JPH04305532A - 血小板のコラーゲンへの付着をブロックする方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】内皮下層に見出されるコラーゲンは、損傷
を受けるか疾患にかかった血管壁の部位で血液に提示さ
れる最初の血栓形成刺激であると考えられる。インビト
ロにおいて、コラーゲンは、血小板の付着と凝集、そし
てそれにつづく血小板の活性化の両方を促進する。

【０００２】エキスタチン（Ｅｃｈｉｓｔａｔｉｎ）　
と、それがフィブリノーゲン受容体糖タンパク質ＩＩｂ
／ＩＩＩａに結合することによって血小板凝集を阻害す
る能力について、Ｇａｎ　ら（Ｊ．　Ｂｉｏｌ．　Ｃｈ
ｅｍ．　２６３　、ｐｐ．１９８２７〜１９８３２　（
１９８８））、Ｇａｒｓｋｙら　（Ｐｒｏｃ．　Ｎａｔ
ｌ．　Ａｃａｄ．　Ｓｃｉ．　ＵＳＡ　８６　、ｐｐ．
４０２２　〜４０２６、（１９８９））及びＧａｎ　ら
（Ｇｅｎｅ　７９　、ｐｐ．１５９〜１６６（１９８９
））が述べている。

【０００３】Ｓｉｍｏｎｉｄｅｓｚらは、米国特許第４
，５２０，０１８号で、ＡＤＰ、アラキジン酸又はコラ
ーゲンによって誘発される血小板凝固を阻害して血液循
環を促進させる５位置換−４−オキソＰＧＩ１誘導体に
ついて述べている。

【０００４】Ｃｏａｎは、米国特許第４，２２９，５４
０　号で、ヒトの血漿に見られる、ＡＤＰ、エピネフリ
ン、又はコラーゲンによって誘発される血小板凝固を阻
害する加水分解酵素について述べている。

【０００５】Ｒｕｏｓｌａｈｔｉ　らは、米国特許第４
，５７８，０７９号で、フィブロネクチンの主要な細胞
結合部位が短かいアミノ酸配列　Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｓ
ｐ−Ｓｅｒであり、これが、少くとも接着タンパクの１
つであるコラーゲンにも存在することを述べている。

【０００６】本発明は、血小板のコラーゲンへの付着を
ブロックすることによってコラーゲンによって刺激され
る血小板の活性化を阻害する組成物であって以下の配列
を有するポリペプチドから成る。すなわち：ＮＨ２　（
Ｃｈ）　Ａｌａ　Ａｒｇ　Ｇｌｙ　Ａｓｐ　（Ｃｘ）　
ＣＯＯＨ　　　　　（ｉ）ＮＨ２　（Ｃｈ）　Ａｌａ　
Ａｌａ　Ｇｌｙ　Ａｓｐ　（Ｃｘ）　ＣＯＯＨ　　　　
　（ｉｉ）ＮＨ２　（Ｃｈ）　Ａｌａ　Ａｒｇ　Ｔｙｒ
　Ａｓｐ　（Ｃｘ）　ＣＯＯＨ　　　　　（ｉｉｉ）Ｎ
Ｈ２　（Ｃｈ）　Ａｌａ　Ａｒｇ　Ｇｌｙ　Ａｓｐ　（
Ｃｙ）　Ｚ　　　　　　（ｉｖ）配列中、Ｃｈは、 Ｇｌｕ　Ｃｙｓ　Ｇｌｕ　Ｓｅｒ　Ｇｌｙ　Ｐｒｏ　Ｃ
ｙｓ　Ｃｙｓ　ＡｒｇＡｓｎ　Ｃｙｓ　ＬｙｓＰｈｅ　
Ｌｅｕ　Ｌｙｓ　Ｇｌｕ　Ｇｌｙ　Ｔｈｒ　Ｉｌｅ　Ｃ
ｙｓ　Ｌｙｓ　Ａｒｇ又は、その保存的アミノ酸置換体
；Ｃｘは、Ａｓｐ　Ｍｅｔ　Ａｓｐ　Ａｓｐ　Ｔｙｒ　
Ｃｙｓ　Ａｓｎ　Ｇｌｙ　ＬｙｓＴｈｒ　Ｃｙｓ　Ａｓ
ｐＣｙｓ　Ｐｒｏ　Ａｒｇ　Ａｓｎ　Ｐｒｏ　Ｈｉｓ　
Ｌｙｓ　Ｇｌｙ　Ｐｒｏ　Ａｌａ　Ｔｈｒ又は、その保
存的アミノ酸置換体；Ｃｙは、Ａｓｐ　Ｍｅｔ　Ａｓｐ
　Ａｓｐ　Ｔｙｒ　Ｃｙｓ　Ａｓｎ　Ｇｌｙ　ＬｙｓＴ
ｈｒ　Ｃｙｓ　ＡｓｐＣｙｓ 又は：その保存的アミノ酸置換体；そしてＺは、ＮＨ２
　又はＣＯＯＨである。

