KR20030060988A

KR20030060988A - 펩타이드 및/또는 단백질, 및 치료제 및 예방제의 제조를위한 그들의 용도

Info

Publication number: KR20030060988A
Application number: KR10-2003-7007799A
Authority: KR
Inventors: 페첼바우어페터
Original assignee: 피브렉스 메디칼 리서치 앤드 디벨롭먼트 게엠베하
Priority date: 2000-12-12
Filing date: 2001-12-07
Publication date: 2003-07-16
Also published as: EA200300678A1; DE50110182D1; US20090137464A1; JP2004527469A; NO330767B1; PL209752B1; CZ20031630A3; BR0116122A; DK1341819T3; EA005576B1; US7494973B2; PL362924A1; ZA200304545B; HUP0401536A2; CN1518558B; NO20032656D0; ES2323963T3; ATE425184T1; SK7062003A3; US20040192596A1

Abstract

본 발명은 하기 일반식 I(SEQ ID NO 1, 2)의 펩타이드 또는 단백질, 및 이들의 염, 예를 들면 아미드, 또는 이들의 혼합물 및/또는 이들 이외에 인간 및/또는 수의 약제 용도의 치료 및/또는 예방용 물질 적어도 1종과의 혼합물에 관한 것이다:

[일반식 I]

상기 식에서,

R₁및 R₂는 서로 독립적으로 수소, 혹은 1개 내지 3개, 특히 10개 이하의 탄소 원자를 포함하는 포화 또는 불포화 탄화수소 잔기를 의미하고,

Z₁은 히스티딘 또는 프롤린 잔기를 의미하고,

Z₂는 아르기닌 잔기, 시작 아르기닌 잔기를 포함하는, 특히 2개 내지 30개의 아미노산을 포함하는 펩타이드 잔기 또는 단백질 잔기를 의미한다.

Description

펩타이드 및/또는 단백질, 및 치료제 및 예방제의 제조를 위한 그들의 용도 {PEPTIDES AND/OR PROTEINS AND USE THEREOF FOR THE PRODUCTION OF A THERAPEUTIC AND/OR PROPHYLACTIC MEDICAMENT}

지금까지 예방 및 치료용으로 사용되어온, 소위 면역억제제라 불리는 염증 반응의 저해 및 예방용 물질은 일반적으로 2개의 그룹으로 구성된다. 하나는 체내에서 자연 발생하는 호르몬 유도체, 즉 코르티손이고, 다른 하나는 사이클로스포린 및 그의 유도체들, 아자티오프린, 사이클로포스파미드 등과 같은 외인성 면역억제제이다. 이들 물질은 모두 소염 효과를 가지나, 장기간 치료 시에는 상당한 부작용을 나타낸다. 그러한 부작용은 장기간 치료를 제한하며, 이것이 부작용을 허용 가능한 수준으로 유지하기 위해서나, 실제로 치료를 진행하기 위하여 이들 물질을 대체용으로 사용하거나 조합물로서 사용하는 이유이다. 부작용의 예로는 코르티손의 골다공화 작용에 의해 초래되는 코르티손 관련의 병리학적 골절, 또는 사이클로스포린에 의해 초래되는 신장 부전이 있다. 그러한 부작용은 이들 두 그룹의 화합물에 대해서 불가피한 것으로, 다만 문제가 되는 것은 치료를 중단해야 하는 시점의 총 투여량 및 치료 기간이다.

본 발명은 펩타이드 및/또는 단백질, 치료 및/또는 예방용 제약 조성물을 제조하기 위한 그들의 용도, 및 제약 조성물에 관한 것이다.

본 발명은 염증성 작용의 예방 또는 억제에 적합하고 부작용이 작은 신규한 약품을 제공하는 것을 목적으로 한다. 본 발명의 또 다른 목적은 장기간 치료를 제공하는 데 있다.

이하에서, 본 발명에 따르는 아미노산은 α-아미노산을 나타내는 통상적인 약어로 언급된다.

"유사체"란 유도체화, 치환, 바람직하게는 상동 치환, 결실 및/또는 삽입에 의해 피브린 서열, 특히 바람직한 서열로부터 유래되는 펩타이드로서 이해된다.

본 발명에 따르는 펩타이드 또는 단백질은 하기 일반식 I(SEQ ID NO 1, 2)을 나타낸다.

[일반식 I]

상기 식에서,

R₁및 R₂는 서로 동일하거나 상이한 것으로서, 수소, 혹은 1개 내지 3개, 특히 10개 이하의 탄소 원자를 포함하는 포화 또는 불포화 탄화수소 잔기를 의미하고,

Z₁은 히스티딘 또는 프롤린 잔기를 의미하고,

이들의 염, 예를 들면 아미드, 또는 이들의 혼합물 및/또는 이들 이외에 인간 및/또는 수의 약제 용도의 치료 및/또는 예방용 물질 적어도 1종과의 혼합물도 마찬가지이며, 이를 통해서는 특히 L-아미노산만이 제공된다.

특정 아미노산 서열이 혈류로부터 혈관벽 내피 세포에 대한 세포의 부착 및/또는 수반되는 그들의 이주를 방해한다는 것을 매우 놀라왔다.

