JPH0733337B2

JPH0733337B2 - 血小板のコラーゲンへの付着をブロックする方法

Info

Publication number: JPH0733337B2
Application number: JP3296808A
Authority: JP
Inventors: エム．コノリートマス; カルチュウスキジャーツィ
Original assignee: Merck and Co Inc
Current assignee: Merck and Co Inc
Priority date: 1990-11-13
Filing date: 1991-11-13
Publication date: 1995-04-12
Anticipated expiration: 2010-04-12
Also published as: JPH04305532A; US5179082A; CA2055146A1; EP0487238A3; EP0487238A2

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】内皮下層に見出されるコラーゲンは、損傷
を受けるか疾患にかかった血管壁の部位で血液に提示さ
れる最初の血栓形成刺激であると考えられる。インビト
ロにおいて、コラーゲンは、血小板の付着と凝集、そし
てそれにつづく血小板の活性化の両方を促進する。

【０００２】エキスタチン（Echistatin) と、それがフ
ィブリノーゲン受容体糖タンパク質IIｂ／IIIaに結合す
ることによって血小板凝集を阻害する能力について、Ga
n ら(J. Biol. Chem. 263 、pp.19827〜19832 (198
8))、Garskyら (Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86 、pp.
4022 〜4026、(1989)）及びGan ら（Gene 79 、pp.159
〜166(1989））が述べている。

【０００３】Simonideszらは、米国特許第4,520,018号
で、ＡＤＰ、アラキジン酸又はコラーゲンによって誘発
される血小板凝固を阻害して血液循環を促進させる５位
置換−４−オキソＰＧＩ１誘導体について述べている。

【０００４】Coanは、米国特許第4,229,540 号で、ヒト
の血漿に見られる、ＡＤＰ、エピネフリン、又はコラー
ゲンによって誘発される血小板凝固を阻害する加水分解
酵素について述べている。

【０００５】Ruoslahti らは、米国特許第4,578,079号
で、フィブロネクチンの主要な細胞結合部位が短かいア
ミノ酸配列 Arg-Gly-Asp-Serであり、これが、少くとも
接着タンパクの１つであるコラーゲンにも存在すること
を述べている。

【０００６】本発明は、血小板のコラーゲンへの付着を
ブロックすることによってコラーゲンによって刺激され
る血小板の活性化を阻害する組成物であって以下の配列
を有するポリペプチドから成る。すなわち： NH₂(Ch) Ala Arg Gly Asp (Cx) COOH (i) NH₂(Ch) Ala Ala Gly Asp (Cx) COOH (ii) NH₂(Ch) Ala Arg Tyr Asp (Cx) COOH (iii) NH₂(Ch) Ala Arg Gly Asp (Cy) Z (iv) 配列中、Chは、 Glu Cys Glu Ser Gly Pro Cys Cys ArgAsn Cys Lys Phe Leu Lys Glu Gly Thr Ile Cys Lys Arg 又は、その保存的アミノ酸置換体；Cxは、 Asp Met Asp Asp Tyr Cys Asn Gly LysThr Cys Asp Cys Pro Arg Asn Pro His Lys Gly Pro Ala Thr 又は、その保存的アミノ酸置換体；Cyは、 Asp Met Asp Asp Tyr Cys Asn Gly LysThr Cys Asp Cys 又は：その保存的アミノ酸置換体；そしてＺは、NH₂又
はCOOHである。

【０００７】本発明は、また、この組成物を用いてコラ
ーゲンによって刺激される血小板の活性化を阻害する方
法を包含する。

【０００８】本発明は、また、哺乳類においてコラーゲ
ンによって刺激される血小板の活性化を阻害する組成
物、及び、この化合物を哺乳類に投与することから成
る、哺乳類におけるコラーゲンによって刺激される血小
板の活性化を阻害する方法を包含する。この化合物は以
下の配列を有するポリペプチドから成る。すなわち： NH₂(Ch) Ala Arg Gly Asp (Cx) COOH (i) NH₂(Ch) Ala Ala Gly Asp (Cx) COOH (ii) NH₂(Ch) Ala Arg Tyr Asp (Cx) COOH (iii) NH₂(Ch) Ala Arg Gly Asp (Cy) Z (iv) 配列中、Chは、 Glu Cys Glu Ser Gly Pro Cys Cys ArgAsn Cys Lys Phe Leu Lys Glu Gly Thr Ile Cys Lys Arg 又は、その保存的アミノ酸置換体；Cxは、 Asp Met Asp Asp Tyr Cys Asn Gly LysThr Cys Asp Cys Pro Arg Asn Pro His Lys Gly Pro Ala Thr 又は、その保存的アミノ酸置換体；Cyは、 Asp Met Asp Asp Tyr Cys Asn Gly LysThr Cys Asp Cys 又は、その保存的アミノ酸置換体；そしてＺは、NH₂又
はCOOHである。