【０００７】本発明は、また、この組成物を用いてコラ
ーゲンによって刺激される血小板の活性化を阻害する方
法を包含する。

【０００８】本発明は、また、哺乳類においてコラーゲ
ンによって刺激される血小板の活性化を阻害する組成物
、及び、この化合物を哺乳類に投与することから成る、
哺乳類におけるコラーゲンによって刺激される血小板の
活性化を阻害する方法を包含する。この化合物は以下の
配列を有するポリペプチドから成る。すなわち：ＮＨ２
　（Ｃｈ）　Ａｌａ　Ａｒｇ　Ｇｌｙ　Ａｓｐ　（Ｃｘ
）　ＣＯＯＨ　　　　　（ｉ）ＮＨ２　（Ｃｈ）　Ａｌ
ａ　Ａｌａ　Ｇｌｙ　Ａｓｐ　（Ｃｘ）　ＣＯＯＨ　　
　　　（ｉｉ）ＮＨ２　（Ｃｈ）　Ａｌａ　Ａｒｇ　Ｔ
ｙｒ　Ａｓｐ　（Ｃｘ）　ＣＯＯＨ　　　　　（ｉｉｉ
）ＮＨ２　（Ｃｈ）　Ａｌａ　Ａｒｇ　Ｇｌｙ　Ａｓｐ
　（Ｃｙ）　Ｚ　　　　　　（ｉｖ）配列中、Ｃｈは、 Ｇｌｕ　Ｃｙｓ　Ｇｌｕ　Ｓｅｒ　Ｇｌｙ　Ｐｒｏ　Ｃ
ｙｓ　Ｃｙｓ　ＡｒｇＡｓｎ　Ｃｙｓ　ＬｙｓＰｈｅ　
Ｌｅｕ　Ｌｙｓ　Ｇｌｕ　Ｇｌｙ　Ｔｈｒ　Ｉｌｅ　Ｃ
ｙｓ　Ｌｙｓ　Ａｒｇ又は、その保存的アミノ酸置換体
；Ｃｘは、Ａｓｐ　Ｍｅｔ　Ａｓｐ　Ａｓｐ　Ｔｙｒ　
Ｃｙｓ　Ａｓｎ　Ｇｌｙ　ＬｙｓＴｈｒ　Ｃｙｓ　Ａｓ
ｐＣｙｓ　Ｐｒｏ　Ａｒｇ　Ａｓｎ　Ｐｒｏ　Ｈｉｓ　
Ｌｙｓ　Ｇｌｙ　Ｐｒｏ　Ａｌａ　Ｔｈｒ又は、その保
存的アミノ酸置換体；Ｃｙは、Ａｓｐ　Ｍｅｔ　Ａｓｐ
　Ａｓｐ　Ｔｙｒ　Ｃｙｓ　Ａｓｎ　Ｇｌｙ　ＬｙｓＴ
ｈｒ　Ｃｙｓ　ＡｓｐＣｙｓ 又は、その保存的アミノ酸置換体；そしてＺは、ＮＨ２
　又はＣＯＯＨである。

【０００９】血小板のコラーゲンの付着を阻害する好適
なポリペプチドは、配列番号１、２、３、４、及び５で
同定されるものである。配列１〜３は、アミノ酸１（Ｇ
ｌｕ）の末端アミノ基と、アミノ酸４９（Ｔｈｒ）の末
端カルボキシル基を含む。配列４は、アミノ酸１（Ｇｌ
ｕ）の末端アミノ基とアミノ酸３９（Ｃｙｓ）の末端カ
ルボキシル基を含む。配列５は、アミノ酸１（Ｇｌｕ）
の末端アミノ基とアミノ酸３９（Ｃｙｓ）の末端アミノ
基を含む。ポリペプチド配列２、３、４、及び５は、（
血小板のフィブリノゲンへの付着を阻害することに対し
て）選択的に血小板のコラーゲンへの付着を阻害するの
により好ましい。ポリペプチド配列５はもっとも好まし
い。

【００１０】本発明に役立つポリペプチドは、通常、Ｍ
ｅｒｒｉｆｉｅｌｄ（Ｊ．　Ａｍ．　Ｃｈｅｍ．　Ｓｏ
ｃ．，　８５、２１４９（１９６４））　の述べる固相
合成法に従がって、また、Ｓｔｅｗａｒｔ　とＹｏｕｎ
ｇ（”ＳｏｌｉｄＰｈａｓｅ　Ｐｅｐｔｉｄｅ　Ｓｙｎ
ｔｈｅｓｉｓ”（「固相ペプチド合成」）第２版、Ｐｉ
ｅｒｃｅ　ＣｈｅｍｉｃａｌＣｏｍｐａｎｙ，　Ｒｏｃ
ｋｆｏｒｄ，イリノイ、ｐｐ．　１〜５２）　に従がっ
て製造する。この分野で既知の、Ｈｏｕｇｈｔｅｎ　（
Ｐｒｏｃ．　Ｎａｔｌ．　Ａｃａｄ．　Ｓｃｉ．，　８
２、５１３２（１９８５））の合成等の他の同様な合成
法を用いることもできる。これらの論文の内容は、本出
願書に引用されその一部となっている。

【００１１】固相合成は、Ｒｉｖｉｅｒら（米国特許第
４，２４４，９４６　号、１９８２年１月２１日発行）
　が一般的に述べ、その内容が本出願書に引用されその
一部となっている方法に従い、保護したアミノ酸を適当
な樹脂に結合することによって、ペプチドのＣ末端から
開始する。この一般的な合成の例は、米国特許第４，３
０５，８７２　号、及び第４，３１６，８９１　号に述
べられている。４１残基のポリペプチドの固相合成に関
する論考が、Ｓｃｉｅｎｃｅ　２１３　、１３９４〜１
３９７（１９８１年９月）の　Ｖａｌｅ　らの論文に述
べられているが、これは、Ｍａｒｋｅ　ら　（Ｊ．　Ａ
ｍ．　Ｃｈｅｍ．　Ｓｏｃ．，　１０３、３１７８（１
９８１））　の論文に見出されるより詳細な論考につい
て言及している。

【００１２】ポリペプチドの合成において、アルファア
ミノ基を適当に保護したカルボキシ末端アミノ酸を、ク
ロロメチル化ポリスチレン樹脂等に結合させる。塩化メ
チレン中のトリフルオロ酢酸等を用いてアルファアミノ
保護基をとりのぞいた後、合成の次の段階に進むことが
できる。公開されている論文が述べるように、特定のア
ミノ保護基をとりのぞくために他の標準的切断試薬及び
条件を用いてもよい。

【００１３】残りのα−アミノ基と側鎖を保護したアミ
ノ酸を、次に、所望の順序で段階的に結合させて、樹脂
に結合した中間化合物を得る。合成において各アミノ酸
を別々に加えるかわりに、成長している固相鎖に加える
以前に、いくつかのアミノ酸を互いに結合してもよい。 適当な結合試薬の選択は、この分野の技術の範囲である
。

