JPH07138293A - 新規生理活性物質 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【構成】分子量、構成成分、サイズおよびＮ末端アミノ
酸部分配列で特定されるポリペプチドＡおよび／または
ポリペプチドＢ。 【効果】ｖＷＦと血小板膜ＧＰＩｂの結合を阻害し、ｖ
ＷＦ依存性の血小板凝集を阻害し、自体では血小板凝集
を惹起しない性質を有しており、高ずり応力による血小
板凝集のみを阻害する優れた抗血栓剤として、広範囲の
血栓塞栓症などの予防あるいは治療薬として有用。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は、血小板の粘着・凝集を
阻害し、抗血栓作用を有するポリペプチドＡまたはポリ
ペプチドＢに関する。

【０００２】

【従来の技術】動脈硬化、外科手術、外傷、分娩および
伝染性の疾病が血栓症すなわち血管内に血液の塊を形成
する危険の増大につながることは周知である。フォンウ
ィルブランド因子（ｖｏｎ Ｗｉｌｌｅｂｒａｎｄ Ｆａ
ｃｔｏｒ：以下ｖＷＦと略す）は、血液凝固第ＶＩＩＩ
因子（血友病因子）と非共有結合による複合体を形成
し、担体蛋白としてその安定化および活性保持をはか
り、凝固血栓（二次止血）の形成に寄与する。もう１つ
の重要な働きは、生体内血管損傷部位における速やかな
血小板血栓（一次止血）形成への直接的な貢献である。
この一次止血は、血小板の血管内皮下組織への粘着、血
小板の活性化および粘着蛋白を介した血小板相互の凝集
［血小板膜糖蛋白（ＧＰ）ＩＩｂ／ＩＩＩａとフィブリ
ノーゲンの結合が重要視されている］という一連の過程
で進行すると考えられているが、ｖＷＦはこの第一ステ
ップである露出血管内皮下組織に対する血小板の粘着反
応において両者間の架橋反応を促す分子糊としての役割
を果たしている。特に、ｖＷＦと血小板膜ＧＰＩｂとの
結合反応が、血小板の内皮下組織への粘着に必須である
と考えられている。遺伝性出血性疾患として知られるフ
ォンウィルブランド病（ｖＷＦの量的あるいは質的異
常）やベルナール・スーリエ症候群（Bernard-Soulier
syndrome: 血小板膜ＧＰＩｂの欠損症）において認めら
れる易出血傾向は生体内におけるこの反応の重要性を示
唆している。

【０００３】ｖＷＦと血小板膜ＧＰＩｂとの結合反応
は、 in vitro では、非生理的モジュレーターであるリ
ストセチン（抗生物質の一種）やボトロセチン［ブラジ
ル産響尾蛇ボトロップス ジャララカ（Bothrops jarar
aca ）由来蛋白］を用いて再現され、上記先天性疾患の
臨床診断にも用いられている。しかしながら、in vivo
での反応メカニズムの詳細は未だ明らかではなく、以下
のような仮説が考えられている。すなわち、血管破綻部
位において、ｖＷＦは血管内皮下組織に結合し、その結
果、ｖＷＦ分子上に構造変化が起こり、血小板膜ＧＰＩ
ｂとの結合能が発現され、血小板膜ＧＰＩｂと結合する
というものである。この仮説において、ｖＷＦは、正常
流血中では決して血小板膜ＧＰＩｂとは結合せず、血管
破綻時あるいはある特殊な流体力学下（高ずり応力）
で、はじめて結合することになる。高ずり応力は、動脈
硬化等の強い血管狭窄を伴う部位に発生し、病態とのか
かわりが最近特にクローズアップされてきた。高ずり応
力で誘導される血小板の凝集には、ｖＷＦと血小板膜Ｇ
ＰＩｂおよびｖＷＦと血小板膜ＧＰＩＩｂ／ＩＩＩａと
の結合が重要であり、一方、低ずり応力で誘導される血
小板の凝集には、フィブリノーゲンと血小板膜ＧＰＩＩ
ｂ／ＩＩＩａとの結合が重要視されている。

【０００４】このような背景から、近年、ｖＷＦと血小
板膜ＧＰＩｂの結合を抑制し、高ずり応力による血小板
の凝集のみを阻害する新しい抗血栓剤創製の試みがなさ
れている。Ｐｅｎｇら（Biochemistry,30,11529-11536,
1991）は、ある種の蛇毒から血小板膜ＧＰＩｂに作用
し、ｖＷＦの結合を阻害する新しい蛇毒蛋白アルボアグ
レギンＢ（ＡＬ−Ｂ）を報告した。

【０００５】

【発明が解決しようとする課題】しかしながら、この蛋
白ＡＬ−Ｂはそれ自体で血小板凝集を惹起してしまい、
医薬品としての発展性を考慮すると、大きな障害となる
ことが予想される。本発明は、ｖＷＦと血小板膜ＧＰＩ
ｂの結合を阻害し、ｖＷＦ依存性の血小板凝集を阻害
し、自体では血小板凝集を惹起しない性質を有するポリ
ペプチドを提供することを目的とする。

