JPH083193A - 新規生理活性物質 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【構成】分子量、構成成分、サイズおよびＮ末端アミノ
酸部分配列で特定されるトカラハブ由来のポリペプチド
であるトカラセチンに関する。 【効果】ｖＷＦと血小板膜ＧＰＩｂの結合を阻害し、ｖ
ＷＦ依存性の血小板凝集を阻害し、自体では血小板凝集
を惹起しない性質を有しており、高ずり応力による血小
板凝集のみを阻害する優れた抗血栓剤として、広範囲の
血栓塞栓症などの予防あるいは治療薬として有用。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は、血小板の粘着・凝集を
阻害し、抗血栓作用を有するポリペプチドに関する。

【０００２】

【従来の技術】動脈硬化、外科手術、外傷、分娩および
伝染性の疾病が血栓症すなわち血管内に血液の塊を形成
する危険の増大につながることは周知である。フォンウ
ィルブランド因子（ｖｏｎ Ｗｉｌｌｅｂｒａｎｄ Ｆａ
ｃｔｏｒ：以下ｖＷＦと略す）は、血液凝固第ＶＩＩＩ
因子（血友病因子）と非共有結合による複合体を形成
し、担体蛋白としてその安定化および活性保持をはか
り、凝固血栓（二次止血）の形成に寄与する。もう１つ
の重要な働きは、生体内血管損傷部位における速やかな
血小板血栓（一次止血）形成への直接的な貢献である。
この一次止血は、血小板の血管内皮下組織への粘着、血
小板の活性化および粘着蛋白を介した血小板相互の凝集
［血小板膜糖蛋白（ＧＰ）ＩＩｂ／ＩＩＩａとフィブリ
ノーゲンの結合が重要視されている］という一連の過程
で進行すると考えられているが、ｖＷＦはこの第一ステ
ップである露出血管内皮下組織に対する血小板の粘着反
応において両者間の架橋反応を促す分子糊としての役割
を果たしている。特に、ｖＷＦと血小板膜ＧＰＩｂとの
結合反応が、血小板の内皮下組織への粘着に必須である
と考えられている。遺伝性出血性疾患として知られるフ
ォンウィルブランド病（ｖＷＦの量的あるいは質的異
常）やベルナール・スーリエ症候群（Bernard-Soulier
syndrome: 血小板膜ＧＰＩｂの欠損症）において認めら
れる易出血傾向は生体内におけるこの反応の重要性を示
唆している。

【０００３】ｖＷＦと血小板膜ＧＰＩｂとの結合反応
は、 in vitro では、非生理的モジュレーターであるリ
ストセチン（抗生物質の一種）やボトロセチン［ブラジ
ル産響尾蛇ボトロップス ジャララカ（Bothrops jarar
aca ）由来蛋白］を用いて再現され、上記先天性疾患の
臨床診断にも用いられている。しかしながら、in vivo
での反応メカニズムの詳細は未だ明らかではなく、以下
のような仮説が考えられている。すなわち、血管破綻部
位において、ｖＷＦは血管内皮下組織に結合し、その結
果、ｖＷＦ分子上に構造変化が起こり、血小板膜ＧＰＩ
ｂとの結合能が発現され、血小板膜ＧＰＩｂと結合する
というものである。この仮説において、ｖＷＦは、正常
流血中では決して血小板膜ＧＰＩｂとは結合せず、血管
破綻時あるいはある特殊な流体力学下（高ずり応力）
で、はじめて結合することになる。高ずり応力は、動脈
硬化等の強い血管狭窄を伴う部位に発生し、病態とのか
かわりが最近特にクローズアップされてきた。高ずり応
力で誘導される血小板の凝集には、ｖＷＦと血小板膜Ｇ
ＰＩｂおよびｖＷＦと血小板膜ＧＰＩＩｂ／ＩＩＩａと
の結合が重要であり、一方、低ずり応力で誘導される血
小板の凝集には、フィブリノーゲンと血小板膜ＧＰＩＩ
ｂ／ＩＩＩａとの結合が重要視されている。

【０００４】このような背景から、近年、ｖＷＦと血小
板膜ＧＰＩｂの結合を抑制し、高ずり応力による血小板
の凝集のみを阻害する新しい抗血栓剤創製の試みがなさ
れている。Ｐｅｎｇら（Biochemistry, 30, 11529-1153
6, 1991）は、ある種の蛇毒から血小板膜ＧＰＩｂに作
用し、ｖＷＦの結合を阻害する新しい蛇毒蛋白アルボア
グレギンＢ（ＡＬ−Ｂ）を報告した。

