HU216066B - Eljárás von-Willebrand faktor GPIb-kötő domént tartalmazó polipeptidek, és ezeket tartalmazó gyógyászati készítmények előállítására - Google Patents

Abstract

A találmány szerinti eljárással előállítőtt nemglikőzilezett,biőlógiailag aktív, 189–225 aminősavat és adőtt esetben egy N-terminális metiőnin addíciót tartalmazó pőlipeptidek a vőn Willebr nd-faktőr (vWF) GPIb-kötő dőménjét tartalmazzák. Ezek a pőlipeptidekgátőlják a vérlemezke-aggregációt és -adhéziót cerebrővaszkűláris éskardiővaszkűláris rendellenességben szenvedő betegekben. A találmány afenti pőlipeptideket kódőló expressziós plazmidők és az azőkkaltranszfőrmált gazdasejtek előállítására is vőnatkőzik. A találmányszerinti eljárással előállítőtt pőlipeptidek vérlemezke-aggregációtgátló hatásűk következtében gyógyászati készítmények hatóanyagakéntcerebrővaszkűláris, kardiővaszkűláris és egyéb bete ségek kezelésérealkalmazhatók. ŕ

Description

A találmány humán von Willebrand-faktor analógok klónozására és előállítására, valamint hatóanyagként ilyen analógokat tartalmazó gyógyászati készítmények előállítására vonatkozik.

A von Willebrand-faktor (vWF) egy nagy plazmaprotein, amely a véredényfalak felső felületének bevonatát képező belhámsejtekben és a vérlemezke-prekurzor megakarociták által szintetizálódik. A vWF nagy mennyiségben található a vérlemezkék Ó-granuláiban, amelyek tartalma a vérlemezke-aktiválódás során szabadul fel a vérbe. A belhámsejtekben újonnan szintetizálódott vWF két eltérő útvonalon juthat be a vérbe. Egy része eleve a vérbe szekretálódik, főleg diszulfidkötött dimerek vagy kis, 250 000 dalton móltömegű alegységekből álló multimerek formájában. Egy részük azonban a Weibel-Palade-testeknek nevezett szekretáló organellumokba is bekerülhet. A Weibel-Paladetestekben raktározott vWF erősen multimer, méretre a dimertől az 50, vagy még több alegységből álló multimerekig változhat, és a sejtekből kiválasztásfokozó szerekkel, például trombinnal végzett kezelés hatására szabadulhat fel. A legnagyobb mértékben multimer vWF a leghatásosabb a vérlemezke-adhézió elősegítésében.

A vWF-et kódoló gént izolálták, és kimutatták, hogy az több, mint 150 kb hosszúságú. Ez a gén több, mint 20 exonból áll. A vWF mRNS mintegy 9000 bázis hosszúságú, és egy 2813 aminosavból álló pre-provWF-et kódol. Az 1 -22. maradék egy leader-szekvenciát képez, amely valószínűleg lehasad, miután a protein bejutott a durva endoplazmatikus retikulumba. A provWF N-terminális része (741 aminosav) a propeptid, amely az érett vWF-ben nincs jelen. Ez a peptid a vérben jelen van, és kimutatták, hogy azonos a korábban von Willebrand-antigén II (von Willebrand-faktor Ágii) néven ismert vérproteinnel. A propeptid a vWF multimerizációja szempontjából nélkülözhetetlen. Azok a sejtek, amelyekbe csak érett vWF szekvenciákat kódoló vWF cDNS-t juttattak be, csak dimereket termelnek. A propeptid vagy vW Ágii semmiféle funkciója nem ismert.

DNS-szekvencia analízissel kimutatták, hogy a provWF prekurzor ismétlődő dómén alegységekből áll. Négy különböző domént azonosítottak. Az érett vWF három A típusú, három B típusú és két C típusú doménből áll. Van még két teljes és egy részleges D típusú dómén is. A propeptid két D típusú doménből áll, amiből arra következtettek, hogy az kapcsolódó funkciókkal rendelkezhet.

Az érett vWF egy multivalens molekula, amely számos protein számára tartalmaz kötőhelyeket. A kötőhelyek egyike a vérlemezke-glikoprotein Ib-t (GPIb) ismeri fel. Proteolitikus emésztést alkalmazva ezt a helyet az érett vWF 449. és 728. aminosavmaradéka közötti régióban lokalizálták. Ezenkívül a vWF legalább két kollagénkötő helyet, legalább két heparinkötő helyet, egy VIII faktorkötő helyet és egy RGD-helyet tartalmaz, amely a vérlemezke GPIIb/IIIa receptorhoz kötődik.

A kollagénkötő, heparinkötő és GPIb-kötő domének jelenlétét a vWF 449. aminosavtól 728. aminosavig terjedő régiójában több dokumentumban is leírták [lásd például EP-A2 0255206; Pietu G., Biochem. Biophys. Rés. Commun. 164(3), 1339-47 (1989); Fujimura Y., J. Bioi. Chem. 262(4), 1734-9 (1987); Mohri H., J. Bioi. Chem. 264(29), 17361-7 (1989); Pareti F. I., J. Bioi. Chem. 261(32), 15310-5 (1986)]. Andrews R. K. tovább szűkítette a GPI-kötő dómén lehetséges helyzetét [Biochemistry 28(21), 8326-36 (1989)]. Mohri H. és Pareti F. I, a kollagénkötő dómén helyzetét ismertették [Bioi. Chem. 264(29), 17361-7 (1989); és J. Bioi. Chem. 261(32), 15310-5 (1986)], míg a heparinkötő dómén térképezését Fujimura Y. és Mohri H. ismertették [J. Bioi. Chem. 262(4), 1734-9 (1987); és J. Bioi. Chem. 264(29), 17361-7 (1989)]. A fenti fragmentum struktúráját kifejezetten a GPIb-kötő dómén elhelyezkedése szempontjából is megvizsgálták [EP-A2 0255206; és Mohri H., J. Bioi. Chem. 263(34), 17901-4 (1988)]. Az EP-A2 0255206 számú szabadalmi leírásban leírták a vWF teljes hosszúságú GPIb-kötő doménjét (52/48 kD, VaW^-Asn⁷³⁰), amely 280 aminosavat tartalmaz, és ismertettek néhány 15-mer peptidet is.

Azonban a fenti dokumentumok egyikében sem írták le vagy javasolták találmány szerinti polipeptidek előállítását, amelyek maximális hosszúsága 225 aminosav plusz/mínusz egy metioninmaradék, tehát vegyületeink újak. Ezenkívül a találmány szerinti eljárással előállított polipeptidek meglepő módon sokkal nagyobb aktivitást mutatnak, mint a fenti dokumentumokban ismertetett molekulák. Szakember számára egyáltalán nem lehetett kézenfekvő, hogy a fenti dokumentumokban leírt polipeptidek szekvenciájának lerövidítése a találmány szerinti 189-225 aminosavat tartalmazó szekvenciára 10-20-szor aktívabb molekulát fog eredményezni.

A vWF szerepe a vérlemezkék szubendotéliumhoz való tapadásában

Mind klinikai megfigyelések, mind in vitro vizsgálatok bizonyítják, hogy a vWF, és közelebbről, a vWF kötődése a vérlemezke GPIb receptorhoz alapvető fontosságú a normális vérlemezke-adhézióhoz. A von Willebrand-betegség (vWD) néven ismert vérzési rendellenességben szenvedő betegekben a vwF koncentrációja alacsony, vagy teljesen hiányzik a vWF. Ezek a betegek hibás vWF-fel is rendelkezhetnek. Egy másik betegségre, a Bemard-Soulier-szindrómára (BSS) is jellemző a GPIb receptorokat nélkülöző vérlemezke.

A sérült véredényre leginkább hasonlító in vitro rendszer egy perfúziós kamrából áll, amelyben egy kifordított véredény-szegmensen (nyúlaortán, humán post mortem veseartérián vagy humán köldökartérián) át folyatják a vért. A belhámsejtek véredényről való lekaparása után a vért engedik a kamrán átfolyni. A vérlemezke-adhézió mértékét vagy közvetlenül, morfometriával, vagy közvetve, radioaktívan jelzett vérlemezkékkel határozzák meg. A vWD-ben vagy BSS-ben szenvedő betegekből származó vér nem segíti elő a vérlemezke-adhéziót ebben a rendszerben, míg a normális vér igen, ami jelzi, hogy szükség van a vWF-re és a vérlemezke GPIb-re. Ezenkívül, a GPIb-vel szembeni

HU 216 066 Β monoklonális antitestek hozzáadása szintén meggátolja a vérlemezke-adhéziót. A vérlemezke-adhézió vWF-től való függése még kifejezettebb nagy nyírási sebességek mellett, ami például az artériás áramlás során fennáll. Kis nyírási sebességek mellett a vérlemezke-adhéziót egyéb adhéziós proteinek, például a fibronektin elősegíthetik. Feltehetőleg az ilyen egyéb proteinek által szolgáltatott adhéziós erők nem elég nagyok ahhoz, hogy nagy nyírási erők esetén is elősegítsék az adhéziót, és a vWF-függés nyilvánvalóvá válik. A vWF multimer jellege is erősebb kötést biztosíthat a vérlemezke több helyéhez való kötődés révén.

Azon betegek mintegy 20%-ában, akikből érplasztikával vagy szöveti plazminogén aktivátor (tPA) adagolással eltávolították a vérrögöt, újraelzáródás lép fel. Ennek oka feltehetőleg a belhám sérülése a kezelés során, amely a vérlemezkéknek az érintett régióhoz való tapadását eredményezi a véredény belső felületén. Ezt több vérlemezke- és fibrinréteg aggregálódása követi az előzőleg letapadt vérlemezkékhez, és így alakul ki a trombus.

Napjainkig szakirodalomból ismert egyetlen vérlemezke-aggregációt gátló szer sem akadályozza meg a vérlemezkék kezdeti adhézióját a sérült szubendotéliumhoz, amely megakadályozhatná a további vérrög5 képződést.

A találmány tárgya eljárás nemglikozilezett, biológiailag aktív polipeptidek előállítására, amelyek a von Willebrand-faktor (vWF) GPIb-kötő doménjét tartalmazzák. Ezek a polipeptidek többek között a vérlemezke-ad10 hézió és -aggregáció gátlására alkalmazhatók például cerebrovaszkuláris és kardiovaszkuláris rendellenességekben szenvedő betegek kezelésében. A találmány tárgya továbbá eljárás a fenti polipeptideket kódoló plazmidok, az ezeket tartalmazó transzformált sejtek, valamint ezek alkalmazásával a fenti polipeptidek előállítására.

A találmány szerinti eljárással előállított polipeptidek vérlemezke-aggregációt gátló hatásuk következtében gyógyszerkészítmények hatóanyagaként alkalmasak különféle cerebrovaszkuláris és kardiovaszkuláris rendellenességek kezelésére.

A találmány közelebbről az

X-A-

[Cys

Ser

Arg

Leu

Leu

Asp

Leu

Val

Phe

Leu

Leu

Asp

Gly

Ser

Ser

Arg

Leu

Ser

Glu

Alá

Glu

Phe

Glu

Val

Leu

Lys

Alá

Phe

Val

Val

Asp

Met

Met

Glu

Arg

Leu

Arg

Ile

Ser

Gin

Lys

Trp

Val

Arg

Val

Alá

Val

Val

Glu

Tyr

His

Asp

Gly

Ser

His

Alá

Tyr

Ile

Gly

Leu

Lys

Asp

Arg

Lys

Arg

Pro

Ser

Glu

Leu

Arg

Arg

Ile

Alá

Ser

Gin

Val

Lys

Tyr

Alá

Gly

Ser

Gin

Val

Alá

Ser

Thr

Ser

Glu

Val

Leu

Lys

Tyr

Thr

Leu

Phe

Gin

Ile

Phe

Ser

Lys

Ile

Asp

Arg

Pro

Glu

Alá

Ser

Arg

Ile

Alá

Leu

Leu

Leu

Met

Alá

Ser

Gin

Glu

Pro

Gin

Arg

Met

Ser

Arg

Asn

Phe

Val

Arg

Tyr

Val

Gin

Gly

Leu

Lys

Lys

Lys

Lys

Val

Ile

Val

Ile

Pro

Val

Gly

Ile

Gly

Pro

His

Alá

Asn

Leu

Lys

Gin

Ile

Arg

Leu

Ile

Glu

Lys

Gin

Alá

Pro

Glu

Asn

Lys

Alá

Phe

Val

Leu

Ser

Ser

Val

Asp

Glu

Leu

Glu

Gin

Gin

Arg

Asp

Glu

Ile

Val

Ser

Tyr

Leu

Cys]

-B-COOH

aminosavszekvenciával rendelkező, nem-glikozilezett, 45 biológiailag aktív polipeptidek előállítására vonatkozik, ahol

X jelentése NH₂-metionin vagy -NH₂,

A jelentése egy aminosav, vagy egy legfeljebb 5 aminosavat tartalmazó aminosavszekvencia, amely a természetes vWF-ben jelen van, és amelynek karboxilterminális aminosavja a 12. ábra szerinti aminosavszekvenciában az 508. helyzetű tirozin,

B jelentése egy aminosav, vagy legfeljebb 33 aminosavat tartalmazó aminosavszekvencia, amely a természetes vWF-ben jelen van, és amelynek aminoterminális aminosavja a 12. ábra szerinti aminosavszekvenciában a 696. helyzetű aszparaginsav, és a zárójelbe tett szekvenciában lévő két cisztein diszulfidkötéssel kapcsolódik egymáshoz.

A találmány szerinti eljárás értelmében a fenti polipeptideket úgy állítjuk elő, hogy egy gazdasejtet a polipeptidet kódoló expressziós plazmiddal transzformálunk, a kapott transzformált sejteket a plazmid által kódolt polipeptid expresszálására alkalmas körülmé50 nyék között tenyésztjük, majd az így termelődött polipeptidet kinyerjük.

A találmány tárgya továbbá eljárás gyógyászati készítmények előállítására, amelyek egy vérlemezke-aggregációt gátló hatású fenti polipeptidet tartalmaznak vala55 mely gyógyászatilag elfogadható hordozóanyag mellett.

A találmány szerinti eljárással előállított gyógyászati készítmények vérlemezke-aggregáció gátlására alkalmazhatók.

Ezenkívül a találmány szerinti eljárással előállított 60 gyógyászati készítmények különféle rendellenessé3

HU 216 066 Β gek, például cerebrovaszkuláris vagy kardiovaszkuláris rendellenességek vagy trombózis kezelésére, megelőzésére vagy gátlására is alkalmazhatók.