【０００６】

【課題を解決するための手段】このような状況下に、本
発明者らは琉球ハブの毒液中に、ｖＷＦ依存性の血小板
凝集を阻害する蛋白の存在を推定して鋭意探索した結
果、ｖＷＦと血小板膜ＧＰＩｂの結合を阻害し、ｖＷＦ
依存性の血小板凝集を阻害し、自体では血小板凝集を惹
起しない性質を有する２種のポリペプチドＡおよびＢを
単離することに成功し本発明を完成させるに至った。

【０００７】すなわち、本発明は、下記物理化学的性質
で特定されるポリペプチドＡまたはポリペプチドＢであ
る。 （１）分子量、構成成分、サイズ： （Ａ）ポリペプチドＡ；ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲ
ル電気泳動法（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）の分析による分子量
が、１４８，７００±５，０００であり、還元後１６，
５００±３，０００であるサブユニットＡ−α、１３，
７００±３，０００であるサブユニットＡ−βとからな
るポリペプチド。 （Ｂ）ポリペプチドＢ；ＳＤＳ−ＰＡＧＥの分析による
分子量が、１３８，５００±５，０００であり、還元後
１６，５００±３，０００であるサブユニットＢ−α、
１３，７００±３，０００であるサブユニットＢ−β、
１４，５００±３，０００であるサブユニットＢ−γと
からなるポリペプチド。 （２）Ｎ末端アミノ酸部分配列： （ａ）ポリペプチドＡのサブユニットＡ−α：配列表１ （ｂ）ポリペプチドＡのサブユニットＡ−β：配列表２ （配列中、 Xaa はアミノ酸残基を意味する。）

【０００８】本発明のポリペプチドＡ、Ｂは、いずれも （ａ）リストセチンおよび／またはボトロセチンによる
ヒトホルマリン固定浮遊血小板およびヒト多血小板血漿
の凝集を阻害する。 （ｂ）ウシｖＷＦによるヒトホルマリン固定浮遊血小板
の凝集を阻害する。 （ｃ）リストセチンおよび／またはボトロセチンによる
ｖＷＦのヒトホルマリン固定血小板への結合を阻害す
る。 （ｄ）ヒト多血小板血漿を用いた高ずり応力により誘導
した血小板凝集を阻害するが、低ずり応力のそれは阻害
しない。 （ｅ）ポリペプチド単独ではヒト固定血小板の凝集を惹
起しない。 という薬理学的性質によっても特徴づけられるものであ
る。なお、ポリペプチドＡは、 （ｆ）ＧＰＩｂ結合蛋白であり、その結合部位がｖＷＦ
結合部位と同一かその近傍である。 （ｇ）還元するとｖＷＦ依存性血小板凝集阻害活性を失
う。 という性質をも有している。従って、本発明には、上記
（１）および（２）によって特定される構造を有するポ
リペプチドは勿論、本発明ポリペプチドのアミノ酸配列
中の一またはそれ以上の部位において、一またはそれ以
上のアミノ酸が欠失し、挿入されまたは置換したポリペ
プチドも、上記ポリペプチドＡおよびＢに共通する
（ａ）乃至（ｇ）の性質、すなわちｖＷＦと血小板膜Ｇ
ＰＩｂの結合を阻害し、ｖＷＦ依存性の血小板凝集を阻
害し、自体では血小板凝集を惹起しない性質を有するこ
とがあるので、かかる同効のポリペプチド（以下同効物
という）も含まれる。本発明における特に好適なポリペ
プチドとしては、上記琉球ハブの蛇毒由来のポリペプチ
ドＡおよび／またはＢあるいはその同効物、とりわけ本
発明者らによって命名されたフラボセチン（Flavoceti
n）Ａおよび／またはＢあるいはその同効物が挙げられ
る。

【０００９】なお、本明細書において、ペプチドのＮ末
端部分アミノ酸配列の表記は、慣例に従い、左端をＮ末
端とし、Ｃ末端方向へ順に右に記載し、またＩＵＰＡＣ
−ＩＵＢ生化学命名委員会による略号あるいは当該分野
における慣用略号に基づき、以下に例示したような三文
字表記のアミノ酸記号を用いて行っている。アラニン
Ａｌａ、アルギニン Ａｒｇ、アスパラギン Ａｓｎ、
アスパラギン酸 Ａｓｐ、システイン Ｃｙｓ、グルタ
ミン酸 Ｇｌｕ、グルタミン Ｇｌｎ、グリシン Ｇｌ
ｙ、ヒスチジン Ｈｉｓ、イソロイシン Ｉｌｅ、ロイ
シンＬｅｕ、リジン Ｌｙｓ、メチオニン Ｍｅｔ、フ
ェニルアラニン Ｐｈｅ、プロリン Ｐｒｏ、セリン
Ｓｅｒ、トレオニン Ｔｈｒ、トリプトファン Ｔｒ
ｐ、チロシン Ｔｙｒ、バリン Ｖａｌ。また、Ｘａａ
が示すアミノ酸残基は、天然のアミノ酸残基であればよ
く、具体的には例えば上述したアミノ酸の残基が挙げら
れる。