본 발명에 따르는 펩타이드 또는 단백질은 일반식 II(SEQ ID NO 3 내지 10)를 나타낸다:

[일반식 II]

상기 식에서,

Z₁은 히스티딘 또는 프롤린 잔기를 의미하고,

Arg는 아르기닌 잔기를 의미하고,

Z₃은 프롤린 또는 발린 잔기를 의미하고,

Z₄는 류신 또는 발린 잔기를 의미하고,

Z₅는 특히 2개 내지 30개의 아미노산을 포함하는 단백질 또는 펩타이드 잔기를 의미하거나, 1개 내지 3개, 특히 10개 이하의 탄소 원자를 포함하는 알콜 잔기를 의미하거나, 혹은 유기 또는 무기 염기 잔기를 의미한다.

이들의 염, 예를 들면 아미드, 또는 이들의 혼합물 및/또는 이들 이외에 인간 및/또는 수의 약제 용도의 치료 및/또는 예방용 물질 적어도 1종과의 혼합물도 마찬가지이며, 이로써 단지 L-아미노산만이 제공된다.

피브리노겐의 서열, 펩타이드 또는 단편들의 일부가 소염 작용을 나타낸다는 점은 매우 놀라왔다. 특정 이론으로 제한하고자 하는 것은 아니나, 이러한 소염 작용은 피브린이 B베타-사슬의 신생 N-말단을 통해 내피 세포에 결합하고, A알파-사슬의 서열을 통해 혈류내 세포에 결합함으로써, 조직에 대한 세포의 부착 및 운반을 유도한다는 사실을 근거로 할 수 있다. 이러한 결합은 피브린의 형성을 저해하는 부작용을 나타낸다. 그러나, 경미한 상처가 발생하는 경우에는 피브린 부재 시에도 혈액 응고가 충분하기 때문에, 상기 작용이 환자에게 잠재적으로 유해한 것은 아니다. 다만, 외과적 치료를 하는 경우에는 그러한 종류의 요법을 중단하는 것이 선택적으로 적합할 수 있다. 이러한 물질들은 천연 리간드에 대해서만 작용하기 때문에, 다른 부작용들은 실질적으로 배제할 수 있다. 또한, 자연 방어는 혈중 백혈구에 의해 부정적인 영향을 받지 않는다. 따라서, 동일한 조성체, 예를 들면 과립구, 림프구 및 단핵구도 영향을 받지 않은 상태로 유지되므로, 자연 방어 과정이 유지되고, 혈중 감염에 대한 방어도 불변 상태로 유지된다.

피브리노겐은 간에서 생성되며, 이 형태는 생물학적으로 불활성인 것으로, 정상적으로는 대략 3 g/ℓ 농도로 혈액에 제공된다. 전구 효소(proenzyme)인 프로트롬빈의 단백질 가수분해성 절단에 의해 트롬빈이 형성되고, 이는 피브리노겐을 피브리노펩타이드 A 및 B로 절단한다. 이렇게 하여, 피브리노겐이 생물학적 활성 형태로 전환된다. 피브린 및 피브린 절단 산물이 생성된다.

트롬빈은 혈액 응고가 활성화되는 동안, 즉 염증, 외상 또는 퇴행성 기원일 수 있는 조직 손상에 의해 활성화된다. 트롬빈에 의해 매개되는 피브린의 형성은 기본적으로 혈관계에 초래된 임의의 결함을 신속하게 봉합하기 위한 목적의 보호 과정이다. 그러나, 피브린의 형성 과정은 발병 과정이 되기도 한다. 심근 경색의 시발이 되는 피브린 혈전의 출현은 인간 약제에서 가장 두드러진 문제 중 하나이다.

한편으로는 조직 내에서 발생하는 종양 세포 또는 병원성 미생물에 대한 바람직한 방어 과정이면서, 다른 한편으로는 그 자체가 조직에 가해지는 손상을 초래하거나 연장시키는 과정이기도 한, 혈류로부터 조직으로의 염증 세포의 유출 과정에 있어 피브린의 역할은 지금까지 전혀 또는 충분히 조사되지 않았다. 피브린은 B베타 서열에 의하여 B베타의 신생 N-말단을 통해 내피 세포에 결합하고, A알파 서열에 의하여 혈중 세포에 결합함으로써, 세포의 조직으로의 부착 및 이동을 유발한다.

본 발명에 따르는 펩타이드 또는 단백질은 혈류로부터 혈관벽의 내피 세포에 대한 세포의 부착 및/또는 이에 수반되는 그들의 이동을 방해할 수 있다.

Z₅는 하기 아미노산 서열(SEQ ID NO 11)을 포함하는 펩타이드 잔기를 의미하고:

Asp Lys Lys Arg Glu Glu Ala Pro Ser Leu Arg Pro Ala Pro Pro Pro Ile Ser Gly Gly Gly Tyr Arg;

Z₁은 히스티딘 잔기를 의미하고,

Arg는 아르기닌 잔기를 의미하고,

Z₃은 프롤린 잔기를 의미하고,

Z₄는 류신 잔기를 의미하는 일반식 II의 본 발명에 따르는 펩타이드 또는 단백질은 피브린 단편이 혈관벽에 침착 또는 부착되는 것을 방해한다. 따라서, 염증성 세포가 동맥 및 정맥 혈관벽의 내피 세포에 유지되지 못하게 되므로, 이러한 세포들이 혈관벽에 유지되지 못하게 되므로, 더 이상 조직으로 침윤할 수 없게 된다.

