JP2004527469A6

JP2004527469A6 - ペプチドおよび／またはタンパク質、並びにその治療用および／または予防用医薬成分を調製するための使用

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Publication number: JP2004527469A6
Application number: JP2002549711A
Authority: JP
Inventors: ペッツェルバウアー，ペーター
Original assignee: ファイブレックスメディカルリサーチアンドデベロップメントゲーエムベーハー
Priority date: 2000-12-12
Filing date: 2001-12-07
Publication date: 2005-02-03
Anticipated expiration: 2021-12-07

Abstract

本発明は、一般式（Ｉ）のペプチドまたはタンパク質に関し、Ｒ_１およびＲ_２は、独立に、＝水素、または１から３の、特に１０までの炭素原子を有する飽和あるいは不飽和炭化水素基、Ｚ_１＝ヒスチジンあるいはプロリン基、Ｚ_２＝アルギニン基、初めの端にアルギニン基を有する、特に２から３０のアミノ酸を有するペプチド基またはタンパク質基である。同様に、その塩類、例えばそのアミド、または、その材料のおよび／または少なくとも一つの更なる材料との混合物に関する。（Ｉ）はヒト用および／または動物用薬剤において、治療および／または予防への適用に使用できる。

Description

本発明は、ペプチドおよび／またはタンパク質、その治療用および／または予防用医薬成分を調製するための使用、並びに医薬成分に関する。
【０００１】
炎症反応を抑制または予防する物質、いわゆる免疫抑制剤が、従来予防や治療に使われており、これは一般的に２つの異なる群を含んでいる。１つは体内で自然に生じるホルモン誘導体、すなわちコルチゾンであり、２つ目はシクロスポリンおよびその誘導体、アザチオプリン、シクロファスファミド等の外来性の免疫抑制剤である。これらの物質すべては、抗炎症作用を有しているが、長期間の治療においてはかなりの副作用を示す。このような副作用は長期間の治療において制限をもたらす。このため、これらの物質は、副作用を許容できるレベルに保つために、あるいは実質的にその治療を進めるために、交代に、あるいは組み合わせて使われる。副作用の例としては、コルチゾンに関わる病的骨折があり、この骨折はコルチゾンがもたらす骨粗鬆症により起こる。また、シクロスポリンにより腎不全を起こす可能性がある。このような副作用は両グループの成分には不可避なものであり、そしてそれゆえ、どの時点で治療を止めなければならないかは、単に治療期間および全服用量により決まる。
【０００２】
本発明は炎症反応を予防もしくは抑制するのに適しており、より小さな副作用しか示さない、新しい医薬生成品を提供することを目的としている。更なる目的は、長期間の治療を提供することにある。
【０００３】
以下に、本発明に係るペプチドのアミノ酸を、標準的な略記により記載する。なお、アミノ酸はαアミノ酸を示している。
【０００４】
類推により、ペプチドがフィブリンの配列から、および特に好ましい配列から、誘導体化、置換、好ましくは相同的な置換、欠失および／または挿入により、得られたものと理解される。
【０００５】
本発明に係るペプチドまたはタンパク質は、ヒト用および／または動物用薬剤における、治療および／または予防としての使用のための、一般式Ｉ（ＳＥＱＩＤＮＯ１，２）を示し、
【０００６】
【化３】

【０００７】
Ｒ_１およびＲ_２は、同じでも異なっていてもよく、水素、または１から３までの、特に１０までの炭素原子を含む飽和あるいは不飽和炭化水素残基を示し、
Ｚ_１がヒスチジンあるいはプロリン残基を示し、
Ｚ_２がアルギニン残基、初めにアルギニン残基を含む、特に２から３０までのアミノ酸を含むペプチド残基またはタンパク質残基を示す、ペプチドまたはタンパク質、
および、その塩類、および同様に例えばアミド、互いのおよび／または少なくとも一つの更なる物質との混合物を示し、これにより特にＬ−アミノ酸だけが提供される。
【０００８】
特定のアミノ酸配列が、細胞の、血流から血管壁の内皮細胞への接着を防ぎ、および／またはその結果生じる血液から組織への移行を防ぐことは極めて驚くべきことである。
【０００９】
本発明に係るペプチドまたはタンパク質は、ヒト用および／または動物用薬剤における、治療および／または予防としての使用のための、一般式ＩＩ（ＳＥＱＩＤＮＯ３から１０）を示し、
【００１０】
【化４】