【０００５】

【発明が解決しようとする課題】しかしながら、この蛋
白ＡＬ−Ｂはそれ自体で血小板凝集を惹起してしまい、
医薬品としての発展性を考慮すると、大きな障害となる
ことが予想される。本発明は、ｖＷＦと血小板膜ＧＰＩ
ｂの結合を阻害し、ｖＷＦ依存性の血小板凝集を阻害
し、自体では血小板凝集を惹起しない性質を有するポリ
ペプチドを提供することを目的とする。

【０００６】

【課題を解決するための手段】このような状況下に、本
発明者らはトカラハブの毒液中に、ｖＷＦ依存性の血小
板凝集を阻害する蛋白の存在を推定して鋭意探索した結
果、ｖＷＦと血小板膜ＧＰＩｂの結合を阻害し、ｖＷＦ
依存性の血小板凝集を阻害し、自体では血小板凝集を惹
起しない性質を有するポリペプチドを単離することに成
功し本発明を完成させるに至った。

【０００７】すなわち、本発明は、下記物理化学的性質
で特定されるポリペプチドである。 （１）分子量、構成成分、サイズ：ＳＤＳ−ポリアクリ
ルアミドゲル電気泳動法（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）の分析に
よる分子量が、２８，９００±５，０００であり、還元
後１６，１００±３，０００であるサブユニットα、１
５，４００±３，０００であるサブユニットβとからな
るポリペプチド。 （２）Ｎ末端アミノ酸部分配列： （ａ）ポリペプチドのサブユニットα：配列表１ （ｂ）ポリペプチドのサブユニットβ：配列表２ （配列中、 Xaa はアミノ酸残基を意味する。）

【０００８】本発明のポリペプチドは、 （ａ）リストセチンおよび／またはボトロセチンによる
ヒトホルマリン固定浮遊血小板およびヒト多血小板血漿
の凝集を阻害する。 （ｂ）ウシｖＷＦによるヒトホルマリン固定浮遊血小板
の凝集を阻害する。 （ｃ）リストセチンおよび／またはボトロセチンによる
ｖＷＦのヒトホルマリン固定血小板への結合を阻害す
る。 （ｄ）ヒト多血小板血漿を用いた高ずり応力により誘導
した血小板凝集を阻害するが、低ずり応力のそれは阻害
しない。 （ｅ）ポリペプチド単独ではヒト固定血小板の凝集を惹
起しない。という薬理学的性質によっても特徴づけられ
るものである。なお、ポリペプチドは、 （ｆ）ＧＰＩｂ結合蛋白であり、その結合部位がｖＷＦ
結合部位と同一かその近傍である。 （ｇ）還元すると終濃度３μg/mlでｖＷＦ依存性血小板
凝集阻害活性を失う。という性質をも有している。 従って、本発明には、上記（１）および（２）によって
特定される構造を有するポリペプチドは勿論、本発明ポ
リペプチドのアミノ酸配列中の一またはそれ以上の部位
において、一またはそれ以上のアミノ酸が欠失し、挿入
されまたは置換したポリペプチドも、上記ポリペプチド
のもつ（ａ）乃至（ｇ）の性質、すなわちｖＷＦと血小
板膜ＧＰＩｂの結合を阻害し、ｖＷＦ依存性の血小板凝
集を阻害し、自体では血小板凝集を惹起しない性質を有
することがあるので、かかる同効のポリペプチド（以下
同効物という）も含まれる。本発明における特に好適な
ポリペプチドとしては、上記トカラハブの蛇毒由来のポ
リペプチドあるいはその同効物、とりわけ本発明者らに
よって命名されたトカラセチン（Tokaracetin）あるい
はその同効物が挙げられる。

【０００９】なお、本明細書において、ペプチドのＮ末
端部分アミノ酸配列の表記は、慣例に従い、左端をＮ末
端とし、Ｃ末端方向へ順に右に記載し、またＩＵＰＡＣ
−ＩＵＢ生化学命名委員会による略号あるいは当該分野
における慣用略号に基づき、以下に例示したような三文
字表記のアミノ酸記号を用いて行っている。アラニン
Ａｌａ、アルギニン Ａｒｇ、アスパラギン Ａｓｎ、
アスパラギン酸 Ａｓｐ、システイン Ｃｙｓ、グルタ
ミン酸 Ｇｌｕ、グルタミン Ｇｌｎ、グリシン Ｇｌ
ｙ、ヒスチジン Ｈｉｓ、イソロイシン Ｉｌｅ、ロイ
シンＬｅｕ、リジン Ｌｙｓ、メチオニン Ｍｅｔ、フ
ェニルアラニン Ｐｈｅ、プロリン Ｐｒｏ、セリン
Ｓｅｒ、トレオニン Ｔｈｒ、トリプトファン Ｔｒ
ｐ、チロシン Ｔｙｒ、バリン Ｖａｌ。また、Ｘａａ
が示すアミノ酸残基は、天然のアミノ酸残基であればよ
く、具体的には例えば上述したアミノ酸の残基が挙げら
れる。