Z₅는 하기 아미노산 서열(SEQ ID NO 12)을 포함하는 펩타이드 잔기를 의미하고:

Glu Arg His Gln Ser Ala Cys Lys Asp Ser Asp Trp Pro Phe Cys Ser Asp Glu Asp Trp Asn Tyr Lys;

Z₁은 프롤린 잔기를 의미하고,

Arg는 아르기닌 잔기를 의미하고,

Z₃은 발린 잔기를 의미하고,

Z₄는 발린 잔기를 의미하는 일반식 II의 본 발명에 따르는 펩타이드 또는 단백질은 모세혈 세포가 피브린 또는 피브린 단편에 부착되는 것을 저해함으로써 조직 내에서 이들의 이동을 방해하는 효과를 갖는다.

상술한 절단 산물은 문헌을 통해 펩타이드 B베타 및 펩타이드 A알파로서도 알려져 있다. 상술한 사전 부착(proadhesive) 및 사전 이동(promigratory) 경로는 혈류로부터 조직으로의 세포의 이동을 제한하는 완전히 새로운 시스템이다. 이러한 피브린의 기능은 펩타이드 B베타 및 펩타이드 A알파에 의해 차단될 수 있다.

그러므로, 본 발명에 따르는 상기 펩타이드는 혈류로부터 조직으로의 세포 이동을 차단하기 위한 인간 및 동물용 치료제로서 적합하다. 단백질 가수분해성 절단에 의해 생성되는 피브린 또는 기타 피브리노겐 산물, 예를 들면 유로키나아제-플라스미노겐-활성인자에 의해 절단된 피브리노겐은 특이적이고 국소로 제한된 범위, 즉 염증, 응집 장애, 동맥 경화증, 혈전증 및/또는 종양 성장 자리에서만 생성되기 때문에, 상기 치료제의 효과는 국소로 제한되며, 이는 다른 장소에서는 병리학적 부작용의 발생이 예상되지 않거나, 제한된 범위에서만 발생함을 의미하는 것이다.

본 발명에 따르는 펩타이드 및/또는 단백질이 바람직하게 적용될 수 있는 분야에는 감염에 의해 발생하거나, 자가면역 반응, 류마티스성 질환, 면역계 이상 및 유전적 질환을 기초로 하는 체내의 국소성 및/또는 전신성 염증의 치료 또는 예방을 위한 제약 조성물, 그리고 기관 이식 후 발생하는 거부반응, 동맥 경화증, 재관류성 외상(reperfusion trauma), 동맥 경화성 질환 및/또는 혈전성 질환 및 피브린 침착 증가의 예방 및/또는 치료를 위한 제약 조성물의 제조 분야가 있다. 이러한 펩타이드, 특히 B베타 펩타이드는 추가의 약물을 인간 또는 동물의 내피 세포로 운반하는 제약 조성물을 제조하는 데에도 매우 적합하다. 이렇게, 전달하고자 하는 약물을 VE-카드헤린을 통해 상기 펩타이드의 한쪽 말단에 연결함으로써, 이들 약물은 혈관벽의 유리된 지점, 즉 내피 세포 상에 침착하게 된다.

이하에서 실례를 들어 본 발명을 보다 상세히 설명한다.

실시예 1

피브리노겐 절단 산물의 제조:

Blomback 등(Nature 1968, 218 ; 130-134)에 따르는 시안 브로마이드 관련 분해를 통해 피브리노겐의 비중합성(non-polymerizing) 분해 산물을 얻었다. 이렇게 분해된 피브리노겐은 크게 63 kD의 단편, 즉 N-말단 디설파이드 노트(NDSK)로 이루어지며, A알파-사슬 1-51, B베타-사슬 1-118 및 감마-사슬 1-78을 포함한다. NDSK-II(NDSK에서 피브리노겐 A 및 B가 결실된 것)를 얻기 위하여, 실온에서 3시간 동안 트롬빈(20 유닛/㎍ NDSK)을 이용해 A알파-사슬 및 B베타-사슬의 N-말단 아미노산을 절단한 뒤, 디이소프로필플루오로포스페이트를 처리해 트롬빈 활성을 차단한다. 이렇게 얻어진 NDSK-II는 A알파-사슬 17-51, B베타-사슬 15-118 및 감마-사슬 1-78로 이루어진다.

NDSK-uPA를 얻기 위하여, 500 ㎍의 NDSK에 유로키나아제-플라스미노겐-활성인자(uPA)(Messr. Technolone, Vienna, Austria) 200유닛을 37℃에서 1시간 동안 처리하였다. 5 mM의 페닐메틸술포닐 플루오라이드를 이용해 반응을 중단시켰다. 이렇게 얻어진 NDSK-uPA은 NDSK로서, 피브리노겐 B를 함유하지 않는다.

음성 대조군으로서, Nieuwenhuizen 등(Biochem Biophys Acta 1983, 755; 531-533)에 따라 FCB-2라 불리는 피브리노겐 절단 산물로부터 제2의 단편을 얻었다. 상기 절단 산물은 시안 브로마이드를 처리해 제조하였다. FCB-2는 43 kD 크기의 단백질로서, A알파-사슬 148-208, B베타-사슬 191-305 및 감마-사슬 95-265로 구성된다. 대조 목적으로, 트롬빈 및 디이소프로필플루오로포스페이트를 상기 단백질에 첨가하였다. 그러나, 이는 단백질에 대해 어떠한 변화도 초래하지 않았다(이하, FCB-2-thr이라 칭함).

