PL209419B1

PL209419B1 - Zastosowanie peptydów lub białek do wytwarzania leku do terapeutycznego i/lub profilaktycznego stosowania w przypadku zapaleń w medycynie i/lub weterynarii

Info

Publication number: PL209419B1
Application number: PL362924A
Authority: PL
Inventors: Peter Petzelbauer
Original assignee: Fibrex Medical Res & Dev Gmbh
Priority date: 2000-12-12
Filing date: 2001-12-07
Publication date: 2011-08-31
Also published as: CY1109107T1; DK1586586T3; CA2430972C; BR0116122A; IL156360A; DE50114771D1; US20090088384A1; WO2002048180A3; NO330767B1; PT1586586E; YU53803A; US7811985B2; DE50110182D1; ZA200304545B; US7494973B2; SI1586586T1; KR20030060988A; WO2002048180A2; US20090137464A1; EP1586586B1

Description

Przedmiotem wynalazku jest zastosowanie peptydów lub białek do wytwarzania leku do terapeutycznego i/lub profilaktycznego stosowania w przypadku zapaleń w medycynie i/lub weterynarii.

Substancje hamujące reakcje zapalne lub zapobiegające reakcjom zapalnym, zwane immunosupresantami, które dotychczas stosowano w profilaktyce i terapii, ogólnie są podzielone na dwie grupy. Pierwszą grupę stanowią pochodne hormonu naturalnie występującego w ludzkim organizmie, kortyzonu, drugą grupę zaś stanowią immunosupresanty, takie jak cyklosporyna i jej pochodne, azatiopryna, cyklofosfamid itp. Wszystkie te substancje mają działanie przeciwzapalne, ale wykazują również znaczące działania uboczne przy długotrwałym stosowaniu. Takie działania uboczne ograniczają terapie długoterminowe, dlatego też substancje te są stosowane na przemian lub w połączeniu, dla zmniejszenia działań ubocznych do dopuszczalnego poziomu, względnie dla umożliwienia kontynuowania terapii. Jako działania uboczne można wymienić patologiczne złamania kości związane ze stosowaniem kortyzonu, wskutek działania kortyzonu wywołującego osteoporozę, bądź ostrą niewydolność nerek, która może być spowodowana przez cyklosporynę. Takie działania uboczne są nieuniknione przy stosowaniu związków należących do obu grup, a zatem czas trwania terapii i całkowita dawka decydują o tym, w którym momencie terapia musi być przerwana.

Wiadomo, że fibrynogen zawiera zarówno łańcuchy peptydowe α jak i β oraz że synteza fibrynogenu jest silnie zwiększona podczas procesów zapalnych (Herrick i in., The International Journal of

Biochemistry & Cell Biology, tom 31, 1999, str. 741-746). Ponadto wymieniono łańcuch peptydowy

Ββ_15-42 (Ikematsu, Rinsho Kensa, tom 28, nr 1, 1984, str. 20-24). Rola produktów rozszczepienia fibrynogenu w zapaleniu i leczeniu zmian chorobowych ostała również opisana w Blood, tom 71, 1988, str.1475-1479.

Istniało zapotrzebowanie na nowe farmaceutyki odpowiednie do profilaktyki lub hamowania reakcji zapalnych, oraz wykazujące minimalne działania uboczne, a ponadto umożliwiające terapię długoterminową.

Wynalazek dotyczy zastosowania peptydów lub białek o ogólnym wzorze II _D HO

R. i ii

3> N — C — C — His—Arg-Pro ~Leu ~Z,

R ¹ ² H w którym R1 i R2 są takie same lub różne i oznaczają atom wodoru, nasyconą lub nienasyconą grupę węglowodorową zawierającą 1 - 10, w szczególności do 3 atomów węgla,

Z5 oznacza ugrupowanie białka lub peptydu, zwłaszcza zawierające 2 - 30 aminokwasów, albo ugrupowanie alkoholu zawierające 1 - 10, w szczególności do 3 atomów węgla, albo ugrupowanie zasady organicznej lub nieorganicznej, oraz ich soli, a także przykładowo amidów, albo ich mieszanin i/lub mieszanin z co najmniej jedną dodatkową substancją, do wytwarzania leku do terapeutycznego i/lub profilaktycznego stosowania w przypadku zapaleń w medycynie i/lub weterynarii.