【０００９】血小板のコラーゲンの付着を阻害する好適
なポリペプチドは、配列番号１、２、３、４、及び５で
同定されるものである。配列１〜３は、アミノ酸１（Gl
u)の末端アミノ基と、アミノ酸４９（Thr)の末端カルボ
キシル基を含む。配列４は、アミノ酸１（Glu)の末端ア
ミノ基とアミノ酸３９（Cys)の末端カルボキシル基を含
む。配列５は、アミノ酸１（Glu)の末端アミノ基とアミ
ノ酸３９（Cys)の末端アミノ基を含む。ポリペプチド配
列２、３、４、及び５は、（血小板のフィブリノゲンへ
の付着を阻害することに対して）選択的に血小板のコラ
ーゲンへの付着を阻害するのにより好ましい。ポリペプ
チド配列５はもっとも好ましい。

【００１０】本発明に役立つポリペプチドは、通常、Me
rrifield(J. Am. Chem. Soc., 85、2149(1964)) の述べ
る固相合成法に従がって、また、Stewart とYoung("Sol
idPhase Peptide Synthesis"（「固相ペプチド合成」）
第２版、Pierce ChemicalCompany, Rockford,イリノ
イ、pp. １〜52) に従がって製造する。この分野で既知
の、Houghten (Proc. Natl. Acad. Sci., 82、5132(198
5)）の合成等の他の同様な合成法を用いることもでき
る。これらの論文の内容は、本出願書に引用されその一
部となっている。

【００１１】固相合成は、Rivierら（米国特許第4,244,
946 号、1982年１月21日発行) が一般的に述べ、その内
容が本出願書に引用されその一部となっている方法に従
い、保護したアミノ酸を適当な樹脂に結合することによ
って、ペプチドのＣ末端から開始する。この一般的な合
成の例は、米国特許第4,305,872 号、及び第4,316,891
号に述べられている。４１残基のポリペプチドの固相合
成に関する論考が、Science 213 、1394〜1397(1981年
９月）の Vale らの論文に述べられているが、これは、
Marke ら (J. Am. Chem. Soc., 103、3178(1981)) の論
文に見出されるより詳細な論考について言及している。

【００１２】ポリペプチドの合成において、アルファア
ミノ基を適当に保護したカルボキシ末端アミノ酸を、ク
ロロメチル化ポリスチレン樹脂等に結合させる。塩化メ
チレン中のトリフルオロ酢酸等を用いてアルファアミノ
保護基をとりのぞいた後、合成の次の段階に進むことが
できる。公開されている論文が述べるように、特定のア
ミノ保護基をとりのぞくために他の標準的切断試薬及び
条件を用いてもよい。

【００１３】残りのα−アミノ基と側鎖を保護したアミ
ノ酸を、次に、所望の順序で段階的に結合させて、樹脂
に結合した中間化合物を得る。合成において各アミノ酸
を別々に加えるかわりに、成長している固相鎖に加える
以前に、いくつかのアミノ酸を互いに結合してもよい。
適当な結合試薬の選択は、この分野の技術の範囲であ
る。

【００１４】ペプチドの化学的合成では通常、鎖が完全
に組み終わったあとで最終的に鎖を取りはずすまでは、
種々のアミノ酸部分の不安定な側鎖基のある部位を適当
な保護基で保護しておく。又、通常、カルボキシ基との
反応中、アミノ酸又はペプチドフラグメント上のアルフ
ァアミノ酸を保護しておき、その後そのアルファアミノ
酸保護基を選択的にとりのぞいて、その部位で次の反応
が行なえるようにする。したがって、通常、合成のある
段階では、側鎖保護基を持った種々のアミノ酸残基がペ
プチド中に所望の配列で位置する中間化合物が作られ
る。その後、通常、これらの保護基は、ほとんど同時に
とりのぞかれて、その結果所望の生成物となり、ついで
精製が行なわれる。