다른 음성 대조를 목적으로, 배지(영국 Paisky 소재의 Messr. Life techn. Inc.사의 RPMI)에 상기와 같이 트롬빈을 처리하여 불활성화하거나(RPMI-thr), 상기와 같이 uPA를 처리하여 불활성화하였다(RPMI-uPA).

실시예 2

알파 펩타이드(SEQ ID NO 12)는 피브린의 A알파-사슬의 아미노산 1-28에 해당하는 것으로서, 하기와 같은 피브리노겐의 A알파-사슬의 아미노산 17-45와 동일하였으며, 서열은 다음과 같다:

Gly Pro Arg Val Val Glu Arg His Gln Ser Ala Cys Lys Asp Ser Asp Trp Pro Phe Cys Ser Asp Glu Asp Trp Asn Tyr Lys.

베타 펩타이드(SEQ ID NO 11)는 피브린의 B베타-사슬의 아미노산 1-28에 해당하는 것으로서, 피브리노겐의 B베타-사슬의 아미노산 15-43과 동일하였으며, 서열은 다음과 같다:

Gly His Arg Pro Leu Asp Lys Lys Arg Glu Glu Ala Pro Ser Leu Arg Pro Ala Pro Pro Pro Ile Ser Gly Gly Gly Tyr Arg.

Carpino L.A. 및 Han. G.Y.(J. Amer. Chem. Soc. 1981; 37; 3404-3409)에 따르는 플루오레닐메틸옥시카르보닐(FMOC)-보호기 방법을 적용하여, 다중 펩타이드 합성기를 이용해 Merrifield R.B.(J. Amer. Chem. Soc. 1963; 85, 2149-2154)에 따르는 고체상 펩타이드 합성을 통해 상기 두 펩타이드를 합성하였다. Engelhart H. 및 Muller H.에 의해 Chromatography 1984, 19:77 및 Henschen A., Hupe K.P. 및 Lottspeich F.에 의해 High Performance Liquid Chromatography VCH 1985에 제시된 Nucleosil 100-10, C18-칼럼을 통해 분취용 역상 HPLC를 실시해 조제 펩타이드를 정제하였다. 대조용 펩타이드로는, 무작위화 아미노산 서열을 포함하는 것을 제외하고는 동일한 길이의 펩타이드를 사용하였다.

실시예 3

HU-SCID 마우스 모델:

인간 피부를 SCID 마우스의 등으로 이식하고, 2주 후, 인간 림프구를 복막으로 주사하였다. 이러한 과정은 Petzelbauer 등에 의해 J. Invest. Dermatol.1996, 107; 576-581에 제시된 절차에 따라 진행하였다. 이어서, 이렇게 준비된 15마리의 마우스에게 그들의 꼬리 정맥을 통해 다음을 주사하였다:

a) 인간 NDSK-II 100 ㎍

b) 인간 FCB-2 100 ㎍

c) 펩타이드 A알파 100 ㎍

d) 펩타이드 B베타 100 ㎍

e) 무작위화 A알파 100 ㎍

f) 무작위화 B베타 100 ㎍.

24시간 후, 인간 피부를 제거하고, 0.3 mm²당 세포수로 표시되는 염증자리의 수를 평가하여, 표준편차로 평균값을 결정하였다.

a)의 경우: 22±2.8

b)의 경우: 9±2.1

c)의 경우: 4±1.1

d)의 경우: 6±1.1

e)의 경우: 5±1.2

f)의 경우: 7±1.3.

그 결과, NDSK-II는 염증을 초래하므로, 상기 단백질은 발병 물질로서 사용되었다고 할 수 있다. 그 밖의 화합물들은 그 자체로는 염증 세포의 양에 대해 어떠한 유의한 증가도 나타내지 않았다.

비교예 4

실시예 3에 따르는 15마리의 마우스에게 그들의 꼬리 정맥을 통해 인간 NDSK-II 100 ㎍ 및 무작위화 펩타이드 A알파 100 ㎍을 주사하였다.

나머지 절차는 실시예 3에 따라 진행하였다. 0.3 mm²당 23±3.5개의 염증자리를 측정할 수 있었다.

비교예 5

실시예 3에 따르는 15마리의 마우스에게 그들의 꼬리 정맥을 통해 실시예 1에 따르는 인간 NDSK-II 100 ㎍ 및 무작위화 펩타이드 B베타 100 ㎍을 주사하였다.

나머지 절차는 실시예 3에 따라 진행하였다. 0.3 mm²당 24±2개의 염증자리를 측정할 수 있었다.

실시예 6

실시예 3에 따르는 15마리의 마우스에게 인간 NDSK-II 100 ㎍ 및 합성 펩타이드 A알파 100 ㎍을 주사하였다.

나머지 절차는 실시예 3에 따라 진행하였다. 0.3 mm²당 21±2.2개의 염증자리를 측정할 수 있었다.

실시예 7

실시예 3에 따르는 15마리의 마우스에게 그들의 꼬리 정맥을 통해 인간 NDSK-II 100 ㎍ 및 합성 펩타이드 B베타 100 ㎍을 주사하였다.