A találmány tisztított, biológiailag aktív fenti polipeptidek kinyerésére is vonatkozik, amelynek értelmében (a) egy baktériumsejtben előállítjuk a fenti aminosavszekvenciával rendelkező, de diszulfidkötést nem tartalmazó első polipeptidet, (b) a baktériumsejtek szétroncsolásával előállítunk egy, az első polipeptidet tartalmazó lizátumot, (c) a lizátum kezelésével az első polipeptidet tartalmazó zárványtesteket állítunk elő, (d) a (c) lépésben kapott zárványtestekből az első polipeptidet oldható formában felszabadítjuk, (e) a kapott első polipeptidet biológiailag aktív formává alakítjuk, (f) a kapott biológiailag aktív polipeptidet kinyerjük és (g) a kinyert, biológiailag aktív polipeptidet tisztítjuk. Az ábrákat röviden az alábbiakban ismertetjük.

1. ábra: pvWIP szerkesztése

A fenti ábra szemlélteti a pvW IP plazmid szerkesztését. Egy sorozat vWF cDNS kiónt izolálunk Ágtl 1-ben (amelyet humán belhámsejt cDNS-könyvtárból izoláltunk). Egy, a teljes GPIb-kötó domént magában foglaló cDNS kiónt a pUC19 EcoRl helyére szubklónozzuk. A kapott pvWlP plazmid egy 2,5 kb hosszúságú cDNS inszertet tartalmaz.

2. ábra: pvWF-VAl szerkesztése

A fenti ábra szemlélteti a pvWF-VAl plazmid szerkesztését. Egy szintetikus oligomert, amely egy ATG iniciátor kodont tartalmaz a 437-es helyzetben lévő Glu (azaz a 12. ábrán látható vWF protein 437. aminosavja) előtt, az Ndel-gyel és Bsu36I-gyel emésztett pvWlP plazmiddal ligáljuk. A kapott plazmidot pvWF-VAl plazmidnak neveztük, és E. coli S<X>930 törzsben ATCC 68530 számon helyeztük letétbe.

3. ábra: pvWF-VBl szerkesztése

A fenti ábra szemlélteti a pvWF-VBl plazmid szerkesztését. Egy szintetikus oligomert, amely egy ATG iniciátor kodont tartalmaz a 443-as helyzetben lévő Phe (azaz a 12. ábrán látható vWF protein 443. aminosavja) előtt, az Ndel-gyel és Bsu36I-gyel emésztett pvWlP plazmiddal ligáljuk. A kapott plazmidot pvWFVB1 plazmidnak neveztük.

4. ábra: pvWF-VA2 szerkesztése

A fenti ábra szemlélteti a pvWF-VA2 plazmid szerkesztését. Egy szintetikus oligomert, amely egy TAA terminátor kodont tartalmaz a 728-as helyzetben lévő Lys (azaz a 12. ábrán látható vWF protein 728. aminosavja) után, a HindlII-mal és Xmal-gyel emésztett pvWF-VAl plazmiddal ligáljuk. A kapott plazmidot pvWF-VA2 plazmidnak neveztük.

5. ábra: pvWF-VB2 szerkesztése

A fenti ábra szemlélteti a pvWF-VB2 plazmid szerkesztését. Egy TAA terminátor kodont tartalmazó szintetikus oligomert Egálunk a HindlII-mal és Xmal-gyel emésztett pvWF-VBl plazmiddal. A kapott plazmidot pvWF-VB2 plazmidnak nevezzük.

6. ábra: pvWF-VA3 szerkesztése

A fenti ábra szemlélteti a pvWF-VA3 plazmid szerkesztését. Egy Ndel-EcoRV fragmenst izolálunk a pvWF-VA2 plazmidból és az Ndel-gyel és PvuII-vel emésztett pMF-945 plazmidhoz ligáljuk (amelyet a 11. ábra szerint szerkesztettünk meg). A kapott plazmidot pvWF-VA3-nak nevezzük. A plazmid expresszálja a VA-nak nevezett vWF GPIb-kötó domént tartalmazó polipeptidet, amely a 12. ábra szerinti 437-728. aminosavakat tartalmazza a deo P]P₂ promoter szabályozása alatt.

7. ábra: pvWF-VB3 szerkesztése

A fenti ábra szemlélteti a pvWF-VB3 plazmid szerkesztését. Egy Ndel-EcoRV fragmenst izolálunk a pvWFVB2 plazmidból és az Ndel-gyel és PvuII-vel emésztett pMF-945 plazmidhoz ligáljuk. A kapott plazmidot pvWF-VB3-nak nevezzük. A plazmid expresszálja a VB-nek nevezett vWF GPIb-kötó domént tartalmazó polipeptidet, amely a 12. ábra szerinti 443-728. aminosavakat tartalmazza a deo P_tP₂ promoter szabályozása alatt.

8. ábra: pvWF-VC3 szerkesztése

A fenti ábra szemlélteti a pvWF-VC3 plazmid szerkesztését. Egy szintetikus linkért Egálunk az Ndel-gyel és Tthllll-gyel emésztett pvWF-VA3-hoz. A kapott plazmidot pvWF-VC3-nak nevezzük, és ATCC 68241 számon helyeztük letétbe. A plazmid expresszálja a VC-nek nevezett vWF GPIb-kötó domént tartalmazó polipeptidet (amelyet VCL-nek vagy VC3-nak is neveznek), amely a 12. ábra szerinti 504-728. aminosavakat tartalmazza a deo P[P₂ promoter szabályozása alatt.

9. ábra: pvWF-VD3 szerkesztése

A fenti ábra szemlélteti a pvWF-VD3 plazmid szerkesztését. Egy szintetikus linkért Egálunk az Ndel-gyel és Tthllll-gyel emésztett pvWF-VA3-hoz. A kapott plazmidot pvWF-VD3-nak nevezzük. Ez a plazmid expresszálja a VD-nek nevezett vWF GPIb-kötó domént tartalmazó polipeptidet, amely a 12. ábra szerinti 513-728. aminosavakat tartalmazza a deo P_tP₂ promoter szabályozása alatt.

10. ábra: vWF-GPIb-kötő domént tartalmazó polipeptidek összehasonlítása

Ez az ábra mutatja a vWF-GPIb-kötő domént tartalmazó polipeptidek relatív elrendeződését. A felső két vonal a vWF cDNS-t és a cDNS-ben a GPIb-kötó domént kódoló régió elhelyezkedését jelenti.

11. ábra: pMF-945 plazmid szerkesztése

Ez az ábra mutatja a pMF-945 plazmid szerkesztését. A pEFF-920 plazmidot (Escherichia coli SO930-ban, letéti száma ATCC 67706) BglII-vel és Ndel-gyel hasítjuk és a nagy fragmenst izoláljuk. Ezt a fragmenst Egáljuk a pMF-5534 plazmid (letéti száma ATCC 67703) BglII-vel és Ndel-gyel való hasításával kapott 549 bp hosszúságú kis fragmenssel. Az így előállított pMF-945 plazmid tartalmazza a PÁR szekvenciát és 5γ 3’ irányban a deo P[P₂ promoter szekvenciákat, a módosított deo riboszomális kötőhelyet egy erősítő szekvenciával, egy pGH analóg kódoló szekvenciát és a T[T₂ transzkripciós terminátorszekvenciákat. A pMF4

HU 216 066 Β

945 plazmid nagy koncentrációban expresszálja a pGH analóg proteint.

12. ábra: Érett humán vWF transzlatált cDNS szekvenciája

Ez az ábra - amely a 12A, 12B, 12C, 12D, 12E, 12F, 12G és 12H ábrából áll - mutatja az érett, humán von Willebrand-faktor transzlatált cDNS szekvenciáját.

Ezt a szekvenciát Verweij C. L. és munkatársai [EMBO Journal 5, 1839-1847 (1986)] és Sadler J. E. és munkatársai [Proc. Natl. Acad. Sci. 82, 6394-6398 (1985)] által ismertetett adatok felhasználásával állítottuk össze. Ez a nukleotidszekvencia a 2519. nukleotiddal kezdődik (ahol az 1. nukleotid a szignálpeptidet kódoló szekvencia kezdetére vonatkozik) és a 8668. nukleotiddal fejeződik be, összesen 6150 nukleotid kódolja a 2050 aminosavból álló, érett vWF-t. A transzlatált aminosavszekvencia az 1. aminosawal kezdődik és a 2050. aminosawal fejeződik be. A megfelelő nukleotid- és aminosavszámozást alkalmaztuk az egész leírásban.

13. ábra: A pvWF-VC3 és pvWF-VCL által expresszált, VC-nek nevezett vWF GPIb-kötő domént tartalmazó polipeptid transzlatált szekvenciája

Ez az ábra mutatja a pwWF-VC3 (ATCC 68241) és pvWF-VCL (ATCC 68242) plazmidok által expresszált von Willebrand-faktor GPIb-kötő domént tartalmazó polipeptid transzlatált szekvenciáját.

A 12. ábra szerinti szekvencia 4028-4702. nukleotidjának megfelelő nukleotidszekvenciát kiegészítettük a transzlációs iniciátor kodont, a metionint kódoló első ATG kodonnal. Ez a szekvencia egy 225 aminosavat (plusz az iniciátor metionint) tartalmazó polipeptidet kódol, ami a 12. ábra szerinti szekvencia 504. Leu 728. Lys aminosavjának, azaz összesen 226 aminosavjának felel meg.

14. ábra: pvWF-VCL szerkesztése

Ez az ábra mutatja a pvWF-VCL plazmid szerkesztését. A pvWF-VC3 plazmidot HindlII-mal és Styl-gyel emésztjük és a 860 bp hosszúságú fragmenst izoláljuk. Ezt a fragmenst ligáljuk a pMLK-100 plazmid HindlIIStyl emésztési termékéből izolált nagy fragmenssel. A kapott plazmidot pvWF-VCL plazmidnak nevezzük és E. coli 4300(F ) törzsben helyeztük letétbe, letéti száma ATCC 68242. Ez a plazmid a VCL-t, a pvWFVC3-mal azonos vWF GPIb-kötő domént tartalmazó polipeptidet (metionin + 504-728. aminosavakat tartalmazó szekvencia) expresszálja, de a XP_L promoter és a deo riboszmális kötőhely szabályozása alatt.

75. ábra: pvWF-VE2plazmid szerkesztése A pvWF-VA2 plazmidot Ndel-gyel és Pstl-gyel emésztjük és a nagy fragmenst izoláljuk. A 16. ábra szerinti 2. és 3. szintetikus oligomert T4 polinukleotidkinázzal kezeljük. A nagy pvWF-VA2 fragmenst ezután a 16. ábra szerinti 1. és 4. szintetikus oligomerrel és a kinázzal kezelt 2. és 3. oligomerrel ligáljuk. A kapott plazmidot pvWF-VE2-nek nevezzük.

16. ábra: A pvWF-VE2 szerkesztésére alkalmazott szintetikus oligomerek

Ez az ábra mutatja a pvWF-VE2 plazmid szerkesztésére alkalmazott négy szintetikus linker (1-4.) szekvenciáját.

77. ábra: pvWF-VE 3plazmid szerkesztése

A pvWF-VE2 plazmidot HindlII-mal emésztjük és a 770 bp hoszszúságú kis fragmenst izoláljuk és a pMLK-7891 plazmid Ndel-HindlII emésztési termékéből izolált nagy fragmenssel ligáljuk. A kapott plazmidot pvWF-VE3 plazmidnak nevezzük.

18. ábra:pvWF-VELplazmid szerkesztése

A pvWF-VE3 plazmidot XmnI-gyel emésztjük, bakteriális lúgos foszfatázzal (BAP) kezeljük és Ndel-gyel és HindlII-mal tovább emésztjük. A pMLK-100 plazmidot Ndel-gyel és HindlII-mal emésztjük és BAP-zal kezeljük. A két emésztési terméket elegyítve és ligáivá kapjuk a pvWF-VEL plazmidot, amely az érett vWF 469-728. aminosavjának megfelelő DNS-szekvenciát expresszálja, a XP_L promoter és a cll riboszomális kötőhely szabályozása alatt.

79. ábra: VCL hatása a BJV-indukálta aggregációra vérlemezkében gazdag humán plazmában (PRP)

Ez az ábra mutatja a standard von Willebrand-faktor(vWF-) függő aggregációs vizsgálat eredményeit, humán PRP alkalmazásával.

20. ábra: VCL hatása a BJV-indukálta aggregációra patkány PRP-ben

Ez az ábra mutatja a standard von Willebrand-faktor(vWF-) függő aggregációs vizsgálat eredményeit, patkány PRP alkalmazásával.

A találmányt részleteiben az alábbiakban ismertetjük. A pvWF-VC3, pvWF-VCL és pvWF-VAl plazmidot Escherichia coliban helyeztük letétbe a Budapesti Egyezmény (International Recognition of the Deposit of Microorganisms fór the Purposes of Patent Procedure) előírásainak megfelelően az American Type Culture Collection-ben (ATCC) (12301 Parklawn Drive, Rockville, Maryland 20852), letéti számuk:

68241, 68242, illetve 68530.

A találmány szerinti nemglikozilezett, biológiailag aktív polipeptidek az alábbi aminosavszekvenciával rendelkeznek:

X-A-	[Cys	Ser	Arg	Leu	Leu
Ser	Ser	Arg	Leu	Ser	Glu
Phe	Val	Val	Asp	Met	Met
Trp	Val	Arg	Val	Alá	Val

Leu	Val	Phe	Leu	Leu	Asp	Gly
Glu	Phe	Glu	Val	Leu	Lys	Alá
Arg	Leu	Arg	lle	Ser	Gin	Lys
Glu	Tyr	His	Asp	Gly	Ser	His

HU 216 066 Β

Alá

Tyr

Ile

Gly

Leu

Lys

Asp

Arg

Lys

Arg

Pro

Ser

Glu

Leu

Arg

Arg

Ile

Alá

Ser

Gin

Val

Lys

Tyr

Alá

Gly

Ser

Gin

Val

Alá

Ser

Thr

Ser

Glu

Val

Leu

Lys

Tyr

Thr

Leu

Phe

Gin

Ile

Phe

Ser

Lys

Ile

Asp

Arg

Pro

Glu

Alá

Ser

Arg

Ile

Alá

Leu

Leu

Leu

Met

Alá

Ser

Gin

Glu

Pro

Gin

Arg

Met

Ser

Arg

Asn

Phe

Val

Arg

Tyr

Val

Gin

Gly

Leu

Lys

Lys

Lys

Lys

Val

Ile

Val

Ile

Pro

Val

Gly

Ile

Gly

Pro

His

Alá

Asn

Leu

Lys

Gin

Ile

Arg

Leu

Ile

Glu

Lys

Gin

Alá

Pro

Glu

Asn

Lys

Alá

Phe

Val

Leu

Ser

Ser

Val

Asp

Glu

Leu

Glu

Gin

Gin

Arg

Asp

Glu

Ile

Val

Ser

Tyr

Leu

Cys]

-B-COOH

ahol

X jelentése NH₂-metionin vagy -NH₂,

A jelentése egy aminosav, vagy egy legfeljebb 5 aminosavat tartalmazó aminosavszekvencia, amely a természetes vWF-ben jelen van, és amelynek karboxil-terminális aminosavja a 12. ábra szerinti aminosavszekvenciában az 508. helyzetű tirozin,

B jelentése egy aminosav, vagy legfeljebb 33 aminosavat tartalmazó aminosavszekvencia, amely a természetes vWF-ben jelen van, és amelynek 20 aminoterminális aminosavja a 12. ábra szerinti aminosavszekvenciában a 696. helyzetű aszparaginsav, és a zárójelbe tett szekvenciában lévő két cisztein diszulfidkötéssel kapcsolódik egymáshoz. A zárójelbe tett szekvencia a 12. ábra szerinti szekvencia 509-695. aminosavjait tartalmazna.