Korzystne jest zastosowanie peptydów lub białek o ogólnym wzorze II, w którym Z5 oznacza ugrupowanie peptydu o następującej sekwencji aminokwasów (SEQ ID NO: 1):

Asp Lys Lys Arg Glu Glu Ala Pro Ser Leu Arg Pro Ala Pro Pro Pro Ile Ser Gly Gly Gly Tyr Arg do wytwarzania leku do terapeutycznego i/lub profilaktycznego stosowania w przypadku zapaleń w medycynie i/lub weterynarii.

Korzystne jest zastosowanie peptydów i/lub białek do wytwarzania leku do terapii miejscowego i/lub uogólnionego stanu zapalnego w organizmie, na podłożu zakaźnym, na podłożu reakcji autoimmunologicznej, na podłożu choroby reumatycznej, na podłożu zaburzenia układu odpornościowego i na podłożu choroby genetycznej.

Nieoczekiwane jest to, że sekwencja aminokwasów określona powyżej wykazuje działanie przeciwzapalne. Bez wiązania się takimi rozważaniami teoretycznymi działania te mogą być oparte na tym, że fibryna wiąże się z komórkami śródbłonka poprzez neo-N-koniec łańcucha Be oraz z komórkami w prądzie krwi poprzez sekwencję łańcucha Aa, co prowadzi do adhezji i transmigracji komórek do tkanek. Ubocznym skutkiem tego rodzaju wiązania jest hamowanie powstawania fibryny. Takie hamowanie powstawania fibryny nie stanowi jednak potencjalnego zagrożenia dla pacjenta, gdyż nawet w nieobecności fibryny krzepnięcie krwi przy małych zranieniach jest wystarczające. Jedynie

PL 209 419 B1 w przypadku zabiegów chirurgicznych dogodne mogłoby być ewentualnie wstrzymanie tego rodzaju terapii. Inne działania uboczne można zasadniczo wykluczyć, gdyż tego rodzaju substancje oddziałują jedynie z naturalnymi Ugandami. Co więcej, naturalne procesy obronne nie ulegają zakłóceniu ze strony leukocytów krwi. Tak więc ich skład, np. granulocytów, limfocytów i monocytów pozostaje niezmieniony, co wiąże się z podtrzymaniem naturalnych procesów obronnych, a ochrona przed zakażeniami we krwi pozostaje niezmieniona.

Fibrynogen jest wytwarzany w wątrobie i w tej postaci pozostaje biologicznie nieaktywny i występuje zazwyczaj we krwi w stężeniu około 3 g/litr. W wyniku proteolitycznego rozszczepienia proenzymu protrombiny powstaje trombina, która odszczepia z fibrynogenu fibrynopeptydy A i B. W ten sposób fibrynogen ulega przemianie w postać biologicznie aktywną . Powstaje fibryna i produkty rozszczepienia fibryny.

Trombina powstaje w wyniku aktywacji każdego procesu krzepnięcia krwi, czyli wskutek każdego uszkodzenia tkanek na podłożu zapalnym, urazowym lub zwyrodnieniowym. Powstawanie fibryny pośredniczone przez trombinę jest zasadniczo procesem ochronnym mającym na celu zasklepienie wszelkich defektów wywołanych w układzie naczyniowym. Jednakże powstawanie fibryny jest również procesem patologicznym. Pojawienie się zatoru fibrynowego jako przyczyna wywołująca zawał serca stanowi jeden z najważniejszych problemów w medycynie.

Rola, jaką ogrywa fibryna w wynaczynianiu komórek zapalnych z prądu krwi do tkanek, będącym z jednej strony pożądanym procesem związanym z ochroną przed patogennymi drobnoustrojami lub komórkami nowotworowymi obecnymi w tkance, ale z drugiej strony procesem wywołującym lub przedłużającym uszkodzenia tkanek, dotychczas nie została zbadana wcale lub w wystarczającym stopniu. Fibryna wiąże się z komórkami śródbłonka poprzez neo-N-koniec łańcucha Ββ poprzez sekwencję Ββ, oraz z komórkami w prądzie krwi poprzez sekwencję Aa, co prowadzi do adhezji i transmigracji komórek do tkanek.

W niniejszym opisie aminokwasy peptydów są określane za pomocą powszechnie stosowanych skrótów, dotyczących a-aminokwasów.

Określenie „analog” oznacza peptyd, który w wyniku derywatyzacji, podstawienia, korzystnie podstawienia homologicznego, delecji i/lub insercji stanowi pochodną sekwencji fibryny, a zwłaszcza sekwencji korzystnych.