【００１１】
Ｒ_１およびＲ_２は、同じでも異なっていてもよく、水素、または１から３までの、特に１０までの炭素原子を含む飽和あるいは不飽和炭化水素残基を示し、
Ｚ_１がヒスチジンまたはプロリン残基を示し、
Ａｒｇがアルギニン残基を示し、
Ｚ_３がプロリンまたはバリン残基を示し、
Ｚ_４がロイシンまたはバリン残基を示し、
Ｚ_５がタンパク質残基もしくはペプチド残基、特に２から３０のアミノ酸を含むもの
または、１から３までの、特に１０までの炭素原子を含むアルコール残基
または、有機または非有機の塩基残基を示す、ペプチドまたはタンパク質、
および、その塩類、および同様に例えばアミド、互いのおよび／または少なくとも一つの更なる物質との混合物を示し、これにより特にＬ−アミノ酸だけが提供される。
【００１２】
フィブリノゲンの配列の一部、ペプチド、フラグメントが抗炎症作用を示すことは極めて驚くべきことである。このような理論的考察に結び付けなければ、上記効果はフィブリンが、そのＢベータ鎖のネオ−Ｎ末端を介して内皮細胞に結合し、およびＡアルファ鎖の配列を介して血流の細胞に結合し、これにより細胞の接着、組織への移行を導くという事実に基づいているだろう。これらの結合はフィブリン形成が阻害されるという副作用を示す。しかし、小さなけがをした場合ではフィブリンがなくても血液凝固が十分に起こるので、上記阻害は患者への潜在的な損害にはならない。外科治療の場合にのみ、随意的にこの種の治療を止めるのに適しているだろう。これらの物質は自然のリガンドにのみ相互作用するので、他の副作用も実質的に除外できるかもしれない。さらに、この自然防御が血液の白血球により逆に冒されることはない。したがって、顆粒白血球、リンパ球、単球等の、その成分は作用されず、したがって自然防御作用は維持され、血中の感染に対する防御はもとのままである。
【００１３】
フィブリノゲンは、肝臓でこの形で生成され、生物的に不活性で、通常は血中で３ｇ／ｌ前後の濃度にて供給される。プロ酵素プロトロンビンのタンパク質分解性分割によりトロンビンが形成され、トロンビンは、フィブリノゲンからフィブリノペプチドＡおよびＢを分割して離れさせる。そうすることで、フィブリノゲンは生物的に活性型に変化する。フィブリンとフィブリン分割生成物ができる。
【００１４】
トロンビンは、例えば炎症性、障害性、あるいは変性の組織への損傷が起こるたびに、凝血の活性化を行う間に毎回形成される。トロンビンにより仲介されるフィブリン形成は、基本的には血管システムに生じたあらゆる欠損をすばやく塞ぐことを目的とする保護作用である。しかし、フィブリン形成は病原性の作用でもある。心筋梗塞を引き起こすフィブリン血栓の出現は、ヒト用医薬品におけるもっとも重要な問題の一つである。
【００１５】
炎症細胞が血流から組織へ噴出する間にフィブリンが担う役割は、一方では病原微生物や組織で発生する腫瘍細胞に対する防御に必要な過程であるが、しかしその反面、それ自身が組織に与えるダメージを誘導したり長引かせたりする過程であり、これは今まで全く、あるいは十分な範囲まで調査されていない。フィブリンは、Ｂベータの配列により、ＢベータのネオＮ末端を介して内皮細胞に結合し、そして、配列Ａアルファにより血流の細胞に結合する。これにより、細胞の接着および組織への移行を誘導する。
【００１６】
本発明に係るペプチドもしくはタンパク質は、血流から血管壁の内皮細胞への細胞の接着、および／または、その結果として起こる血液から組織への移行を防ぐ可能性がある。
【００１７】
一般式ＩＩの、本発明に係るペプチドもしくはタンパク質であって、Ｚ_５が次のアミノ酸配列（ＳＥＱＩＤＮＯ１１）：
ＡｓｐＬｙｓＬｙｓＡｒｇＧｌｕＧｌｕＡｌａＰｒｏＳｅｒＬｅｕＡｒｇＰｒｏＡｌａＰｒｏＰｒｏＰｒｏＩｌｅＳｅｒＧｌｙＧｌｙＧｌｙＴｙｒＡｒｇ
を含むペプチド残基を示し
Ｚ_１がヒスチジン残基を示し、
Ａｒｇがアルギニン残基を示し、
Ｚ_３がプロリン残基を示し、
Ｚ_４がロイシン残基を示すものは、
フィブリン断片が血管壁へ沈着あるいは接着することを防ぐ。したがって、炎症細胞が動脈および静脈の血管壁の内皮細胞に残ることを不可能にし、このような細胞が血管壁に残存することが防がれ、したがって組織にこれ以上侵入することを防ぐ。
【００１８】
一般式ＩＩのペプチドもしくはタンパク質であって、Ｚ_５が次のアミノ酸配列（ＳＥＱＩＤＮＯ１２）：
ＧｌｕＡｒｇＨｉｓＧｌｎＳｅｒＡｌａＣｙｓＬｙｓＡｓｐＳｅｒＡｓｐＴｒｐＰｒｏＰｈｅＣｙｓＳｅｒＡｓｐＧｌｕＡｓｐＴｒｐＡｓｎＴｙｒＬｙｓ
を含むペプチド残基を示し
Ｚ_１がプロリン残基を示し、
Ａｒｇがアルギニン残基を示し、
Ｚ_３がバリン残基を示し、
Ｚ_４がバリン残基を示すものは、
末梢血の細胞がフィブリンもしくはフィブリン断片に接着することを防ぐ効果があり、それゆえ、その組織への移行を妨げる。
【００１９】
記載した分割産物は、資料では、ペプチドＢベータおよびペプチドＡアルファとして知られている。上述した前接着、および前移行の経路は、血液から組織への細胞の移行を制御するシステムでは、完全に新規なものである。フィブリンのこの機能は、ペプチドＢベータにより、およびペプチドＡアルファによっても、妨害できる。