Az egyik kiviteli alak szerint a találmány szerinti polipeptid szekvenciája az alábbi:

X-[Leu His Asp Phe Tyr Cys Ser Arg Leu Leu Asp Leu Val

Phe

Leu

Leu

Asp

Gly

Ser

Ser

Arg

Leu

Ser

Glu

Alá

Glu

Phe

Glu

Val

Leu

Lys

Alá

Phe

Val

Val

Asp

Met

Met

Glu

Arg

Leu

Arg

Ile

Ser

Gin

Lys

Trp

Val

Arg

Val

Alá

Val

Val

Glu

Tyr

His

Asp

Gly

Ser

His

Alá

Tyr

Ile

Gly

Leu

Lys

Asp

Arg

Lys

Arg

Pro

Ser

Glu

Leu

Arg

Arg

Ile

Alá

Ser

Gin

Val

Lys

Tyr

Alá

Gly

Ser

Gin

Val

Alá

Ser

Thr

Ser

Glu

Val

Leu

Lys

Tyr

Thr

Leu

Phe

Gin

Ile

Phe

Ser

Lys

Ile

Asp

Arg

Pro

Glu

Alá

Ser

Arg

Ile

Alá

Leu

Leu

Leu

Met

Alá

Ser

Gin

Glu

Pro

Gin

Arg

Met

Ser

Arg

Asn

Phe

Val

Arg

Tyr

Val

Gin

Gly

Leu

Lys

Lys

Lys

Lys

Val

Ile

Val

Ile

Pro

Val

Gly

Ile

Gly

Pro

His

Alá

Asn

Leu

Lys

Gin

Ile

Arg

Leu

Ile

Glu

Lys

Gin

Alá

Pro

Glu

Asn

Lys

Alá

Phe

Val

Leu

Ser

Ser

Val

Asp

Glu

Leu

Glu

Gin

Gin

Arg

Asp

Glu

Ile

Val

Ser

Tyr

Leu

Cys

Asp

Leu

Alá

Pro

Glu

Alá

Pro

Pro

Pro

Thr

Leu

Pro

Pro

Asp

Met

Alá

Gin

Val

Thr

Val

Gly

Pro

Gly

Leu

Leu

Gly

Val

Ser

Thr

Leu

Gly

Pro Lys]-COOH

HU 216 066 Β ahol

X jelentése NH₂-metionin vagy -NH₂, előnyösen

NH₂-metionin.

A zárójelbe tett szekvencia a 12. ábra szerinti szekvencia 504-728. aminosavjait tartalmazza.

Szakember a találmány leírása alapján rekombináns vagy nemrekombináns DNS-technikák alkalmazásával egyszerűen előállíthatja a fenti polipeptideket.

A találmány szerinti polipeptidek rekombináns DNStechnikák alkalmazásával előállíthatok. A fenti polipeptidek előállításának egyik módja az, hogy a polipeptidet kódoló nukleinsavat megfelelő gazdában, például bakteriális vagy élesztősejtben vagy emlőssejtben expresszáljuk, a szakirodalomból ismert módszerek alkalmazásával, majd a gazdában expresszálódott polipeptidet kinyerjük.

A találmány szerinti polipeptideket kódoló nukleinsavak expresszálására alkalmazható vektorok például vírusok, így például bakteriofágok (mint a lambda fág), kozmidok, plazmidok, és egyéb rekombináns vektorok lehetnek. A nukleinsavmolekulákat a szakirodalomból ismert módszerek alkalmazásával inszertáljuk a vektor genomokba. így például a hagyományos restrikciós enzimhasítási helyeket alkalmazva az inszertet és a vektor DNS-t is egy restrikciós enzimmel kezeljük, így mind a két molekulán komplementer végeket alakítunk ki, amelyek egymással bázispárokat alkotnak, és ezután ligázzal öpsszekapcsolhatók. Úgy is eljárhatunk, hogy az inszertálandó DNS-hez a vektor DNS-ben lévő restrikciós helynek megfelelő linkereket Egálunk, majd a vektor DNS-t olyan restrikciós enzimmel emésztjük, amely ezen a helyen hasítja a DNS-t. Egyéb módszerek szintén alkalmazhatók.

A találmány szerinti polipeptidet kódoló nukleinsavat tartalmazó vektorok bakteriális sejtben, élesztősejtben vagy emlőssejtben való expresszálásra ezenkívül a nukleinsav bakteriális, élesztő- vagy emlőssejtben való expresssziójához szükséges szabályozó elemeket is tartalmaznak, amelyek a polipeptidet kódoló nukleinsavhoz képest úgy helyezkednek el, hogy annak expresszióját lehetővé tegyék. Az expresszióhoz szükséges szabályozó elemek például az RNS-polimeráz megkötésére szolgáló promoterszekvenciák és a riboszómák kötődésére szolgáló transzkripciós iniciátorszekvenciák lehetnek. így például egy bakteriális expressziós vektor tartalmazhat egy promotert, például a P_L promotert vagy deo promotereket és a transzkripció iniciálására a C_n vagy deo riboszomális kötőhelyeket. Az ilyen vektorok a kereskedelmi forgalomban kaphatók, vagy a szakirodalomból ismert módszerekkel, például a vektorok szerkesztésére fent általánosan ismertetett módszerekkel ismert szekvenciákból előállíthatók.

A találmány szerinti polipeptidek előállítására nemrekombináns módszereket, például kémiai szintézist, szintetikus DNS-t vagy cDNS-t is alkalmazhatunk. A polipeptid izolálásának egyik módja az, hogy egy humán genomiális könyvtárat egy természetes vagy mesterségesen tervezett DNS-próbával szondázunk, a szakirodalomból ismert módszerek alkalmazásával. A polipeptidet kódoló DNS- és cDNS-molekulák alkalmazhatók a komplementer genomiális DNS, cDNS vagy RNS kinyerésére humán, emlős vagy egyéb állati forrásból, vagy a megfelelő cDNS vagy genomiális kiónok izolálására a cDNS vagy genomiális könyvtárak szűrésével.

A találmány tárgyát képezi továbbá egy eljárás gyógyászati készítmények előállítására, amelyek egy vérlemezke-aggregációt gátló hatású fenti polipeptidet tartalmaznak, valamely gyógyászatilag elfogadható hordozóanyaggal együtt.

Gyógyászatilag elfogadható hordozó alatt a szokásos gyógyászati hordozókat értjük. Az ilyen hordozók szakemberek számára jól ismertek, ide tartoznak például a standard gyógyászati hordozók, mint például a foszfáttal pufferolt sóoldatok, víz, emulziók, például olaj-a-vízben emulziók és a különféle típusú nedvesítőszerek. Hordozó alatt értjük továbbá a steril oldatokat, tablettákat, bevonatos tablettákat és kapszulákat is.

Ezek a hordozók rendszerint segédanyagokat, például keményítőt, tejcukrot, bizonyos típusú agyagokat, zselatint, sztearinsavat vagy annak sóit, magnézium- vagy kalcium-sztearátot, talkumot, növényi zsírokat vagy olajokat, gumikat, glikolokat vagy egyéb ismert segédanyagokat tartalmaznak. Ezek a hordozók tartalmazhatnak ízesítő és színező adalékanyagokat, és egyéb komponenseket is. A fenti hordozókat tartalmazó készítményeket hagyományos módszerekkel formálhatjuk.

A készítményben a hatóanyag olyan mennyiségben van jelen, amely elegendő a vérben 0,06-58 pmol/l, előnyösen mintegy 0,06-29 gmol/l, például 0,23-23 pmol/l koncentráció biztosítására. Más szavakkal kifejezve, a szükséges dózis 0,1-100 mg/testtömeg kg, előnyösen 0,1-50 mg/testtömg kg, például

O, 4-40 mg/testtömeg kg.

A készítmény bármely hagyományos módon adagolható, például intravénásán, intramuszkulárisan, szubkután módon vagy orálisan.

A találmány szerinti eljárással előállított polipeptidek vérlemezke-aggregáció gátlására alkalmazhatók oly módon, hogy a vérlemezkéket egy vérlemezkeaggregációt gátló hatású találmány szerinti fenti polipeptid vérlemezke-aggregációt gátló mennyiségével hozzuk érintkezésbe.

A találmány tárgyát képezi továbbá a fent említett polipeptideket kódoló expressziós plazmidok előállítása is. Egyik kiviteli alak szerint a szögletes zárójelbe tett polipeptidszekvenciát (azaz a 12. ábra szerinti szekvencia 504-728. aminosavját) kódoló expressziós plazmid neve pvWF-VC3, és letéti száma ATCC 68241. Egy másik kiviteli alak szerint a szögletes zárójelbe tett polipeptidszekvenciát (azaz a 12. ábra szerinti szekvencia 504-728. aminosavját) kódoló expressziós plazmid neve pvWF-VCL, és letéti száma ATCC 68242. A találmány szerinti eljárással előállított expressziós plazmidok megfelelő szabályozó elemeket is tartalmaznak a polipeptidet kódoló DNS-hez viszonyítva olyan helyzetben, amely megfelelő gazdasejtben lehetővé teszi a polipeptid expresszióját, ilyen szabályozó elemek például a promoterek és operátorok, mint például a deo

P, P₂ és ÁP_LO_L, a riboszomális kötőhelyek, például a

HU 216 066 Β deo és a c_n, és a represszorok. További megfelelő szabályozó elem például a lac, trp, tac és Ipp promoter (lásd a 0303972 számon 1989. 02. 22-én publikált európai szabadalmi leírást).

A megfelelő szabályozó elemek a plazmidban úgy helyezkednek el a polipeptidet kódoló DNS-hez viszonyítva, hogy a polipeptid megfelelő gazdasejtben való expressziója végbemenjen. Egy találmány szerinti előnyös megvalósítási mód szerint a szabályozó elemek a közvetlenül a polipeptidet kódoló DNS előtt (3’-»5’ irányban) helyezkednek el.

A találmány szerinti eljárással előállított expressziós plazmidokat megfelelő gazdasejtekbe, előnyösen bakteriális gazdasejtekbe vihetjük be. Előnyös bakteriális gazdasejtek például az Escherichia coli sejtek. Megfelelő Escherichia coli sejt például az S®930 vagy 4300 törzs, de egyéb Escherichia coli törzsek és egyéb baktériumok is alkalmazhatók gazdasejtként a plazmidokhoz. Ilyen egyéb baktérium például a Pseudomonas aeruginosa és a Bacillus subtilis.

A gazdaként alkalmazott baktériumok bármilyen törzsbe tartozhatnak, lehetnek például auxotróf törzsek (mint például az A1645), prototróf törzsek (például az A4255), vagy litikus törzsek; F⁺ és F~ törzsek; a lambda profág cl⁸⁵⁷ represszor szekvenciáját hordozó törzsek (mint például az A1645 és A4255); és olyan törzsek, amelyből a deo represszor és a deo gént törölték (lásd a 0303972 számon 1989. 02. 22-én publikált európai szabadalmi leírást). Az Escherichia coli A4255 (F+) törzs letéti száma ATCC 53468, és az Escherichia coli A1645 törzs letéti száma ATCC 67829.

A találmány tárgyát képezi a fenti expressziós plazmidokat tartalmazó baktériumsejtek előállítása is. Egyik kiviteli mód szerint a baktériumsejt egy Escherichia coli sejt. Előnyös kiviteli mód az E. coli δΦ930 törzsben ATCC 68530 számon letétbe helyezett pvWF-VAl plazmidot, a pvWF-VA3 plazmidot, a pvWF-VB3 plazmidot, az E. coli 8Φ5930 törzsben ATCC 68241 számon letétbe helyezett pvWF-VC3 plazmidot, a pvWF-VD3 plazmidot, vagy az E. coli 4300 (F ) törzsben ATCC 68242 számon letétbe helyezett pvWF-VCL plazmidot tartalmazó Escherichia coli sejt előállítása.

Az összes fenti E. coli gazdasejtből eltávolítható a benne tárolt plazmid szakirodalomból jól ismert módszerek alkalmazásával, például az R. P. Novick és munkatársai által ismertetett etidium-bromidos módszerrel [Bacteriol. Review 33, 210 (1969)].

A találmány szerinti egyik eljárás értelmében a fenti polipeptideket úgy állítjuk elő, hogy egy baktériumsejtet a polipeptidet kódoló expressziós plazmiddal transzformálunk, a kapott baktériumsejteket a plazmid által kódolt polipeptid expresszálására alkalmas körülmények között tenyésztjük, majd az így termelődött polipeptidet kinyerjük.

A találmány szerinti eljárással előállított polipeptidek cerebrovaszkuláris rendellenességgel rendelkező betegek kezelésére alkalmazhatók oly módon, hogy a kezelendő betegnek egy találmány szerinti eljárással előállított polipeptidet adagolunk, vérlemezke-aggregációt gátló hatást kiváltó mennyiségben.

A találmány szerinti eljárással előállított polipeptidek továbbá kardiovaszkuláris rendellenességben szenvedő betegek kezelésére is alkalmazhatók oly módon, hogy a kezelendő betegnek egy találmány szerinti polipeptidet adagolunk, vérlemezke-aggregációt gátló hatást kiváltó mennyiségben. A találmány szerinti eljárással előállított polipeptiddel kezelhető kardiovaszkuláris betegség például akut miokardiális infarktus vagy angina lehet.

A találmány szerinti eljárással előállított polipeptidek ezenkívül vérlemezke-aggregáció gátlására is alkalmazhatók érplasztika, trombolitikus kezelés vagy szívkoszorúér-átvezetéses sebészeti beavatkozás előtt álló, alatti vagy azon átesett betegekben oly módon, hogy a kezelendő betegnek egy találmány szerinti eljárással előállított polipeptidet adagolunk, vérlemezke-aggregációt gátló hatást kiváltó mennyiségben.