Peptydy lub białka mogą zapobiegać adhezji komórek z prądu krwi do komórek śródbłonka ściany naczynia i/lub zachodzącej następnie ich transmigracji z krwi do tkanki.

Peptyd lub białko stosowane zgodnie z wynalazkiem o ogólnym wzorze II, w którym Z5 oznacza ugrupowanie peptydu o następującej sekwencji aminokwasów (SEQ ID NO: 1):

Asp Lys Lys Arg Glu Glu Ala Pro Ser Leu Arg Pro Ala Pro Pro Pro Ile Ser Gly Gly Gly Tyr Arg a Z1 oznacza resztę histydyny,

Arg oznacza resztę argininy,

Z3 oznacza resztę proliny,

Z4 oznacza resztę leucyny, zapobiega odkładaniu się lub przywieraniu fragmentów fibryny do ściany naczynia. Tak więc niemożliwe staje się zatrzymywanie komórek zapalnych na komórkach śródbłonka ścian naczyniowych tętnic i żył, co zapobiega zatrzymywaniu tych komórek na ścianach naczyń, a tym samym zapobiega następnie infiltracji tkanek.

Peptyd lub białko o ogólnym wzorze II, w którym Z5 oznacza ugrupowanie peptydu o następującej sekwencji aminokwasów (SEQ ID NO: 2):

Glu Arg His Gin Ser Ala Cys Lys Asp Ser Asp Trp Pro Phe Cys Ser Asp Glu Asp Trp Asn Tyr Lys a Z1 oznacza resztę proliny,

Arg oznacza resztę argininy,

Z3 oznacza resztę waliny,

Z4 oznacza resztę waliny, zapobiega przywieraniu komórek krwi obwodowej do fibryny lub fragmentów fibryny, a tym samym uniemożliwia ich migrację do tkanek.

Opisane produkty rozszczepienia są również znane w literaturze jako peptyd Ββ i peptyd Aa.

Wyżej wspomniany szlak sprzyjający adhezji i migracji stanowi całkowicie nowy system kontroli migracji komórek z krwi do tkanek. Tego rodzaju działanie fibryny może zostać zablokowane przez peptyd Ββ i peptyd Aa.

PL 209 419 B1

Tak więc peptydy stosowane zgodnie z wynalazkiem są odpowiednimi środkami terapeutycznymi dla ludzi i zwierząt do blokowania migracji komórek z krwi do tkanek. Ponieważ fibryna i inne produkty fibrynogenu powstające w wyniku proteolitycznego rozszczepienia, takie jak np. fibrynogen rozszczepiony przez aktywator urokinazy-plazminogenu, powstają tylko w sposób specyficzny i regionalnie ograniczony, to znaczy w miejscach ze stanem zapalnym, zaburzonym krzepnięciem, stwardnienia tętnic, zakrzepicą i/lub wzrostem nowotworowym, wpływ tego środka terapeutycznego jest ograniczony lokalnie, co oznacza, że nie należy oczekiwać występowania działań ubocznych w innych miejscach, bądź wystąpią one w ograniczonym zakresie.

Do korzystnych i całkowicie nieoczekiwanych dziedzin zastosowania opisanych peptydów i/lub białek należy wytwarzanie leków do terapii lub profilaktyki miejscowych i/lub uogólnionych stanów zapalnych w organizmie, na podłożu zakaźnym, na podłożu reakcji autoimmunologicznej, na podłożu choroby reumatycznej, na podłożu zaburzenia układu odpornościowego bądź na podłożu choroby genetycznej.

Wynalazek ilustrują poniższe przykłady.

P r z y k ł a d 1

Wytwarzanie produktów rozszczepienia fibrynogenu

Niepolimeryzujące produkty degradacji fibrynogenu otrzymano w wyniku rozpadu pod wpływem bromku cyjanogenu według Blomback i in. (Nature 1968, 218:130-134). W wyniku tej reakcji fibrynogen ulega degradacji głównie do fragmentu 63 kDa, czyli N-końcowego węzła disulfidowego, NDSK, oraz zawiera łańcuch Aa 1-51, łańcuch Be 1-118 i łańcuch γ 1-78. W celu otrzymania NDSK-II (NDSK bez fibrynopeptydów A i B), N-końcowe aminokwasy łańcuchów Aa i Be odszczepiono za pomocą trombiny (20 jednostek/1 μg NDSK) w ciągu trzech godzin w temperaturze pokojowej, a następnie poddano działaniu fluoro-fosforanu diizopropylu w celu zablokowania aktywności trombiny. Tak otrzymany NDSK-II zawierał łańcuch Aa 17-51, łańcuch Be 15-118 i łańcuch γ 1-78.