【００１０】本発明の生理活性ポリペプチドは、ペプチ
ド合成装置を使用する合成方法によって製造することも
可能であるが、天然物からの単離精製法によって生産す
ることができる。天然物の起源としては、本発明ペプチ
ドの起源である琉球ハブ、トリメレスラス フラボビリ
ディスの蛇毒が最適なものとして挙げられるが、この蛇
毒のみに限定されるものではなく、上記（１）および
（２）の理化学的性質を備えたポリペプチドＡおよび／
またはＢ、あるいは上記（ａ）乃至（ｇ）の性質を有す
るポリペプチドＡおよび／またはポリペプチドＢの同効
物を含有する天然物であればよい。単離・精製は、例え
ば天然物として蛇毒を用いるときは、蛇毒から粗毒を抽
出するかまたはせずして、前記（ａ）乃至（ｅ）の特性
であるリストセチン、ボトロセチンによる血小板凝集阻
害活性、リストセチン、ボトロセチンによるｖＷＦの血
小板への結合阻害活性、ずり応力により誘導した血小板
凝集阻害活性、およびペプチド自体の血小板凝集性、必
要によりポリペプチドＡについてはさらに上記（ｆ）乃
至（ｇ）の特性をも指標としながら、種々の吸着剤に対
する吸着親和性の差、種々の溶剤に対する溶解性あるい
は溶解度の差、２種の混じり合わない液相間の分配の
差、分子の大きさに基づく溶出速度の差、溶液からの析
出性あるいは析出速度の差などを利用する種々の手段を
適用して行なわれる。これらの手段は、必要に応じて、
単独であるいは任意の順序に組合せ、また反復して適用
することができる。粗毒を抽出するときは、ポリペプチ
ドＡおよび／またはＢを溶解可能な溶媒、ことにメタノ
ール、エタノール、イソプロパノールなどのアルコール
系の溶媒、ベンゼン、トルエン、キシレン、アセトン、
メチルエチルケトン、エーテル、テトラヒドロフラン、
ジオキサン、ジメチルスルオキシド、酢酸エチルやアセ
トニトリルなどの有機溶媒や水、あるいはこれらの混合
溶媒を用い、必要なら加温撹拌下に行なうのが有利であ
る。 また、単離精製手段としては、特にＤＥＡＥ−セ
ファロース（DEAE-Sepharose）ＦＦ、ヘパリン−セファ
ロース（Heparin-Sepharose）ＣＬ−６Ｂ、フェニル−
５ＰＷ（Phenyl−5PW）、Ｑ−セファロースなどをカラ
ム充填剤とするカラムクロマトグラフィーや限外濾過な
どに付して実施するのが有利である。

【００１１】本発明の新規生理活性物質の特性は、下記
の方法により、定められたものである。 （物質）琉球ハブ由来の蛇毒（凍結乾燥品）は日本蛇族
学術研究所より入手した。なお、琉球ハブは奄美、沖縄
群島に多数生息し、毒の収量もよく、捕獲も容易である
ことから安価に得ることができる。粗毒を収集する方法
は、まず琉球ハブを生きたまま保定し、円錐形液量器の
縁を咬ませて蛇毒を吐き出させ、これを多量に集めた
後、若干の蒸留水で薄め、冷却遠心器により５℃で遠心
分離し、その上清を凍結乾燥することにより得られる。
このようにして得られた粗毒の凍結乾燥品は冷蔵庫で保
管することができる。また、ＤＥＡＥセファロース、ヘ
パリンセファロース、Ｑ−セファロースはファルマシア
社から、また、フェニル−５ＰＷは東ソーの製品を使用
した。アクアサイドＩＩはカルビオケム社より購入し
た。

【００１２】（血小板の調製）健常人（成人、男子）よ
り１／１０容クエン酸ナトリウムにて採血を行い、DeMa
rcoらの方法（J.Clin.Invest.,77,1272-1277,1986）に
従い多血小板血漿を、MacFarlaneらの方法（Thromb.Dia
th.Haemorrh.,34,306,1975）に従い固定血小板を調製し
た。