A találmány szerinti eljárással előállított polipeptidek rákos betegek kezelésére is alkalmazhatók oly módon, hogy a kezelendő betegnek egy találmány szerinti eljárással előállított polipeptidet adagolunk, tumor metasztázist gátló mennyiségben.

A találmány szerinti eljárással előállított polipeptidek trombózisos betegek kezelésére is alkalmazhatók oly módon, hogy a kezelendő betegnek egy találmány szerinti eljárással előállított polipeptidet adagolunk, trombózisgátló hatást kiváltó mennyiségben. A trombózis gyulladásos reakcióval is társulhat.

Ezenkívül a találmány szerinti eljárással előállított polipeptidek vérlemezkék sérült érfelületekhez való adhéziójával járó betegségben szenvedő betegek kezelésére is alkalmazhatók oly módon, hogy a kezelendő betegnek egy találmány szerinti eljárással előállított polipeptidet adagolunk, vérlemezkék sérült érfelületekhez való adhézióját gátló mennyiségben.

A találmány szerinti eljárással előállított polipeptidek továbbá vérlemezkék protézisanyagokhoz vagy -eszközökhöz való adhéziójának meggátlására is alkalmazhatók oly módon, hogy a kezelendő betegnek egy találmány szerinti eljárással előállított polipeptidet adagolunk, a vérlemezkék fenti anyagokhoz vagy eszközökhöz való adhézióját gátló mennyiségben.

A találmány szerinti eljárással előállított polipeptidek újraelzáródás gátlására is alkalmazhatók érplasztikán vagy trombózison átesett betegekben oly módon, hogy a kezelendő betegnek egy találmány szerinti eljárással előállított polipeptidet adagolunk, újraelzáródást gátló mennyiségben.

A találmány szerinti eljárással előállított polipeptidek érelzáródásos krízis megelőzésére is alkalmazhatók sarlósejtes anémiában szenvedő betegekben, oly módon, hogy a kezelendő betegnek egy találmány szerinti eljárással előállított polipeptidet adagolunk, érelzáródásos krízis megelőzésére hatásos mennyiségben.

A találmány szerinti eljárással előállított polipeptidek arterioszklerózis megelőzésére is alkalmazhatók oly módon, hogy a kezelendő betegnek egy találmány szerinti polipeptidet adagolunk, arterioszklerózis megelőzésére hatásos mennyiségben.

A találmány szerinti eljárással előállított polipeptidek trombusokat tartalmazó, vérlemezkében gazdag

HU 216 066 Β aggregátumok trombolitikus kezelésére is alkalmazhatók oly módon, hogy a kezelendő betegnek egy találmány szerinti eljárással előállított polipeptidet adagolunk, trombusokat tartalmazó, vérlemezkében gazdag aggregátumok kezelésére hatásos mennyiségben. 5

A találmány szerinti eljárással előállított polipeptidek nagy nyíróerőknek tulajdonítható vérlemezke-aktiváció és trombusképződés gátlására is alkalmazhatók beszűkült, vagy részlegesen elzáródott artériás betegben oly módon, hogy a kezelendő betegnek egy találmány szerinti eljárással előállított polipeptidet adagolunk, vérlemezke-aktivációt és trombusképződést gátló mennnyiségben.

A találmány szerinti eljárással előállított polipeptidek trombinindukálta vérlemezke-aktiváció megelőzésére is alkalmazhatók oly módon, hogy a kezelendő betegnek egy találmány szerinti eljárással előállított polipeptidet adagolunk, trombinindukálta vérlemezkeaktivációt gátló mennyiségben.

A találmány szerinti eljárással előállított polipeptidek érsérüléseket követő simaizom-proliferáció következtében kialakult beszűkülés megelőzésére is alkalmazhatók oly módon, hogy a kezelendő betegnek egy találmány szerinti eljárással előállított polipeptidet adagolunk, a beszűkülést megakadályozó mennyiségben.

A találmány tisztított, biológiailag aktív találmány szerinti polipeptidek kinyerésére alkalmas eljárásra is vonatkozik, amelynek értelmében (a) egy baktériumsejtben előállítjuk a fenti aminosavszekvenciával rendelkező, de diszulfidkötést nem tartalmazó első polipeptidet, (b) a baktériumsejtek szétroncsolásával előállítunk egy, az első polipeptidet tartalmazó lizátumot, (c) a lizátum kezelésével az első polipeptidet tartalmazó zárványtesteket állítunk elő, (d) a (c) lépésben kapott zárványtestekből az első polipeptidet oldható formában felszabadítjuk, (e) a kapott első polipeptidet biológiailag aktív formává alakítjuk, (f) a kapott biológiailag aktív polipeptidet kinyerjük és (g) a kinyert, biológiailag aktív polipeptidet tisztítjuk.

Az (e) lépésben a polipeptidet egy tioltartalmú vegyülettel és egy diszulfiddal hozzuk érintkezésbe, és ezáltal a polipeptidet „újragombolyítjuk” és visszaoxidáljuk. A tiol-tartalmú vegyület előnyösen glutatíon, tioredoxin, β-merkapto-etanol vagy cisztein lehet.

A (d) lépést denaturálószer, például guanidin-hidrogén-klorid vagy karbamid jelenlétében hajthatjuk végre.

Az (f) lépésben a polipeptid kinyerése a denaturálószer dialízissel való eltávolításából állhat.

A (g) lépésben a biológiailag aktív polipeptid tisztítását kationcserélő kromatográfiával végezhetjük.

Az első polipeptidet is tisztíthatjuk kationcserélő 10 kromatográfiával a (d) lépést követően.

A találmányt közelebbről - a korlátozás szándéka nélkül - az alábbi példákkal kívánjuk szemléltetni. A példákban a vektorok szerkesztésére, az érdekes polipeptideket kódoló gének fenti vektorokba való inszer15 tálására vagy a kapott plazmidok bakteriális gazdasejtekbe való bejuttatására szokásosan alkalmazott módszereket nem ismertetjük részletesen. A fenti módszerek szakemberek előtt jól ismertek, és számos publikációban megtalálhatók, lásd például Sambrook, Fritsch és 20 Maniatis munkáját [Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2. kiadás, Cold Spring Harbor Laboratory Press, USA (1989)].

A géntérkép-helyzetekre való hivatkozás mindig megfelel az azonosan számozott helyzeteknek az érett 25 humán von Willebrand-faktor transzlatált nukleotidszekvenciájában, amely a 12. ábrán látható.

1. példa vWF GPIb-kötő domént tartalmazó polipeptidek 30 klónozása és expressziója

Humán vWF GPIb-kötő dómén cDNS-ének klónozása

Humán endoteliális cDNS könyvtárat (amelyet a CLONTECH Laboratories, Inc-tól szereztünk be) 35 Ágtl 1-ben szűrünk humán vWF-pozitív szekvenciákra, szintetikus DNS-próbák alkalmazásával. A próbákat a humán vWF ismert DNS-szekvenciájának [Sadler és munkatársai, Proc. Natl. Acad. Sci. 82, 6394-6398 (1985) és Verweij és munkatársai, EMBO J. 3, 40 1829-1847 (1986)] megfelelően szintetizáltuk (a vWF dómén határoló 5’ vége és 3’ vége ismert módon köti a GPIb receptort) (lásd 12. ábrát).

A szintetikus próbák szekvenciája az alábbi:

Szekvencia

Nukleotidok

AAATCTGGCAGTGCTCAGGGTCACTGGGATTCAAGGTGAC

3863-3902

CCAGGACGAACGCCACATCCAGAACCATGGAGTTCCTCTT

4700-4739

A vWF cDNS kiónok sorozatát azonosítottunk és izoláltunk, amelyek a teljes GPIb-kőtő domént fedik. A cDNS fragmenseket a pUC-19 (New England Biolabs, Inc) EcoRI helyére szubklónozzuk. A szubklónok egyike, amelyet pvWlP-nek nevezünk (1. ábra) egy 2,5 kb hosszúságú inszertet tartalmaz. Ez a 2,5 kb hosszúságú inszert fedi a teljes GPIb-kötő domént, amely a GPIb-kötő hely előtti (upstream) 550. bp-től a GPIb-kötő hely utáni (downstream) 1100. bp-ig teljed. (A pvWlP szubklónt pvWF-lP-nek is nevezzük).

A vWF GPIb-kötő domént kódoló DNS manipulálása

A GPIb-kötő dómén deo P[P₂ promoter szabályozása alatti expressziójának elérésére E. coliban a pvWlP plazmidból származó vWF cDNS fragmensét alkalmaztuk az alább ismertetett további manipulációkban. Amint azt már említettük, a triptikus emésztéssel kapott, GPIb receptort kötő vWF fragmens a 449. helyzetű aminosavtól, a Val-tól a 728. helyzetű aminosavig, a Lys-ig tart.

HU 216 066 Β

A) A vWF GPIb-kötő dómén 5 ’-végének szubklónozása és egy ATG transzlációs iniciátor kodonnal való kiegészítése

A pvWlP plazmid két megfelelő restrikciós helyet tartalmaz az 5’-végen. A Bsu36I-et, amely a DNS-szekvenciát a 445. aminosavnak megfelelő Ser-nél hasítja, és a Tthl 111-et, amely az 514. aminosavnak megfelelő Asp-nál hasít. Különböző méretű szintetikus fragmenseket terveztünk, amelyekkel az 5’-végen egy ATG iniciátor kodon, valamint további aminosavak inszertálhatók. Ezzel célunk elsősorban az volt, hogy maximalizáljuk a magas szintű expresszió esélyét. Másodsorban ez az első lépés ahhhoz, hogy a vWF GPIb-kötő domént tartalmazó peptid méretét a lehető legkisebb szükséges méretre csökkentsük, és lehetőleg elimináljuk a kollagén- és heparinkötő helyeket, amelyek végső soron interferálhatnak a termék funkciójával.

Al) 5‘-végen 437-es helyzetben Glu aminosav

Ndel-gyel és Bsu36I-gyel emésztett pvWFlP plaz10 midhoz ligáljuk az

5¹ - TATGGAGGTGGCTGGCCGGCGTTTTGCC - 3¹

3' - _ACCTCCACCGACCGGCCGCAAAACGGAGT - 5'

Ndel Bsu36I szekvenciájú szintetikus oligomereket (lásd 2. ábrát). A kapott plazmidot pvWF-VAl plazmidnak nevezzük. A pvWF-VAl plazmidot E. coli 5930 törzsben tartjuk fenn, letéti száma ATCC 68530.

A2) 5 '-végen 443-as helyzetben Phe aminosav

Ndel-gyel és Bsu36I-gyel emésztett pvWFlP plazmidhoz ligáljuk az

5' - TATGTTTGCC - 3'

3' - ACAAACGGAGT - 5' szekvenciájú szintetikus oligomereket (lásd 3. ábrát). A kapott plazmidot pvWF-VBl plazmidnak nevez20 zük.

B) A vWF GPIb-kötő dómén 3‘-végének szubklónozása, transzlációs stop kodon bevezetése

Bl) Stop kodon bevezetése pvWF-VAl plazmidba

Xmal-gyel és HindlII-mal emésztett pvWF-VAl plazmidhoz ligáljuk az

5¹-CCGGGGCTCTTGGGGGTTTCGACCCTGGGGCCCAAGTAAGATATCA-3' ' -CGAAGAACCCCCAAAGCTGGGACCCCGGGTTCATTCTATAGTTCGA-5 ’ szekvenciájú szintetikus oligomert (lásd 4. ábrát). A kapott plazmidot pvWF-VA2 plazmidnak nevezzük. Ez az újonnan konstruált plazmid a 728. aminosavval (Lys) szomszédos helyzetben egy TAA transzlációs terminátor kodont és egy EcoRV helyet tartalmaz.

B2) Transzlációs stop kodon bevezetése pvWF-VBl 35 plazmidba

Xmal-gyel és HindlII-mal emésztett pvWFVB1 plazmidhoz ligáljuk az ’ -CCGGGGCTCTTGGGGTTTCGACCCTGGGGCCCAAGTAAGATATCA

3'-CCGAGAACCCCAAAGCTGGGACCCCGGGTTCATTCTATAGTTCGA-5' szekvenciájú szintetikus oligomert (lásd 5. ábrát). A ka- 45 pott plazmidot pvWF-VB2 plazmidnak nevezzük. vWF GPIb-kötő dómén expressziója Escherichia coliban

A vWF GPIb-kötő dómén expressziójának elérésére deo P1P2 konstitutív promoter rendszeren alapuló különböző expressziós plazmidokat szerkesztettünk.

1. vWF GPIb-kötő doménű polipeptid expressziója, amely a 437-es helyzetű Glu-tól a 728-as helyzetű

Lys-ig tartó aminosavszekvenciát tartalmazza (pvWF-VA2plazmid alapján)

A pvWF-VA2 plazmidból egy Ndel-EcoRV fragmenst izolálunk és pMF-945 plazmidba (11. ábra) ligáljuk, amelyet Ndel-gyel és PvuII-vel emésztettünk (6. ábra). A kapott plazmidot pvWF-VA3-nak nevezzük, és Escherichia coli 8Φ930 törzsben tartjuk fenn.

2. vWF GPIb-kötő doménű polipeptid expressziója, amely a 443-as helyzetű Phe-tól a 728-as helyzetű Lys-ig tartó aminosavszekvenciát tartalmazza (pvWF-VB2plazmid alapján)

A pvWF-VB2 plazmidból izolált Ndel-EcoRV fragmenst Ndel-gyel és PvuII-vel emésztett pMF945 plazmidba ligáljuk (7. ábra). A kapott plazmidot pvWF-VB3-nak nevezzük, és Escherichia coli ΞΦ930 törzsben tartjuk fenn.

3. vWF GPIb-kötő doménű polipeptid expressziója, 55 amely az 504-es helyzetű Leu-tól a 728-as helyzetű

Lys-ig tartó aminosavszekvenciát tartalmazza (pvWF-VA3plazmid alapján)

Ndel-gyel és Tthllll-gyel emésztett pvWF-VA3 plazmidhoz ligáljuk az

HU 216 066 Β

5' - TATGTTGCACGATTTCTACTGCAGCAGGCTACTGGACC - 3'

3' - ACAACGTGCTAAAGATGACGTCGTCCGATGACCTGGA - 5'

Ndel TthlllX szintetikus oligomerszekvenciát. A kapott plazmidot pvWF-VC3-nak nevezzük (8. ábra). A pvWF-VC3 plazmidot Escherichia coli SO930 törzsben tartjuk fenn, letéti száma ATCC 68241 (lásd még a 13. ábrát).