【００２０】
したがって、本発明に係る上記ペプチドは、血液から組織への細胞の移行を妨害するための、ヒト用もしくは動物用の治療薬剤に適している。タンパク質分解性の分割により生成されるフィブリンまたは他のフィブリノゲン産物、例えばウロキナーゼ−プラスミノーゲン活性因子により分割されたフィブリノゲンのようなものは、特異的に、および局所的に限られた範囲すなわち炎症部位、凝血が妨害されている部位、動脈硬化部位、血栓症部位、および／または腫瘍増殖部位でしか生成されない。このため、上記治療薬剤の効果は局所的なものとなり、これは他の場所で起こった病原的な副作用が予想されない、もしくは限られた範囲であることを意味する。
【００２１】
本発明に係るペプチドおよび／またはタンパク質の好ましく、完全に予期されていない適用分野は、感染が発生した場合に、自己免疫反応による、リュウマチ性疾患による、免疫システムの不全による、遺伝的疾患による、体内で起こる局所性および／または全身性の炎症を治療するまたは予防する医薬成分の調製にある。また、適用分野は、臓器移植の後に起こる拒否反応、動脈硬化、再潅流障害、動脈硬化および／または血栓症およびフィブリンの沈着増加にの予防および／または治療のための医薬成分の調製にある。このようなペプチド、特にＢベータは、ヒトまたは動物の内皮細胞へのさらなる薬剤物質の輸送を成し遂げる医薬成分の調製にも非常に適している。このようして、輸送される薬剤物質はその一端でペプチドに結合し、そしてＶＥ−カドヘリンにより血管壁、すなわち内皮細胞のフリースポット上に沈着する。
【００２２】
以下に、本発明を実施例を用いてより詳しく説明する。
【００２３】
実施例１：
フィブリノゲン分割生成物の調製
フィブリノゲンの非重合分解産物は、ブロムベック（Ｂｌｏｍｂａｅｃｋ）ら（Ｎａｔｕｒｅ１９６８，２１８，１３０−１３４）にしたがって、臭化シアンを用いた分解により得られた。このようにして、フィブリノゲンは主に６３ｋＤａの断片、すなわちＮ末端ジスルフィドノット（ＮＤＳＫ）からなり、およびＡアルファ鎖１−５１、Ｂベータ鎖１−１１８およびガンマ鎖１−７８を含むものに分解された。ＮＤＳＫ−ＩＩ（ＮＤＳＫマイナスフィブリノペプチドＡおよびＢ）を得るためには、トロンビン（２０ユニット／１μｇＮＤＳＫ）を室温で３時間作用させることで、Ａアルファ−およびＢベータ鎖のＮ末端アミノ酸を分割して離し、続いてジイソプロピルフルオロリン酸処理して、トロンビン活性を阻害する。このようにして得られたＮＤＳＫ−ＩＩは、Ａアルファ鎖１７−５１、Ｂベータ鎖１５−１１８およびガンマ鎖１−７８からなる。
【００２４】
ＮＤＳＫ−ｕＰＡを得るために、ＮＤＳＫ５００μｇを、メサーズテクノクローン（ＦｉｒｍａＴｅｃｈｎｏｃｌｏｎｅ），ウィーン、オーストリアのウロキナーゼ−プラスミノーゲン活性因子（ｕＰＡ）２００ユニットで、３７℃で１時間処理した。反応は５ｍＭのフッ化フェニルメチルスルフォニルにより止められた。このようにして得られたＮＤＳＫ−ｕＰＡは、ＮＤＳＫであり、フィブリノペプチドＢを持たない。
【００２５】
ネガティブコントロールとして、フィブリノゲン分割産物から、ニーウェンハイゼン（Ｎｉｅｕｗｅｎｈｕｉｚｅｎ）ら（ＢｉｏｃｈｅｍＢｉｏｐｈｙｓＡｃｔａ１９８３，７５５；５３１−５３３）によるとＦＣＢ−２と呼ばれる２つ目のフラクションを得た。この分割産物は臭化シアンで処理されることで生成された。ＦＣＢ−２は４３ｋＤａの大きさのタンパク質であり、Ａアルファ鎖１４８−２０８、Ｂベータ鎖１９１−３０５、およびガンマ鎖９５−２６５からなる。調整のため、トロンビンとジイソプロピルフルオロリン酸を上記タンパク質に加えた。しかし、これはこのタンパク質（以下、ＦＣＢ−２−ｔｈｒと称する）に何の変化ももたらさなかった。
【００２６】
更なるネガティブコントロールを目的に、培地（ＦｉｒｍａＬｉｆｅｔｅｃｈｎ，Ｉｎｃ．，Ｐａｉｓｋｙ，ＵＫのＲＰＭＩ）を上記のようにトロンビンで処理し、続いて不活性化した（ＲＰＭＩ−ｔｈｒ）、または、上記のようにｕＰＡで処理してそして不活性化した（ＲＰＭＩ−ｕＰＡ）。
【００２７】
実施例２：
ペプチドＡアルファ（ＳＥＱＩＤＮＯ１２）は、フィブリンのアルファ鎖のアミノ酸１から２８に対応し、フィブリノゲンのＡアルファ鎖のアミノ酸１７から４５と同一である：
ＧｌｙＰｒｏＡｒｇＶａｌＶａｌＧｌｕＡｒｇＨｉｓＧｌｎＳｅｒＡｌａＣｙｓＬｙｓＡｓｐＳｅｒＡｓｐＴｒｐ
ＰｒｏＰｈｅＣｙｓＳｅｒＡｓｐＧｌｕＡｓｐＴｒｐＡｓｎＴｙｒＬｙｓ
ペプチドＢベータ（ＳＥＱＩＤＮＯ１１）は、フィブリンのベータ鎖のアミノ酸１から２８に対応し、フィブリノゲンのＢベータ鎖のアミノ酸１５から４３と同一である。以下に配列を示す。：
ＧｌｙＨｉｓＡｒｇＰｒｏＬｅｕＡｓｐＬｙｓＬｙｓＡｒｇＧｌｕＧｌｕＡｌａＰｒｏＳｅｒＬｅｕＡｒｇＰｒｏ
ＡｌａＰｒｏＰｒｏＰｒｏＩｌｅＳｅｒＧｌｙＧｌｙＧｌｙＴｙｒＡｒｇ