나머지 절차는 실시예 3에 따라 진행하였다. 0.3 mm²당 14±2개의 염증자리를 측정할 수 있었다.

실시예 4 내지 7에서는 펩타이드 B베타가 림프구 염증을 차단하는 것으로 나타났다.

비교예 8

인간 배꼽 정맥 유래의 내피 세포(HUVEC)를 형광 염료(Cell Tracker Orange, 1 ㎕/㎖, Molecular Probes, Eugene, OR)로 표지하고, 콜라겐 간질(Collaborative Biomedical Products, Bedford, MA) 상에 분산시켰다. 내피 세포의 합류 시, 녹색 형광 염료(Cell Tracker Green, 1 ㎕/㎖, Molecular Probes of Messrs. Eugne, Origon)로 표지된 모세혈 단핵구(PBMC)(25 mm²당 10⁵세포)를 그 위에 얹었다. 이후, 세포들을 37℃에서 12시간 동안 배양하였다.

겔로 이동한 부착 세포를 레이저-주사 현미경으로 사진 찍고, Groger 등(J. Immunol. Method 1999; 222: 101-109)에 따르는 "NH 영상" 수단을 이용해 화소로 전환시켜 평가하였다.

"부착" 하에 상술한 바와 같이 0.1 mm²당 부착 세포의 수를 용이하게 측정하였다. "이동" 하에 상술한 바와 같이 0.04 mm²당 이동 세포의 수를 용이하게 측정하였다. 3회에 걸친 3개 실험의 평균값을 표준 편차로 평가하였다.

부착 이동

a) RPMI-uPA0.1 ㎍/㎖40±44±3

1.0 ㎍/㎖38±25±2

10.0 ㎍/㎖32±45±1

b) NDSK0. 1 ㎍/㎖31±186±3

1.0 ㎍/㎖35±185±2

10.0 ㎍/㎖36±246±3

c) NDSK-II0.1 ㎍/㎖55±2112±5

1.0 ㎍/㎖67±3119±12

10.0 ㎍/㎖65±3119±10

d) NDSK-uPA0.1 ㎍/㎖58±310±2

1.0 ㎍/㎖60±3.514±3

10.0 ㎍/㎖65±318±1.5

e) FCB20.1 ㎍/㎖30±266±4

1.0 ㎍/㎖10±103±2

10.0 ㎍/㎖21±75±4

f) FCB-2-thr0.1 ㎍/㎖20±126±5

1.0 ㎍/㎖23±137±5

10.0 ㎍/㎖26±114±2

g) RPMI-thr0.1 ㎍/㎖29±154±5

1.0 ㎍/㎖26±145±5

10.0 ㎍/㎖41±205± 4

그 결과, NDSK-II는 NDSK-uPA보다 큰 규모의 모세혈 단핵구(PBMC)의 유의한 이동을 초래하므로, 발병 활성을 나타내는 것으로 볼 수 있다. 대조군 a), b), e), f) 및 g) 중 어는 것도 어떠한 유의한 이동도 유발하지 않았다.

실시예 9

NDSK-II 및 B베타 또는 무작위화 B베타를 PBMC 현탁액을 포함하는 실시예 8에 따르는 콜라겐 기질에 첨가하고, 나머지 절차는 실시예 8에 따라 진행하였다.

부착 이동

a) NDSK-II 무첨가38±156±4

b) NDSK-II 단독 100 ㎍73±2916±7

c) NDSK-II + B베타 10 ㎍63±337±4

d) NDSK-II + B베타 100 ㎍47±345±4

e) NDSK-II + B베타 1000 ㎍52±2710±6

f) NDSK-II + 무작위화 B베타 10 ㎍77±3316±6

g) NDSK-II + 무작위화 B베타 100 ㎍86±3515±6

h) NDSK-II + 무작위화 B베타 1000 ㎍78±3113±8

이상의 테스트 결과로부터 유추할 수 있는 바와 같이, 펩타이드 B베타는 염증을 차단한다.

실시예 10

100 ㎍의 NDSK-II 및 A알파 또는 무작위화 A알파를 PBMC 현탁액을 포함하는실시예 8에 따르는 콜라겐 기질에 첨가하고, 나머지 절차는 실시예 8에 따라 진행하였다.

부착 이동

a) NDSK-II 무첨가42±610±1

b) NDSK-II 단독96±1124±3

c) NDSK-II + A알파 10 ㎍69±1221±4

d) NDSK-II + A알파 100 ㎍73±1315±6

e) NDSK-II + A알파 1000 ㎍70±613±5

f) NDSK-II + 무작위화 A알파 10 ㎍70±625±2

g) NDSK-II + 무작위화 A알파 100 ㎍65±1624±3

h) NDSK-II + 무작위화 A알파 1000 ㎍70±1226±3

이상의 테스트 결과로부터 유추할 수 있는 바와 같이, 펩타이드 A알파는 PBMC의 이동을 부분적으로만 차단한다.

실시예 11

PBMC는 실질적으로 림프구 및 단핵구의 혼합물로 이루어지기 때문에, 실시예 11에서는 (실시예 8-10에서와 같은) PBMC 대신 순수한 림프구를 사용하였다.

각각 NDSK-uPA 100 ㎍ 및 NDSK-II 100 ㎍, 및 각각의 A알파 또는 B베타를 내피 세포 및 림프구를 포함하는 실시예 8에 따르는 콜라겐 기질에 첨가하였다.