【００１５】所望のアミノ酸配列が完成した後、液体Ｈ
Ｆ等の試薬で処理して中間ペプチドを樹脂からとりのぞ
くが、この試薬はペプチドを樹脂から切断するだけでは
なく、残っているすべての側鎖保護基を切断する。その
後、ペプチドをゲル濾過して、ついでRivierら（Peptid
es : Structure and Biological Function（「ペプチ
ド：構造と生物学的機能」）pp 125−128 (1979)) が述
べるようセミプレパラティブＨＰＬＣにかける。通常で
は、少なくとも（存在する全ペプチドに関して）９３％
以上の純度のものが順当に得られるが、これは臨床試験
や使用に好適である。しかしながら、純度９８％が実用
的であるが、ある種のインビトロの適用にはより低純度
のものも用いることができる。したがって、このポリペ
プチドは、ほぼ純粋な形態、すなわち存在する全ペプチ
ドに対して少なくとも約５０重量％である場合に、本適
用の目的にとって有用であると考えられる。

【００１６】合成全自動ペプチドシンセサイザー（Applied Biosystems)
を用いて、本発明のポリペプチドを製造する。ポリペプ
チド１、２、３、４、及び５を合成するために、標準的
固相法を用いて、例えば固体の架橋ポリスチレンPam 樹
脂に、スレオニンを結合させる。このPam 樹脂は、Stew
art とYoung の記述（pp. 11〜12) に従がって製造でき
る。この樹脂は、アミノ酸の連結や保護基の除去を行う
間、ペプチド−樹脂結合の安定性が非常によい。その
後、スレオニンブロック基をアミノアシルポリマーから
とりのぞいてから、アラニンをこのアミノアシルポリマ
ーに結合させる。この脱保護と結合のサイクルを、ペプ
チド鎖に組み込む各アミノ酸についてくりかえす。各ア
ミノ酸は、望ましくないラセミ化の危険をさけるため
に、１つずつ加えてゆく。

【００１７】個々のアミノ酸に関し合成中に有用なのは
以下のブロック基である：ヒスチジン−ベンジルオキシメチルアスパラギン酸−シクロヘキシルエステル類グルタミン酸−シクロヘキシルエステル類システィン−４−メチルベンジルセリン−ベンジルアルギニン−トシルリジン−クロロベンジルオキシカルボニルスレオニン−ベンジルチロシン−ブロモベンジルオキシカルボニル

【００１８】アミノ酸を加えていく時に、ダブル・カッ
プリングは用いられるべき重要なテクニックである。ポ
リペプチドの合成中注意すべき段階は、最後のアミノ酸
を加えたあとであり、この時点で適当な分子高次構造を
得て完全に配列を保存するように、合成の終了した溶液
を処理しなければならない。配列に最後のアミノ酸を加
えた後、かつ、樹脂からポリペプチドを切断する前に、
Ｎ末端のBoc 基をとりのぞく。

【００１９】保護基をとりのぞいた後、樹脂−ペプチド
をＨＦで処理する。ポリペプチド中の残基のアルキル化
（たとえば、メチオニン、システィン及びチロシン残基
のアルキル化）をさけるために、ＨＦ反応混合物中にス
カベンジャーを含む必要がある。本発明によれば、用い
るべきスカベンジャーは、硫黄を含むスカベンジャー、
好ましくはチオクレゾールとクレゾールの混合物であ
る。このスカベンジャーは、メチオニン残基のスルホキ
シドへの酸化を最小にする。前記ＨＦ混合物による処理
の後、樹脂をエーテルで洗浄し、ただちに多量の希酢酸
に移して、可溶化して分子間架橋を最小にする。２５０
mMの濃度のポリペプチドを、０．１Ｍ酢酸約２リットル
で希釈する。この工程は、通常つづいて行なわれる工程
（たとえば、同様な濃度のポリペプチドを約５０〜１０
０mlの希酢酸に溶解する）と非常に対照的である。その
後、溶液を攪拌して、水酸化アンモニウムを用いてpHを
約８．０に調整する。pHを調整すると、ポリペプチドは
所望の高次構造となる。

【００２０】以上の工程にしたがって、分子間架橋及び
望ましくない高次構造を最小にとどめつつ、システィン
残基を多量に含むポリペプチドを製造することができ
る。

【００２１】実施例１下記（配列番号１）として同定されるポリペプチドの構
築を、Merrifield固相法によって行なった（Kentおよび
Clark-Lewis (1985) "Synthetic Peptides inBiology
and Medicine"（「生物学及び医学における合成ペプチ
ド」）Proc. Labsystem Symp., Alitaloら編、Elsevie
r, オランダ、pp. 29〜57 ;及び Merrifield (1963) J.
Amer. Chem. Soc., Vol. 85 、pp. 2149〜2154) 。