【００１３】（血小板凝集アッセイ）凝集惹起剤である
リストセチンはコスモバイオ社より購入し、用いた二本
鎖ボトロセチンは、藤村らの方法（Biochemistry,30,19
57-1964,1991）により調製した。ヒトｖＷＦは、De Mar
coらの方法（J.Clin.Invest.,68,321-328,1981）により
調製し使用した。多血小板血漿、固定血小板ともに自動
血球計数器（ＭＥＫ−５１５８、日本光電）にて3x10⁸
/ml に調製して使用した。血小板凝集能は、血小板凝集
計（ＮＢＳヘマトレーサー８０１、二光バイオサイエン
ス）を用いて測定した。すなわち、多血小板血漿の場合
血小板（80μl）とサンプル（10μl）を３７℃で３分間
インキュベート後、リストセチン（1mg/ml）あるいはボ
トロセチン（5μg/ml）を10μl添加し、透過光の変化を
５分間記録し、その最大凝集率から凝集阻害率を算出し
た。固定血小板の場合、血小板（70μl）と精製ヒトｖ
ＷＦ（5μg/ml,10μl）とサンプル（10μl）を３７℃で
３分間インキュベート後、リストセチン（1mg/ml）ある
いはボトロセチン（5μg/ml）を10μl添加し、同様の方
法で凝集阻害率を算出した。凝集惹起活性は、ヒト固定
血小板（80μl）と精製ヒトｖＷＦ（5μg/ml, 10μl）
を３７℃で３分間インキュベート後、サンプルを 10μl
添加し、上記凝集計により凝集惹起活性を確認した。

【００１４】（¹²⁵ＩヒトｖＷＦの固定血小板への結合
評価系）¹²⁵Ｉ−ヨウ化ナトリウム（Ｎａ¹²⁵Ｉ；アマシ
ャム社）を使用し、ヨードジェン（IodoGen）法による
精製ヒトｖＷＦの¹²⁵Ｉラベルを行った。放射活性は約3
μCi/μgであった。バインディングアッセイは、藤村ら
の方法（Blood, 77,113-120,1991）により行った。すな
わち、ヒト固定血小板（1x10⁸/ml）、サンプル、¹²⁵Ｉ
−ｖＷＦ（1μg/ml）、リストセチン（1mg/ml）あるい
はボトロセチン（10μg/ml）を３０分間室温にてインキ
ュベート後、２０％シュクロース上に載せ10,000 gで５
分間の遠心操作により血小板を遠沈し、結合放射活性の
測定を行った。なお、非特異的結合数はリストセチンあ
るいはボトロセチンを添加しない場合の放射活性により
求め、これを総結合数から差し引くことにより特異的結
合数を算出した。

【００１５】（ずり応力依存性血小板凝集能評価系）コ
ーンプレート回転粘度計を用いて、福山らの方法（Thro
mb.Res., 54,253-260,1989）により測定した。すなわ
ち、既述多血小板血漿360μlとサンプル40μlを添加
後、最初の１５秒間6dyn/cm²で、次の９０秒間で6から1
2dyn/cm²へ、さらに２分間で12から108 dyn/cm²へとず
り応力を変化させ、最後の９０秒間108dyn/cm²での凝集
を観察した。

【００１６】（蛋白濃度測定法）サンプルの蛋白濃度
は、バイオラッド社の色素結合アッセイキットを用い、
標準物質にウシ血清アルブミンを用いた標準曲線を基に
決定した。

【００１７】（ＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳
動）Laemmliの方法（Nature, 227,680-685,1970）に準
拠し、１６％のＳＤＳ-ＰＡＧＥまたは４〜２０％のグ
ラジェントゲルを用いて、蛋白量1μgまたは0.5μgで、
まず非還元条件下、次いで還元条件下に実施した。還元
サンプルバッファーは、終濃度５％にβ−メルカプトエ
タノールを添加して調製し、サンプルとサンプルバッフ
ァーは等量混合し、９５℃４分間加温処理した。泳動後
のゲルは１０％酢酸を含む３０％イソプロピルアルコー
ル溶液に溶解したクマシーブリリアントブルーＲ−２５
０で染色し、５％酢酸を含む１６．５％メタノール溶液
で脱色した。

【００１８】（Ｎ末端アミノ酸配列決定）純化したおの
おののポリペプチドは、還元後、ＳＤＳ−ＰＡＧＥを行
い、Matsudairaの方法（J.Biol.Chem.,262,10035-1003
8）にて、ＰＶＤＦ膜に転写し、クマシー染色したもの
を直接気相アミノ酸シークエンサー（Applied Biosyste
ms,USA）で、Ｎ末端アミノ酸シークエンスを決定した。

【００１９】

【実施例】以下に実施例を掲記し本発明をさらに詳細に
説明するが、本発明が実施例のみに限定されるべきでな
いことは勿論である。

【００２０】実施例１（精製方法） 第１段階（ｓｔｅｐ１）：ＤＥＡＥセファロースＦＦカ
ラムクロマトグラフィー2mMベンザミジンハイドロクロ
ライド、0.02%ナトリウムアジド（NaN₃）を含む84mMイ
ミダゾールハイドロクロライドバッファー（0.02%NaN₃
添加）pH7.4（バッファーＡ）200mlに溶解した３ｇの粗
毒（不溶物質は２，５００ｇ,１５分の遠心後除去）を
出発材料に、藤村らの方法（Biochemistry,30,1957-196
4,1991）に準じ、バッファーＡにて平衡化したＤＥＡＥ
セファロースＦＦカラム（2.6x35cm）にサンプルを添加
後、同バッファーにて流速50ml/hrで１２時間洗浄し、
素通り画分を除去後、0.3M塩化ナトリウムを含むバッフ
ァーＡにて洗浄し溶出画分を採取した。

