 Asp Lys Asp Lys Asp Lys Lys Lys Lys Lys His Ile Cys Ile Cys Lys 1 5 10 15 Lys Asn Lys
【００５８】配列番号：１１ 配列の長さ：２７ 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド 配列 Asp Asp Asp Asn Asn Asn Asn Asn Asn Asn His Ile Cys Ile Cys Lys 1 5 10 15 Lys Asp Lys Lys Lys Lys Lys Lys Lys Lys Lys 20 25
【００５９】配列番号：１２ 配列の長さ：９ 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド
【００６０】配列番号：１３ 配列の長さ：９ 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド
【００６１】配列番号：１４ 配列の長さ：１３ 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド 配列 Lys Lys Lys Lys His Leu Cys Phe Cys Lys Lys Lys Lys 1 5 10
【００６２】配列番号：１５ 配列の長さ：１２ 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド
【００６３】配列番号：１６ 配列の長さ：１３ 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド 配列 Lys Lys Lys Lys Val Leu Cys Phe Cys Lys Lys Lys Lys 1 5 10
【００６４】配列番号：１７ 配列の長さ：１３ 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド 配列 Lys Lys Lys Lys Tyr Leu Cys Ile Cys Arg Lys Lys Lys 1 5 10
【００６５】配列番号：１８ 配列の長さ：１３ 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド 配列 Lys Lys Lys Lys Phe Asp Cys Phe Cys Lys Lys Lys Lys 1 5 10
【００６６】配列番号：１９ 配列の長さ：１３ 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド 配列 Lys Lys Lys Lys Tyr Ile Cys Lys Cys Lys Lys Lys Lys 1 5 10
【００６７】配列番号：２０ 配列の長さ：１３ 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド 配列 Lys Lys Lys Lys Phe Ile Cys Lys Cys Lys Lys Lys Lys 1 5 10
【００６８】配列番号：２１ 配列の長さ：１２ 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド
【００６９】配列番号：２２ 配列の長さ：１５ 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド 配列 Lys Lys Lys Lys Lys Tyr Ile Cys Phe Cys Ser Ser Ser Ser Ser 1 5 10 15
【００７０】配列番号：２３ 配列の長さ：１４ 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド 配列 Ser Ser Lys Lys Lys Phe Arg Cys Thr Cys Ser Ser Ser Lys 1 5 10
【００７１】配列番号：２４ 配列の長さ：１３ 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド 配列 Lys Lys Lys Lys Asp Ile Cys Ile Cys Lys Lys Lys Lys 1 5 10
【００７２】配列番号：２５ 配列の長さ：１３ 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド 配列 Lys Lys Lys Lys His Ile Cys Asp Cys Lys Lys Lys Lys 1 5 10
【００７３】配列番号：２６ 配列の長さ：１３ 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド 配列 Lys Lys Lys Lys His Ile Cys Ile Cys Asp Lys Lys Lys 1 5 10
【００７４】配列番号：２７ 配列の長さ：１２ 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ｃ０７Ｋ 17/08
Claims (2)
- 【請求項１】 一般式： Ｈ−Ｘ−Ａ１−Ａ２−Ｃｙｓ−Ａ３−Ｃｙｓ−Ａ４−Ｙ
−Ｚ （式中、ＸおよびＹは酸性アミノ酸残基、塩基性アミノ
酸残基、非荷電極性アミノ酸残基からなる群より選択さ
れる単一のアミノ酸残基を又はこれらのアミノ酸残基の
２〜１０個から構成されるペプチド断片を表わす。Ａ１
は中性アミノ酸残基又は塩基性アミノ酸残基、Ａ２は任
意のアミノ酸残基、Ａ３は中性アミノ酸残基又は塩基性
アミノ酸残基、Ａ４は塩基性アミノ酸残基又は非荷電極
性アミノ酸残基を表わし、Ｚは水酸基またはアミノ基を
表わす。）で表され、かつ、Ａ２とＡ３の間のＣｙｓ残
基、Ａ３とＡ４の間のＣｙｓ残基がジスルフィド結合し
ていることを特徴とするペプチド。 - 【請求項２】 請求項１記載のペプチドを血液接触部に
固定化した医療材料。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP7172737A JPH0859694A (ja) | 1994-06-15 | 1995-06-14 | ペプチドおよびこれを固定化した医療材料 |
Applications Claiming Priority (3)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP6-158015 | 1994-06-15 | ||
| JP15801594 | 1994-06-15 | ||
| JP7172737A JPH0859694A (ja) | 1994-06-15 | 1995-06-14 | ペプチドおよびこれを固定化した医療材料 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH0859694A true JPH0859694A (ja) | 1996-03-05 |
Family
ID=26485277
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP7172737A Pending JPH0859694A (ja) | 1994-06-15 | 1995-06-14 | ペプチドおよびこれを固定化した医療材料 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPH0859694A (ja) |
-
1995
- 1995-06-14 JP JP7172737A patent/JPH0859694A/ja active Pending
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