【化１】

【００２２】側鎖保護の適当な選択は、合成及びＨＦに
よる脱保護中の副生物を最小にするように行なった。ダ
ブル・カップリングのプロトコルをペプチド−樹脂構築
に用いて、残留遊離アミンのニンヒドリン分析（Sarin
ら、(1981) Aral. Biochem.,Vol. 117 、pp 147〜157)
によって結合の確実さをモニターした。結合収率は、３
サイクルをのぞいてすべて９８．５％以上であった。Ar
g⁹とArg²²をつけ加える結合は４回、そしてIle¹⁹をつ
け加える結合は３回行なった。このくりかえしの結合の
後、ニンヒドリン分析は向上して９７％をこえる結合完
了レベルになった。全体収率９３％で単離した最終的な
４９ペプチド樹脂を、高ＨＦ法（Tam ら、(1983) J. Am
er. Chem. Soc. Vol. 105 、pp. 6442〜6455) を用い
て、スカベンジャーとしてのｐ−クレゾールとｐ−チオ
クレゾールの存在下に、樹脂から切断した。スカベンジ
ャーにアニソールを用いたり、低−高ＨＦ法（Tam ら前
出)を適用した場合には、コンプレックスが生成して混
合物を精製するのがむずかしいために、それほど好まし
くないことがわかった。ＨＦ処理につづいて、未精製の
還元された生成物を、酢酸アンモニウムバッファー中で
空気酸化させた。４日間にわたってpH６．５、７．０、
７．５及び８．０で試験的に酸化すると、最適のpHは
８．０であった。反応の完了をEllman分析と分析ＨＰＬ
Ｃで確かめた。粗生成物は、酸化反応物をそのままＣ₁₈
−シリカ逆相カラムにかけて分取ＨＰＬＣを用いて精製
した。この技術によって、未精製ポリペプチドを含む４
リットルの溶液をカラム上で能率良く濃縮でき、つづい
て、精製生成物を単離するために勾配溶離を行なった。
１回通過で、生成物のピークは純度９５％をこえた。生
成物を２回目の勾配溶離にかけると、同じ溶媒系での分
析ＨＰＬＣにより純品である物質が、はじめからの収率
４％で得られた。この協奏精製技術を用いて、高純度の
タンパク質を単離することができた。

【００２３】生成物を、構造と純度で特徴づけた。７０
時間の酸加水分解と過ギ酸酸化後のアミノ酸分析は、予
想した値を示した。４７サイクルにわたって行なった配
列分析は、予想した結果を与えた。検出の限界内（１０
％）で、D₂O 中のプロトンＮＭＲにより、酸化メチオニ
ンのないことを確かめた。又、ＮＭＲは側鎖官能基のア
ルキル化が起きなかったことを示した。７０時間の酸加
水分解後の CNBr 処理したタンパク質のアミノ酸構成
は、予想されたメチオニンのホモセリンへの転換につい
て一致した。さらにこの結果は、メチオニンスルホキシ
ドが存在しないことを確実にした。

【００２４】予備的なインビボの研究では、合成ペプチ
ドＩは、大変効力のある抗血栓剤であることが示され
た。

【００２５】詳細な工程 Applied Biosystems 430 A (ABI)ペプチドシンセサイザ
ーにおける合成に必要な Boc−Ｏ−ベンジルスレオニン
−ＰＡＭ樹脂、Boc 保護したアミノ酸、及び他のすべて
の試薬は製造元から入手した。側鎖保護したAsp 、Glu
及びHis は、Bachem, Inc.より入手した。溶媒のジメチ
ルホルムアミド（ＤＭＦ）と塩化メチレン（CH₂Cl₂) は
Burdick and Jacksonより入手した。ジチオスレイトー
ル（ＤＴＴ）は Bethesda Res. Labs より購入した。ジ
チオエリスリトール（ＤＴＥ）は、Chemical Dynamics
より、ｐ−クレゾールとｐ−チオクレゾールは Aldrich
Chemical Co. より入手した。