【００１０】本発明の生理活性ポリペプチドは、ペプチ
ド合成装置を使用する合成方法によって製造することも
可能であるが、天然物からの単離精製法によって生産す
ることができる。天然物の起源としては、本発明ペプチ
ドの起源であるトカラハブ［Trimeresurus tokarensi
s］の蛇毒が最適なものとして挙げられるが、この蛇毒
のみに限定されるものではなく、上記（１）および
（２）の理化学的性質を備えたポリペプチド、あるいは
上記（ａ）乃至（ｇ）の性質を有するポリペプチドの同
効物を含有する天然物であればよい。単離・精製は、例
えば天然物として蛇毒を用いるときは、蛇毒から粗毒を
抽出するかまたはせずして、前記（ａ）乃至（ｅ）の特
性であるリストセチン、ボトロセチンによる血小板凝集
阻害活性、リストセチン、ボトロセチンによるｖＷＦの
血小板への結合阻害活性、ずり応力により誘導した血小
板凝集阻害活性、およびペプチド自体の血小板凝集性、
必要によりさらに上記（ｆ）乃至（ｇ）の特性をも指標
としながら、種々の吸着剤に対する吸着親和性の差、種
々の溶剤に対する溶解性あるいは溶解度の差、２種の混
じり合わない液相間の分配の差、分子の大きさに基づく
溶出速度の差、溶液からの析出性あるいは析出速度の差
などを利用する種々の手段を適用して行われる。これら
の手段は、必要に応じて、単独であるいは任意の順序に
組合せ、また反復して適用することができる。粗毒を抽
出するときは、ポリペプチドを溶解可能な溶媒、ことに
メタノール、エタノール、イソプロパノールなどのアル
コール系の溶媒、ベンゼン、トルエン、キシレン、アセ
トン、メチルエチルケトン、エーテル、テトラヒドロフ
ラン、ジオキサン、ジメチルスルオキシド、酢酸エチル
やアセトニトリルなどの有機溶媒や水、あるいはこれら
の混合溶媒を用い、必要なら加温撹拌下に行なうのが有
利である。 また、単離精製手段としては、特にＳＰ−
セファロース（SP-Sepharose）ＦＦ、ヘパリン−セファ
ロース（Heparin-Sepharose）ＣＬ−６Ｂ、フェニル−
５ＰＷ（Phenyl−5PW）などをカラム充填剤とするカラ
ムクロマトグラフィーや限外濾過などに付して実施する
のが有利である。

【００１１】本発明の新規生理活性物質の特性は、下記
の方法により、定められたものである。 （物質）トカラハブ由来の蛇毒（凍結乾燥品）は日本蛇
族学術研究所より入手した。なお、トカラハブはクサリ
ヘビ科マムシ亜科に属し、トカラ列島の宝島と小宝島に
生息する特産種である（伏谷ら編，動物成分利用集成
水産・蛇・昆虫・漢方薬篇，ｐ１３２，Ｒ＆Ｄプランニ
ング，東京，１９８６）。捕獲は容易であり、毒の収量
もよいことから安価に得ることが出来る。粗毒を収集す
る方法は、まずトカラハブを生きたまま保定し、円錐形
液量器の縁を咬ませて蛇毒を吐き出させ、これを多量に
集めた後、若干の蒸留水で薄め、冷却遠心機により５℃
で遠心分離し、その上清を凍結乾燥することにより得ら
れる。このようにして得られた粗毒の凍結乾燥品は冷蔵
庫で保管することができる。また、ＳＰセファロース、
ヘパリンセファロースはファルマシア社から、フェニル
−５ＰＷは東ソーの製品を使用した。アクアサイドＩＩ
はカルビオケム社より購入した。