【００１４】ペプチドの化学的合成では通常、鎖が完全
に組み終わったあとで最終的に鎖を取りはずすまでは、
種々のアミノ酸部分の不安定な側鎖基のある部位を適当
な保護基で保護しておく。又、通常、カルボキシ基との
反応中、アミノ酸又はペプチドフラグメント上のアルフ
ァアミノ酸を保護しておき、その後そのアルファアミノ
酸保護基を選択的にとりのぞいて、その部位で次の反応
が行なえるようにする。したがって、通常、合成のある
段階では、側鎖保護基を持った種々のアミノ酸残基がペ
プチド中に所望の配列で位置する中間化合物が作られる
。その後、通常、これらの保護基は、ほとんど同時にと
りのぞかれて、その結果所望の生成物となり、ついで精
製が行なわれる。

【００１５】所望のアミノ酸配列が完成した後、液体Ｈ
Ｆ等の試薬で処理して中間ペプチドを樹脂からとりのぞ
くが、この試薬はペプチドを樹脂から切断するだけでは
なく、残っているすべての側鎖保護基を切断する。その
後、ペプチドをゲル濾過して、ついでＲｉｖｉｅｒら（
Ｐｅｐｔｉｄｅｓ　：　Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ　ａｎｄ　
Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ　Ｆｕｎｃｔｉｏｎ（「ペプチド
：構造と生物学的機能」）ｐｐ　１２５−１２８　（１
９７９））　が述べるようセミプレパラティブＨＰＬＣ
にかける。通常では、少なくとも（存在する全ペプチド
に関して）９３％以上の純度のものが順当に得られるが
、これは臨床試験や使用に好適である。しかしながら、
純度９８％が実用的であるが、ある種のインビトロの適
用にはより低純度のものも用いることができる。したが
って、このポリペプチドは、ほぼ純粋な形態、すなわち
存在する全ペプチドに対して少なくとも約５０重量％で
ある場合に、本適用の目的にとって有用であると考えら
れる。

【００１６】合成 全自動ペプチドシンセサイザー（Ａｐｐｌｉｅｄ　Ｂｉ
ｏｓｙｓｔｅｍｓ）　を用いて、本発明のポリペプチド
を製造する。ポリペプチド１、２、３、４、及び５を合
成するために、標準的固相法を用いて、例えば固体の架
橋ポリスチレンＰａｍ　樹脂に、スレオニンを結合させ
る。このＰａｍ　樹脂は、Ｓｔｅｗａｒｔ　とＹｏｕｎ
ｇ　の記述（ｐｐ．　１１〜１２）　に従がって製造で
きる。この樹脂は、アミノ酸の連結や保護基の除去を行
う間、ペプチド−樹脂結合の安定性が非常によい。その
後、スレオニンブロック基をアミノアシルポリマーから
とりのぞいてから、アラニンをこのアミノアシルポリマ
ーに結合させる。この脱保護と結合のサイクルを、ペプ
チド鎖に組み込む各アミノ酸についてくりかえす。各ア
ミノ酸は、望ましくないラセミ化の危険をさけるために
、１つずつ加えてゆく。

【００１７】個々のアミノ酸に関し合成中に有用なのは
以下のブロック基である： ヒスチジン−ベンジルオキシメチル アスパラギン酸−シクロヘキシルエステル類グルタミン
酸−シクロヘキシルエステル類システィン−４−メチル
ベンジル セリン−ベンジル アルギニン−トシル リジン−クロロベンジルオキシカルボニルスレオニン−
ベンジル チロシン−ブロモベンジルオキシカルボニル

【００１８
】アミノ酸を加えていく時に、ダブル・カップリングは
用いられるべき重要なテクニックである。ポリペプチド
の合成中注意すべき段階は、最後のアミノ酸を加えたあ
とであり、この時点で適当な分子高次構造を得て完全に
配列を保存するように、合成の終了した溶液を処理しな
ければならない。配列に最後のアミノ酸を加えた後、か
つ、樹脂からポリペプチドを切断する前に、Ｎ末端のＢ
ｏｃ　基をとりのぞく。

【００１９】保護基をとりのぞいた後、樹脂−ペプチド
をＨＦで処理する。ポリペプチド中の残基のアルキル化
（たとえば、メチオニン、システィン及びチロシン残基
のアルキル化）をさけるために、ＨＦ反応混合物中にス
カベンジャーを含む必要がある。本発明によれば、用い
るべきスカベンジャーは、硫黄を含むスカベンジャー、
好ましくはチオクレゾールとクレゾールの混合物である
。このスカベンジャーは、メチオニン残基のスルホキシ
ドへの酸化を最小にする。前記ＨＦ混合物による処理の
後、樹脂をエーテルで洗浄し、ただちに多量の希酢酸に
移して、可溶化して分子間架橋を最小にする。２５０ｍ
Ｍの濃度のポリペプチドを、０．１Ｍ酢酸約２リットル
で希釈する。この工程は、通常つづいて行なわれる工程
（たとえば、同様な濃度のポリペプチドを約５０〜１０
０ｍｌの希酢酸に溶解する）と非常に対照的である。そ
の後、溶液を攪拌して、水酸化アンモニウムを用いてｐ
Ｈを約８．０に調整する。ｐＨを調整すると、ポリペプ
チドは所望の高次構造となる。