【００２６】ポリペプチドＩの合成０．５０mM（０．６９ｇ）の Boc-Thr(Bzl)O-Pam-樹脂
（置換度０．７２mM Thr／ｇ樹脂）から出発して、ＡＢ
Ｉオートマチックペプチドシンセサイザーを用いて、段
階的に合成を行なった（Kent and Clark-Lewis (1985)
"SyntheticPeptides in Biology and Medicine"、
（「生物学及び医学における合成ペプチド」）Proc. La
bsystems Res. Symp., Alitaloら編、Elsevier、オラン
ダ pp.29〜57）。アミノ酸は、製造元のプレパックした
カートリッジ（各２mM）を用いて導入した。側鎖保護は
以下のようにした。すなわち、Arg(Tos)、Asp(OcHx) 、
Cys(Meb)、Glu(OcHx) 、His(Bom)、Lys[Z(Cl)]、Ser(Bz
l)、Thr(Bzl)、Tyr[Z(Br)]。ただしTos ; トシル、cHx
; シクロヘキシル、Meb ; ４−メチルベンジル、Z(C
l); ２−クロロベンジルオキシカルボニル、Bom ; ベン
ジルオキシメチル、Bzl ;ベンジル、Z(Br) ; ２ブロモ
ベンジルオキシカルボニルである。対称的無水物の（CH
₂Cl₂中で行ない、ついで溶媒をＤＭＦにとりかえる）ダ
ブルカップリングを、ダブルカップリングのプロトコー
ルでＤＭＦ中のヒドロキシベンゾトリアゾールを用いた
Arg(Tos)、Asn 及びHis(Bom)をのぞいて、すべてのBoc-
保護したアミノ酸に対して用いた。トリフルオロ酢酸
（ＴＦＡ）の脱保護中に酸が触媒となって起る望ましく
ない酸化からCys と Metを保護するための（Draperら、
(1973) J. Med. Chem. Vol.16 、pp. 1326〜1329) 、ス
カベンジャーとして０．１％（wt／ｖ）のＤＴＥを加え
た。Ｎ末端のGlu 結合後に、ＴＦＡを用いてBoc 基をと
りのぞき、ペプチド−樹脂を乾燥した。Ｎ末端を脱保護
したペプチド−樹脂の最終重量は４．１５ｇであった。

【００２７】ＨＦ切断と酸化組みあげたペプチド−樹脂（２．０ｇ）を、ＨＦ装置
（Peninsula Labs. Inc., Type 1B)中の１：１（ｖ／
ｖ）ｐ−チオクレゾール／ｐ−クレゾール混合物３mlに
懸濁した。この系をメカニカル真空ポンプで真空にし
て、液体窒素冷却を用いてＨＦを濃縮した（３０ml）。
０〜５℃で１．５時間攪拌した後、反応混合物を、液体
窒素トラップを用いて減圧下に蒸発させた（２０〜３０
分間）。残渣をエーテルで摩砕して、濾過し、さらにエ
ーテルを加えて３回洗浄した。濾過した残渣をただちに
４リットルの攪拌した希酢酸（０．４％／H₂O)溶液に移
した。数分の攪拌の後、混合物のpHを水酸化アンモニウ
ムで８．０に調整した。濾過によって樹脂をとりのぞい
て、つづいて、攪拌せずに５℃で（１８時間）、さらに
常温（１９〜２０℃）で３日間、未精製の酸化生成物を
放置した。分析用ＨＰＬＣを用いて酸化の進行をモニタ
ーした。定量 Ellman テスト (Habeeb, "Methods in En
zymology”（酵素学の方法」）(1972) Hirs 及びTimash
eff 編、Academic Pressニューヨーク pp. 457〜464)を
用いて、精製に進む前に、遊離スルフヒドリル基が消滅
したことをモニターした。このテストは、残っているｐ
−チオクレゾールをとりのぞくために、凍結乾燥した１
mlのサンプルについて行なった。