W celu otrzymania NDSK-uPA, 500 μg NDSK poddawano działaniu 200 jednostek aktywatora urokinazy-plazminogenu (uPA) z Messrs. Technoclone, Wiedeń, Austria przez 1 godzinę w 37°C. Reakcję przerwano dodawszy 5 mM fluorku fenylometylosulfonylu. Tak otrzymany NDSK-uPA stanowił NDSK i był pozbawiony fibrynopeptydu B.

Jako kontrolę negatywną otrzymano drugą frakcję produktów rozszczepienia fibrynogenu, określoną jako FCB-2 według Nieuwenhuizen i in., (Biochem Biophys Acta 1983, 755:531-533), przy czym produkty rozszczepienia otrzymano przez podziałanie bromkiem cyjanogenu. FCB-2 stanowi białko o wielkości 43 kDa i zawiera łańcuch Aa 148-208, łańcuch Be 191-305 i łańcuch γ 95-265. W celach kontrolnych do tego białka dodano trombiny i fluorofosforanu diizopropylu. Nie prowadziło to do jakichkolwiek zmian w białku (oznaczanym jako FCB-2-thr).

Dla kolejnej kontroli negatywnej, pożywkę (RPMI z Messrs. Life techn. Inc., Paisky, UK) poddano działaniu trombiny, jak wyżej, a następnie inaktywowano (RPMI-thr), albo poddano działaniu uPA jak wyżej i inaktywowano (RPMI-uPA).

P r z y k ł a d 2

Peptyd Aa (SEQ ID NO: 2) odpowiada aminokwasom 1-28 łańcucha a fibryny i jest identyczny z aminokwasami 17 - 45 łańcucha Aa fibrynogenu:

Gly Pro Arg Val Val Glu Arg His Gin Ser Ala Cys Lys Asp Ser Asp Trp Pro Phe Cys Ser Asp Glu Asp Trp Asn Tyr Lys

Peptyd Be (SEQ ID NO: 1) odpowiada aminokwasom 1 - 28 łańcucha e fibryny i jest identyczny z aminokwasami 15 - 43 łańcucha Be fibrynogenu, o następującej sekwencji:

Gly His Arg Pro Leu Asp Lys Lys Arg Glu Glu Ala Pro Ser Leu Arg Pro Ala Pro Pro Pro Ile Ser Gly Gly Gly Tyr Arg

Oba peptydy zsyntetyzowano metodą syntezy peptydów w fazie stałej według Merrifield R.B., J. Amer. Chem. Soc. 1963:85, 2149-2154, w syntetyzatorze peptydów, przy użyciu strategii z zabezpieczającą grupą fluorenylometyloksykarbonylową (FMOC) według Carpino L.A. i Han G.Y., J. Amer. Chem. Soc. 1981; 37: 3404-3409,. Surowe peptydy oczyszczono metodą preparatywnej HPLC z odwróconymi fazami w kolumnie Nucleosil 100-10, C18, według Engelhart H. i M^ler H., Chromatography 1984 19:77, oraz według Henschen A., Hupe K.P. i Lottspeich F., High Performance Liquid Chromatography VCH 1985. Jako peptydy kontrolne stosowano peptydy o tej samej długości ale zawierające przypadkową sekwencję aminokwasów.

PL 209 419 B1

P r z y k ł a d 3

Model myszy HU-SCID

Ludzką skórę przeszczepiono na plecy myszy SCID, a po upływie 2 tygodni wstrzyknięto ludzkie limfocyty dootrzewnowe Dalej postępowano zgodnie z procedurą Petzelbauer'a i in. (J. Invest. Dermatol. 1996, 107:57 6-581). Następnie piętnastu myszom przygotowanym w ten sposób wstrzyknięto do żył ogonowych następujące związki:

a) 100 Lg ludzkiego NDSK-II

b) 100 Lig ludzkiego FCB-2

c) 100 Lig peptydu Aa

d) 100 Lig peptydu Ββ

e) 100 ug randomizowanego Aa

f) 100 ug randomi zowanego Be

Po upływie 24 godzin ludzką skórę usunięto i oceniono liczbę miejsc zapalnych, wyrażoną jako liczba komórek na 0,3 mm², jako wartość średnią z odchyleniem standardowym.

dla a: 22 ± 2,8 dla b: 9 ± 2,1 dla c: 4 ± 1,1 dla d: 6 ± 1,1 dla e: 5 ± 1,2 dla f: 7 ± 1,3

Na podstawie tych wyników stwierdzono, że NDSK-II powoduje stan zapalny, a więc białko to zostało użyte jako substancja patogenna. Inne związki per se nie powodują żadnego znaczącego wzrostu liczby komórek zapalnych.