【００２０】以上の工程にしたがって、分子間架橋及び
望ましくない高次構造を最小にとどめつつ、システィン
残基を多量に含むポリペプチドを製造することができる
。

【００２１】実施例１ 下記（配列番号１）として同定されるポリペプチドの構
築を、Ｍｅｒｒｉｆｉｅｌｄ固相法によって行なった（
Ｋｅｎｔおよび　Ｃｌａｒｋ−Ｌｅｗｉｓ　（１９８５
）　”Ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ　Ｐｅｐｔｉｄｅｓ　ｉｎＢ
ｉｏｌｏｇｙ　ａｎｄ　Ｍｅｄｉｃｉｎｅ”（「生物学
及び医学における合成ペプチド」）Ｐｒｏｃ．　Ｌａｂ
ｓｙｓｔｅｍ　Ｓｙｍｐ．，　Ａｌｉｔａｌｏら編、Ｅ
ｌｓｅｖｉｅｒ，　オランダ、ｐｐ．　２９〜５７　；
及び　Ｍｅｒｒｉｆｉｅｌｄ　（１９６３）　Ｊ．　Ａ
ｍｅｒ．　Ｃｈｅｍ．　Ｓｏｃ．，　Ｖｏｌ．　８５　
、ｐｐ．　２１４９〜２１５４）　。

【化１】

【００２２】側鎖保護の適当な選択は、合成及びＨＦに
よる脱保護中の副生物を最小にするように行なった。ダ
ブル・カップリングのプロトコルをペプチド−樹脂構築
に用いて、残留遊離アミンのニンヒドリン分析（Ｓａｒ
ｉｎ　ら、（１９８１）　Ａｒａｌ．　Ｂｉｏｃｈｅｍ
．，Ｖｏｌ．　１１７　、ｐｐ　１４７〜１５７）によ
って結合の確実さをモニターした。結合収率は、３サイ
クルをのぞいてすべて９８．５％以上であった。Ａｒｇ
９とＡｒｇ２２　をつけ加える結合は４回、そしてＩｌ
ｅ１９　をつけ加える結合は３回行なった。このくりか
えしの結合の後、ニンヒドリン分析は向上して９７％を
こえる結合完了レベルになった。全体収率９３％で単離
した最終的な４９ペプチド樹脂を、高ＨＦ法（Ｔａｍ　
ら、（１９８３）　Ｊ．　Ａｍｅｒ．　Ｃｈｅｍ．　Ｓ
ｏｃ．　Ｖｏｌ．　１０５　、ｐｐ．　６４４２〜６４
５５）　を用いて、スカベンジャーとしてのｐ−クレゾ
ールとｐ−チオクレゾールの存在下に、樹脂から切断し
た。スカベンジャーにアニソールを用いたり、低−高Ｈ
Ｆ法（Ｔａｍ　ら前出）を適用した場合には、コンプレ
ックスが生成して混合物を精製するのがむずかしいため
に、それほど好ましくないことがわかった。ＨＦ処理に
つづいて、未精製の還元された生成物を、酢酸アンモニ
ウムバッファー中で空気酸化させた。４日間にわたって
ｐＨ６．５、７．０、７．５及び８．０で試験的に酸化
すると、最適のｐＨは８．０であった。反応の完了をＥ
ｌｌｍａｎ分析と分析ＨＰＬＣで確かめた。粗生成物は
、酸化反応物をそのままＣ１８−シリカ逆相カラムにか
けて分取ＨＰＬＣを用いて精製した。この技術によって
、未精製ポリペプチドを含む４リットルの溶液をカラム
上で能率良く濃縮でき、つづいて、精製生成物を単離す
るために勾配溶離を行なった。 １回通過で、生成物のピークは純度９５％をこえた。生
成物を２回目の勾配溶離にかけると、同じ溶媒系での分
析ＨＰＬＣにより純品である物質が、はじめからの収率
４％で得られた。この協奏精製技術を用いて、高純度の
タンパク質を単離することができた。

【００２３】生成物を、構造と純度で特徴づけた。７０
時間の酸加水分解と過ギ酸酸化後のアミノ酸分析は、予
想した値を示した。４７サイクルにわたって行なった配
列分析は、予想した結果を与えた。検出の限界内（１０
％）で、Ｄ２Ｏ　中のプロトンＮＭＲにより、酸化メチ
オニンのないことを確かめた。又、ＮＭＲは側鎖官能基
のアルキル化が起きなかったことを示した。７０時間の
酸加水分解後の　ＣＮＢｒ　処理したタンパク質のアミ
ノ酸構成は、予想されたメチオニンのホモセリンへの転
換について一致した。さらにこの結果は、メチオニンス
ルホキシドが存在しないことを確実にした。

【００２４】予備的なインビボの研究では、合成ペプチ
ドＩは、大変効力のある抗血栓剤であることが示された
。

【００２５】詳細な工程 Ａｐｐｌｉｅｄ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ　４３０　Ａ　
（ＡＢＩ）ペプチドシンセサイザーにおける合成に必要
な　Ｂｏｃ−Ｏ−ベンジルスレオニン−ＰＡＭ樹脂、Ｂ
ｏｃ　保護したアミノ酸、及び他のすべての試薬は製造
元から入手した。側鎖保護したＡｓｐ　、Ｇｌｕ　及び
Ｈｉｓ　は、Ｂａｃｈｅｍ，　Ｉｎｃ．より入手した。 溶媒のジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）と塩化メチレン
（ＣＨ２Ｃｌ２）　は　Ｂｕｒｄｉｃｋ　ａｎｄ　Ｊａ
ｃｋｓｏｎより入手した。ジチオスレイトール（ＤＴＴ
）は　Ｂｅｔｈｅｓｄａ　Ｒｅｓ．　Ｌａｂｓ　より購
入した。ジチオエリスリトール（ＤＴＥ）は、Ｃｈｅｍ
ｉｃａｌ　Ｄｙｎａｍｉｃｓ　より、ｐ−クレゾールと
ｐ−チオクレゾールは　Ａｌｄｒｉｃｈ　Ｃｈｅｍｉｃ
ａｌ　Ｃｏ．　より入手した。