3. vWF GPIb-kötő doménű polipeptid expressziója, amely az 513-as helyzetű Leu-tól a 728-as helyzetű

Lys-ig tartó aminosavszekvenciát tartalmazza (pvWF-VA3plazmid alapján)

Ndel-gyel és Tthl 111-gyel emésztett pvWFVA3 plazmidhoz ligáljuk az

5' - TATGCTGGACC - 3'

3¹ - ACGACCTGGA - 5 ’

Ndel TthlllI szintetikus oligomerszekvenciát. A kapott plazmidot pvWF-VD3-nak nevezzük (9. ábra). A pvWFVD3 plazmidot Escherichia coli ΞΦ930 törzsben tartjuk fenn.

vWF-GPIb-kötő domént tartalmazó polipeptidek expressziója

Az expresszós plazmidok összehasonlítása a 10. ábrán látható. A pvWF-VA3, pvWF-VB3, pvWWFVC3 és pvWF-VD3 plazmidokat Escherichia coli S4>930 törzsben alkalmaztuk a különböző vWF-GPIbkötő doménű polipeptidek expressziós szintjének tanulmányozására. A kapott kiónokat 100 pg/ml Amp-t tartalmazó LB tápközegben tenyésztjük 37 °C-on 48 órán keresztül.

A 48 órán keresztül tenyésztett baktériumsejteket összegyűjtjük és 10 000 fordulat/perccel 2 percen keresztül centrifugáljuk. Az üledéket 1/10 térfogat 50 mmol/1 koncentrációjú Tris-HCl-ben (pH 8,0) oldjuk. Hozzáadjuk a mintapuffert (amely SDS-t és β-merkapto-etanolt tartalmaz). A mintákat 10 percen keresztül forraljuk, majd 10% SDS-poli(akril-amid)-gélre visszük. A vWF GPIb-kötő doménű polipeptidek expressziója viszonylag alacsony volt a pvWF-VA3, pvWF-VB3 és pvWFVD3 kiónokban a bakteriális összes proteinhez viszonyítva. A fenti klónokból származó vWF polipeptidek Western biot analízissel detektálhatok, kereskedelmi forgalomban kapható poliklonális vWF antitest (Dekopatts a/s, Glostrup, Dánia) alkalmazásával.

A pvWF-VC3 plazmiddal transzformált Escherichia coli δΦ930 törzsből származó kiónok azonban nagy koncentrációban expresszálták a vWF GPIb-kötő doménű polipeptidet (504. Leu aminosavtól a 728. Lys aminosavig tartó szekvencia + metionin), amely fő sávként detektálható Coomassie festéssel.

A pvWF-VC3 plazmidot tartalmazó Escherichia coli δΦ930 törzset ATCC 68241 számon letétbe helyeztük. Ezután szerkesztettünk egy indukálható plazmidot, amely ugyanazt a vWF kódoló régiót tartalmazza, mint a pvWF-CV3, a ÁP_L promoter és a deo riboszomális kötőhely szabályozása alatt expresszálva (14. ábra). Ez az új, pvWF-VCL-nek nevezett plazmid nagy koncentrációban expresszálja a VCL-t (vWF GPIb-kötő dómén polipeptid, amely metioninból + az 504. Leu-tól a 728. Lys-ig tartó aminosavszekvenciából áll). Ezt a plaz10 midot Escherichia coli 4300 törzsben helyeztük letétbe, letéti száma ATCC 68242. Az Escherichia coli 4300 törzs - amely az ATCC 12435 letéti számú Escherichia coli törzsből származik - egy vadtípusú, F-, biotindependens törzs, amely λ cI857 hőmérséklet15 érzékeny represszort tartalmaz. (Egy harmadik megkonstruált plazmid, amely ugyanezt a vWF kódoló régiót tartalmazza a λ promoter és a cll riboszomális kötőhely szabályozása alatt, nem expresszál Coomassie-festéssel detektálható mennyiségű vWF peptidet.)

A pvWF-VCL Ndel-HindlII inszertjét más expressziós vektorokba is szubklónozhatjuk, például a kereskedelmi forgalomban kapható pUC 19-be, ily módon olyan polipeptidsorozatot állíthatunk elő, amelyek ugyanazt az 509 (cys)-695. (cys) aminosavszekvenciát tartalmazzák, és ugyanazzal a biológiai aktivitással rendelkeznek.

2. példa vWF GPIb-kötő domént tartalmazó polipeptideket expresszáló baktériumok fermentálása

A pvWF-VC3 klón fermentálásának méretnagyítása során azt tapasztaltuk, hogy a gazdasejt instabilitása következtében hajlamos elveszíteni a plazmidot. A plazmidok elvesztése a vWF GPIb-kötő doménű polipeptid expressziójának csökkenését okozza. Szükségesnek találtuk a folyamatos szelekciós nyomás alkalmazását (azaz ampicillin folyamatos adagolását) a plazmid kópiaszámának és az expresszió szintjének fenntartása érdekében. A nagyüzemi méretű fermentálást 12 órán keresztül haj40 tottuk végre.

A fermentálást az alábbi összetételű tápközegben végezzük:

N-Z amino AS	20 g
élesztőkivonat	10g
NaCl	5g
K2HPO4	2,5 g
MgSO4.7H2O	1,0 g
habzásgátló	0,4 ml
A tápközeghez 150 ml/1 végkoncentrációban 50%-

os fruktózoldatot adunk, és a fermentorba folyamatosan 100 mg/ml koncentrációjú ampicillint szivattyúzunk, összesen 8 ml/1 végkoncentrációban. A fermentálást 12 órán keresztül végezzük 37 °C-on.

Polipeptidek tisztítása

A sejteket 12 órán keresztüli fermentálás után összegyűjtjük és centrifugáljuk. A baktérium-üledéket pufferoldatban [összetétele: 50 mmol/1 Tris (pH 8,0), 50 mmol/1 NaCl, 1 mmol/1 EDTA, 1 mmol/1 DTT (ditiotreitol), 1 mmol/1 PMSF (fenil-metil-szulfonil-fluo60 rid) és 10% glicerin)] újra szuszpendáljuk. További

HU 216 066 Β centrifugálás és szonikálás után a vWF GPIb-kötő doménű polipeptid az üledékben található.

A vWF GPIb-kötő doménű polipeptidet az üledék mmol/1 DTT-t, 25 mmol/1 Trist (pH 8,0) és 1 mmol/1 EDTA-t tartalmazó, 8 mol/1 koncentrációjú karbamidban szobahőmérsékleten való szolubilizálásával tisztítjuk tovább. A szolubilizált üledéket DEAE cellulóz ioncserélő oszlopon kromatografálva frakcionáljuk. (Az elúciós puffer összetétele a fent megadott, azzal az eltéréssel, hogy a DTT koncentrációja 0,15 mmol/1).

A vWF GPIb-kötő doménű polipeptid 150 mmol/1

NaCl-koncentrációnál eluálódik. A fenti pufferrel 50 mmol/1 NaCl-koncentrációra való hígítás után a részlegesen tisztított peptidet Q-Sepharose oszlopra visszük fel. A Q-Sepharose oszlop eluálását változó koncentrációjú NaCl-dal végezzük (lépcsős elúció). A vWF GPIbkötő doménű polipeptidet a 100 mmol/1, 200 mmol/1, 250 mmol/1 és 500 mmol/1 NaCl-koncentrációnál eluálódott négy csúcsban gyűjtjük össze. Mind a négy frakciót 150 mmol/1 NaCl-dal és 50 mmol/1 Tris-sel (pH 8,0) szemben dializáljuk 36 órán keresztül. A dialízis során a dialízisoldat karbamidkoncentrációja lineáris gradienssel csökkent 6 mmol/1 karbamidról nullára.

3. példa

A vWF GPIb-kötő doménű polipeptidek biológiai aktivitása

Vérlemezke-aggregáció vizsgálata vWF preparátum

A humán plazmából származó vWF-et lejárt szavatossági idejű humán vérbank plazmából tisztítottuk J. Loscalzo és R. I. Handin módszere szerint [Biochemistry 23, 3880-3886 (1984)]. A plazmából származó tisztított vWF-et Amicon 100 000 kizárású szűrőmembránon koncentráltuk 0,25 mg/ml végkoncentrációra.

Aszialo-vWF preparátum

A plazmából származó, tisztított humán vWF-et L. DeMarco és S. Saphiro módszere szerint desziáloztuk [J. Clin. Invst. 68, 321-328 (1981)], az alábbi módosításokkal :

1. az alkalmazott neuraminidáz II típusú Vibrio cholerából származott (Sigma);

2. a reakcióelegy 0,2 egység enzim/mg proteint és proteáz-inhibitorokat tartalmazott, az alábbi koncentrációkban: benzamidin 20 mmol/1, leupeptin 15 pg/ml és aprotinin 20 egység/ml.

Az aszilalo-vWF-et további tisztítás nélkül használtuk a vérlemezke-aggregáció vizsgálatára.

Aszialo-vWF-fel indukált vérlemezke-aggregáció Amint azt fent említettük, az oldható vWF nem kötődik a vérlemezkékhez a GPIb-receptoron keresztül. Az aszialo-vWF - amelyet a sziálsavmaradékok eltávolítására neuraminidázos kezeléssel nyertünk - könnyen kötődik a vérlemezkékhez a GPIb-n keresztül. A desziálozás valószínűleg csökkenti a nettó negatív töltést a vWFen, és ezáltal lehetővé teszi a kötődését a negatív töltésű GPIb receptorhoz. Az aszialo-vWF a vérlemezkékhez kötődve aktiválást, ADP-felszabadulást és GP Ilb/IIIa mediálta aggregációt okoz. Az aszialo-vWF-fel indukált vérlemezke-aggregációt 200 pl PRP (vérlemezkében gazdag plazma) [Fujimura Y. és munkatársai, J. Bioi. Chem. 261, 381-385 (1986)] és 39 pg/ml aszialo-vWF végkoncentráció alkalmazásával vizsgáltuk, Lumi aggrométerben. A vérlemezke-aggregációs vizsgálat eredményeit a VC vWF GPIb-kötő doménű polipeptiddel az I. táblázatban foglaljuk össze.

A VC (amelyet VCL-nek vagy VC3-nak is nevezünk) egy vWF GPIb-kötő doménű polipeptid, amely metionint és az 504-728. aminosavakat (12. ábra) tartalmazza.

I. táblázat: Aszialo-vWF által indukált vérlemezkeaggregáció gátlása PRP-ben egy vWF GPIb-kötő doménű polipeptiddel, a VCvel

Q-Sepharose frakció	VC koncent- rációja (μιηοΙ/Ι)	V érlemezke-aggregáció gátlása (%)
200 mmol/1 NaCl	6	76	64
250 mmol/1 NaCl	6	82	73
500 mmoVI NaCl	6	89	79

Risztocetinnel indukált vérlemezke-aggregáció

A risztocetinnel indukált vérlemezke-aggregáció vizsgálatát tisztított, humán intakt vWF jelenlétében mosott humán vérlemezkékkel hajtottuk végre Fujimura és munkatársai módszere szerint [J. Bioi. Chem. 261, 381-385(1986)].

A risztocetinnel indukált vérlemezke-aggregáció gátlásának eredményeit intakt vWF jelenlétében a Π. táblázatban foglaljuk össze. A fenti vizsgálatok további eredményeit az 5. példában ismertetjük.

II. táblázat: Risztocetinnel indukált vérlemezke-aggregáció gátlása egy vWF GPIb-kötő doménű polipeptiddel, a VC-vel

Q-Sepharose frakció	VC koncentrációja (gmol/l)	Vérlemezkeaggregáció gátlása (%)
200 mmol/1 NaCl	10	76
6	69
3	38
1	22
250 mmol/1 NaCl	10	86
6	67
3	44
1	34
500 mmol/1 NaCl	10	100
6	79
3	68
1	54
0,25	38
Dialízis-puffer (kontroll)	0	0

HU 216 066 Β

4. példa

Javított eljárás tiszta, oxidált, gombolyodott és biológiailag aktív vWF GPIb-kötő doménű polipeptid előállítására

A 2. példában ismertettük a pvWF-VC3 plazmidot tartalmazó sejtek fermentálását. Ezt követően szerkesztettünk egy előnyös plazmidot, a pvWF-VCL-t az 1. példában ismertetett módon, és E. coli A4300 törzsben tartottunk fenn. Ezt a gazda/plazmid rendszert a XP_L promoter szabályozása alatt álló géneket tartalmazó vektorok fermentálására a szakirodalomból ismert módszerek alkalmazásával fermentáltuk (lásd például a 173280 számon 1986. 03. 05-én publikált európai szabadalmi leírás 5. példáját a 73-74. oldalon), biotin, tiamin, nyomelemek és ampicillin hozzáadása nélkül. vWF GPIb-kötő doménű polipeptid tisztítására szolgáló fenti javított eljárásban az A4300/pvWF-VCL fenti fermentálásával kapott sejtüledéket alkalmaztuk.

A fenti eljárás szerint tisztább és aktívabb polipeptid állítható elő, mint a 2. példa szerinti eljárással. Az eljárás általános sémája az alábbi A)-H) lépésekből áll.

A) Sejtek feltárása és az üledék szuszpendálása

A vWF GPIb-kötő doménű polipeptidet tartalmazó üledéket a 2. példában leírtak szerint állítottuk elő, 50 mmol/1 Tris-HCl-t (pH 8,0), 50 mmol/1 NaCl-t, 1 mmol/1 EDTA-t, 1 mmol/1 DTT-t, 1 mmol/1 PMSF-t és 10% glicerint tartalmazó pufferrel készült sejtszuszpenzió szonikálásával és centrifiigálásával.

A zárványtesteket tartalmazó üledéket mintegy 10 vegyes% koncentrációban oldjuk, az oldódás után az oldat végkoncentrációja 8 mol/1 karbamid, 20 mmol/1 DTT, 10 mmol/1 HEPES (pH 8) és 100 mmol/1 NaCl. A kapott oldatot ioncserélő kromatográfiával tovább tisztíthatjuk, az alábbiak szerint. Úgy is eljárhatunk, hogy a zárványtesteket 6 mol/1 guanidin-hidrogén-kloridot tartalmazó pufferben szolubilizáljuk, majd puffercserével karbamidra cseréljük. A zárványtesteket karbamid, guanidin-hidrogén-klorid vagy bármely egyéb denaturálószer különböző koncentrációi jelenlétében, vagy denaturálószerek távollétében is oldhatjuk, például extrém pH alkalmazása mellett.