P r z y k ł a d porównawczy 4

Piętnastu myszom z przykładu 3 wstrzyknięto do żył ogonowych:

100 ug ludzkiego NDSK-II i

100 ug randomizowanego peptydu Aa.

Dalej postępowano zgodnie z przykładem 3. Określono liczbę miejsc zapalnych na 0,3 mm² jako 23 ± 3,5.

P r z y k ł a d porównawczy 5

Piętnastu myszom z przykładu 3 wstrzyknięto do żył ogonowych:

100 ug ludzkiego NDSK-II z przykładu 1 i

100 ug randomizowanego peptydu Be.

Dalej postępowano zgodnie z przykładem 3. Określono liczbę miejsc zapalnych na 0,3 mm² jako 24 ± 2.

P r z y k ł a d 6

Piętnastu myszom z przykładu 3 wstrzyknięto do żył ogonowych:

100 ug ludzkiego NDSK-II i

100 ug zsyntetyzowanego peptydu Aa.

Dalej postępowano zgodnie z przykładem 3. Określono liczbę miejsc zapalnych na 0,3 mm² jako 21 ± 2,2.

P r z y k ł a d 7

Piętnastu myszom z przykładu 3 wstrzyknięto do żył ogonowych:

100 ug ludzkiego NDSK-II i

100 ug zsyntetyzowanego peptydu Be.

Dalej postępowano zgodnie z przykładem 3. Określono liczbę miejsc zapalnych na 0,3 mm² jako 14 ± 2.

Przykłady 4-7 wykazują, że peptyd Be blokuje zapalenie wywołane przez limfocyty.

P r z y k ł a d porównawczy 8

Komórki śródbłonka z ludzkich żył pępkowych (HUVEC) oznakowano czerwonym barwnikiem fluorescencyjnym (Cell Tracker Orange, 1 ul/ml, Molecular Probes, Eugene, OR) i rozprowadzano na matrycy kolagenowej (Collaborative Biomedical Products, Bedford, MA). Po osiągnięciu konfluencji przez komórki śródbłonka, naniesiono na nie komórki jednojądrzaste krwi obwodowej (PBMC) (10⁵ komórek na 25 mm²) oznakowane zielonym barwnikiem fluorescencyjnym (Cell Tracker Green, 1 L l/ml, Molecular Probes, Eugene, OR). Następnie komórki inkubowano w 37°C przez 12 godzin.

PL 209 419 B1

Przywierające komórki, które wniknęły do żelu sfotografowano pod laserowym mikroskopem skaningowym, obrazy przekształcono w piksele i zanalizowano z użyciem „NIH image” według Grotger i in. (J. Immunol. Method 1999: 222: 101-109).

Określono liczbę przywartych komórek na 0,1 mm², wymienionej w rubryce „adhezja”, oraz liczby migrujących komórek na 0,04 mm³, wymienionej w rubryce „migracja”. Określano średnią wartość z trzech powtórzeń z trzech eksperymentów wraz z odchyleniem standardowym.

a) RPMI-uPA	0,1 μg/ml	Adhezja 40 ± 4	migracja 4 ± 3
	1,0 μg/ml	38 ± 2	5 ± 2
	10,0 μg/ml	32 ± 4	5 ± 1
b) NDSK	0,1 μg/ml	31 ± 18	6 ± 3
	1,0 μg/ml	35 ± 18	5 ± 2
	10,0 μg/ml	36 ± 24	6 ± 3
c) NDSK-II	0,1 μg/ml	55 ± 21	12 ± 5
	1,0 μg/ml	67 ± 31	19 ± 12
	10,0 μg/ml	65 ± 31	19 ± 10
d) NDSK-uPA	0,1 μg/ml	58 ± 3	10 ± 2
	1,0 μg/ml	60 ± 3,5	14 ± 3
	10,0 μg/ml	65 ± 3	18 ± 1,5
e) FCB2	0,1 μg/ml	30 ± 26	6 ± 4
	1,0 μg/ml	10 ± 10	3 ± 2
	10,0 μg/ml	21 ± 7	5 ± 4
f) FCB-2-thr	0,1 μg/ml	20 ± 12	6 ± 5
	1,0 μg/ml	23 ± 13	7 ± 5
	10,0 μg/ml	26 ± 11	4 ± 2
g) RPMI-thr	0,1 μg/ml	29 ± 15	4 ± 5
	1,0 μg/ml	26 ± 14	5 ± 5
	10,0 μg/ml	41 ± 20	5 ± 4