【００２６】ポリペプチドＩの合成 ０．５０ｍＭ（０．６９ｇ）の　Ｂｏｃ−Ｔｈｒ（Ｂｚ
ｌ）Ｏ−Ｐａｍ−樹脂（置換度０．７２ｍＭ　Ｔｈｒ／
ｇ樹脂）から出発して、ＡＢＩオートマチックペプチド
シンセサイザーを用いて、段階的に合成を行なった（Ｋ
ｅｎｔ　ａｎｄ　Ｃｌａｒｋ−Ｌｅｗｉｓ　（１９８５
）　”ＳｙｎｔｈｅｔｉｃＰｅｐｔｉｄｅｓ　ｉｎ　Ｂ
ｉｏｌｏｇｙ　ａｎｄ　Ｍｅｄｉｃｉｎｅ”、（「生物
学及び医学における合成ペプチド」）Ｐｒｏｃ．　Ｌａ
ｂｓｙｓｔｅｍｓ　Ｒｅｓ．　Ｓｙｍｐ．，　Ａｌｉｔ
ａｌｏら編、Ｅｌｓｅｖｉｅｒ、オランダ　ｐｐ．２９
〜５７）。アミノ酸は、製造元のプレパックしたカート
リッジ（各２ｍＭ）を用いて導入した。側鎖保護は以下
のようにした。すなわち、Ａｒｇ（Ｔｏｓ）、Ａｓｐ（
ＯｃＨｘ）　、Ｃｙｓ（Ｍｅｂ）、Ｇｌｕ（ＯｃＨｘ）
　、Ｈｉｓ（Ｂｏｍ）、Ｌｙｓ［Ｚ（Ｃｌ）］、Ｓｅｒ
（Ｂｚｌ）、Ｔｈｒ（Ｂｚｌ）、Ｔｙｒ［Ｚ（Ｂｒ）］
。ただしＴｏｓ　；　トシル、ｃＨｘ　；　シクロヘキ
シル、Ｍｅｂ　；　４−メチルベンジル、Ｚ（Ｃｌ）；
　２−クロロベンジルオキシカルボニル、Ｂｏｍ　；　
ベンジルオキシメチル、Ｂｚｌ　；ベンジル、Ｚ（Ｂｒ
）　；　２ブロモベンジルオキシカルボニルである。対
称的無水物の（ＣＨ２Ｃｌ２中で行ない、ついで溶媒を
ＤＭＦにとりかえる）ダブルカップリングを、ダブルカ
ップリングのプロトコールでＤＭＦ中のヒドロキシベン
ゾトリアゾールを用いたＡｒｇ（Ｔｏｓ）、Ａｓｎ　及
びＨｉｓ（Ｂｏｍ）をのぞいて、すべてのＢｏｃ−保護
したアミノ酸に対して用いた。トリフルオロ酢酸（ＴＦ
Ａ）の脱保護中に酸が触媒となって起る望ましくない酸
化からＣｙｓ　と　Ｍｅｔを保護するための（Ｄｒａｐ
ｅｒら、（１９７３）　Ｊ．　Ｍｅｄ．　Ｃｈｅｍ．　
Ｖｏｌ．１６　、ｐｐ．　１３２６〜１３２９）　、ス
カベンジャーとして０．１％（ｗｔ／ｖ）のＤＴＥを加
えた。Ｎ末端のＧｌｕ　結合後に、ＴＦＡを用いてＢｏ
ｃ　基をとりのぞき、ペプチド−樹脂を乾燥した。Ｎ末
端を脱保護したペプチド−樹脂の最終重量は４．１５ｇ
であった。

【００２７】ＨＦ切断と酸化 組みあげたペプチド−樹脂（２．０ｇ）を、ＨＦ装置（
Ｐｅｎｉｎｓｕｌａ　Ｌａｂｓ．　Ｉｎｃ．，　Ｔｙｐ
ｅ　１Ｂ）中の１：１（ｖ／ｖ）ｐ−チオクレゾール／
ｐ−クレゾール混合物３ｍｌに懸濁した。この系をメカ
ニカル真空ポンプで真空にして、液体窒素冷却を用いて
ＨＦを濃縮した（３０ｍｌ）。 ０〜５℃で１．５時間攪拌した後、反応混合物を、液体
窒素トラップを用いて減圧下に蒸発させた（２０〜３０
分間）。残渣をエーテルで摩砕して、濾過し、さらにエ
ーテルを加えて３回洗浄した。濾過した残渣をただちに
４リットルの攪拌した希酢酸（０．４％／Ｈ２Ｏ）溶液
に移した。数分の攪拌の後、混合物のｐＨを水酸化アン
モニウムで８．０に調整した。濾過によって樹脂をとり
のぞいて、つづいて、攪拌せずに５℃で（１８時間）、
さらに常温（１９〜２０℃）で３日間、未精製の酸化生
成物を放置した。分析用ＨＰＬＣを用いて酸化の進行を
モニターした。定量　Ｅｌｌｍａｎ　テスト　（Ｈａｂ
ｅｅｂ，　”Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｉｎ　Ｅｎｚｙｍｏｌｏ
ｇｙ”（酵素学の方法」）（１９７２）　Ｈｉｒｓ　及
びＴｉｍａｓｈｅｆｆ　編、Ａｃａｄｅｍｉｃ　Ｐｒｅ
ｓｓニューヨーク　ｐｐ．　４５７〜４６４）を用いて
、精製に進む前に、遊離スルフヒドリル基が消滅したこ
とをモニターした。このテストは、残っているｐ−チオ
クレゾールをとりのぞくために、凍結乾燥した１ｍｌの
サンプルについて行なった。