【００１２】（血小板の調製）健常人（成人、男子）よ
り１／１０容クエン酸ナトリウムにて採血を行い、DeMa
rco らの方法（J.Clin.Invest., 77, 1272-1277, 198
6）に従い多血小板血漿を、MacFarlane らの方法（Thro
mb.Diath.Haemorrh., 34, 306, 1975）に従い固定血小
板を調製した。

【００１３】（血小板凝集アッセイ）凝集惹起剤である
リストセチンはコスモバイオ社より購入し、用いた二本
鎖ボトロセチンは、藤村らの方法（Biochemistry, 30,
1957-1964, 1991）により調製した。ヒトｖＷＦは、De
Marco らの方法（J.Clin.Invest., 68, 321-328, 198
1）により調製し使用した。多血小板血漿、固定血小板
ともに自動血球計数器（ＭＥＫ−５１５８、日本光電）
にて 3x10⁸ /ml に調製して使用した。血小板凝集能
は、血小板凝集計（ＮＢＳヘマトレーサー８０１、二光
バイオサイエンス）を用いて測定した。すなわち、多血
小板血漿の場合血小板（80 μl）とサンプル（10 μl）
を３７℃で３分間インキュベート後、リストセチン（1
mg/ml）あるいはボトロセチン（5 μg/ml）を 10 μl
添加し、透過光の変化を５分間記録し、その最大凝集率
から凝集阻害率を算出した。固定血小板の場合、血小板
（70μl）と精製ヒトｖＷＦ（5 μg/ml,10 μl）とサン
プル（10 μl）を３７℃で３分間インキュベート後、リ
ストセチン（1 mg/ml）あるいはボトロセチン（5 μg/m
l）を 10 μl添加し、同様の方法で凝集阻害率を算出し
た。凝集惹起活性は、ヒト固定血小板（80 μl）と精製
ヒトｖＷＦ（5μg/ml, 10μl）を３７℃で３分間インキ
ュベート後、サンプルを 10 μl 添加し、上記凝集計に
より凝集惹起活性を確認した。

【００１４】（¹²⁵ＩヒトｖＷＦの固定血小板への結合
評価系）¹²⁵Ｉ−ヨウ化ナトリウム（Ｎａ¹²⁵Ｉ；アマシ
ャム社）を使用し、ヨードジェン（IodoGen）法による
精製ヒトｖＷＦの¹²⁵Ｉラベルを行った。放射比活性は
約3μCi/μgであった。バインディングアッセイは、藤
村らの方法（Blood, 77, 113-120, 1991）により行っ
た。すなわち、ヒト固定血小板（1x10⁸/ml）、サンプ
ル、¹²⁵Ｉ−ｖＷＦ（1 μg/ml）、リストセチン（1 mg/
ml）あるいはボトロセチン（10 μg/ml）を３０分間室
温にてインキュベート後、２０％シュクロース上に載せ
10,000 gで５分間の遠心操作により血小板を遠沈し、結
合放射活性の測定を行った。なお、非特異的結合数はリ
ストセチンあるいはボトロセチンを添加しない場合の放
射活性により求め、これを総結合数から差し引くことに
より特異的結合数を算出した。

【００１５】（ＧＰＩｂへの結合評価系）トカラセチン
のＧＰＩｂへの結合部位がｖＷＦ結合部位と同一かその
近傍であることは、トカラセチンのヒト固定血小板への
結合を、ＧＰＩｂ上のｖＷＦ結合部位を認識する抗ＧＰ
Ｉｂモノクローナル抗体が阻害することにより確認し
た。¹²⁵Ｉ−ヨウ化ナトリウム（Ｎａ¹²⁵Ｉ；アマシャム
社）を用いて、ヨードジェン法にてトカラセチンのヨー
ドラベルを行った。バインディングアッセイは、Ｐｅｎ
ｇらの方法（Biochemistry 30,11529-11536,1991）によ
り行った。この際用いる抗体は、ＧＰＩｂ上のｖＷＦ結
合部位を認識する抗ＧＰＩｂモノクローナル抗体であれ
ばいずれも用いることができるが、例えば、ＧＵＲ２０
−５（宝酒造）が使用できる。

【００１６】（ずり応力依存性血小板凝集能評価系）コ
ーンプレート回転粘度計を用いて、福山らの方法（Thro
mb.Res., 54, 253-260, 1989）により測定した。すなわ
ち、既述多血小板血漿 360 μl とサンプル40 μl を添
加後、最初の１５秒間 6 dyn/cm² で、次の９０秒間で
6 から 12 dyn/cm² へ、さらに２分間で 12 から 10⁸ d
yn/cm² へとずり応力を変化させ、最後の９０秒間 10⁸
dyn/cm² での凝集を観察した。