부착 이동

a) 무첨가68±816±3

b) NDSK-uPA143±1153±5

c) NDSK-II119±1143±4

d) B베타 단독 100 ㎍58±1814±1

e) NDSK-uPA + B베타 100 ㎍74±819±2

f) NDSK-II + B베타 100 ㎍74±817±3

g) A알파 단독 100 ㎍77±418±1

h) NDSK-uPA + A알파 100 ㎍131±440±3

i) NDSK-II + A알파 100 ㎍131±444±4

j) 무작위화 B베타 단독 100 ㎍75±519±1

k) NDSK-uPA + 무작위화 B베타 100 ㎍134±1346±4

l) NDSK-II + 무작위화 B베타 100 ㎍120±1242±4

테스트 결과는 다음과 같다:

1) NDSK-II 및 NDSK-uPA 모두 림프구 염증을 촉진하였며,

2) 펩타이드 B베타는 NDSK-II 및 NDSK-uPA에 의해 유도되는 림프구 부착 및 이동을 차단하는 반면, 펩타이드 A알파는 차단 활성을 나타내지 않으며, 이는 림프구의 부착 및 이동을 유도하는 데는 유리된 A알파-사슬이 요구되지 않음을 시사한다.

실시예 12

림프구 대신 순수한 단핵구가 사용되는 것을 제외하고는 실시예 11에 따라 절차를 진행하였다. 각각 NDSK-uPA 100 ㎍ 및 NDSK-II 100 ㎍을 펩타이드 A알파,무작위화 펩타이드 A알파, 펩타이드 B베타 또는 무작위화 펩타이드 B베타에 첨가하였다.

부착 이동

a) 무첨가43±87±1

b) NDSK-uPA48±1010±2

c) NDSK-II90±1119±6

d) B베타 100 ㎍59±75±1

e) NSDK-uPA + B베타 100 ㎍61±118±3

f) NDSK-II + B베타 100 ㎍70±77±5

g) 무작위화 B베타 100 ㎍40±76±1

h) NDSK-uPA + 무작위화 B베타 100 ㎍45±58±3

g) NDSK-II + 무작위화 B베타 100 ㎍92±1020±7

j) A알파 100 ㎍59±65±1

k) NDSK-uPA + A알파 100 ㎍62±48±5

l) NDSK-II + A알파 100 ㎍68±109±6

m) 무작위화 A알파 100 ㎍58±76±1

n) NDSK-uPA + 무작위화 A알파 100 ㎍50±1010±4

o) NDSK-II + 무작위화 A알파 100 ㎍108±821±5

테스트 결과, NDSK-II뿐 아니라 NDSK-uPA도 단핵구의 이동을 촉진하는 것으로 나타났으며, 이는 알파-사슬 및 베타-사슬 모두가 유리된 N-말단이 노출되어야,단핵구의 이동을 차단함을 의미한다.

실시예 13

순수한 림프구를 사용해, 실시예 11에 따라 절차를 진행하였다. 각각 NDSK-uPA 100 ㎍ 및 NDSK-II 100 ㎍을 A알파 Gly Pro Arg (Pro)-NH₂아세테이트(알파 유도체) 또는 B베타 Gly His Arg Pro-OH 아세테이트(베타 유도체)로부터 유래된 단쇄 펩타이드 염에 첨가하였다.

부착 이동

a) 무첨가60±814±1

b) NDSK-uPA149±1257±5

c) NDSK-II121±1148±7

d) B베타-유도체 단독 100 ㎍58±1012±9

e) NDSK-uPA + B베타-유도체 100 ㎍70±816±3

f) NDSK-II + B베타-유도체 100 ㎍69±714±5

g) A알파-유도체 단독 100 ㎍77±418±1

h) NDSK-uPA + A알파-유도체 100 ㎍134±448±5

i) NDSK-II + A알파-유도체 100 ㎍131±749±6

j) 무작위화 B베타-유도체 단독 100 ㎍70±514±7

k) NDSK-uPA + 무작위화 B베타-유도체 100 ㎍130±1249±6

l) NDSK-II + 무작위화 B베타-유도체 100 ㎍120±1055±8

상기 실험 결과, 림프구 이동이 저해되는 경우, 적합한 방식으로 연속 첨가된 단쇄 펩타이드는 장쇄 펩타이드와 동일한 활성을 나타내는 것으로 나타났다.

실시예 14

순수한 단핵구를 사용해, 실시예 12에 따라 절차를 진행하였다. NDSK-uPA 100 ㎍ 또는 NDSK-II 100 ㎍ 각각을 A알파 Gly Pro Arg (Pro)-NH₂아세테이트(알파 유도체) 또는 B베타 Gly His Arg Pro-OH 아세테이트(베타 유도체)로부터 유래된 단쇄 펩타이드 염에 첨가하였다.