ＣａｒｐｉｎｏＬ．Ａ．およびＨａｎ．ＧＹ，Ｊ．Ａｍｅｒ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１９８１；３７；３４０４−３４０９に従ったフルオレニルメチルオキシカルボニル（ＦＭＯＣ）−保護群法を適用することで、ＭｅｒｒｉｆｉｅｌｄＲ．Ｂ．，Ｊ．Ａｍｅｒ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１９６３；８５，２１４９−２１５４によれば複合ペプチド合成機を用いて固相ペプチド合成により両方のペプチドが合成される。粗ペプチドは、ＥｎｇｅｌｈａｒｔＨ．およびＭｕｅｌｌｅｒＨ．クロマトグラフィ１９８４１９：７７、およびＨｅｎｓｃｈｅｎＡ．，ＨｕｐｅＫ．Ｐ．およびＬｏｔｔｓｐｅｉｃｈＦ．高性能液体クロマトグラフィＶＣＨ１９８５に従った、ヌクレオシル（Ｎｕｃｌｅｏｓｉｌ）１００−１０，Ｃ１８−カラムを介した分離用逆相（ｐｒａｅｐａｒａｔｉｖｅｒｒｅｖｅｒｓｅｄ−ｐｈａｓｅ）ＨＰＣＬにより精製された。コントロールペプチドとして、同じ長さのペプチドであるが、ランダム化したアミノ酸配列が含まれたものを用いた。
【００２８】
実施例３：
ＨＵ−ＳＣＩＤマウスモデル：
ヒトの皮膚をＳＣＩＤマウスの背中に移植し、２週間後、ヒトリンパ球を腹膜に注入した。手順はペッツェルバウアー（Ｐｅｚｔｅｌｂａｕｅｒ）ら（Ｊ．Ｉｎｖｅｓｔ．Ｄｅｒｍａｔｏｌ．１９９６，１０７；５７６−５８１）に従った。そして、このように準備された１５匹のマウスに対して、以下のものを尾静脈に注入した。
ａ）１００μｇのヒトＮＤＳＫ−ＩＩ
ｂ）１００μｇのヒトＦＣＢ−２
ｃ）１００μｇのペプチドＡアルファ
ｄ）１００μｇのペプチドＢベータ
ｅ）１００μｇのランダム化したペプチドＡアルファ
ｆ）１００μｇのランダム化したペプチドＢベータ
２４時間後、ヒトの皮膚を除去し、０．３ｍｍ^２内の細胞にて発現した炎症部位の数を算出し、標準偏差により平均値を求めた。
ａについて：２２＋／−２．８
ｂについて：９＋／−２．１
ｃについて：４＋／−１．１
ｄについて：６＋／−１．１
ｅについて：５＋／−１．２
ｆについて：７＋／−１．３
これにより、ＮＤＳＫ−ＩＩが炎症を引き起こすという結果が導かれる。それゆえ、上記タンパク質は病原性物質として使用した。他の化合物はそれ自体は有意な炎症細胞の量の増加を示さなかった。
【００２９】
比較例４：
実施例３に記載の１５匹のマウスに対して、
１００μｇのヒトＮＤＳＫ−ＩＩ
１００μｇのランダム化したペプチドＡアルファ
を尾静脈に注入した。
以降の手順は実施例３に従った。０．３ｍｍ^２内に２３＋／−３．５の炎症部位が認められた。
【００３０】
比較例５：
実施例３に記載の１５匹のマウスに対して、
１００μｇの実施例１に記載のヒトＮＤＳＫ−ＩＩ、および
１００μｇのランダム化したペプチドＢベータ
を尾静脈に注入した。
以降の手順は実施例３に従った。０．３ｍｍ^２内に２４＋／−２の炎症部位が認められた。
【００３１】
実施例６：
実施例３に記載の１５匹のマウスに対して、
１００μｇのヒトＮＤＳＫ−ＩＩ、および
１００μｇの合成したペプチドＡアルファ
を尾静脈に注入した。
以降の手順は実施例３に従った。０．３ｍｍ^２内に２１＋／−２．２の炎症部位が認められた。
【００３２】
実施例７：
実施例３に記載の１５匹のマウスに対して、
１００μｇのヒトＮＤＳＫ−ＩＩ、および
１００μｇの合成したペプチドＢベータ
を尾静脈に注入した。
以降の手順は実施例３に従った。０．３ｍｍ^２内に１４＋／−２の炎症部位が認められた。
【００３３】
例４から７は、ペプチドＢベータがリンパ性炎症をを阻害することを示している。
【００３４】
比較例８：
ヒト臍静脈（ＨＵＶＥＣ）から得た内皮細胞を赤色蛍光染色（セルトラッカーオレンジ（ＣｅｌｌＴｒａｃｋｅｒＯｒａｎｇｅ），１μｌ／ｍｌ，ＭｏｌｅｃｕｌａｒＰｒｏｂｅｓ，Ｅｕｇｅｎｅ，ＯＲ）で標識し、コラーゲンマトリックス（ＣｏｌｌａｂｏｒａｔｉｖｅＢｉｏｍｅｄｉｃａｌＰｒｏｄｕｃｔｓ，Ｂｅｄｆｏｒｄ，ＭＡ）上に分散した。内皮細胞の集合上に、緑色蛍光染色（セルトラッカーグリーン（ＣｅｌｌＴｒａｃｋｅｒＧｒｅｅｎ），１μｌ／ｍｌ，ＭｏｌｅｃｕｌａｒＰｒｏｂｅｓｄｅｒＦｉｒｍａＥｕｇｅｎｅＯｒｉｇｏｎ））により標識された末梢単核血球（ＰＢＭＣ）（２５ｍｍ^２内に１０^５細胞）が重なっていた。その後、細胞を１２時間３７℃で保温した。
【００３５】
ゲル内に移行した接着細胞は、レーザースキャン顕微鏡で撮影され、画素に変換し、グロガー（Ｇｒｏｅｇａｒ）ら（Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄ１９９９；２２２；１０１−１０９）にしたがった「ＮＩＨ画像」により評価した。
【００３６】
これにより、０．１ｍｍ^２における接着細胞、例えば上述した「接着」している（ｕｎｔｅｒ ”Ａｄｈａｅｓｉｏｎ”）もの、の数を決定することができた。これにより、０．０４ｍｍ^３における移行した細胞、例えば上述した「移行」している（ｕｎｔｅｒ ”Ｍｉｇｒａｔｉｏｎ”）もの、の数を決定することができた。標準偏差により３回の３つの試行の平均値を算出した。
【００３７】
【表１】