【００１７】（蛋白濃度測定法）サンプルの蛋白濃度
は、バイオラッド社の色素結合アッセイキットを用い、
標準物質にウシ血清アルブミンを用いた標準曲線を基に
決定した。

【００１８】（ＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳
動）Laemmli の方法（Nature, 227, 680-685, 1970）に
準拠し、１６％のＳＤＳ-ＰＡＧＥを用いて、蛋白量 1
μg で、非還元条件下および還元条件下に実施した。還
元サンプルバッファーは、終濃度５％にβ−メルカプト
エタノールを添加して調製し、サンプルにサンプルバッ
ファー1/2量を混合し、９５℃４分間加温処理した。泳
動後のゲルは１０％酢酸を含む３０％イソプロピルアル
コール溶液に溶解したクマシーブリリアントブルーＲ−
２５０で染色し、５％酢酸を含む１６．５％メタノール
溶液で脱色した。

【００１９】（Ｎ末端アミノ酸配列決定）純化したポリ
ペプチドは、トリ−ｎ−ブチルホスフィン（還元剤）お
よび４−ビニルピリジンにて還元ピリジルエチル化し、
逆相ＨＰＬＣ［充填剤：シンクロパック（Synchropak）
RP-18（シンクローム社）］にてトカラセチン−α、−
βに分け、それぞれについて気相アミノ酸シークエンサ
ー（Applied Biosystems,USA）で、Ｎ末端アミノ酸シー
クエンスを決定した。

【００２０】

【発明の効果】本発明のポリペプチドは、前記のごとく
ｖＷＦと血小板膜ＧＰＩｂの結合を阻害し、ｖＷＦ依存
性の血小板凝集を阻害し、自体では血小板凝集を惹起し
ない性質を有しており、高ずり応力による血小板凝集の
みを阻害する優れた抗血栓剤として、血管の炎症並びに
代謝障害に基づく広範囲の血栓塞栓症の予防あるいは治
療薬として有用である。本発明のポリペプチドを有効成
分とする医薬組成物は、細菌や発熱物質を完全に除去し
たポリペプチドと通常製薬学的に許容される製剤化成
分、例えば希釈剤、安定化剤などの添加剤（例えば、生
理食塩水、注射用蒸留水、各種緩衝液、白糖、乳糖、ブ
ドウ糖、マンニトール、ソルビトール、キシリトールな
どの糖類、アルギニン、グリシンなどのアミノ酸、モノ
エタノールアミン、ジエタノールアミン、トリエタノー
ルアミンなどのエタノールアミン類、ポリオキシエチレ
ン高級脂肪酸エステル、ポリオキシエチレンソルビタン
高級脂肪酸エステル、ポリオキシエチレン硬化ひまし油
などの界面活性剤その他常用の添加剤）を用いて、通常
注射剤（液剤、用時溶解型の凍結乾燥製剤など）として
調製され、非経口投与（例えば、静脈注射あるいは皮下
注射など）されるが、経口投与も可能である。

【００２１】

【実施例】以下に実施例を掲記し本発明をさらに詳細に
説明するが、本発明が実施例のみに限定されるべきでな
いことは勿論である。

【００２２】実施例１（精製方法） 第１段階（ｓｔｅｐ１）：ＳＰセファロースＦＦカラム
クロマトグラフィー 0.05%アジ化ナトリウム（NaN₃）を含む50mMトリス塩酸
バッファー（0.05% NaN₃ 添加）pH 7.5（バッファー
Ａ）200mlに溶解した２ｇの粗毒（不溶物質は２，５０
０ｇ,１５分の遠心後除去）を出発材料に、バッファー
Ａにて平衡化したＳＰセファロースＦＦカラム（1.6x25
cm）にサンプルを添加後、同バッファーにて流速60 ml
/hrで１２時間洗浄し、素通り画分を除去後、0→0.3 M
塩化ナトリウムを用いたバッファーＡのグラジエントを
同流速にて１３時間の溶出を行ない、１０ｍｌずつの分
画に採取した。各分画のｖＷＦ依存性凝集を、ヒト固定
血小板を用いたウシ精製ｖＷＦ凝集阻害を指標としてア
ッセイを行い、大きく３つの阻害活性画分を得た。３番
目の分画をプールし、ダイアフローメンブレン（ＰＭ１
０：アミコン）を用いて、限外濾過（モデル８０５０、
アミコン）を行い、全量約２０ｍｌに濃縮した後、0.1
M トリス塩酸バッファー（0.05% NaN₃添加 pH7.4）（バ
ッファーＢ）に対し、４℃にて１昼夜透析した。