B) Kationcserélő kromatográfia

Ebben a lépésben a szennyeződések többségét eltávolítjuk és a vWF GPIb-kötő doménű polipeptidet 90%-nál nagyobb tisztasággal állítjuk elő. Ebben a lépésben bármely kationcserélő (például karboxi-metil) módszer alkalmazható, de legelőnyösebb a CM-Sepharose fást flow (gyors átfolyásos) (Pharmacia) kromatográfia. A funkciós csoport például karboxi-metil-csoport, foszfocsoport, vagy szulfoncsoport, például szulfo-propil-csoport lehet. A mátrix alapját szervetlen vegyületek, szintetikus gyanták, poliszacharidok vagy szerves polimerek képezhetik; mátrixként például agarózt, cellulózt, triszakrilt, dextránt, üveggyöngyöt, oxirán-akril-gyöngyöt, akril-amidot, agaróz/poli(akril-amid)-kopolimert (Ultrogel) vagy hidrofil vinil-polimert (Fractogel) alkalmazhatunk. Egyik megvalósítási mód szerint a polipeptidet 8 mol/1 karbamidot, 1 mmol/1 DTT-t, 20 mmol/1 HEPES-t (pH 8), 100 mmol/1 NaCl-t tartalmazó pufferrel ekvilibrált CMSepharose FF oszlopra visszük fel. A tiszta polipeptid mol/1 karbamidot, 1 mmol/1 DTT-t, 20 mmol/1 HEPESt (pH 8), 200 mmol/1 NaCl-t tartalmazó pufferrel eluálódik. A CM-Sepharose FF oszlopra legfeljebb mintegy 30 OD₂₈o egységnyi szolubilizált zárványtestet vihetünk fel ml-enként. Ilyen arány mellett az eluált polipeptid koncentrációja rendszerint 4-5 OD₂₈₀/ml.

C) Oxidáció/újragombolyítás

A fenti kationcserélő lépésben az eluált polipeptidoldatot 6 mol/1 koncentrációjú guanidin-hidrogénkloriddal (GuCl) kezeljük, hogy a jelenlévő aggregátumokat megbontsuk. A polipeptidet ezután 0,05 OD₂₈₀ra hígítjuk 2 mol/1 GuCl-dal (pH 5-11), előnyösen 0,1 mmol/1 GSSG-t (oxidált formájú glutation) tartalmazó 20 mmol/1 HEPES-sel (pH 8). A kapott elegyet egy éjszakán keresztül szobahőmérsékleten állni hagyjuk. A termékeket a feldolgozás előtt gélszűréssel analizáljuk gyors protein folyadékkromatográfiás eljárással (FPLC), például Superose 12-vel. Az analízis szerint ez a proteinkoncentráció reprodukálható módon mintegy 30% helyesen oxidált monomert és 70% S-kötött dimert és multimert, valamint redukált és nem helyesen oxidált monomereket eredményez. Magasabb protein-koncentrációt alkalmazva nagyobb a helyesen oxidált monomerek abszolút hozama, de kisebb %-os hozam az S-kötött dimerek és multimerek nagyobb mértékű keletkezése miatt. így például 0,1 OD_280/ml proteinkoncentráció csak 20% helyesen oxidált monomert eredményez. A koncentrációt 0,025 OD₂₈₀/ml-re csökkentve a helyesen oxidált monomerek hozama 35-40%, de az oxidáció abszolút, literenkénti hozama alacsonyabb. Az oxidációt GuCl helyett karbamidban vagy bármely más denaturálószerben, vagy denaturálószer nélkül, megfelelő pufferolt körülmények között is végezhetjük, amikor például a pH-t, az ionerősséget és a hidrofobicitást változtathatjuk. A karbamid koncentrációja előnyösen 0,5 mol/1 és 10 mol/1 közötti, előnyösebben 4 mol/1, és az előnyös oxidálószer a GSSG 0,01 mmol/1 és 5 mmol/1 közötti, előnyösen 0,1 mmol/1 koncentrációban. Más oxidálószer, például CuCl₂ is alkalmazható, vagy nem adagolunk oxidálószert, ekkor csak a levegő általi oxidációt hasznosítjuk. Méretnagyításhoz 4 mol/1 koncentrációjú karbamidoldat a jelenleg legelőnyösebben alkalmazott oldat az oxidációs lépésben.

D) Koncentrálás

Az oxidációs termékeket koncentráljuk, előnyösen mintegy OD₂₈₀= 1 értékre, egy tangenciális átfolyású ultraszűrő-rendszerrel, 30 K kizárású membrán, például MINITAN vagy FELLICON rendszer (Millipore) alkalmazásával. A szűrlet teljesen tiszta, mivel az anyag viszonylag tiszta, és a szennyeződések többsége túl nagy ahhoz, hogy a 30 K membránon átjusson. Ezért a szűrlet újra felhasználható az oxidáció kivitelezésére. Ezzel jelentős megtakarítás érhető el, mivel a 2 mol/1 koncentrációjú GuCl nagy térfogatokban sokba kerül. FPLC analízissel nem mutatható ki különbség az oxidációs termékekben, ha frissen előállított helyett újra felhasznált 2 mol/1 koncentrációjú GuCl-dal végezzük az oxidálást.

E) Dialízis

A GuCl vagy karbamid koncentrációját 10 mmol/1nél kisebb értékre kell csökkenteni. Ezt dialízissel érjük

HU 216 066 Β el, 100 mmol/1 NaCl-ot tartalmazó 20 mmol/1 koncentrációjú HEPES-sel (pH 8) szemben. A dialízist dializálócsóben hajtjuk végre, 2-3 puffercserével, de végrehajthatjuk diaszűréssel is ugyanezen pufferral szemben, tangenciális átfolyású ultraszűrő-rendszerben, 10 K móltömeg kizárású membránt alkalmazva.

A dialízis folyamán a GuCl (vagy karbamid vagy egyéb denaturálószer) koncentrációjának csökkenésével fehér csapadék képződik. Ez a csapadék mintegy 80% D) lépésben előállított proteint tartalmaz, amely S-S-kötött dimerekből, redukált és nem helyesen oxidálódott monomerekből és kevés szennyeződésből áll, amely a kationcserélő lépésben együtt eluálódott a termékkel. A felülúszó közel 100%-ban helyesen oxidálódott és újragombolyított monomerből áll 0,2 OD₂₈₀/ml koncentrációnál, amely a D) lépésben kapott protein mintegy 20%-a. A szennyeződések és a protein nemkívánatos formáinak ilyen szelektív kicsapódása a dialízis eredményeként igen meglepő és előre nem látható volt. A helyesen oxidált monomer hozama jelentősen növelhető a precipitátumból való kinyeréssel. Ezt az alábbiak szerint végezzük el: az oldatot centrifugálással derítjük. A felülúszót eltesszük, és az üledéket DTT-vel kezelve redukáljuk az S-S kötéseket, és újraoxidálunk a fent leírtak szerint. Az üledéket minimális térfogatnyi 6 mol/1 GuCl-t, 20 mmol/1 HEPES-t (pH 8), 150 mmol/1 NaCl-t és 20 mmol/1 DTT-t tartalmazó pufferben oldjuk. Az oldatot Sephadex G25-ön átfolyatjuk, az oldásra használt pufferhez hasonló összetételű pufferben, amely azonban csak 1 mmol/1 DTT-t tartalmaz (20 mmol/1 helyett). Az eluátumot ezután OD₂₈₀= 0,05 értékre hígítjuk és a C), D) és E) lépésben fent leírtak szerint kezeljük. Ezt az eljárást egynél többször is megismételhetjük, egészen addig, míg további tisztított monomert kapunk. Ezután az összes felülúszót egyesítjük.

F) Kationcsere

Az E) lépésben kapott dializátumok egyesített felülúszóját CM-Sepharose-hoz való kötéssel koncentráljuk 100 mmol/1 NaCl-t tartalmazó 20 mmol/1 REPES-ben (pH 8). Az eluálást 400 mmol/1 NaCl-t tartalmazó 20 mmol/1 REPES-sel (pH 8) végezzük. Az eluátum kizárólag monomereket tartalmaz, a magas sókoncentráció ellenére. 3 mg/ml koncentrációkat is elértünk ezzel a módszerrel, és ez még nem a felső határ. Ezt a lépést Heparin-Sepharose-zal is végrehajthatjuk - amely szintén megköti a tisztított monomert - 150 mmol/1 NaCl-t tartalmazó 10 mmol/1 Tris-ben (pH 7,4). A HeparinSepharose-ról való eluálást 500 mmol/1 NaCl-t tartalmazó 10 mmol/1 Tris-HCL-val (pH 7,4) végezzük.

G) Dialízis

Az előző lépésben kapott terméket 150 mmol/1 NaCl-t tartalmazó 20 mmol/1 koncentrációjú REPESsel (pH 8) szemben dializáljuk.

H) Tárolás

Ebben a fázisban a tisztított vWF GIPb-kötő domént tartalmazó polipeptidet liofilizálhatjuk. A lioíilizálás előtti térfogattal azonos térfogatú vízzel rekonstituálva a kapott oldat kizárólag monomer proteint tartalmaz, nyomokban sem tartalmaz dimereket vagy egyéb multímereket FPLC analízis szerint.

A fenti eljárás egy előnyös megvalósítási módja értelmében az alábbiak szerint járunk el.

a) 10 g zárványtestet (nettó száraz tömege 0,43 g) 100 ml végtérfogatban oldunk 8 mol/1 karbamidot, 10 mmol/1 DTT-t, 20 mmol/1 HEPES-t (pH 8) és 100 mmol/1 NaCl-ot tartalmazó pufferben.

b) A proteint 8 mol/1 karbamidot, 1 mmol/1 DTT-t, 20 mmol/1 HEPES-t (pH 8), 100 mmol/1 NaCl-ot tartalmazó pufferrel ekvilibrált CM-Sepharose oszlopra visszük. A proteint 200 mmol NaCl-ot, 8 mol/1 karbamidot, 20 mmol/1 HEPES-t (pH 8) és 1 mmol/1 DTT-t tartalmazó pufferrel eluáljuk és összegyűjtjük.

c) Az előző lépésben kapott eluátumot 6 mmol/1 GuCldal kezelve eltávolítjuk az esetleges aggregátumokat, majd 2 mol/1 GuCl-t, 20 mmol/1 HEPES-t (pH 8) és 0,1 mmol/1 GSSG-t tartalmazó pufferral 0,05 OD₂₈₀/ml-re hígítjuk. Az oxidációt szobahőmérsékleten egy éjszakán keresztül játszatjuk le (megjegyezzük, hogy az oxidációs lépést karbamid jelenlétében is lejátszathatjuk GuCl helyett).

d) Az oxidációs terméket OD₂₈₀= 1 értékre koncentráljuk ultraszűréssel, 30 K membránt tartalmazó MINITAN egységet alkalmazva.

e) Az előző lépésben kapott koncentrátumot három puffercserével dializáljuk 100 mmol/1 NaCl-ot tartalmazó 20 mmol/1 koncentrációjú HEPES pufferrel (pH 8) szemben. A polipeptidet 400 mmol/1 NaCl-ot tartalmazó 20 mmol/1 koncentrációjú HEPES pufferrel (pH 8) eluáljuk és 4 °C-on tároljuk.

g) Az előző lépésben kapott összegyűjtött eluátumot 150 mmol/1 NaCl-ot tartalmazó 20 mmol/1 koncentrációjú HEPES pufferrel (pH 8) szemben dializáljuk 4 °C-on.

h) A dialízis után a tisztított vWF GPIb-kötő domént tartalmanó polipeptidet - amelyet VCL-nek nevezünk - liofilizáljuk.

VCL analízise

1. A fent ismertetett módon tisztított VCL aminosavszekvencia analízise szerint az N-terminális szekvencia Met-Leu-His-Asp-Phe, amely egy N-terminális metionin hozzáadásával megfelel a 12. ábra szerinti várt szekvenciának.

2. A VCL poli(akril-amid)-gélen való vizsgálata szerint a VCL nemredukáló körülmények között alacsonyabb látszólagos móltömegggel elektroforetizálódik, mint redukáló körülmények között (β-merkapto-etanol). Ez az eltolódás a tömörből a kevésbé tömör konfiguráció felé megfelel egy diszulfidkötés redukciójának. Ilyen intramolekuláris kötés az 509es és 695-ös helyzetű risztéinek között alakul ki. (A móltömegben mutatkozó eltolódás nem elég nagy ahhoz, ami megfelelhetne egy intermolekuláris kötés redukciójának.)

5. példa

A VCL-nek nevezett, vWF GPIb-kötő domént tartalmazó polipeptid biológiai aktivitása A 4. példa szerint előállított vWF GPIb-kötő domént tartalmazó polipeptidet VCL-nek nevezzük, és biológiai aktivitását az alábbiak szerint határozzuk meg.

HU 216 066 Β

1. Risztocetin által indukált vérlemezke-aggregáció (RIPA)

A RIPA vizsgálatot a 3. példában leírtak szerint végezzük, milliliterenként 2xlO^s vérlemezkét, 1 pg plazma-vWFet és 1 mg risztocetint tartalmazó reakcióelegyben. A VCL koncentrációsorozatának vizsgálatával meghatároztuk az IC₅₀ értéket, amely 3 vizsgálat eredményeként 0,2-0,3 pmol/l-nek adódott. 100%-os gátlást mintegy 1 pmol/1 VCL-lel értünk el.

2. Aszialo-vWF által indukált vérlemezke-aggregáció

Az aszialo-vWF által indukált vérlemezke-aggregáció vizsgálatát a 3. példában leírtak szerint végeztük 200 pl vérlemezkében gazdag plazmával (PRP) és 10 pg/ml aszialo-vWF-fel, Lumi aggregométerben. A VCL koncentrációsorozatónak vizsgálatával meghatároztuk az IC₅₀ értéket, amely 0,15 pmol/l-nek adódott, teljes gátlást 0,5 pmol/1 VCL-lel értünk el.

3. WL hatása már kialakult aggregátumokra

Megvizsgáltuk a VCL hatását RIPA-val kialakított aggregátumokra. Az aggregátumok az 1. pontban fent leírtak szerint képződtek VCL távollétében. A VCL 0,5 pmol/1 koncentrációjának hozzáadására az aggregátumok azonnal felbomlottak.

4. Trombin által indukált vérlemezke-aggregáció gátlása

A trombin által indukált vérlemezke-aggregáció vizsgálatát 0,025 egység/ml trombin és stractan preparált vérlemezkék alkalmazásával végeztük. A VCL koncentrációsorozatának vizsgálatával meghatároztuk az IC₅₀ értéket, amely 0,3 pmol/l-nek adódott. Ez igen meglepő hatás, mivel egy párhuzamos kísérletben a VCL nem fejtett ki gátló hatást a ¹²⁵I-dal jelzett trombin vérlemezkékhez való direkt kötődésére.