【００３８】
これにより、ＮＤＳＫ−ＩＩがＮＤＳＫ−ｕＰＡより大きな程度で末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）の有意な移行を引き起こし、それゆえ病原活性を示すという結論が導かれる。コントロールのａ），ｂ），ｅ），ｆ），およびｇ）のいずれも有意な移行を引き起こさなかった。
【００３９】
実施例９：
１００μｇのＮＤＳＫ−ＩＩと、Ｂベータまたはランダム化したＢベータとを、ＰＢＭＣの懸濁液を含む、実施例８に基づくコラーゲンマトリックスに添加した。以降の手順は実施例８に基づく。
【００４０】
【表２】

【００４１】
これらのテストの結果からもわかるように、ペプチドＢベータは炎症を阻止する。
【００４２】
実施例１０：
１００μｇのＮＤＳＫ−ＩＩと、Ａアルファまたはランダム化したＡアルファとを、ＰＢＭＣの懸濁液を含む、実施例８に基づくコラーゲンマトリックスに添加した。以降の手順は実施例８に基づく
【００４３】
【表３】

【００４４】
これらのテストの結果からもわかるように、ペプチドＡアルファは少しだけＰＢＭＣの移行を阻止する。
【００４５】
実施例１１：
ＰＢＭＣは実質的にリンパ球と単球の混合物からなるので、ＰＢＭＣ（実施例８−１０のように）の代わりに、実施例１１では精製リンパ球を用いた。
【００４６】
１００μｇのＮＤＳＫ−ｕＰＡまたは１００μｇのＮＤＳＫ−ＩＩそれぞれ、および、ＡアルファまたはＢベータそれぞれを、内皮細胞およびリンパ球を含む、実施例８に基づくコラーゲンマトリックスに加えた。
【００４７】
【表４】