부착 이동

a) 무첨가40±85±1

b) NDSK-uPA54±97±2

c) NDSK-II85±1122±6

d) B베타-유도체 100 ㎍52±76±1

e) NDSK-uPA + B베타-유도체 100 ㎍61±118±3

f) NDSK-II + B베타-유도체 100 ㎍68±78±4

g) 무작위화 B베타-유도체 100 ㎍40±76±1

h) NDSK-uPA + 무작위화 B베타-유도체 100 ㎍44±68±2

i) NDSK-II + 무작위화 B베타-유도체 100 ㎍92±1023±7

j) A알파-유도체 100 ㎍50±54±4

k) NDSK-uPA + A알파-유도체 100 ㎍60±57±6

l) NDSK-II + A알파-유도체 100 ㎍64±118±2

m) 무작위화 A알파-유도체 100 ㎍54±106±3

n) NDSK-uPA + 무작위화 A알파-유도체 100 ㎍50±1010±4

o) NDSK-II + 무작위화 A알파-유도체 100 ㎍99±821±7

실시예 15

220 g 내지 280 g 체중의 수컷 위스타 래트에 대해 테스트를 실시하였다. 래트에게 표준 사료 및 물을 제공하였다. 테스트를 실시하기 위하여, 래트를 마취시키고, 30 부피%의 산소를 함유하며 1 mmHg 내지 2 mmHg의 초과 압력을 가지는 기체를 체중 kg당 8 ㎖ 내지 10 ㎖ 수준으로 배출시켜, 분당 70펄스의 주파수로 인공 호흡시켰다. 오른팔측 심동맥에 측정 캐눌라를 장착하고, 동맥 혈압을 및 심박을 측정하였다. 동맥 혈압과 심박 속도를 곱해 mmHg/분/10²의 단위로 압력 속도(pressure rate)를 측정하였다. 왼팔측 정맥에 시료 도핑용 측정 캐뉼라를 장착하였다. 외과적 치료를 실시한 후, 래트의 혈액 2 ㎖를 심장으로 공급하였다. 30분 후, 왼팔측 심동맥을 교합하였다. 추가 25분 후, 상기 교합을 해제해 국소 빈혈 영역에 혈액을 재공급하였다. 이 시점에, 800 ㎍/㎏의 펩타이드 B베타 또는 무작위화 펩타이드 B베타 각각을 절반의 동물들에게 정맥내 투여한 뒤, 2시간 동안 방치하였다.

손상 심조직과 비손상 심조직을 구별하기 위하여, 왼팔측 심동맥에 에반스 블루 염료를 2 중량% 농도로 공급하였다. 그 후 즉시, 절제한 심장을 횡으로 다섯 군데 절개하고, 동맥의 우벽을 절제하고, 정상 조직과 손상 조직이 구별될 수 있도록, 절편에 트리페닐테트라톨클로라이드(1 중량%)를 37℃에서 20분간 처리하였다. 컴퓨터를 이용한 면적 측정법을 이용해 상기 절편을 평가하였다.

혈관 교합으로 인해, 시험용 래트의 심장내 심근은 60%가 절박된 데 대하여, 참조용 래트의 심장내 심근은 62.5%가 절박되었다. 시험용 래트의 심장에서는 위태로운 조직의 29%가 사멸한 데 반하여, 참조용 래트의 심장에서는 45%가 사멸하였다. 이는 37%의 사멸 조직의 감소에 해당한다(p<0.05)

본 발명에 따르는 물질 및 제약 조성물을 제조하기 위한 그들의 용도는 자가반응성 림프구의 조직 손상 작용에 의해 초래되는 질환의 치료에 사용되는 제약 조성물의 경우에 특히 중요하다.

자가면역성 구와 관련된 질환 중에는, 아교질증(collagenosis), 류마티스성 질환, 건선 및 포스트/파라인펙션 질환 및 이식 대 숙주 반응에 의해 유발되는 질환이 있다. 제약 조성물은 림프구가 조직으로 이동하는 것을 차단하기 때문에 치유 작용이 발생한다. 따라서, 림프구가 혈류 중에 남게 되어, 자가 반응성 조직-손상 작용을 일으킬 수 없게 된다.

치유 효과는 기관 이식 후 발생하는 거부반응의 치료제 및/또는 예방제에 의해 발생할 수 있는 데, 이는 상기 제제가 혈류로부터 외래 기관으로의 림프구 이동을 저해하므로, 외래 기관이 자가 반응성 림프구에 의해 파괴되지 않을 수 있기 때문이다.

치유 효과는 동맥 경화증의 치료제 및/또는 예방제에 의해 발생할 수 있는 데, 이는 상기 제제가 림프구 및 단핵구의 혈관벽으로의 이동을 방해함으로써, 혈관벽 세포의 활성화를 저해하기 때문이다.

치유 효과는 혈관 수술, 혈관 이식 수술 및 기관 이식 후, 예를 들면, 심근경색, 졸중과 같은 외과적 수술 또는 약물에 의한 혈류 회복 후에 수반되는 재관류성 외상의 치료제 및/또는 예방제에 의해서도 발생하는 데, 이는 상기 제제가 림프구 및 단핵구의 혈관벽으로의 이동을 저해하기 때문이다. 재관류성 외상은 혈류 회복기에 혈관 세포 내에서 발생하는 산소 결핍/산증(acidosis)에 의해 유발되며, 그들의 활성화를 초래한다. 이를 통해, 림프구 및 단핵구는 혈관벽에 부착해 이동한다. 림프구 및 단핵구가 혈관벽에 부착해 이동한다는 점으로 인해, 수반되는 염증 반응에 의해 초래되는 영구적인 어떠한 혈관 손상도 없이, 저산소증/산증에 의해 초래되는 손상이 감소한다.