5. Vérlemezke-lerakódásra kifejtett hatás a véráramlás körülményei között

Kifordított, lecsupaszított humán köldökartériát tartalmazó modellrendszerben, áramlási kamrában meghatározható a vérlemezke-lerakódás. Az artériaszakaszon teljes humán vért folyattunk át. 10-15 perc elteltével az áramlást leállítottuk és mikroszkóp alkalmazásával meghatároztuk a vérlemezke-lerakódást. A VCL IC₅₀ értéke ebben a rendszerben mintegy 1 pmol/l-nek adódott.

Az összes fenti eredményt a III. táblázatban foglaljuk össze.

A VCL gátlóhatása a risztocetin vagy aszialo-vWF által indukált vérlemezke-aggregációra, risztocetin által indukált vWF-kötődésre és vérlemezke-adhézióra megszűnik, ha az 509-es és 695-ös helyzetű tiszteinek közötti diszulfidkötést redukáljuk. Néhány kísérletben a redukált VCL kicsapódott az oldatból.

III. táblázat: A VCL nevű, vWF GPIb-kötő domént tartalmazó polipeptid biológiai aktivitása

Vizsgálat száma az 5. példában	Vizsgálat neve	VCL (pmol/1)
1.	Risztocetin által indukált vérlemezkeaggregáció	IC50=0,2-0,3

Vizsgálat száma az 5. példában	Vizsgálat neve	VCL (gmol/l)
2.	Aszialo-vWF által indukált vérlemezkeaggregáció	IC5O=O,15
3.	Már kialakult aggregátumok oldódása	0,5
4.	Trombin által indukált vérlemezke-aggregáció	IC5O=0,3
5.	V érlemezkelerakódásra kifejtett hatás áramló vérben	IC5O=1

6. példa pvWF-VEL plazmid szerkesztése

Olyan plazmidot akartunk szerkeszteni, amely a pvWF-VCL plazmidnál valamivel hosszabb szakaszát expresszálja a vWF GPIb-kötő doménnek. A szerkesztés sémáját a 15-18. ábra és az ábrák rövid ismertetése mutatja.

A) pvWF-2 szerkesztése

A 4. ábra szerint megszerkesztett pvWF-VA2 plazmidot Ndel-gyel és Pstl-gyel emésztjük és a nagy fragmenst izoláljuk. Előállítjuk a 16. ábrán bemutatott 4 szintetikus oligomert. A 2. és 4. oligomert T4 polinukleotid-kinázzal kezelve hozzákapcsoljuk az 5'-foszfátot. A pvWF-VA2 fent említett nagy fragmensét a 15. ábra szerint ligáljuk a négy oligomerrel (amelyek közül kettő kinázzal kezelt, kettő kinázzal nem kezelt). A kapott plazmidot - amelyet pvWF-VE2-nek nevezünk - a 15. ábra mutatja.

B) pvWF-VE3 plazmid szerkesztése

A pvWF-VE3 plazmidot Ndel-gyel és HindlII-mal emésztjük és a vWF GPIb-kötő domént tartalmazó, 770 bp hosszúságú fragmenst izoláljuk. A pMLK-7891 plazmidot szintén Ndel-gyel és HindlII-mal emésztjük és a nagy fragmenst izoláljuk. A kapott plazmidot - amelyet pvWF-VE3-nak nevezünk - a 17. ábra mutatja.

C) pvWF-VEL plazmid szerkesztése

A pvWF-VE3 plazmidot XmnI-gyel emésztjük, bakteriális lúgos foszfatázzal (BAP) defoszforilezzük, majd Ndel-gyel és HindlII-mal emésztjük. A pMLK100 plazmidot Ndel-gyel és HindlII-mal emésztjük és BAP-zal defoszforilezzük. A két emésztési termék ligálásával kapjuk a pvWF-VEL plazmidot, amelyet a 18. ábra mutat. Ez a plazmid expresszálja az érett vWF 469-728. aminosavjának megfelelő DNS-szekvenciát a XP_L promoter és a cll riboszomális kötőhely szabályozása alatt. A protein valószínűleg egy további N-terminális metioninmaradékot is tartalmaz. Egy konzervatív báziscserét hajtunk végre az ala-473 helyen oly módon, hogy a GCC-t GCA-ra cseréljük, amely szintén alanint kódol. Ezzel egy Sphl helyet viszünk be a génbe, a GCCTGC GCATGC-re való cseréje következtében.

A pvWF-VEL expressziója E. coli 4300(F ) törzsben egy 29 kD móltömegű proteint eredményez, amely erősen reagál egy monoklonális anti-vWF antitesttel, ezt a proteint a leírásban VEL-nek nevezzük.

HU 216 066 Β

7. példa

A vWF GPIb-kötő domént tartalmazó polipeptidek gyógyászati alkalmazásai

Az 1. és 4. példákban ismertettük a VCL nevű, új vWF GPIb-kötő domént tartalmazó polipeptid előállítását és tisztítását. A VCL vagy más vWF GPIB-kötő domént tartalmazó polipeptid néhány alkalmazását az alábbiakban ismertetjük. A VCL-t vagy más hasonló polipeptidet tartalmazó gyógyászati készítményeket megfelelő, gyógyászatilag elfogadható hordozókkal formálhatjuk, a hordozók és a formálási eljárások szakemberek számára jól ismertek.

1. A fenti VCL-készítményt alkalmazhatjuk a vérlemezkék sérült érfelületekhez való adhéziójának megakadályozására (5. példa 5. pontja).

2. A fenti VCL-készítményt alkalmazhatjuk a vérlemezkékben gazdag aggregátumok szétbontására (5. példa 3. ponja).

3. A fenti VCL-készítményt alkalmazhatjuk érplasztikát vagy trombolízist követően az újbóli elzáródás megakadályozására [lásd Bellinger és munkatársai, PNAS, USA 84, 8100-8104 (1987), Prevention of occlusive coronary artery thrombosis by a murine monoclonal antibody to porcine von Willebrand Factor].

4. A fenti VCL-készítményt alkalmazhatjuk a nagy nyíróerők miatti vérlemezke-aktiváció és trombusképződés megelőzélére, például beszűkült vagy részlegesen elzáródott artériákban vagy arteriális kettéágazásoknál [lásd Peterson és munkatársai, Blood 2, 625-628 (1987), Shear-induced piatelet aggregation requires von Willebrand Factor and piatelet membráné glycoproteins Ib and Ilb-IIIa)].

5. A fenti VCL-készítményt alkalmazhatjuk érplasztikát vagy trombolízist követően a vérlemezkék trombin általi aktiválása következtében trombózis vagy újbóli elzáródás megakadályozására [lásd Fuster és munkatársai, J. Am. Coll. Cardiol. 12, 78A-84A (1988), Antithrombotic therapy after myocardial reperfusion in acute myocardial infarction],

6. A fenti VCL-készítményt alkalmazhatjuk vérlemezkék protézisanyagokhoz való adhéziójának és azokon való aggregációjának megakadályozására [lásd Badimon és munkatársai, J. of Biomaterials Applications 5, 27-48 (1990), Piatelet interaction to prosthetic materials - role of von Willebrand Factor in Platelet Interaction to PTFE],

7. A fenti VCL-készítményt alkalmazhatjuk intramiokardiális vérlemezke-aggregáció megelőzésére instabil anginás betegekben [lásd Davies és munkatársai, Circulation 73, 418-427 (1986), Intramyocardial piatelet aggregation in patients with unstable angina suffering sudden ischemic cardíac death].

8. A fenti VCL-készítményt alkalmazhatjuk érplasztika, trombolízis vagy egyéb okok miatti artériasérülést követő érgörcsök és érösszehúzódások megelőzésére [lásd Lám és munkatársai, Circulation 75, 243-248 (1987), Is vasospasm related to platelet deposition?].

9. A fenti VCL-készítményt alkalmazhatjuk érplasztikát vagy trombolízist követően az újbóli szűkület megelőzésére [lásd McBride és munkatársai, N. Eng. J. ofMed. 318, 1734-1737 (1988), Restenosis after successftil coronary angioplastyj.

10. A fenti VCL-készítményt alkalmazhatjuk érelzáródásos krízis megelőzésére sarlósejtes anémia esetén [lásd Wick és munkatársai, J. Clin. Invest. 80, 905-910 (1987), Unusually large von Willebrand multimers increase adhesion of sickle erythrocytes to humán endothelial cells under controlled flow].

11. A fenti VCL-készítményt alkalmazhatjuk gyulladásos reakcióval társult trombózis megelőzésére [lásd Esmon, Science 235, 1348-1352 (1987), The reguládon of natural anticoagulant pathways].

12. A fenti VCL-készítményt alkalmazhatjuk arterioszklerózis megelőzésére [lásd Fuster és munkatársai, Circulation Rés. 51, 587-593 (1982), Asteriosclerosis in normál and von Willebrand pigs].

13. A fenti VCL-készítményt alkalmazhatjuk metasztázis elleni szerként [lásd Kitagawa és munkatársai, Cancer Rés. 49, 537-541 (1989), Involvement of platelet membráné glycoprotein Ib and Ilb/IIIa complex in thrombin-dependent and -independent platelet aggregations induced by tumor cells].

8. példa

1. In vitro vizsgálatok

A fenti vizsgálatokhoz a VCL-t vagy a hordozóanyagkontrolit frissen készítettük steril vízzel (2,2 mg/ml törzsoldat).

A) Vérlemezke-aggregáció (PRP)

Ez egy standarizált von Willebrand-faktor- (vWF-) függő aggregációs vizsgálat, amelyben humán vagy patkány vérlemezkében gazdag plazmát (PRP) alkalmazunk. Frakcionálatlan Bothrops jararaca méreg (BJV) amely botrocetint és egy másik trombinszerű komponenst tartalmaz - vagy risztocetin különböző koncentrációinak hozzáadása egyéb további szer távollétében aggregációs választ vált ki. Agonistaként 1,5 mg/ml risztocetint alkalmazva 43 pg/ml VCL védi ki a humán PRP aggregációját. A risztocetin 5,0 mg/ml koncentrációig nem okoz mérhető aggragálódást patkány PRPben. Agonistaként BJV-t alkalmazó rendszerben a VCL 83 pg/ml koncentrációban gyengén gátolja a humán PRP választ (19. ábra), de nem gátolja a patkány PRP aggregálódását (20. ábra).

Ebből arra következtettünk, hogy a risztocetin nem alkalmas agonista patkányban a vWF-függő aggregálódás indukálására. Ezenkívül nem lehetséges a VCL expressziós rendszer vivő hatásait követni patkány-PRP BJV-indukálta aggregálódásának alkalmazásával. Azonban a VCL gátolja a humán PRP-ben a BJV-indukálta aggregátódást in vitro.

B) Vérlemezke trombin receptor vizsgálat

Ezzel a vizsgálattal mérhető a vérlemezke trombin által indukált prokoaguláns expressziója, amelyet röviden az alábbiakban ismertetünk.

Mosott humán vérlemezkéket CaCl₂-ot, Xa faktort, protrombint és humán Ó-trombint tartalmazó pufferben

HU 216 066 Β inkubálunk 60 percen keresztül 28 °C-on. Az inkubálás befejeztével egy alikvotot S2238-at és — a további trombinképződés gátlására - EDTA-t tartalmazó pufferbe viszünk. Az S2238 reakciót 15 perc elteltével szobahőmérsékleten ecetsavval leállítjuk, és mérjük az abszorpciót 405 nm-en. A közvetlenül a hozzáadott humán Ó-trombinnak tulajdonítható S2238 hasítás mértékét egy protrombin nélküli kontroll alkalmazásával határozzuk meg, és ezt az értéket minden eredményből levonjuk. A VCL-t ebben a vizsgálatban 0,1 mg/ml végkoncentrációban vizsgáltuk.

Ez a vizsgálat érzékeny mind a trombin-inhibitorokra, mind a trombín-receptor antagonistákra. VCL jelenlétében a trombinképződés a kontroll 114%-a (n=2).

Ebből arra következtetünk, hogy a VCL ebben a rendszerben nem hat trombin-receptor antagonistaként. 2. In vivő vizsgálatok

Arteriális trombózis modell (patkány)

Ez a módszer lényegében a Shand és munkatársai által használt modell [Thromb. Rés. 45, 505-515 (1987)] módosítotása. A vizsgálatot rutinszerűen végeztük az alábbiak szerint.

A patkányokat¹¹ 'In-vérlemezkékkel és ¹²⁵I-fibrinogénnel jeleztük. A dorsalis aortát módosított SpencerWells csipeszek alkalmazásával 1 percre elszorítottuk. 45 perces reperfuzió után a sérült eret eltávolítottuk, citráttal mostuk és mértük a beütésszámot. Az eredményeket mg vér ekvivalensben adtuk meg. Kiszámítottuk a placebóval és a gyógyszerrel kezelt állatok esetében mért radioaktív értékek különbségét és a gátlás %-aként fejeztük ki.

A VCL kiértékelésének céljából az adagolás módja bólus intravénás injekció volt. A VCL-t 2 mg/kg (n=5) és 4 mg/kg (n=3) dózisban adagoltuk, a lezárás előtt 1 perccel. Az eret ezután 20 percen keresztül reperfundáltuk. A trombózisellenes hatást a 20 perces reperfuzió végpontjában határoztuk meg. A reperfuzió időtartamát (a rutinhoz viszonyítva) azért csökkentettük, hogy ezzel anyagot takarítsunk meg. Megfelelő hordozókontrollokat (n=5 minden dózisnál) is alkalmaztunk.

A IV. táblázat eredményeiből látható, hogy a fenti körülmények között a VCL ebben a modellben gátolja a trombus kialakulását. A gátlás a trombus vérlemezke(^H1In) komponensére 4 mg/kg dózisban látható. Az egyéb változások statisztikusan nem szignifikánsak, így a VCL trombózisellenes hatást mutat ebben a patkány arteriális trombózis modellben.

IV. táblázat: VCL hatása artériás trombus képződésére 5 patkány dorsalis aortában

Dózis (mg/kg)	Gátlás (%)
Vérlemezkék	P	Fibrinogén	P	N
4	61,3±8,0	0,01	34,7±8,7	n.s.	3
2	25,54±20,98	n.s.	22,78± 13,48	n.s.	5

A számadatok jelentése átlagos %-os gátlás±stan15 dard hiba. A kísérletek számát a kezelt csoportban a táblázatban megadtuk, és minden esetben egy 5 állatból álló kontrollcsoporttal hasonlítjuk össze. A statisztikus analízist a mért adatokkal végeztük %-os gátlássá való átalakításuk előtt, n. s. - statisztikusan nem szignifi20 káns.