【００４８】
これらのテスト結果は、以下のことを示す。
１）ＮＤＳＫ−ＩＩおよびＮＤＳＫ−ｕＰＡの両者がリンパ性炎症を促進させた。２）ペプチドＢベータは、ＮＤＳＫ−ＩＩおよびＮＤＳＫ−ｕＰＡにより誘導されるリンパ球の接着および移行を完全に阻止した。一方、ペプチドＡアルファは阻止活性を示さなかった。これは遊離アルファ鎖がリンパ球の接着および移行を誘導するのに必要でないことを示唆している。
【００４９】
実施例１２：
手順は、精製単球がリンパ球の代わりに使われていること以外は、実施例１１に基づいている。１００μｇのＮＤＳＫ−ｕＰＡまたは１００μｇのＮＤＳＫ−ＩＩを、それぞれペプチドＡアルファ、ランダム化されたＡアルファ、Ｂベータまたはランダム化されたＢベータに添加した。
【００５０】
【表５】

【００５１】
これらのテスト結果は、ＮＤＳＫ−ＩＩのみが単球の移行を促進させ、そしてＮＤＳＫ−ｕＰＡが促進させないことを示している。これはアルファ鎖およびベータ鎖の両者が遊離Ｎ末端を提示していなければならず、そして単球の移行を阻止することを意味している。
【００５２】
実施例１３：
手順は、実施例１１に基づいており、精製リンパ球を用いた。１００μｇのＮＤＳＫ−ｕＰＡまたは１００μｇのＮＤＳＫ−ＩＩを、それぞれ、ＡアルファＧｌｙＰｒｏＡｒｇ（Ｐｒｏ）−ＮＨ_２アセテート（Ａアルファ誘導体）に由来する、またはＢベータＧｌｙＨｉｓＡｒｇＰｒｏ−ＯＨアセテート（Ｂベータ誘導体）に由来する短いペプチド塩類に加えた。
【００５３】
【表６】

【００５４】
上記実験により、リンパ球移行が阻害された場合、適した方法で持続的に添加されたこれらの短いペプチドは、長いペプチドと同様の活性を示すという結果を示した。
【００５５】
実施例１４：
手順は、実施例１２に基づいており、精製単球を用いた。１００ｍｇのＮＤＳＫ−ｕＰＡまたは１００μｇのＮＤＳＫ−ＩＩを、それぞれ、ＡアルファＧｌｙＰｒｏＡｒｇ（Ｐｒｏ）−ＮＨ_２アセテート（Ａアルファ誘導体）またはＢベータＧｌｙＨｉｓＡｒｇＰｒｏ−ＯＨアセテート（Ｂベータ誘導体）の短いペプチド塩類に加えた。
【００５６】
【表７】