【００２１】第２段階（ｓｔｅｐ２）：ヘパリンセファ
ロースＣＬ−６Ｂカラムクロマトグラフィー ｓｔｅｐ１における0.3M塩化ナトリウム溶出画分を、ダ
イアフローメンブレン（ＰＭ１０：アミコン）を用い
て、限外濾過（モデル８０５０、アミコン）を行い、全
量約２０ｍｌに濃縮した後、0.1Mトリス塩酸バッファー
（0.05%NaN₃添加pH7.4）（バッファーＢ）に対し、４℃
にて１昼夜透析した。この画分をバッファーＢにて１昼
夜平衡化したヘパリンセファロースＣＬ−６Ｂカラム
（1.6x20cm）に添加し、同バッファーにて流速30ml/hr
にて６時間洗浄し、素通り画分を除去後、０→０．３Ｍ
塩化ナトリウムを用いたバッファーＢのグラジエントを
同流速にて１０時間の溶出を行い、１０ｍｌずつの分画
に採取した。各分画のフォンウィルブランド因子（ｖＷ
Ｆ）依存性凝集を、ヒト固定血小板を用いたウシ精製ｖ
ＷＦ凝集阻害を指標としてアッセイを行い、阻害活性画
分をプールし、既述の方法にて、全量約１０ｍｌに濃縮
し、1.5M硫酸アンモニウムを含む50mM酢酸ナトリウムpH
6.0（バッファーＣ）に対し、４℃にて１昼夜透析し
た。

【００２２】第３段階（ｓｔｅｐ３）：フェニルクロマ
トグラフィー 上記活性画分をバッファーＣにて平衡化したフェニル−
５ＰＷ（Phenyl-5PW）カラム（7.5mm×7.5cm）に添加
し、1.5M硫酸アンモニウムの100%→0%による直線勾配溶
出を流速0.5ml/分で45分間行った。ピークの検出はUV 2
80nmで行い、ｓｔｅｐ２同様のアッセイにより活性を確
認した。

【００２３】第４段階（ｓｔｅｐ４）：Ｑ−セファロー
スカラムクロマトグラフィー ｓｔｅｐ３における活性画分を、限外濾過（既述）とア
クアサイドＩＩで全量１０ｍｌに濃縮した後、0.05%NaN
₃を含む0.1Mトリス塩酸バッファー（pH8.0）（バッファ
ーＤ）に対し４℃にて１昼夜透析した。この分画を同バ
ッファーで平衡化したＱ−セファロースカラム（1.6 x
20 cm）に添加し、同バッファーで流速６０ｍｌ／にて
４時間洗浄し、素通り画分を除去後、０→０．４Ｍ塩化
ナトリウムを用いたバッファーＤのグラジエントを同流
速にて１０時間の溶出を行い、１０ｍｌずつの分画に採
取した。０→０．４Ｍ塩化ナトリウムの勾配による溶出
でいくつかの大きな蛋白ピークに分離した。これらから
既述のＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびｖＷＦ依存性凝集阻害活
性でフラボセチンＡおよびＢを同定し、限外濾過（既
述）とアクアサイドＩＩで濃縮後、生理食塩水を用いて
４℃にて１昼夜透析した。それぞれのポリペプチドは濃
縮後記既述の蛋白定量を行った。

【００２４】ｓｔｅｐ４の工程を経て得られたポリペプ
チドＡおよびＢの活性を確認した結果は以下の通りであ
る。 （１）血小板凝集阻害 これらポリペプチドは、ヒト固定血小板及びヒト多血小
板血漿のリストセチン、ボトロセチン凝集を1μg/mlで
完全に阻害した。また、ヒト固定血小板のウシｖＷＦに
よる凝集を1μg/mlで完全に阻害した。さらに、ヒト多
血小板血漿のＡＤＰ、コラーゲン凝集に対し10μg/mlで
影響を与えなかった。 （２）バインディングアッセイ これらポリペプチドは、ボトロセチンによる¹²⁵Ｉ−ヒ
トｖＷＦのヒト固定血小板への結合、および¹²⁵Ｉ−ウ
シｖＷＦのヒト固定血小板への結合を1μg/mlで完全に
阻害した。 （３）ずり応力誘導血小板凝集阻害 これらポリペプチドは、ヒト多血小板血漿を用いた高ず
り応力により誘導した血小板凝集を1μg/mlで完全に阻
害したが、低ずり応力のそれは阻害しなかった。 （４）血小板凝集惹起活性 これらポリペプチドは、10μg/mlで、ヒト固定血小板の
凝集を全く惹起しなかった。