【００２３】第２段階（ｓｔｅｐ２）：ヘパリンセファ
ロースＣＬ−６Ｂカラムクロマトグラフィー ｓｔｅｐ１において得た画分を、バッファーＢにて１昼
夜平衡化したヘパリンセファロースＣＬ−６Ｂカラム
（1.6x20 cm）に添加し、同バッファーにて流速60ml/hr
にて６時間洗浄し、素通り画分を除去後、０→０．４
Ｍ塩化ナトリウムを用いたバッファーＢのグラジエント
を同流速にて１１時間の溶出を行い、１０ｍｌずつの分
画に採取した。ｓｔｅｐ１同様のアッセイにより阻害活
性画分をプールし、既述の方法にて、全量約１０ｍｌに
濃縮し、1.5M硫酸アンモニウムを含む50mM酢酸ナトリウ
ム pH 6.0（バッファーＣ）に対し、４℃にて１昼夜透
析した。

【００２４】第３段階（ｓｔｅｐ３）：フェニルクロマ
トグラフィー 上記活性画分をバッファーＣにて平衡化したフェニル−
５ＰＷ（Phenyl-5PW）カラム（7.5 mm×7.5 cm）に添加
しバッファーＣの流速 1 ml/min でカラムを洗浄し、素
通り画分を採取した。サンプルは限外濾過（既述）とア
クアサイドＩＩで濃縮後、生理食塩水を用いて４℃にて
１昼夜透析した。ポリペプチドは濃縮後既述の蛋白定量
を行った。

【００２５】ｓｔｅｐ３の工程を経て得られたポリペプ
チドの活性を確認した結果は以下の通りである。 （１）血小板凝集阻害 これらポリペプチドは、ヒト固定血小板及びヒト多血小
板血漿のリストセチン、ボトロセチン凝集を 3 μg/ml
で完全に阻害した。また、ヒト固定血小板のウシｖＷＦ
による凝集を 3 μg/ml で完全に阻害した。さらに、ヒ
ト多血小板血漿のＡＤＰ、コラーゲン凝集に対し 30 μ
g/ml で影響を与えなかった。 （２）バインディングアッセイ これらポリペプチドは、ボトロセチンによる¹²⁵Ｉ−ヒ
トｖＷＦのヒト固定血小板への結合、および¹²⁵Ｉ−ウ
シｖＷＦのヒト固定血小板への結合を 1 μg/mlで完全
に阻害した。 （３）ずり応力誘導血小板凝集阻害 これらポリペプチドは、ヒト多血小板血漿を用いた高ず
り応力により誘導した血小板凝集を 3 μg/ml で完全に
阻害したが、低ずり応力のそれは阻害しなかった。 （４）血小板凝集惹起活性 これらポリペプチドは、30 μg/ml で、ヒト固定血小板
の凝集を全く惹起しなかった。

【００２６】純化したポリペプチド（蛋白量 1 μg）に
ついて、ウサギ筋肉由来のフォスフォリラーゼＢ（97.4
Kd）、牛血清由来の血清アルブミン（66.2 Kd）、卵白
由来のオバルブミン（45 Kd）、牛由来のカーボニック
アンヒドラーゼ（31 Kd）、大豆由来のトリプシンイン
ヒビター（21.5 Kd）および卵白由来のリゾチーム（14.
4 Kd）をスタンダードとする１６％のＳＤＳ−ＰＡＧＥ
で、非還元条件下および還元条件下に分子量を検量線を
用いて正確に計算したところ、還元前２８，９００、還
元後１６，１００および１５，４００のサブユニットか
らなることが判明した。

【００２７】本発明者らは、このようにして得られたポ
リペプチドが上記各性質を有するものとして新規な物質
であると認め、トカラセチン（Tokaracetin）（還元前
ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析で分子量が２８，９００と認めら
れたポリペプチド））と、還元後分離されたポリペプチ
ドにつき、トカラセチンサブユニットα（還元後ＳＤＳ
−ＰＡＧＥ分析で分子量が１６，１００と認められたポ
リペプチド）、トカラセチンサブユニットβ（同１５，
４００）と命名した。