【００２８】酸化ポリペプチドＩの精製未精製酸化溶液
（４Ｌ）に酢酸（１０ｍｌ）を加えて酸性にし、そのま
まポンプでＣ１８−シリカ（５×３０ｃｍ、１５ｍ、３
００Ａ）カートリッジ（Ｗａｔｅｒｓ　Ａｓｓｏｃｉａ
ｔｅｓ）に送った。生成物は、分取ＨＰＬＣ（Ｓｅｐａ
ｒａｔｉｏｎｓ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ　Ｉｎｃ．）を
用いて精製した。段階的勾配（１００ｍｌづつ増分）は
１リットルごとに移動相の濃度を順次高くしてゆくこと
で作り出した。７０ｍｌ／分の流速で生成物を溶離した
。ＲＰ−ＨＰＬＣ（Ｖｙｄａｃ　Ｃ１８　、２１８ＴＰ
５４１５）で決定した均質の（＞９５％）のフラクショ
ンを保存し、凍結乾燥して７２ｍｇの生成物を得た。こ
の半精製した生成物は、生成物のピークの肩としてより
極性の小さい成分が混入していた。生成物を、前記と同
じ方法で再びＨＰＬＣにかけてさらに精製して、５４ｍ
ｇのエキスタチンを得た。０．２５ｍＭの出発樹脂に対
して、この重量は、全収率で４％となる。単一性は、分
析用ＨＰＬＣで確かめられた。合成生成物を天然の物質
と一緒に注入して、単一のピークを得た。生成物をさら
に、６Ｎ　ＨＣｌ　で加水分解した後に、アミノ酸分析
によって、また全自動エドマン分解（ＡＢＩ４７０Ａプ
ロティンシークエンサー）によって特徴づけをした。最
大１．９％のプレビュー（ｐｒｅｖｉｅｗ）がみられた
。最初の段階からのＰＴＨアミノ酸の高い収量は、また
、Ｃ末端Ｇｌｕ　のピロＧｌｕ　への環化が起こってな
いことを示した。

【００２９】ポリペプチド１の還元と再生ポリペプチド
１（０．５ｍｇ）を、０．０７Ｍ、ｐＨ８．０の酢酸ア
ンモニウム（１０ｍＭＤＴＴ）１ｍｌに溶解して、分析
用ＨＰＬＣによって還元の進行をモニターした。１時間
後、出発物質は定量的に、単一の還元生成物に変わった
。この還元生成物を、０．０７Ｍ酢酸アンモニウムバッ
ファー（４リットル）に対して直径１２ｍｍ、１０００
ＭＷ分子分画セルロースチューブ（Ｓｐｅｃｔｒｕｍ　
Ｍｅｄｉｃａｌ　Ｉｎｄ．）を用いて（２４時間）透析
すると、エキスタチンのみが得られた。再び酸化する前
に、このポリペプチドが完全に還元された形態であるこ
とを確かめるために、６Ｍ塩酸グアニジンの存在下で前
記と同様に、ＤＴＴ還元をくりかえした。分析用ＨＰＬ
Ｃは、還元生成物が同一の保持時間を有することを確証
した。セミプレパラディブＨＰＬＣによる還元ポリペプ
チドの単離と、それにつづく定量Ｅｌｌｍａｎ分析（Ｈ
ａｂｅｅｂ前出）　は、生成物がオクタヒドロの形態で
あることを示した。

【００３０】実施例２ 実施例１にしたがって製造したポリペプチドは、血小板
のコラーゲンへの付着を阻害することが示される。ポリ
スチレン９６穴マイクロタイタープレート（Ｃｏｓｔａ
ｒ　Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，　ＭＡ）　を、ウェルあたり
５ｍＭ酢酸に溶解した４０ｍｇ／ｍｌのコラーゲン１０
０μｌを用いて室温で１時間コーティングした後、１時
間熱変性したＢＳＡ１０ｍｇ／ｍｌを２００μｌ加えて
、非特異的な細胞結合部位をブロックした。コントロー
ルのウェルはＢＳＡだけでコーティングした。ウェルは
、２０ｍＭ　　ＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．４、０．１４　Ｍ
　ＮａＣｌ　及び２ｍＭ　ＭｇＣｌ２を含むＨＥＰＥＳ
で緩衝した塩類液（ＨＢＳ）で３回洗浄した。１００μ
ｌの洗浄した血小板を、種々の濃度のポリペプチド１、
又はコントロールとしてバッファーと室温で５分間イン
キュベートした後、コラーゲンでコーティングした各ウ
ェルに加えて、室温で４５分間インキュベートした。付
着しない血小板を吸引してとりのぞき、ウェルを２００
μｌのＨＢＳで３回洗浄した。ＢＣＡ試薬を用いて、５
６２ｎｍで各ウェルの吸収を測定してタンパク質アッセ
イにより、付着した血小板の数を決定した。コントロー
ルＡ５６２　は０．３ないし０．１　　Ｏ．Ｄ．の範囲
の値となり、ポリペプチド１は、その濃度に応じて５０
％まで値を減少させた。この阻害を生じさせるポリペプ
チド１のＩＣ５０は、１１０ｎＭである。

【００３１】実施例３、４及び５ 詳述の一般的工程及び実施例１において特定的に述べた
工程を適当に変更した工程にしたがって、配列番号２、
３、４及び５の配列を有するポリペプチドを製造し、血
小板のコラーゲンへの付着に対する阻害作用を評価した
。

【００３２】実施例６ 配列番号１、２、３、４及び５の血小板のコラーゲンへ
の付着を阻害する作用を、実施例２の血小板のコラーゲ
ンへの付着の阻害を決定するアッセイを用いて評価した
。プレートをコラーゲンでなくフィブリノゲンでコーテ
ィングしたことをのぞいては、実施例２で述べたのと同
じアッセイを、血小板のフィブリノゲンへの付着を決定
するために行なった。表１は、これらのポリペプチドが
、ＡＤＰに刺激される血小板の凝固を阻害すること、及
び配列番号５が、血小板のコラーゲンへの付着に対して
最も特異的であることを示している。

【表１】

【００３３】これらのポリペプチドは、遺伝子工学技術
によっても製造できると考えられる。つまり、本出願書
が開示するアミノ酸配列にもとづいて、この開示された
アミノ酸に対応する合成遺伝子をうまく製造し、この遺
伝子を適当なクローニングベクターによって適当なホス
トに導入すればよい。したがって、本発明の範囲には、
遺伝子工学技術により製造したこれらのポリペプチドも
含まれると考える。