【００２５】純化したポリペプチドＡおよびＢ（蛋白量
1μg）について、ウサギ筋肉由来のミオシン（200k
d）、大腸菌由来のβ−ガラクトシダーゼ（116.25K
d）、ウサギ筋肉由来のフォスフォリラーゼＢ（97.4 K
d）、牛血清由来の血清アルブミン（66.2 Kd）、卵白由
来のオバルブミン（45Kd）、牛由来のカーボニックアン
ヒドラーゼ（31Kd）、大豆由来のトリプシンインヒビタ
ー（21.5Kd）および卵白由来のリゾチーム（14.4Kd）を
スタンダードとする４−２０％のＳＤＳ−ＰＡＧＥで、
非還元条件下および還元条件下に分子量を検量線を用い
て正確に計算したところ、還元前おのおの１４８，７０
０および１３８，５００であり、還元後、前者は１６，
５００および１３，７００の、後者は１６，５００、１
４，５００および１３，７００のサブユニットからなる
ことが判明した。

【００２６】本発明者らは、このようにして得られた２
種のポリペプチドが上記各性質を有するものとして新規
な物質であると認め、それぞれフラボセチン（Flavocet
in）Ａ（還元前ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析で分子量が１４
８，７００と認められたポリペプチド）、フラボセチン
Ｂ（同１３８，５００）と、還元後分離されたポリペプ
チドにつき、それぞれフラボセチンＡサブユニットα
（還元後ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析で分子量が１６，５００
と認められたポリペプチド）、フラボセチンＡサブユニ
ットβ（同１３，７００）、フラボセチンＢサブユニッ
トα（同１６，５００）、フラボセチンＢサブユニット
β（同１３，７００）、フラボセチンＢサブユニットγ
（同１４，５００）と命名した。

【００２７】以上の結果から、本発明のフラボセチンＡ
およびＢは、ＳＤＳ−ＰＡＧＥの分析による分子量が、
それぞれ１４８，７００±５，０００、１３８，５００
±５，０００であり、還元後それぞれ１６，５００±
３，０００であるサブユニットＡ−α、１３，７００±
３，０００であるサブユニットＡ−βおよび１６，５０
０±３，０００であるサブユニットＢ−α、１３，７０
０±３，０００であるサブユニットＢ−βおよび１４，
５００±３，０００であるサブユニットＢ−γからなる
ポリマーであると認められた。

【００２８】ｓｔｅｐ４の精製工程を経て得られたフラ
ボセチンＡおよびＢの還元前および還元条件下における
４〜２０％のグラジェントＳＤＳ−ＰＡＧＥの泳動パタ
ーンを図１、２に示す。図１中レーン１は、上述ＳＤＳ
−ＰＡＧＥ分析の分子量スタンダードであり、200 Kdは
ウサギ筋肉由来のミオシン、116.25 Kdは大腸菌由来の
β−ガラクトシダーゼ、97.4 Kdはウサギ筋肉由来のフ
ォスフォリラーゼＢ、66.2 Kdは牛血清由来の血清アル
ブミン、45 Kdは卵白由来のオバルブミンである。レー
ン２および３は、それぞれｓｔｅｐ４で得られたフラボ
セチンＡ（0.5μg）およびフラボセチンＢ（0.5μg）の
非還元条件下における泳動パターンであり、同様にレー
ン１のスタンダードに対する分子量として、それぞれ約
148.7 Kd、約 138.5 Kdと算出されたものである。図２
中レ−ン４は、ｓｔｅｐ４で得られたフラボセチンＡ
（0.5μg）の還元条件下における泳動パターンであり、
レーン６のスタンダードに対する分子量として検量線を
用いて約 16.5 Kdと算出されたものがフラボセチンＡサ
ブユニットαであり、同様に約 13.7 Kdと算出されたも
のがフラボセチンＡサブユニットβである。レーン５
は、ｓｔｅｐ４で得られたフラボセチンＢ（0.5μg）の
還元条件下におけるＳＤＳ−ＰＡＧＥによる泳動パター
ンであり、同様にレーン６のスタンダードに対する分子
量として約 16.5 Kdと算出されたスポットがフラボセチ
ンＢサブユニットα、同様に約 13.7 Kdと算出されたス
ポットがフラボセチンＢサブユニットβ、約 14.5 Kdと
算出されたスポットがフラボセチンＢサブユニットγで
ある。レーン６は、上述ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析の分子量
スタンダードであり、97.4 Kdはウサギ筋肉由来のフォ
スフォリラーゼＢ、66.2 Kdは牛血清由来の血清アルブ
ミン、45 Kdは卵白由来のオバルブミン、31 Kdは牛由来
のカーボニックアンヒドラーゼ、21.5 Kdは大豆由来の
トリプシンインヒビター、14.4 Kdは卵白由来のリゾチ
ームである。