【００２８】以上の結果から、本発明のトカラセチン
は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥの分析による分子量が、２８，９
００±５，０００であり、還元後１６，１００±３，０
００であるサブユニットα、１５，４００±３，０００
であるサブユニットβからなるヘテロダイマーであると
認められた。

【００２９】ｓｔｅｐ３の精製工程を経て得られたトカ
ラセチンの還元前および還元条件下における１６％グラ
ジェントＳＤＳ−ＰＡＧＥの泳動パターンを図１に示
す。図中レーン１は、上述ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析の分子
量スタンダードであり、９７．４ Ｋｄはウサギ筋肉由
来のフォスフォリラーゼＢ、66.2 Kdは牛血清由来の血
清アルブミン、45 Kdは卵白由来のオバルブミン、31 Kd
は牛由来のカーボニックアンヒドラーゼ、21.5 Kdは大
豆由来のトリプシンインヒビター、14.4 Kdは卵白由来
のリゾチームである。図中レーン２は、ｓｔｅｐ３で得
られたトカラセチン（1μg）の非還元条件下における泳
動パターンであり、同様にレーン１のスタンダードに対
する分子量として、約 28.9 Kdと算出されたものであ
る。レ−ン３は、ｓｔｅｐ３で得られたトカラセチン
（1 μg）の還元条件下における泳動パターンであり、
レーン１のスタンダードに対する分子量として検量線を
用いて約 16.1 Kdと算出されたものがトカラセチンサブ
ユニットαであり、同様に約 15.4 Kdと算出されたもの
がトカラセチンサブユニットβである。

【００３０】ｓｔｅｐ３の精製工程で得られたトカラセ
チンを炭酸アンモニウムに透析後凍結乾燥した粉末をサ
ンプルとし、このサンプル 300 mg に塩酸グアニジン 6
00 mg を添加し、400 μl の 0.3M トリス塩酸バッファ
ー（pH 8.3）を加えて撹拌し、200 μl のミリキュー
（MilliQ）水を加えて約 1 mlとした。20 μl のトリ−
ｎ−ブチルホスフィン（還元剤）、次に 10 μl の４−
ビニルピリジンを加え３時間放置後、逆相ＨＰＬＣ［充
填剤：シンクロパック（Synchropak） RP-18］にてトカ
ラセチン−α、−βに分け、これらについて既述の方法
でＮ末端アミノ酸部分配列を確認した結果、それぞれ配
列表１、２の配列であることが確認された。

【００３１】ｓｔｅｐ３で得られたトカラセチンについ
て、その活性を確認したところ、トカラセチンは、ヒト
固定血小板及びヒト多血小板血漿のリストセチン、ボト
ロセチン凝集を 3 μg/ml で完全に阻害し、ヒト多血小
板血漿のＡＤＰ、コラーゲン凝集に対し 30 μg/ml で
影響を与えなかった。また、バインディングアッセイの
ボトロセチンによる¹²⁵Ｉ−ヒトｖＷＦのヒト固定血小
板への結合および¹²⁵Ｉ−ウシｖＷＦのヒト固定血小板
への結合を 1 μg/ml で完全に阻害した。また、トカラ
セチンは 30 μg/ml でヒト固定血小板の凝集を全く惹
起せず、自体では血小板凝集を惹起しないことが確認さ
れた。

【００３２】実施例２（トカラセチンの還元アルキル
化） 実施例１のｓｔｅｐ３で得られたトカラセチンの 300
μg/ml を、10 mM ジチオスレイトール（DTT:dithiothr
eitol）を含む 50 mM トリス塩酸バッファー（pH 8.6）
で３７℃、３０分間インキュベート後、80 mM ヨードア
セトアミド（IAA:iodoacetamide）を含む 50 mM トリス
塩酸バッファー（pH 8.6）を添加し、室温で30分間放置
した。ＳＤＳ−ＰＡＧＥによる分子量測定を行い、トカ
ラセチンが１６，１、１５，４Ｋｄのサブユニットに還
元されたことを確認した。この還元トカラセチンのｖＷ
Ｆ依存性血小板凝集阻害活性はウシ精製ｖＷＦ 5 μg/m
lによるヒト固定血小板凝集阻害により確認した。その
結果、還元トカラセチン（終濃度３μg/mｌ）のｖＷＦ
依存性血小板凝集阻害活性は、完全に消失していた。