Na podstawie tych wyników stwierdzono, że NDSK-II powoduje znaczącą migrację komórek jednojądrzastych krwi obwodowej (PBMC) w większym stopniu niż NDSK-uPA, a więc wykazuje działanie patogenne. Żadna z kontroli a), b), e), f) i g) nie wykazywała znaczącej migracji.

P r z y k ł a d 9

Do matrycy kolagenowej z przykładu 8, zawierającej zawiesinę PBMC dodano 100 μg NDSK-II oraz Be lub randomizowanego Be, a dalej postępowano zgodnie z przykładem 8.

a) bez NDSK-II	adhezja 38 ± 15	migracja 6 ± 4
b) tylko 100 μg NDSK-II	73 ± 29	16 ± 7
c) 10 μg Be + NDSK-II	63 ± 33	7 ± 4
d) 100 μg Be + NDSK-II	47 + 34	5 ± 4
e) 1000 μg Be + NDSK-II	52 ± 27	10 + 6
f) 10 μg randomizowanego Be + NDSK-II	77 ± 33	16 + 6
g) 100 μg randomizowanego Be + NDSK-II	86 ± 35	15 ± 6
h) 1000 μg randomizowanego Be + NDSK-I	78 ± 31	13 ± 8

Jak widać z powyższych wyników badań, peptyd Be hamuje zapalenie.

P r z y k ł a d 10

Do matrycy kolagenowej z przykładu 8, zawierającej zawiesinę PBMC dodano 100 μg NDSK-II oraz Aa lub randomizowanego Aa, a dalej postępowano zgodnie z przykładem 8.

a) bez NDSK-II	Adhezja 42 ± 6	migracja 10 + 1
b) tylko 100 μg NDSK-II	96 ± 11	24 ± 3
c) 10 μg Aa + NDSK-II	69 ± 12	21 ± 4
d) 100 μg Aa + NDSK-II	73 ± 13	15 + 6
e) 100C μg Aa + NDSK-II	70 ± 6	13 ± 5
f) 10 μg randomizowanego Aa + NDSK-II	70 ± 6	25 ± 2
g) 100 μg randomizowanego Aa + NDSK-II	65 ± 16	24 ± 3

PL 209 419 B1

h) 100C μg randomizowanego Aa + NDSK-II 70 ± 12 26 ± 3

Jak widać z powyższych wyników badań, peptyd Aa tylko częściowo blokuje migrację PBMC.

P r z y k ł a d 11

Z uwagi na to, że PBMC stanowi zasadniczo mieszaninę limfocytów i monocytów, w przykładzie 11 zamiast PBMC zastosowano czyste limfocyty.

Do matrycy kolagenowej z przykładu 8 zawierającej komórki śródbłonka i limfocyty dodano odpowiednio 100 μg NDSK-uPA lub 100 μg NDSK-II oraz Aa lub Be.

a) bez dodatków	adhezja 68 ± 8	migracja 16 ± 3
b) NDSK-uPA	143 ± 11	53 ± 5
c) NDSK-II	119 ± 11	43 ± 4
d) tylko 100 μg Be	58 ± 18	14 ± 1
e) NDSK-uPA + 100 μg Be	74 ± 8	19 ± 2
f) NDSK-II + 100 μg Be	74 ± 8	17 ± 3
g) tylko 100 μg Aa	77 ± 4	18 ± 1
h) NDSK-uPA + 100 μg Aa	131 ± 4	40 ± 3
i) NDSK-II + 100 μg Aa	131 ± 4	44 ± 4
i) tylko 100 μg randomizowanego Be	75 ± 5	19 ± 1
k) NDSK-uPA + 100 μg randomizowanego Be	134 ± 13	46 ± 4
1) NDSK-II + 100 μg randomizowanego Be	120 ± 12	42 ± 4

Powyższe wyniki badań wykazują, że:

1) zarówno NDSK-II, jak i NDSK-uPA sprzyjają zapaleniu limfocytarnemu,

2) peptyd Be całkowicie blokuje adhezję limfocytów i migrację indukowaną przez NDSK-II i NDSK-uPA, a peptyd Aa nie wykazuje właściwości blokujących, co wskazuje, że wolny łańcuch a nie jest potrzebny do wywoływania adhezji i migracji limfocytów.