【００２９】ｓｔｅｐ４の精製工程で得られたフラボセ
チンＡおよびＢをそれぞれ炭酸アンモニウムに透析後凍
結乾燥した粉末をサンプルとし、このサンプル1 mgに塩
酸グアニジン600mgを添加し、400μlの0.3Mトリス塩酸
バッファー（pH8.3）を加えて撹拌し、200μlのミリキ
ュー（MilliQ）水を加えて約 1 mlとする。20 μlのト
リ−ｎ−ブチルスルホン（還元剤）、次に４−ビニルピ
リジンを加え３時間放置後、逆相ＨＰＬＣ［充填剤：シ
ンクロパック（Synchropak） RP-18］にてフラボセチン
Ａ−α、Ａ−βに分け、これらについて既述の方法でＮ
末端アミノ酸部分配列を確認した結果、それぞれ配列表
１、２の配列であることが確認された。ｓｔｅｐ４で得
られたフラボセチンＡおよびＢについて、その活性を確
認したところ、フラボセチンＡは、ヒト固定血小板及び
ヒト多血小板血漿のリストセチン、ボトロセチン凝集を
1μg/mlで完全に阻害し、ヒト多血小板血漿のＡＤＰ、
コラーゲン凝集に対し10μg/mlで影響を与えなかった。
また、バインディングアッセイのボトロセチンによる
¹²⁵Ｉ−ヒトｖＷＦのヒト固定血小板への結合および¹²⁵
Ｉ−ウシｖＷＦのヒト固定血小板への結合を1μg/mlで
完全に阻害した。一方、フラボセチンＢもフラボセチン
Ａと同様にこれらｖＷＦ依存性の凝集および結合を阻害
した。また、フラボセチンＡおよびＢは、いずれも10μ
g/mlでヒト固定血小板の凝集を全く惹起せず、自体では
血小板凝集を惹起しないことが確認された。

【００３０】実施例２（フラボセチンＡおよびＢの還元
アルキル化） 実施例１のｓｔｅｐ４で得られたフラボセチンＡおよび
Ｂの10μg/mlを、10mMジチオスレイトール（DDT:dithio
threitol）を含む50mMトリス塩酸バッファー（pH8.6）
で３７゜Ｃ３０分間インキュベート後、400mMヨードア
セトアミド（IAA:iodoacetamide）を含む 50mMトリス塩
酸バッファー（pH8.6）を添加し、室温で30分間放置し
た。ＳＤＳ−ＰＡＧＥによる分子量測定を行い、フラボ
セチンＡおよびＢがそれぞれ１６．５、１３．７Ｋｄお
よび１６．５、１３．７、１４．５Ｋｄのサブユニット
に還元されたことを確認した。この還元フラボセチンの
ｖＷＦ依存性血小板凝集阻害活性はウシ精製ｖＷＦ 5μ
g/mlによるヒト固定血小板凝集阻害により確認した。そ
の結果、還元フラボセチンＡおよびＢのｖＷＦ依存性血
小板凝集阻害活性は、いずれも完全に消失していた。

【００３１】実施例３（¹²⁵Ｉ−フラボセチンＡのヒト
固定血小板への結合）¹²⁵ Ｉ−ヨウ化ナトリウム（Ｎａ¹²⁵Ｉ；アマシャム社）
を用いて、ヨードジェン法にてフラボセチンＡのヨード
ラベルを行った。ラベル蛋白の放射活性は、6.75μCi/
μgであった。この¹²⁵Ｉ−フラボセチンＡ（1.85μg/m
l）は、ヒト固定血小板に強く結合し、この結合は飽和
的であった。また、この結合は、ＧＰＩｂ上のｖＷＦ結
合部位を認識することが既に確認されている抗ＧＰＩｂ
モノクローナル抗体ＡＰ−１（5μg/ml）により完全に
阻害された。つまり、フラボセチンＡは、ＧＰＩｂ結合
蛋白であり、かつその結合部位はｖＷＦ結合部位と同一
かその近傍にあることが判明した。スキャッチャード
プロット（Scatchard Plot）による解析の結果、結合の
Ｋｄ値は0.4 nmol/lであり、血小板１個あたりの結合数
は約19,400であった。

【００３２】

【発明の効果】本発明のポリペプチドＡおよび／または
ポリペプチドＢは、前記のごとくｖＷＦと血小板膜ＧＰ
Ｉｂの結合を阻害し、ｖＷＦ依存性の血小板凝集を阻害
し、自体では血小板凝集を惹起しない性質を有してお
り、高ずり応力による血小板凝集のみを阻害する優れた
抗血栓剤として、血管の炎症並びに代謝障害に基づく広
範囲の血栓塞栓症の予防あるいは治療薬として有用であ
る。本発明のポリペプチドＡおよび／またはＢを有効成
分とする医薬組成物は、細菌や発熱物質を完全に除去し
たポリペプチドと通常製薬学的に許容される製剤化成
分、例えば希釈剤、安定化剤などの添加剤（例えば、生
理食塩水、注射用蒸留水、各種緩衝液、白糖、乳糖、ブ
ドウ糖、マンニトール、ソルビトール、キシリトールな
どの糖類、アルギニン、グリシンなどのアミノ酸、モノ
エタノールアミン、ジエタノールアミン、トリエタノー
ルアミンなどのエタノールアミン類、ポリオキシエチレ
ン高級脂肪酸エステル、ポリオキシエチレンソルビタン
高級脂肪酸エステル、ポリオキシエチレン硬化ひまし油
などの界面活性剤その他常用の添加剤）を用いて、通常
注射剤（液剤、用時溶解型の凍結乾燥製剤など）として
調製され、非経口的に投与（例えば、静脈注射あるいは
皮下注射など）される。