【００５７】
上記実験により、単球移行が阻害された場合、適した方法で持続的に添加されたこれらの短いペプチドは、長いペプチドと同様の活性を示すという結果を示した。
【００５８】
実施例１５
テストは、体重２２０ｇから２８０ｇの間のオスのウィスターラットにて行った。ラットには通常の餌と水を与えた。テストを行うために、ラットは麻酔をされ、容量で３０％の酸素を含み、かつ１ｍｍから２ｍｍマーキュリーの過圧力を加えたガスを、キログラム当たり８ｍｌから１０ｍｌ放出することで、人工的に１分に７０パルス頻度で呼吸させた。右側の心臓動脈に測定管を備えて、心拍数に加えて動脈の血圧も測定した。圧力率は動脈の血圧と脈拍率との帰結として、ｍｍマーキュリー／分／１０^３の範囲で決定された。右側の静脈は、テスト物質を投与するための測定管を備えている。外科処置を行った後、２ｍｌのラット血液を心臓に供給した。３０分後、左側の心臓動脈を閉塞した。さらに２５分後、虚血部分に血液を再供給するために閉塞を開放した。このとき、８００μｇ／ｋｇのペプチドＢベータまたはランダム化したペプチドＢベータが、それぞれ動物の半分に静脈投与され、そして２時間おいておいた。
【００５９】
損傷した心臓組織と損傷していない心臓組織とを区別するために、そのとき左側の心臓動脈には、２重量％濃度のエバンスブルー色素を与えた。それからすぐ、除去した心臓を５つの水平切片に解剖し、静脈の右側壁を除し、断面を３７℃で２０分トリフェニルテトラトルクロライド（Ｔｒｉｐｈｅｎｙｌｔｅｔｒａｔｏｌｃｈｌｏｒｉｄ）（１重量％）処理し、標準組織と梗塞組織との区別を可能とした。断面はコンピューター支援の面積測定により評価した。
【００６０】
血管閉塞により、対照試験ラットの心臓の６２．５％の心筋が危機にあったのに対し、テストラットの心臓は６０％であった。対照試験のラットでは、危機にさらされた組織の４６％が死滅したのに対し、テストラットの心臓では２９％であった。これは、死滅組織の３７％減少に一致する（ｐ＜０．０５）。
【００６１】
本発明に係る物質、および本発明に係る物質の医薬成分調製のための使用は、以下の事項に対して特に重要である：
自己反応リンパ球の組織損傷作用により引き起こされる疾患の治療での医薬成分のためのもの。
【００６２】
これらは、自己免疫の範囲にあてはまる疾患、コラゲナーゼ、リウマチ性疾患、乾癬、および感染後／感染に従属する（ｐｏｓｔ−／ｐａｒａｉｎｆｅｋｔｉｏｅｓｅ）疾患、および移植片のホストに対する反応により起こる疾患などである。上記医薬成分はリンパ球の組織への移行を阻害するので、治療効果が生じる。したがって、リンパ球は血流に残り、自己反応の組織損傷作用を起こすことができない。
【００６３】
治療効果は、臓器移植の後に起こる拒否反応の治療および／または予防のための薬物により引き起こされる。これは、上記薬物がリンパ球の血流から外来の器官への移行を防ぎ、したがって自己反応したリンパ球により外来の器官が破壊されることがないからである。
【００６４】
治療効果は、臓器移植の後に起こる動脈硬化の治療および／または予防のための薬物により引き起こされる。これは、上記薬物がリンパ球および単球の血管壁への移行を妨げ、それゆえ血管壁の細胞の活性化を防ぐからである。このようにすることで、臓器移植に続いて起こる動脈硬化の発生が極小化するまたは防がれる。
【００６５】
治療効果は、外科的に、あるいは薬で誘導された血流回復の後に起こる再灌流障害、例えば、心筋梗塞、卒中発作の後、血管手術、バイパス手術、および臓器移植の後におこる再灌流障害の治療および／または予防のための薬物により引き起こされる。これは、上記薬物がリンパ球および単球の血管壁への移行を妨げるからである。この再灌流障害は、血流回復の間、血管の細胞で起こる酸素欠乏／アシドーシスによりおこり、その活性化を誘導する。これにより、リンパ球と単球とが血管壁に接着し、それに移行する。リンパ球および単球が血管壁へ接着し移行するのを防ぐと言う事実は、低酸素症／アシドーシス誘導の損傷を減少させ、その後に起こる炎症反応により引き起こされる永久的な血管損傷も起こさない。
【００６６】
治療効果は、代謝疾患または老化過程に続いて起こる動脈硬化の治療および／または予防のための薬物により引き起こされる。これは、上記薬物がリンパ球および単球の血管壁への移行を妨ぎ、それゆえその結果生じる動脈硬化プラークの進行（Ｐｒｏｇｒｅｄｉｅｎｚ）を防ぐからである。
【００６７】
本発明に係る医薬成分は、さらなる薬剤物質を輸送するのに用いてもよい。本発明に係る医薬成分は、分子の表面を内皮細胞へ特異的に結合させる。したがって、それに結合した薬剤物質が、他の場所に副作用を引き起こすことがなく、高濃度で内皮細胞と接触することが考えられる。実施例として述べた、細胞分裂を阻害する物質を使用すれば、物質が内皮細胞へ特異的に付加された後、抗血管形成誘導作用を示すかもしれない。この場合、内皮細胞の増殖を防ぎ、それゆえ新しい血管形成が防がれるので、腫瘍の成長は阻止され、腫瘍の患者に治療効果があらわれる。

Claims

ヒト用および／または動物用薬剤における、治療および／または予防としての使用のための、一般式Ｉ（ＳＥＱＩＤＮＯ１，２）

のペプチドまたはタンパク質であって、
Ｒ_１およびＲ_２が、同じあるいは異なっており、水素、または１から３までの、特に１０までの炭素原子を含む、飽和あるいは不飽和炭化水素残基を示し、
Ｚ_１がヒスチジンあるいはプロリン残基を示し、
Ｚ_２がアルギニン残基、初めのアルギニン残基を含む、特に２から３０までのアミノ酸を含むペプチド残基またはタンパク質残基を示す、ペプチドまたはタンパク質、
および、その塩類、および例えば同様にそのアミド、もしくは互いのおよび／または少なくとも一つの更なる物質との混合物。
請求項１に記載の、ヒト用および／または動物用薬剤における、治療および／または予防としての使用のための、一般式ＩＩ（ＳＥＱＩＤＮＯ３から１０）