Összefoglalóan megállapíthatjuk, hogy a VCL trombózisellenes hatást fejt ki ebben a patkány arteriális trombózis modellben, és ez a hatás dózistól függő lehet. 3. Összefoglalás

A fenti adatokból látható, hogy a VCL kölcsönhatásba lép a humán vérlemezke-vWF-receptorral, és ezáltal gátolja a vérlemezke-aggregációt humán PRP-ben. Azonban jelentős különbség van az egyes fajok (patkány és ember) között, ha a vérlemezke-aggregációt összehasonlítjuk. A fenti hatás fajspecificitását és ennek okát tovább nem vizsgáltuk. Gyakorlati szempontból ez azt jelenti, hogy nem tudtunk ex vivő mintákat analizálni a VCL aggregációra és az arteriális trombózisra kifejtett hatása közötti összefüggés megállapítósá35 ra. Ezért a VCL in vivő hatékonyságának analízisét és trombózisellenes szerként! interpretációját patkány arteriális trombózis modellben ez a tény megnehezíti.

Annak ellenére, hogy a GPIb mind a vWF, mind a trombin számára tartalmaz kötőhelyeket, úgy tűnik, hogy a VCL bármilyen hatása a trombin GPIb-hez való kötődésére nem jelenti a trombinindukálta prokoaguláns expresszió antagonizmusát.

A VCL összességében trombózisellenes hatást mutat patkány arteriális trombózis modellben. Ez a gátlás a vWF saját receptoraihoz való kötődésének interferenciájából származhat.

Claims (36)

1. SZABADALMI IGÉNYPONTOK

   1. Eljárás nemglikozilezett, biológiailag aktív polipeptid - amelynek aminosavszekvenciája

   X-A-[Cys Ser Arg Leu Leu Asp Leu Val Phe Leu Leu Asp Gly Ser Ser Arg Leu Ser Glu Alá Glu Phe Glu Val Leu Lys Alá Phe Val Val Asp Met Met Glu Arg Leu Arg Ile Ser Gin Lys

   HU 216 066 Β

   Trp Val Arg Val Ala Val Val Glu Tyr His Asp Gly Ser His Ala Tyr Ile Gly Leu Lys Asp Arg Lys Arg Pro Ser Glu Leu Arg Arg Ile Ala Ser Gin Val Lys Tyr Ala Gly Ser Gin Val Ala Ser Thr Ser Glu Val Leu Lys Tyr Thr Leu Phe Gin Ile Phe Ser Lys Ile Asp Arg Pro Glu Ala Ser Arg Ile Ala Leu Leu Leu Met Ala Ser Gin Glu Pro Gin Arg Met Ser Arg Asn Phe Val Arg Tyr Val Gin Gly Leu Lys Lys Lys Lys Val Ile Val Ile Pro Val Gly Ile Gly Pro His Ala Asn Leu Lys Gin Ile Arg Leu Ile Glu Lys Gin Ala Pro Glu Asn Lys Ala Phe Val Leu Ser Ser Val Asp Glu Leu Glu Gin Gin Arg Asp Glu Ile Val Ser Tyr Leu Cys] -B-COOH

   ahol

   X jelentése NH₂-metionin vagy -NH₂,

   A jelentése 1 aminosav, vagy egy legfeljebb 5 aminosavat tartalmazó aminosavszekvencia, amely a természetes vWF-ben jelen van, és amelynek karboxilterminális aminosavja a 12. ábra szerinti aminosavszekvenciában az 508. helyzetű tirozin,

   B jelentése 1 aminosav, vagy legfeljebb 33 aminosavat tartalmazó aminosavszekvencia, amely a természetes vWF-ben jelen van, és amelynek aminoterminális aminosavja a 12. ábra szerinti aminosavszekvenciában a 696. helyzetű aszparaginsav, és a zárójelbe tett szekvenciában lévő két cisztein díszül fidkötéssel kapcsolódik egymáshoz előállítására, azzal jellemezve, hogy (a) egy, a tárgyi körben definiált peptidet kódoló DNSszekvenciát tartalmazó DNS-fragmenst expresszáltatunk, és az expresszálódott peptidet kinyeijük, vagy

   25 (b) a tárgyi körben definiált peptid aminosavszekvenciájának megfelelő aminosavakat a megfelelő sorrendben összekapcsoljuk.
2. 2. Az 1. igénypont szerinti eljárás olyan polipeptid előállítására, amelynek aminosavszekvenciája

   30 ahol

   X jelentése NH₂-metionin vagy -NH₂, előnyösen NH₂metionin, azzal jellemezve, hogy a megfelelő DNS-fragmenseket vagy aminosavakat alkalmazzuk.

   X- [Leu His Asp Phe Tyr Cys Ser Arg Leu Leu Asp Leu Val

   Phe Leu Leu Asp Gly Ser Ser Arg Leu Ser Glu Ala Glu Phe Glu Val Leu Lys Ala Phe Val Val Asp Met Met Glu Arg Leu Arg Ile Ser Gin Lys Trp Val Arg Val Ala Val Val Glu Tyr His Asp Gly Ser His Ala Tyr Ile Gly Leu Lys Asp Arg Lys Arg Pro Ser Glu Leu Arg Arg Ile Ala Ser Gin Val Lys Tyr Ala Gly Ser Gin Val Ala Ser Thr Ser Glu Val Leu Lys Tyr Thr Leu Phe Gin Ile Phe Ser Lys Ile Asp Arg Pro Glu Ala Ser Arg Ile Ala Leu Leu Leu Met Ala Ser Gin Glu Pro Gin Arg Met Ser Arg Asn Phe Val Arg Tyr Val Gin Gly Leu Lys Lys Lys Lys Val Ile Val Ile Pro Val Gly Ile Gly Pro His

   HU 216 066 Β

   Alá Asn Leu Lys Gin Ile Arg Leu Ile Glu Lys Gin Alá Pro Glu Asn Lys Alá Phe Val Leu Ser Ser Val Asp Glu Leu Glu Gin Gin Arg Asp Glu Ile Val Ser Tyr Leu Cys Asp Leu Alá Pro Glu Alá Pro Pro Pro Thr Leu Pro Pro Asp Met Alá Gin Val Thr Val Gly Pro Gly Leu Leu Gly Val Ser Thr Leu Gly Pro Lys] -COOH
3. 3. Eljárás gyógyászati készítmény előállítására, azzal jellemezve, hogy az 1. vagy 2. igénypont szerinti eljárással előállított polipeptidet mint hatóanyagot a gyógyszerkészítésben szokásosan alkalmazott hordozóés/vagy egyéb segédanyagokkal összekeverjük, és gyógyászati készítménnyé alakítjuk.
4. 4. Eljárás az 1. igénypontban definiált polipeptidet kódoló expressziós plazmid előállítására, azzal jellemezve, hogy egy, az 1. igénypontban definiált polipeptidet kódoló DNS-szekvenciát egy vektorba illesztjük.
5. 5. A 4. igénypont szerinti eljárás a 2. igénypontban definiált polipeptidet kódoló, pvWF-VC3 néven ATCC

   68241 számon letétbe helyezett expressziós plazmid előállítására, azzal jellemezve, hogy a megfelelő kiindulási anyagokat használjuk.
6. 6. A 4. igénypont szerinti eljárás a 2. igénypontban definiált polipeptidet kódoló, pvWF-VCL néven ATCC

   68242 számon letétbe helyezett expressziós plazmid előállítására, azzal jellemezve, hogy a megfelelő kiindulási anyagokat használjuk.
7. 7. Eljárás az 1. vagy 2. igénypontban definiált polipeptid előállítására alkalmas transzformált baktériumsejt előállítására, azzal jellemezve, hogy a 4-6. igénypontok bármelyike szerinti eljárással előállított expressziós plazmidot gazdasejtbe juttatjuk.
8. 8. A 7. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy gazdasejtként Escherichia coli sejtet alkalmazunk.
9. 9. Az 1. vagy 2. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy egy baktériumsejtet a polipeptidet kódoló expressziós plazmiddal transzformálunk, a kapott baktériumsejteket a plazmid által kódolt polipeptid expresszálására alkalmas körülmények között tenyésztjük, majd a termelődött polipeptidet kinyerjük.
10. 10. A 3. igénypont szerinti eljárás cerebrovaszkuláris rendellenességek kezelésére alkalmas, vérlemezkeaggregációt gátló hatású gyógyászati készítmények előállítására, azzal jellemezve, hogy a megfelelő kiindulási anyagokat alkalmazzuk.
11. 11. A 10. igénypont szerinti eljárás cerebrovaszkuláris rendellenességként akut miokardiális infarktus kezelésére alkalmas gyógyászati készítmények előállítására, azzal jellemezve, hogy a megfelelő kiindulási anyagokat alkalmazzuk.
12. 12. A 10. igénypont szerinti eljárás cerebrovaszkuláris rendellenességként angina kezelésére alkalmas gyógyászati készítmények előállítására, azzal jellemezve, hogy a megfelelő kiindulási anyagokat alkalmazzuk.
13. 13. A 3. igénypont szerinti eljárás érplasztika, trombolitikus kezelés vagy szívkoszorúér-átvezetéses sebészeti beavatkozás előtti, alatti vagy utáni kezelésre alkalmas, vérlemezke-aggregációt gátló hatású gyógyászati készítmények előállítására, azzal jellemezve, hogy a megfelelő kiindulási anyagokat alkalmazzuk.
14. 14. A 13. igénypont szerinti eljárás véredények átfolyását biztosító hatású gyógyászati készítmények előállítására, azzal jellemezve, hogy a megfelelő kiindulási anyagokat alkalmazzuk.
15. 15. A 3. igénypont szerinti eljárás rákos betegségek kezelésére alkalmas, tumor metasztázist gátló hatású gyógyászati készítmények előállítására, azzal jellemezve, hogy a megfelelő kiindulási anyagokat alkalmazzuk.
16. 16. A 3. igénypont szerinti eljárás trombózis kialakulását gátló hatású gyógyászati készítmények előállítósára, azzal jellemezve, hogy a megfelelő kiindulási anyagokat alkalmazzuk.
17. 17. A 3. igénypont szerinti eljárás vérlemezkék sérült érfelületekhez történő tapadását gátló hatású gyógyászati készítmények előállítására, azzal jellemezve, hogy a megfelelő kiindulási anyagokat alkalmazzuk.
18. 18. A 3. igénypont szerinti eljárás vérlemezkék protézisanyaghoz vagy -eszközhöz történő tapadását gátló hatású gyógyászati készítmények előállítására, azzal jellemezve, hogy a megfelelő kiindulási anyagokat alkalmazzuk.
19. 19. A 3. igénypont szerinti eljárás érplasztika vagy trombolitikus kezelést követően az erek újbóli elzáródását gátló hatású gyógyászati készítmények előállítására, azzal jellemezve, hogy a megfelelő kiindulási anyagokat alkalmazzuk.
20. 20. A 3. igénypont szerinti eljárás sarlósejtes anémia esetén érelzáródásos krízis kialakulásának megelőzésére alkalmas gyógyászati készítmények előállítására, azzal jellemezve, hogy a megfelelő kiindulási anyagokat alkalmazzuk.
21. 21. A 3. igénypont szerinti eljárás arteriosclerosis megelőzésére alkalmas gyógyászati készítmények előállítására, azzal jellemezve, hogy a megfelelő kiindulási anyagokat alkalmazzuk.
22. 22. A 3. igénypont szerinti eljárás trombustartalmú vérlemezkékben gazdag aggregátumok kezelésére alkalmas gyógyászati készítmények előállítására, azzal jellemezve, hogy a megfelelő kiindulási anyagokat alkalmazzuk.
23. 23. A 3. igénypont szerinti eljárás beszűkült, vagy részlegesen elzáródott artériák esetén vérlemezke-akti19

    HU 216 066 Β vációt és trombusképződést gátló hatású gyógyászati készítmények előállítására, azzal jellemezve, hogy a megfelelő kiindulási anyagokat alkalmazzuk.
24. 24. A 3. igénypont szerinti eljárás trombin által indukált vérlemezke-aktivációt gátló hatású gyógyászati készítmények előállítására, azzal jellemezve, hogy a megfelelő kiindulási anyagokat alkalmazzuk.
25. 25. A 3. igénypont szerinti eljárás simaizom-proliferáció következtében kialakult beszűkülés megelőzésére, kezelésére alkalmas gyógyászati készítmények előállítására, azzal jellemezve, hogy a megfelelő kiindulási anyagokat alkalmazzuk.
26. 26. A 16. igénypont szerinti eljárás gyulladással járó trombózis kialakulását gátló hatású gyógyászati készítmények előállítására, azzal jellemezve, hogy a megfelelő kiindulási anyagokat alkalmazzuk.
27. 27. Eljárás tisztított, biológiailag aktív, 1. vagy 2. igénypontban definiált polipeptid előállítására, azzal jellemezve, hogy (a) egy baktériumsejtben előállítjuk a tárgyi kör szerinti aminosavszekvenciával rendelkező, de diszulfid-kötést nem tartalmazó első polipeptidet, (b) a baktériumsejtek szétroncsolásával előállítunk egy, az első polipeptidet tartalmazó lizátumot, (c) a lizátum kezelésével az első polipeptidet tartalmazó zárványtesteket állítunk elő, (d) a (c) lépésben kapott zárványtestekből az első polipeptidet oldható formában felszabadítjuk, (e) a kapott első polipeptidet biológiailag aktív formává alakítjuk, (f) a kapott biológiailag aktív polipeptidet kinyerjük és (g) a kinyert, biológiailag aktív polipeptidet tisztítjuk.
28. 28. A 27. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy az (e) lépésben a polipeptidet egy tioltartalmú vegyülettel és egy diszulfiddal hozzuk érintkezésbe.
29. 29. A 28. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy tioltartalmú vegyületként glutationt, tioredoxint, β-merkapto-etanolt vagy ciszteint alkalmazunk.
30. 30. A 27. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a (d) lépést denaturálószer jelenlétében hajtjuk végre.
31. 31. A 30. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy denaturálószerként guanidin-hidrogén-kloridot vagy karbamidot alkalmazunk.
32. 32. A 27. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy az f) lépésben a polipeptid kinyerését a denaturálószer dialízissel történő eltávolításával végezzük.
33. 33. A 27. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a g) lépésben a biológiailag aktív polipeptid tisztítását kationcserélő kromatográfiával végezzük.
34. 34. A 33. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy az első polipeptidet a (d) lépést követően tisztítjuk kationcserélő kromatográfiával.
35. 35. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy az 1. igénypontban definiált polipeptidet élesztő-, baktérium- vagy emlőssejtben expresszáltatjuk.
36. 36. A 2. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a 2. igénypontban definiált polipeptidet élesztő-, baktérium- vagy emlőssejtben expresszáltatjuk.