【００３３】

【図面の簡単な説明】

【図１】フラボセチンＡおよびＢのそれぞれ非還元条件
下におけるＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析による電気泳動パター
ンを示す図面に代わる写真である。図中、レーン１は相
対的に高分子量のスタンダードであり、レーン２および
３はそれぞれフラボセチンＡ（非還元条件下）、フラボ
セチンＢ（非還元条件下）の泳動パターンである。左側
に記載した数値（Kd）はスタンダードの分子量を、右側
に記載した数値は本発明フラボセチンＡおよびＢ（それ
ぞれＡ、Ｂで記述）の分子量を示す。

【図２】フラボセチンＡおよびＢのそれぞれ還元条件下
におけるＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析による電気泳動パターン
を示す図面に代わる写真である。図中、レーン４および
５はそれぞれフラボセチンＡ（還元条件下）およびフラ
ボセチンＢ（還元条件下）の泳動パターンであり、レー
ン６は相対的に低分子のスタンダードである。左側に記
載した数値は本発明フラボセチンＡ−α、フラボセチン
Ａ−β、フラボセチンＢ−α、フラボセチンＢ−β、フ
ラボセチンＢ−γ（それぞれＡ−α、Ａ−β、Ｂ−α、
Ｂ−β、Ｂ−γで記述）のサブユニットのサイズをそれ
ぞれ示す。右側に記載した数値（Ｋｄ）はスタンダード
の分子量を示す。

【００３５】

【配列表】配列番号：１ 配列の長さ：２８ 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド 配列： Asp Phe Asp Cys Ile Pro Gly Trp Ser Ala Tyr Asp Arg Tyr Cys 1 5 10 15 Tyr Gln Ala Phe Ser Lys Pro Lys Asn Trp Glu Asp Ala 16 20 25

【００３４】配列番号：２ 配列の長さ：３７ 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド 配列： Gly Phe Cys Cys Pro Leu Gly Trp Ser Ser Tyr Asp Glu His Cys 1 5 10 15 Tyr Gln Val Phe Gln Gln Lys Met Asn Xaa Glu Asp Ala Glu Lys 16 20 25 30 Xaa Xaa Thr Gln Gln Xaa Lys 31 35

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 川崎 富久 茨城県つくば市千現１丁目18番地５ パレ スハピネス203 (72)発明者 谷内 由太 茨城県つくば市二の宮３丁目13番地１ ル ーミーにのみや423 (72)発明者 酒井 由美子 茨城県つくば市二の宮１丁目14番地２ ボ ヌールつくば306 (72)発明者 加来 聖司 茨城県つくば市並木３丁目10番地４ マリ ッチヨコタ202 (72)発明者 澤井 芳男 群馬県太田市浜町18−39 星野マンション １ＦＣ

Claims (2)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】下記の物理化学的性質で特定されるポリペ
   プチドＡまたはポリペプチドＢ。 （１）分子量、構成成分、サイズ： （Ａ）ポリペプチドＡ；ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲ
   ル電気泳動法（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）の分析による分子量
   が、１４８，７００±５，０００であり、還元後１６，
   ５００±３，０００であるサブユニットＡ−α、１３，
   ７００±３，０００であるサブユニットＡ−βとからな
   るポリペプチド。 （Ｂ）ポリペプチドＢ；ＳＤＳ−ＰＡＧＥの分析による
   分子量が、１３８，５００±５，０００であり、還元後
   １６，５００±３，０００であるサブユニットＢ−α、
   １３，７００±３，０００であるサブユニットＢ−β、
   １４，５００±３，０００であるサブユニットＢ−γと
   からなるポリペプチド。 （２）Ｎ末端アミノ酸部分配列： （ａ）ポリペプチドＡのサブユニットＡ−α； Asp Phe Asp Cys Ile Pro Gly Trp Ser Ala Tyr Asp Arg Tyr Cys Tyr Gln Ala Phe Ser Lys Pro Lys Asn Trp Glu Asp Ala （ｂ）ポリペプチドＡのサブユニットＡ−β； Gly Phe Cys Cys Pro Leu Gly Trp Ser Ser Tyr Asp Glu His Cys Tyr Gln Val Phe Gln Gln Lys Met Asn Xaa Glu Asp Ala Glu Lys Xaa Xaa Thr Gln Gln Xaa Lys （式中 Xaa は、アミノ酸残基を意味する）
2. 【請求項２】 琉球ハブ［Trimeresurus flavoviridis］
   由来のものである請求項１記載のポリペプチド。