のペプチドまたはタンパク質であって、
Ｒ_１およびＲ_２が、同じあるいは異なっており、水素、または１から３までの、特に１０までの炭素原子を含む、飽和あるいは不飽和炭化水素残基を示し、
Ｚ_１がヒスチジンまたはプロリン残基を示し、
Ａｒｇがアルギニン残基を示し、
Ｚ_３がプロリンまたはバリン残基を示し、
Ｚ_４がロイシンまたはバリン残基を示し、
Ｚ_５がタンパク質残基もしくはペプチド残基、特に２から３０までのアミノ酸を含むもの、
または、１から３までの、特に１０までの炭素原子を含むアルコール残基、
または、有機または非有機の塩基残基を示す、ペプチドまたはタンパク質、
および、その塩類、および同様に例えばそのアミド、もしくは互いのおよび／または少なくとも一つの更なる物質との混合物。
Ｚ_５がフィブリンのＡアルファ鎖に由来するペプチド残基である請求項２に記載のペプチドまたはタンパク質。
Ｚ_５がフィブリンのＢベータ鎖に由来するペプチド残基である請求項２に記載のペプチドまたはタンパク質。
請求項２に記載の一般式ＩＩのペプチドまたはタンパク質であって、
Ｚ_５が以下のアミノ酸配列（ＳＥＱＩＤＮＯ１１）：
ＡｓｐＬｙｓＬｙｓＡｒｇＧｌｕＧｌｕＡｌａＰｒｏＳｅｒＬｅｕＡｒｇＰｒｏＡｌａＰｒｏＰｒｏＰｒｏＩｌｅＳｅｒＧｌｙＧｌｙＧｌｙＴｙｒＡｒｇ
を含むペプチド残基を示し、
Ｚ_１がヒスチジン残基を示し、
Ａｒｇがアルギニン残基を示し、
Ｚ_３がプロリン残基を示し、
Ｚ_４がロイシン残基を示すペプチドまたはタンパク質。
請求項２に記載の一般式ＩＩのペプチドまたはタンパク質であって、
Ｚ_５が以下のアミノ酸配列（ＳＥＱＩＤＮＯ１２）：
ＧｌｕＡｒｇＨｉｓＧｌｎＳｅｒＡｌａＣｙｓＬｙｓＡｓｐＳｅｒＡｓｐＴｒｐＰｒｏＰｈｅＣｙｓＳｅｒＡｓｐＧｌｕＡｓｐＴｒｐＡｓｎＴｙｒＬｙｓ
を含むペプチド残基を示し、
Ｚ_１がプロリン残基を示し、
Ａｒｇがアルギニン残基を示し、
Ｚ_３がバリン残基を示し、
Ｚ_４がバリン残基を示す、ペプチドまたはタンパク質。
感染に由来する、体内の局所的なおよび／または全身的な炎症の治療用医薬成分の調製のための請求項１から６の何れか１項に記載のペプチドおよび／またはタンパク質の使用。
自己免疫反応に基づく、体内の局所的なおよび／または全身的な炎症の治療用医薬成分の調製のための請求項１から７の何れか１項に記載のペプチドおよび／またはタンパク質の使用。
リュウマチ性疾患に基づく、体内の局所的なおよび／または全身的な炎症の治療用医薬成分の調製のための請求項１から８の何れか１項に記載のペプチドおよび／またはタンパク質の使用。
免疫システム不全に基づく、体内の局所的なおよび／または全身的な炎症の治療用医薬成分の調製のための請求項１から９の何れか１項に記載のペプチドおよび／またはタンパク質の使用。
遺伝的疾患に基づく、体内の局所的なおよび／または全身的な炎症の治療用医薬成分の調製のための請求項１から１０の何れか１項に記載のペプチドおよび／またはタンパク質の使用。
臓器移植の後に生じる拒絶反応、動脈硬化、再潅流障害、動脈硬化性疾患、および／または老化過程でのフィブリン沈着の増加の、予防用および／または治療用医薬成分の調製のための請求項１から１１の何れか１項に記載のペプチドおよび／またはタンパク質の使用。
臓器移植後の動脈硬化の予防用および／または治療用医薬成分の調製のための請求項１から１２の何れか１項に記載のペプチドおよび／またはタンパク質の使用。
再潅流障害の予防用および／または治療用医薬成分の調製のための請求項１から１３の何れか１項に記載のペプチドおよび／またはタンパク質の使用。
動脈硬化および／または血栓性疾患の、予防用および／または治療用医薬成分の調製のための請求項１から１４の何れか１項に記載のペプチドおよび／またはタンパク質の使用。
老化過程でのフィブリン沈着の増加の、予防用および／または治療用医薬成分の調製のための請求項１から１５の何れか１項に記載のペプチドおよび／またはタンパク質の使用。
さらなる薬剤物質をヒトまたは動物の内皮細胞に輸送するために使われる医薬成分の調製のための請求項１から１６の何れか１項に記載のペプチドおよび／またはタンパク質の使用。
請求項１から１７の何れか１項に記載のペプチドおよび／またはタンパク質を少なくとも１つ含む医薬成分。
注入に適した形態で準備された請求項１から１８の何れか１項に記載の医薬成分。