【００３４】本発明のポリペプチドは、ヒト又は哺乳類
の血小板がコラーゲンに付着するのを阻害したいあらゆ
る状況において投与できる。本発明の化合物及び方法は
、動脈や器官の取扱い及び／または血小板と人工的表面
との相互作用が血小板の凝固や消耗をひきおこす末梢血
管の手術（血管移植、頸動脈内膜切除）及び心臓血管手
術において有用である。凝固した血小板は、血栓及び血
栓塞栓を形成することがある。本発明のポリペプチドを
これらの患者に投与して、血小板のコラーゲンへの付着
及びコラーゲンによって刺激される血小板の凝固を阻害
することにより、血栓や血栓塞栓の形成を予防できる。

【００３５】心臓血管手術では、通常、血液を酸素化す
るために体外循環を用いる。血小板は体外循環装置の表
面に付着する。この人工的表面から放たれた血小板は止
血作用に欠陥を示す。本発明のポリペプチドを付着の予
防のために投与することができる。

【００３６】これらのポリペプチドの他の適用には、血
栓症治療中及び治療後の血小板性血栓症、血栓塞栓症及
び再閉塞の予防、及び、冠状動脈や他の動脈の形成手術
後及び冠状動脈バイパス処理後の血小板性血栓症、血栓
塞栓症及び再閉塞の予防が含まれる。

【００３７】血小板のコラーゲンへの付着を阻害するポ
リペプチドは、十分な量が結果的に血流中に放出される
ならば、どのような手段で投与してもよい。それらを他
の血小板凝固阻害剤又はプラスミノゲン活性化物質と一
緒にして、血小板凝固を阻害し、また凝固した血小板に
対処してもよい。静脈内投与が現在、好ましい投与経路
であると考えられている。ペプチドは水に可溶であり、
したがって効果的に溶液として投与できる。

【００３８】又、本発明は、本発明のポリペプチドを含
む組成物、及びこれらの組成物を患者に投与することか
ら成る、患者の血栓溶解を誘導して再閉塞をふせぐ方法
を含む。

【００３９】適用の一例として、適量のペプチドを、血
管形成手術を受ける心臓病発作の患者に、静脈内投与す
る。投与は血管形成手術中又は数分前に行ない、その量
は、血小板のコラーゲンへの付着を阻害するのに十分な
、たとえば、約０．０５〜２０ｍＭの間の定常状態の血
漿濃度が得られる量を用いる

【配列表】

【００４０】配列番号：１ 配列の長さ：４９ 配列の型：アミノ酸 配列の種類：ポリペプチド 起源 生物名：エキス・カリナツス（Ｅｃｈｉｓ　ｃａｒｉｎ
ａｔｕｓ　ｖｉｐｅｒ）直接の起源：合成 他の情報　　コラーゲンにたいする血小板付着を阻害