【００２８】酸化ポリペプチドＩの精製未精製酸化溶液（４Ｌ）に酢酸（１０ml）を加えて酸性
にし、そのままポンプでＣ₁₈−シリカ（５×３０cm、１
５ｍ、３００Ａ）カートリッジ（Waters Associates)に
送った。生成物は、分取ＨＰＬＣ（Separations Techno
logy Inc.)を用いて精製した。段階的勾配（１００mlづ
つ増分）は１リットルごとに移動相の濃度を順次高くし
てゆくことで作り出した。７０ml／分の流速で生成物を
溶離した。ＲＰ−ＨＰＬＣ（Vydac C₁₈、218TP5415)で
決定した均質の（＞９５％）のフラクションを保存し、
凍結乾燥して７２mgの生成物を得た。この半精製した生
成物は、生成物のピークの肩としてより極性の小さい成
分が混入していた。生成物を、前記と同じ方法で再びＨ
ＰＬＣにかけてさらに精製して、５４mgのエキスタチン
を得た。０．２５mMの出発樹脂に対して、この重量は、
全収率で４％となる。単一性は、分析用ＨＰＬＣで確か
められた。合成生成物を天然の物質と一緒に注入して、
単一のピークを得た。生成物をさらに、６N HCl で加水
分解した後に、アミノ酸分析によって、また全自動エド
マン分解（ＡＢＩ４７０Ａプロティンシークエンサー）
によって特徴づけをした。最大１．９％のプレビュー
（preview)がみられた。最初の段階からのＰＴＨアミノ
酸の高い収量は、また、Ｃ末端Glu のピロGlu への環化
が起こってないことを示した。

【００２９】ポリペプチド１の還元と再生ポリペプチド１（０．５mg）を、０．０７Ｍ、pH８．０
の酢酸アンモニウム（１０mMＤＴＴ）１mlに溶解して、
分析用ＨＰＬＣによって還元の進行をモニターした。１
時間後、出発物質は定量的に、単一の還元生成物に変わ
った。この還元生成物を、０．０７Ｍ酢酸アンモニウム
バッファー（４リットル）に対して直径１２mm、１００
０MW分子分画セルロースチューブ（Spectrum Medical I
nd.)を用いて（２４時間）透析すると、エキスタチンの
みが得られた。再び酸化する前に、このポリペプチドが
完全に還元された形態であることを確かめるために、６
Ｍ塩酸グアニジンの存在下で前記と同様に、ＤＴＴ還元
をくりかえした。分析用ＨＰＬＣは、還元生成物が同一
の保持時間を有することを確証した。セミプレパラディ
ブＨＰＬＣによる還元ポリペプチドの単離と、それにつ
づく定量Ellman分析（Habeeb前出) は、生成物がオクタ
ヒドロの形態であることを示した。

【００３０】実施例２実施例１にしたがって製造したポリペプチドは、血小板
のコラーゲンへの付着を阻害することが示される。ポリ
スチレン９６穴マイクロタイタープレート（Costar Cam
bridge, MA) を、ウェルあたり５mM酢酸に溶解した４０
mg／mlのコラーゲン１００μｌを用いて室温で１時間コ
ーティングした後、１時間熱変性したＢＳＡ１０mg／ml
を２００μｌ加えて、非特異的な細胞結合部位をブロッ
クした。コントロールのウェルはＢＳＡだけでコーティ
ングした。ウェルは、２０mM ＨＥＰＥＳ、pH７．４、
０．１４ M NaCl 及び２mM MgCl₂を含むＨＥＰＥＳで緩
衝した塩類液（ＨＢＳ）で３回洗浄した。１００μｌの
洗浄した血小板を、種々の濃度のポリペプチド１、又は
コントロールとしてバッファーと室温で５分間インキュ
ベートした後、コラーゲンでコーティングした各ウェル
に加えて、室温で４５分間インキュベートした。付着し
ない血小板を吸引してとりのぞき、ウェルを２００μｌ
のＨＢＳで３回洗浄した。ＢＣＡ試薬を用いて、５６２
nmで各ウェルの吸収を測定してタンパク質アッセイによ
り、付着した血小板の数を決定した。コントロールＡ
₅₆₂は０．３ないし０．１ O.D.の範囲の値となり、ポ
リペプチド１は、その濃度に応じて５０％まで値を減少
させた。この阻害を生じさせるポリペプチド１のＩＣ₅₀
は、１１０nMである。

【００３１】実施例３、４及び５詳述の一般的工程及び実施例１において特定的に述べた
工程を適当に変更した工程にしたがって、配列番号２、
３、４及び５の配列を有するポリペプチドを製造し、血
小板のコラーゲンへの付着に対する阻害作用を評価し
た。

【００３２】実施例６配列番号１、２、３、４及び５の血小板のコラーゲンへ
の付着を阻害する作用を、実施例２の血小板のコラーゲ
ンへの付着の阻害を決定するアッセイを用いて評価し
た。プレートをコラーゲンでなくフィブリノゲンでコー
ティングしたことをのぞいては、実施例２で述べたのと
同じアッセイを、血小板のフィブリノゲンへの付着を決
定するために行なった。表１は、これらのポリペプチド
が、ＡＤＰに刺激される血小板の凝固を阻害すること、
及び配列番号５が、血小板のコラーゲンへの付着に対し
て最も特異的であることを示している。