【００３３】実施例３（¹²⁵Ｉ−トカラセチンのヒト固
定血小板への結合）¹²⁵ Ｉ−ヨウ化ナトリウム（Ｎａ¹²⁵Ｉ；アマシャム社）
を用いて、ヨードジェン法にてトカラセチンのヨードラ
ベルを行った。ラベル蛋白の放射比活性は、2〜3.4 μC
i/μg であった。この¹²⁵Ｉ−トカラセチン（1 μg/m
l）は、ヒト固定血小板に強く結合し、この結合は飽和
的であった。また、この結合は、ＧＰＩｂ上のｖＷＦ結
合部位を認識することが既に確認されている抗ＧＰＩｂ
モノクローナル抗体（10 μg/ml）により完全に阻害さ
れた。つまり、トカラセチンは、ＧＰＩｂ結合蛋白であ
り、かつその結合部位はｖＷＦ結合部位と同一かその近
傍にあることが判明した。スキャッチャードプロット
（Scatchard Plot）による解析の結果、結合のＫｄ値は
3.91±1.36 nmol/lであり、血小板１個あたりの結合数
は 47,440±2,780 であった。

【００３４】

【配列表】配列番号：１ 配列の長さ：４９ 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド フラグメント型：Ｎ末端フラグメント 配列： Asp Cys Pro Ser Gly Trp Ser Ser Phe Lys Gln Tyr Cys Tyr Lys 1 5 10 15 Pro Phe Lys Gln Leu Lys Thr Trp Glu Asp Ala Glu Arg Phe Cys 16 20 25 30 Leu Glu Gln Val Lys Gly Ala His Leu Val Ser Ile Glu Xaa Tyr 31 35 40 45 Xaa Xaa Ala Val 46

【００３５】配列番号：２ 配列の長さ：４３ 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド フラグメント型：Ｎ末端フラグメント 配列： Asp Cys Pro Ser Asp Trp Ser Ser Tyr Asp Glu His Cys Tyr Arg 1 5 10 15 Val Phe Gln Gln Lys Met Asn Trp Glu Asp Ala Glu Lys Phe Cys 16 20 25 30 Thr Gln Gln His Lys Gly Xaa His Leu Xaa Xaa Tyr Glu 31 35 40

【図面の簡単な説明】

【図１】トカラセチンの非還元条件下、還元条件下にお
けるＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析による電気泳動パターンを示
す図面である。図中、レーン１は相対的に低分子量のス
タンダード、レーン２はトカラセチン（非還元条件
下）、レーン３はトカラセチン（還元条件下）の泳動パ
ターンである。左側の数値（Kd）はスタンダードの分子
量を、右側に記載した数値は本発明トカラセチンの分子
量とトカラセチン−α、トカラセチン−β（それぞれ
α、βで記述）のサブユニットのサイズをそれぞれ示
す。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 三浦 修治 奈良県橿原市南八木町２丁目４番地６ (72)発明者 川崎 富久 茨城県つくば市千現１丁目18番地５ パレ スハピネス203 (72)発明者 久道 奈美 茨城県つくば市春日２−37 ２−402号 (72)発明者 谷内 由太 茨城県つくば市二の宮３丁目13番地１ ル ーミーにのみや423

Claims (2)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】下記の物理化学的性質で特定されるポリペ
   プチド。 （１）分子量、構成成分、サイズ：ＳＤＳ−ポリアクリ
   ルアミドゲル電気泳動法（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）の分析に
   よる分子量が、２８，９００±５，０００であり、還元
   後１６，１００±３，０００であるサブユニットα、１
   ５，４００±３，０００であるサブユニットβとからな
   るポリペプチド。 （２）Ｎ末端アミノ酸部分配列： （ａ）ポリペプチドのサブユニットα； Asp Cys Pro Ser Gly Trp Ser Ser Phe Lys Gln Tyr Cys Tyr Lys Pro Phe Lys Gln Leu Lys Thr Trp Glu Asp Ala Glu Arg Phe Cys Leu Glu Gln Val Lys Gly Ala His Leu Val Ser Ile Glu Xaa Tyr Xaa Xaa Ala Val （ｂ）ポリペプチドのサブユニットβ； Asp Cys Pro Ser Asp Trp Ser Ser Tyr Asp Glu His Cys Tyr Arg Val Phe Gln Gln Lys Met Asn Trp Glu Asp Ala Glu Lys Phe Cys Thr Gln Gln His Lys Gly Xaa His Leu Xaa Xaa Tyr Glu （式中 Xaa は、アミノ酸残基を意味する）
2. 【請求項２】 トカラハブ［Trimeresurus tokarensis］
   由来のものである請求項１記載のポリペプチド。