P r z y k ł a d 12

Postępowano zgodnie z przykładem 11, z tym że zamiast limfocytów zastosowano czyste monocyty. Do peptydu Aa, randomizowanego Aa, Be lub randomizowanego Be dodano odpowiednio 100 μg NDSK-uPA lub 100 μg NDSK-II.

a) bez dodatków	adhezja 43 ± 8	migracja 7 ± 1
b) NDSK-uPA	48 ± 10	10 ± 2
c) NDSK-II	90 ± 11	19 ± 6
d) 100 μg Be	59 ± 7	5 ± 1
e) NDSK-uPA + 100 μg Be	61 ± 11	8 ± 3
f) NDSK-II + 100 μg Be	70 ± 7	7 ± 5
g) 100 μg randomizowanego Be	40 ± 7	6 ± 1
h) NDSK-uPA + 100 μg randomizowanego Be	45 ± 5	8 ± 3
i) NDSK-II + 100 μg randomizowanego Be	92 ± 10	20 ± 7
j) tylko 100 μg Aa	59 ± 6	5 ± 1
k) NDSK-uPA + 100 μg Aa	62 ± 4	8 ± 5
l) NDSK-II + 100 μg Aa	68 ± 10	9 ± 6
m) 100 μg randomizowanego Aa	58 ± 7	6 ± 1
n) NDSK-uPA + 100 μg randomizowanego Aa	50 ± 10	10 ± 4
o) NDSK-II + 100 μg randomizowanego Aa	108 ± 8	21 ± 5

Wyniki tych badań wykazują, że tylko NDSK-II, a nie NDSK-uPA, sprzyja migracji monocytów, co oznacza, że zarówno łańcuch a, jak i łańcuch e muszą mieć wolny N-koniec, aby blokować migrację monocytów.

P r z y k ł a d 13

Postępowano zgodnie z przykładem 11, z tym że użyto czystych limfocytów. Do soli krótkiego peptydu otrzymanej z octanu Aa Gly Pro Arg (Pro)-NH2 (pochodna Aa) lub otrzymanej z octanu Be Gly His Arg Pro-OH (pochodna Be) dodano odpowiednio 100 μg NDSK-uPA lub 100 μg NDSK-II.

adhezja migracja

a) bez dodatków 60 ± 8 14 ± 1

b) NDSK-uPA 149 ± 12 57 ± 5

c) NDSK-II 121 ±11 48 ± 7

PL 209 419 B1

d) tylko 100 μg pochodnej Be	58 ± 10	12 ± 9
e) NDSK-uPA + 100 μg pochodnej Be	70 ± 8	16 ± 3
f) NDSK-II + 100 μg pochodnej Be	69 ± 7	14 ± 5
g) tylko 100 μg pochodnej Aa	77 ± 4	18 ± 1
h) NDSK-uPA + 100 μg pochodnej Aa	134 ± 4	48 ± 5
i) NDSK-II + 100 μg pochodnej Aa	131 ± 7	49 ± 6
j) tylko 100 ug randomizowanej pochodnej Be	70 ± 5	14 ± 7
k) NDSK-uPA + 100 μg randomiz. pochodn. Be	130 ± 12	49 ± 6
l) NDSK-II + 100 μg randomiz. pochodn. Be	120 ± 10	55 ± 8

Na podstawie tego eksperymentu można wyciągnąć wniosek, że gdy dochodzi do zahamowania migracji limfocytów, krótkie peptydy dodawane w odpowiedni ciągły sposób mają taką samą aktywność jak długie peptydy.