【表１】

【００３３】これらのポリペプチドは、遺伝子工学技術
によっても製造できると考えられる。つまり、本出願書
が開示するアミノ酸配列にもとづいて、この開示された
アミノ酸に対応する合成遺伝子をうまく製造し、この遺
伝子を適当なクローニングベクターによって適当なホス
トに導入すればよい。したがって、本発明の範囲には、
遺伝子工学技術により製造したこれらのポリペプチドも
含まれると考える。

【００３４】本発明のポリペプチドは、ヒト又は哺乳類
の血小板がコラーゲンに付着するのを阻害したいあらゆ
る状況において投与できる。本発明の化合物及び方法
は、動脈や器官の取扱い及び／または血小板と人工的表
面との相互作用が血小板の凝固や消耗をひきおこす末梢
血管の手術（血管移植、頸動脈内膜切除）及び心臓血管
手術において有用である。凝固した血小板は、血栓及び
血栓塞栓を形成することがある。本発明のポリペプチド
をこれらの患者に投与して、血小板のコラーゲンへの付
着及びコラーゲンによって刺激される血小板の凝固を阻
害することにより、血栓や血栓塞栓の形成を予防でき
る。

【００３５】心臓血管手術では、通常、血液を酸素化す
るために体外循環を用いる。血小板は体外循環装置の表
面に付着する。この人工的表面から放たれた血小板は止
血作用に欠陥を示す。本発明のポリペプチドを付着の予
防のために投与することができる。

【００３６】これらのポリペプチドの他の適用には、血
栓症治療中及び治療後の血小板性血栓症、血栓塞栓症及
び再閉塞の予防、及び、冠状動脈や他の動脈の形成手術
後及び冠状動脈バイパス処理後の血小板性血栓症、血栓
塞栓症及び再閉塞の予防が含まれる。

【００３７】血小板のコラーゲンへの付着を阻害するポ
リペプチドは、十分な量が結果的に血流中に放出される
ならば、どのような手段で投与してもよい。それらを他
の血小板凝固阻害剤又はプラスミノゲン活性化物質と一
緒にして、血小板凝固を阻害し、また凝固した血小板に
対処してもよい。静脈内投与が現在、好ましい投与経路
であると考えられている。ペプチドは水に可溶であり、
したがって効果的に溶液として投与できる。

【００３８】又、本発明は、本発明のポリペプチドを含
む組成物、及びこれらの組成物を患者に投与することか
ら成る、患者の血栓溶解を誘導して再閉塞をふせぐ方法
を含む。

【００３９】適用の一例として、適量のペプチドを、血
管形成手術を受ける心臓病発作の患者に、静脈内投与す
る。投与は血管形成手術中又は数分前に行ない、その量
は、血小板のコラーゲンへの付着を阻害するのに十分
な、たとえば、約０．０５〜２０mMの間の定常状態の血
漿濃度が得られる量を用いる

【配列表】

【００４０】配列番号：１配列の長さ：４９配列の型：アミノ酸配列の種類：ポリペプチド起源生物名：エキス・カリナツス（Echis carinatus viper) 直接の起源：合成他の情報コラーゲンにたいする血小板付着を阻害

【００４１】配列番号：２配列の長さ：４９配列の型：アミノ酸配列の種類：ポリペプチド直接の起源：合成他の情報コラーゲンにたいする血小板付着を阻害

【００４２】配列番号：３配列の長さ：４９配列の型：アミノ酸配列の種類：ポリペプチド直接の起源：合成他の情報コラーゲンにたいする血小板付着を阻害

【００４３】配列番号：４配列の長さ：３９配列の型：アミノ酸配列の種類：ポリペプチド直接の起源：合成他の情報コラーゲンにたいする血小板付着を阻害

【００４４】配列番号：５配列の長さ：３９配列の型：アミノ酸配列の種類：ポリペプチド直接の起源：合成配列の特徴：３９（Ｃｙｓ）はアミド化されている。他の情報：コラーゲンにたいする血小板付着を阻害配列： Glu Cys Glu Ser Gly Pro Cys Cys Arg Asn Cys Lys Phe Leu Lys Glu 1 5 10 15 Gly Thr Ile Cys Lys Arg Ala Arg Gly Asp Asp Met Asp Asp Tyr Cys 20 25 30 Asn Gly Lys Thr Cys Asp Cys 35 39