【
００４１】配列番号：２ 配列の長さ：４９ 配列の型：アミノ酸 配列の種類：ポリペプチド 直接の起源：合成 他の情報　　コラーゲンにたいする血小板付着を阻害

【
００４２】配列番号：３ 配列の長さ：４９ 配列の型：アミノ酸 配列の種類：ポリペプチド 直接の起源：合成 他の情報　　コラーゲンにたいする血小板付着を阻害

【
００４３】配列番号：４ 配列の長さ：３９ 配列の型：アミノ酸 配列の種類：ポリペプチド 直接の起源：合成 他の情報　　コラーゲンにたいする血小板付着を阻害

【
００４４】配列番号：５ 配列の長さ：３９ 配列の型：アミノ酸 配列の種類：ポリペプチド 直接の起源：合成

Claims (3)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】　　配列 ＮＨ２　（Ｃｈ）　Ａｌａ　Ａｒｇ　Ｇｌｙ　Ａｓｐ　
   （Ｃｘ）　ＣＯＯＨ　　　　　（ｉ）ＮＨ２　（Ｃｈ）
   　Ａｌａ　Ａｌａ　Ｇｌｙ　Ａｓｐ　（Ｃｘ）　ＣＯＯ
   Ｈ　　　　　（ｉｉ）ＮＨ２　（Ｃｈ）　Ａｌａ　Ａｒ
   ｇ　Ｔｙｒ　Ａｓｐ　（Ｃｘ）　ＣＯＯＨ　　　　　（
   ｉｉｉ）ＮＨ２　（Ｃｈ）　Ａｌａ　Ａｒｇ　Ｇｌｙ　
   Ａｓｐ　（Ｃｙ）　Ｚ　　　　　　（ｉｖ）を有するポ
   リペプチドを、コラーゲンの存在下に血小板と接触させ
   ることにより、血小板のコラーゲンへの付着をブロック
   することから成る、コラーゲンによって刺激される血小
   板の活性化を阻害する方法であって、配列中、Ｃｈは、 Ｇｌｕ　Ｃｙｓ　Ｇｌｕ　Ｓｅｒ　Ｇｌｙ　Ｐｒｏ　Ｃ
   ｙｓ　Ｃｙｓ　ＡｒｇＡｓｎ　Ｃｙｓ　ＬｙｓＰｈｅ　
   Ｌｅｕ　Ｌｙｓ　Ｇｌｕ　Ｇｌｙ　Ｔｈｒ　Ｉｌｅ　Ｃ
   ｙｓ　Ｌｙｓ　Ａｒｇ又は、その保存的アミノ酸置換体
   ；Ｃｘは、Ａｓｐ　Ｍｅｔ　Ａｓｐ　Ａｓｐ　Ｔｙｒ　
   Ｃｙｓ　Ａｓｎ　Ｇｌｙ　ＬｙｓＴｈｒ　Ｃｙｓ　Ａｓ
   ｐＣｙｓ　Ｐｒｏ　Ａｒｇ　Ａｓｎ　Ｐｒｏ　Ｈｉｓ　
   Ｌｙｓ　Ｇｌｙ　Ｐｒｏ　Ａｌａ　Ｔｈｒ又は、その保
   存的アミノ酸置換体；Ｃｙは、Ａｓｐ　Ｍｅｔ　Ａｓｐ
   　Ａｓｐ　Ｔｙｒ　Ｃｙｓ　Ａｓｎ　Ｇｌｙ　ＬｙｓＴ
   ｈｒ　Ｃｙｓ　ＡｓｐＣｙｓ 又はその保存的アミノ酸置換体；そしてＺは、ＮＨ２　
   又はＣＯＯＨである方法。
2. 【請求項２】　　配列 ＮＨ２　（Ｃｈ）　Ａｌａ　Ａｒｇ　Ｇｌｙ　Ａｓｐ　
   （Ｃｘ）　ＣＯＯＨ　　　　　（ｉ）ＮＨ２　（Ｃｈ）
   　Ａｌａ　Ａｌａ　Ｇｌｙ　Ａｓｐ　（Ｃｘ）　ＣＯＯ
   Ｈ　　　　　（ｉｉ）ＮＨ２　（Ｃｈ）　Ａｌａ　Ａｒ
   ｇ　Ｔｙｒ　Ａｓｐ　（Ｃｘ）　ＣＯＯＨ　　　　　（
   ｉｉｉ）ＮＨ２　（Ｃｈ）　Ａｌａ　Ａｒｇ　Ｇｌｙ　
   Ａｓｐ　（Ｃｙ）　Ｚ　　　　　　　（ｉｖ）を有する
   ポリペプチドを血小板に接触させることにより、血小板
   のコラーゲンへの付着をブロックすることから成る、哺
   乳類におけるコラーゲンによって刺激される血小板の活
   性化を阻害する方法であって、配列中、Ｃｈは、 Ｇｌｕ　Ｃｙｓ　Ｇｌｕ　Ｓｅｒ　Ｇｌｙ　Ｐｒｏ　Ｃ
   ｙｓ　Ｃｙｓ　ＡｒｇＡｓｎ　Ｃｙｓ　ＬｙｓＰｈｅ　
   Ｌｅｕ　Ｌｙｓ　Ｇｌｕ　Ｇｌｙ　Ｔｈｒ　Ｉｌｅ　Ｃ
   ｙｓ　Ｌｙｓ　Ａｒｇ又は、その保存的なアミノ酸置換
   体；Ｃｘは、Ａｓｐ　Ｍｅｔ　Ａｓｐ　Ａｓｐ　Ｔｙｒ
   　Ｃｙｓ　Ａｓｎ　Ｇｌｙ　ＬｙｓＴｈｒ　Ｃｙｓ　Ａ
   ｓｐＣｙｓ　Ｐｒｏ　Ａｒｇ　Ａｓｎ　Ｐｒｏ　Ｈｉｓ
   　Ｌｙｓ　Ｇｌｙ　Ｐｒｏ　Ａｌａ　Ｔｈｒ又は、その
   保存的なアミノ酸置換体；Ｃｙは、Ａｓｐ　Ｍｅｔ　Ａ
   ｓｐ　Ａｓｐ　Ｔｙｒ　Ｃｙｓ　Ａｓｎ　Ｇｌｙ　Ｌｙ
   ｓＴｈｒ　Ｃｙｓ　ＡｓｐＣｙｓ 又は、その保存的アミノ酸置換体；そしてＺは、ＮＨ２
   　又はＣＯＯＨである方法。
3. 【請求項３】　　血小板のコラーゲンへの付着をブロッ
   クすることにより、哺乳類におけるコラーゲンによって
   刺激される血小板の活性化を阻害するための組成物であ
   って、以下の配列を有するポリペプチドから成る：ＮＨ
   ２　（Ｃｈ）　Ａｌａ　Ａｒｇ　Ｇｌｙ　Ａｓｐ　（Ｃ
   ｘ）　ＣＯＯＨ　　　　　（ｉ）ＮＨ２　（Ｃｈ）　Ａ
   ｌａ　Ａｌａ　Ｇｌｙ　Ａｓｐ　（Ｃｘ）　ＣＯＯＨ　
   　　　　（ｉｉ）ＮＨ２　（Ｃｈ）　Ａｌａ　Ａｒｇ　
   Ｔｙｒ　Ａｓｐ　（Ｃｘ）　ＣＯＯＨ　　　　　（ｉｉ
   ｉ）ＮＨ２　（Ｃｈ）　Ａｌａ　Ａｒｇ　Ｇｌｙ　Ａｓ
   ｐ　（Ｃｙ）　Ｚ　　　　　　（ｉｖ）配列中、Ｃｈは
   、 Ｇｌｕ　Ｃｙｓ　Ｇｌｕ　Ｓｅｒ　Ｇｌｙ　Ｐｒｏ　Ｃ
   ｙｓ　Ｃｙｓ　ＡｒｇＡｓｎ　Ｃｙｓ　ＬｙｓＰｈｅ　
   Ｌｅｕ　Ｌｙｓ　Ｇｌｕ　Ｇｌｙ　Ｔｈｒ　Ｉｌｅ　Ｃ
   ｙｓ　Ｌｙｓ　Ａｒｇ又は、その保存的アミノ酸置換体
   ；Ｃｘは、Ａｓｐ　Ｍｅｔ　Ａｓｐ　Ａｓｐ　Ｔｙｒ　
   Ｃｙｓ　Ａｓｎ　Ｇｌｙ　ＬｙｓＴｈｒ　Ｃｙｓ　Ａｓ
   ｐＣｙｓ　Ｐｒｏ　Ａｒｇ　Ａｓｎ　Ｐｒｏ　Ｈｉｓ　
   Ｌｙｓ　Ｇｌｙ　Ｐｒｏ　Ａｌａ　Ｔｈｒ又は、その保
   存的アミノ酸置換体；Ｃｙは、Ａｓｐ　Ｍｅｔ　Ａｓｐ
   　Ａｓｐ　Ｔｙｒ　Ｃｙｓ　Ａｓｎ　Ｇｌｙ　ＬｙｓＴ
   ｈｒ　Ｃｙｓ　ＡｓｐＣｙｓ 又は、その保存的アミノ酸置換体；そしてＺは、ＮＨ２
   　又はＣＯＯＨである組成物。