P r z y k ł a d 14

Postępowano zgodnie z przykładem 12, z tym że użyto czystych monocytów. Do soli krótkiego peptydu otrzymanej z octanu Aa Gly Pro Arg (Pro)-NH₂ (pochodna Aa) lub otrzymanej z octanu Ββ Gly His Arg Pro-OH (pochodna Be) dodano odpowiednio 100 μg NDSK-uPA lub 100 μg NDSK-II

a) bez dodatków	adhezja 40 ± 8	migracja 5 ± 1
b) NDSK-uPA	54 ± 9	7 ± 2
c) NDSK-II	85 ± 11	22 ± 6
d) tylko 100 μg pochodnej Be	52 ± 7	6 ± 1
e) NDSK-uPA + 100 μg pochodnej Be	61 ± 11	8 ± 3
f) NDSK-II + 100 μg pochodnej Be	68 ± 7	8 ± 4
g) 100 μg randomizowanej pochodnej Be	40 ± 7	6 ± 1
h) NDSK-uPA + 100 μg randomiz. pochodnej Be	44 ± 6	8 ± 2
i) NDSK-II + 100 μg randomiz. pochodnej Be	92 ± 10	23 ± 7
j) 100 μg pochodnej Aa	50 ± 5	4 ± 4
k) NDSK-uPA + 100 μg pochodnej Aa	60 ± 5	7 ± 6
l) NDSK-II + 100 μg pochodnej Aa	64 ± 11	8 ± 2
m) 100 μg randomiz. pochodnej Aa	54 ± 10	6 ± 3
n) NDSK-II + 100 μg randomiz. pochodnej Aa	50 ± 10	10 ± 4
o) NDSK-II + 100 μg randomiz. pochodnej Aa	99 ± 8	21 ± 7

Na podstawie tego eksperymentu można wyciągnąć wniosek, że gdy migracja monocytów ulega zahamowaniu, krótkie peptydy dodane w odpowiedni ciągły sposób mają taką samą aktywność jak długie peptydy.

PL 209 419 B1

Wykaz sekwencji <110> FIBREX Medical Research & Development GmbH

Petzelbauer, Peter

Zastosowanie peptydów lub białek do wytwarzania leku do terapeutycznego i/lub profilaktycznego stosowania w przypadku zapaleń w medycynie i/lub weterynarii

<130>	2760 PCT
<140>	PCT/AT 01/00387
<141>	2001-12-07
<150>	AT A 2063/2000
<151>	2000-12-12
<160>	2
<170>	Patentln wersja 3.1
<210>	1
<211>	28
<212>	PRT
<213>	Sekwencja sztuczna;
<220>
<221>	Źródło
<223>	/uwaga = „odpowiada aminokwasom 1-28 sekwencji łańcucha BS fibryny
<400>	1
Gly His Arg Pro Leu Asp Lys Lys Arg Glu Glu Ala Pro Ser Leu Arg
1	5 10 15
Pro Ala Pro Pro Pro Ile Ser Gly Gly Gly Tyr Arg 20 25
<210>	2
<211>	28
<212>	PRT
<213>	Sekwencja sztuczna
<220>
<221>	Źródło
<223>	/uwaga = „odpowiada aminokwasom 1-28 sekwencji łańcucha Aa fibryny
<400>	2
Gly Pro	Arg Val Val Glu Arg His Gln Ser Ala Cys Lys Asp	Ser Asp
1	5 10	15
Trp Pro	Phe Cys Ser Asp Głu Asp Trp Asn Tyr Lys 20 25

PL 209 419 B1

Claims

1. Zastosowanie peptydów lub białek o ogólnym wzorze II _D HO

R. i ii

N — C — C — His—Arg-Pro ~Leu ~Z,

2. Zastosowanie peptydów lub białek o ogólnym wzorze II, według zastrz. 1, w którym Z5 oznacza ugrupowanie peptydu o następującej sekwencji aminokwasów (SEQ ID NO: 1):

3. Zastosowanie peptydów i/lub białek według zastrz. 1 albo 2 do wytwarzania leku do terapii miejscowego i/lub uogólnionego stanu zapalnego w organizmie, na podłożu zakaźnym.

4. Zastosowanie peptydów i/lub białek według zastrz. 1, 2 albo 3 do wytwarzania leku do terapii miejscowego i/lub uogólnionego stanu zapalnego w organizmie, na podłożu reakcji autoimmunologicznej.

5. Zastosowanie peptydów i/lub białek według zastrz. 1 - 4 do wytwarzania leku do terapii miejscowego i/lub uogólnionego stanu zapalnego w organizmie, na podłożu choroby reumatycznej.

6. Zastosowanie peptydów i/lub białek według zastrz. 1 - 5 do wytwarzania leku do terapii miejscowego i/lub uogólnionego stanu zapalnego w organizmie, na podłożu zaburzenia układu odpornościowego.

7. Zastosowanie peptydów i/lub białek według zastrz. 1 - 6 do wytwarzania leku do terapii miejscowego i/lub uogólnionego stanu zapalnego w organizmie, na podłożu choroby genetycznej.