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者ジャーツィカルチュウスキアメリカ合衆国，19422 ペンシルヴァニア，ブルーベル，シルヴァンドライヴ 1634 (56)参考文献特開平２−138298（ＪＰ，Ａ) 特開平２−275899（ＪＰ，Ａ) 欧州特許出願公開382451（ＥＰ，Ａ)

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】 Seq. Id. No.II Glu Cys Glu Ser Gly Pro Cys Cys Arg Asn Cys Lys Phe Leu Lys Glu 1 5 10 15 Gly Thr Ile Cys Lys Arg Ala Ala Gly Asp Asp Met Asp Asp Tyr Cys (ii) 20 25 30 Asn Gly Lys Thr Cys Asp Cys Pro Arg Asn Pro His Lys Gly Pro Ala 35 40 45 Thr 49 Seq. Id. No.III Glu Cys Glu Ser Gly Pro Cys Cys Arg Asn Cys Lys Phe Leu Lys Glu 1 5 10 15 Gly Thr Ile Cys Lys Arg Ala Arg Tyr Asp Asp Met Asp Asp Tyr Cys (iii) 20 25 30 Asn Gly Lys Thr Cys Asp Cys Pro Arg Asn Pro His Lys Gly Pro Ala 35 40 45 Thr 49 Seq. Id. No.IV Glu Cys Glu Ser Gly Pro Cys Cys Arg Asn Cys Lys Phe Leu Lys Glu 1 5 10 15 Gly Thr Ile Cys Lys Arg Ala Arg Gly Asp Asp Met Asp Asp Tyr Cys (iv) 20 25 30 Asn Gly Lys Thr Cys Asp Cys 35 39 Seq. Id. No. V Glu Cys Glu Ser Gly Pro Cys Cys Arg Asn Cys Lys Phe Leu Lys Glu 1 5 10 15 Gly Thr Ile Cys Lys Arg Ala Arg Gly Asp Asp Met Asp Asp Tyr Cys (v) 20 25 30 Asn Gly Lys Thr Cys Asp Cys NH₂ 35 39 配列を有するポリペプチドのいずれかを、コラーゲンの
存在下に血小板と接触させることにより、血小板のコラ
ーゲンへの付着をブロックすることからなる、コラーゲ
ンによって刺激されるヒト以外の哺乳動物における血小
板の活性化を阻害する方法。
【請求項２】 Seq. Id. No.II Glu Cys Glu Ser Gly Pro Cys Cys Arg Asn Cys Lys Phe Leu Lys Glu 1 5 10 15 Gly Thr Ile Cys Lys Arg Ala Ala Gly Asp Asp Met Asp Asp Tyr Cys (ii) 20 25 30 Asn Gly Lys Thr Cys Asp Cys Pro Arg Asn Pro His Lys Gly Pro Ala 35 40 45 Thr 49 Seq. Id. No.III Glu Cys Glu Ser Gly Pro Cys Cys Arg Asn Cys Lys Phe Leu Lys Glu 1 5 10 15 Gly Thr Ile Cys Lys Arg Ala Arg Tyr Asp Asp Met Asp Asp Tyr Cys (iii) 20 25 30 Asn Gly Lys Thr Cys Asp Cys Pro Arg Asn Pro His Lys Gly Pro Ala 35 40 45 Thr 49 Seq. Id. No.IV Glu Cys Glu Ser Gly Pro Cys Cys Arg Asn Cys Lys Phe Leu Lys Glu 1 5 10 15 Gly Thr Ile Cys Lys Arg Ala Arg Gly Asp Asp Met Asp Asp Tyr Cys (iv) 20 25 30 Asn Gly Lys Thr Cys Asp Cys 35 39 Seq. Id. No. V Glu Cys Glu Ser Gly Pro Cys Cys Arg Asn Cys Lys Phe Leu Lys Glu 1 5 10 15 Gly Thr Ile Cys Lys Arg Ala Arg Gly Asp Asp Met Asp Asp Tyr Cys (v) 20 25 30 Asn Gly Lys Thr Cys Asp Cys NH₂ 35 39 配列を有するいずれか一つのポリペプチドを含む、血小
板のコラーゲンへの付着をブロックすることにより、コ
ラーゲンによって刺激される哺乳類における血小板の活
性化を阻害するための組成物。