치유 효과는 대사성 질환 또는 노화 과정 중에 발생하는 동맥 경화증의 치료제 및/또는 예방제에 의해서도 발생하는 데, 이는 상기 제제가 림프구 및 단핵구가 혈관벽으로 이동하는 것을 저해함으로써, 이들로부터 야기되는 동맥 경화성 플라크의 증식을 억제하기 때문이다.

본 발명에 따르는 제약 조성물은 추가의 약물 운반용으로 사용될 수 있다. 본 발명에 따르는 제약 조성물은 표면 분자를 내피 세포에 특이적으로 결합시킨다. 따라서, 거기에 결합된 약물은 고농도로 내피 세포와 접촉할 수 있으며, 이들은 다른 장소에서는 부작용을 일으킬 수 없다. 세포 분열을 저해하는 물질, 예를 들면 내피 세포에 특이적으로 부가된 후 항혈관형성 작용을 나타낼 수 있는 물질의 용도도 언급할 수 있다. 이 경우, 종양 환자는 내피 세포의 증식 저해 및 이로 인한 신생혈관생성의 억제에 의해 종양의 성장이 차단되기 때문에, 치유 효과를 경험하게 된다.

Claims

하기 일반식 I(SEQ ID NO 1, 2)의 펩타이드 또는 단백질, 및 이들의 염, 예를 들면 아미드, 또는 이들의 혼합물 및/또는 이들 이외에 인간 및/또는 수의 약제 용도의 치료 및/또는 예방용 물질 적어도 1종과의 혼합물:

[일반식 I]

상기 식에서,

R₁및 R₂는 서로 동일하거나 상이한 것으로서, 수소, 혹은 1개 내지 3개, 특히 10개 이하의 탄소 원자를 포함하는 포화 또는 불포화 탄화수소 잔기를 의미하고,

Z₁은 히스티딘 또는 프롤린 잔기를 의미하고,

Z₂는 아르기닌 잔기, 시작 아르기닌 잔기를 포함하는, 특히 2개 내지 30개의 아미노산을 포함하는 펩타이드 잔기 또는 단백질 잔기를 의미함.
제1항에 있어서,

하기 일반식 II(SEQ ID NO 3 내지 10)을 가지는 펩타이드 또는 단백질, 및이들의 염, 예를 들면 아미드, 또는 이들의 혼합물 및/또는 이들 이외에 인간 및/또는 수의 약제 용도의 치료 및/또는 예방용 물질 적어도 1종과의 혼합물:

[일반식 II]

상기 식에서,

R₁및 R₂는 서로 동일하거나 상이한 것으로서, 수소, 혹은 1개 내지 3개, 특히 10개 이하의 탄소 원자를 포함하는 포화 또는 불포화 탄화수소 잔기를 의미하고,

Z₁은 히스티딘 또는 프롤린 잔기를 의미하고,

Arg는 아르기닌 잔기를 의미하고,

Z₃은 프롤린 또는 발린 잔기를 의미하고,

Z₄는 류신 또는 발린 잔기를 의미하고,

Z₅는 특히 2개 내지 30개의 아미노산을 포함하는 단백질 또는 펩타이드 잔기를 의미하거나, 1개 내지 3개, 특히 10개 이하의 탄소 원자를 포함하는 알콜 잔기를 의미하거나, 혹은 유기 또는 무기 염기 잔기를 의미함.
제2항에 있어서,

Z₅가 피브린의 A알파-사슬로부터 유래되는 펩타이드 잔기인 펩타이드 또는 단백질.
제2항에 있어서,

Z₅가 피브린의 B베타-사슬로부터 유래되는 펩타이드 잔기인 펩타이드 또는 단백질.
제2항에 있어서,

Z₅는 하기 아미노산 서열(SEQ ID NO 11)을 포함하는 펩타이드 잔기를 의미하고:

Asp Lys Lys Arg Glu Glu Ala Pro Ser Leu Arg Pro Ala Pro Pro Pro Ile Ser Gly Gly Gly Tyr Arg;

Z₁은 히스티딘 잔기를 의미하고,

Arg는 아르기닌 잔기를 의미하고,

Z₃은 프롤린 잔기를 의미하고,

Z₄는 류신 잔기를 의미하는 펩타이드 또는 단백질.
제2항에 있어서,

Z₅는 하기 아미노산 서열(SEQ ID NO 12)을 포함하는 펩타이드 잔기를 의미하고:

Glu Arg His Gln Ser Ala Cys Lys Asp Ser Asp Trp Pro Phe Cys Ser Asp Glu Asp Trp Asn Tyr Lys;

Z₁은 프롤린 잔기를 의미하고,

Arg는 아르기닌 잔기를 의미하고,

Z₃은 발린 잔기를 의미하고,

Z₄는 발린 잔기를 의미하는 펩타이드 또는 단백질.
감염에 의해 발생하는 체내의 국소성 및/또는 전신성 염증의 치료를 위한 제약 조성물을 제조하기 위한 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 따르는 펩타이드 및/또는 단백질의 용도.
자가면역 반응을 기초로 하는 체내의 국소성 및/또는 전신성 염증의 치료를 위한 제약 조성물을 제조하기 위한 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 따르는 펩타이드 및/또는 단백질의 용도.
류마티스성 질환을 기초로 하는 체내의 국소성 및/또는 전신성 염증의 치료를 위한 제약 조성물을 제조하기 위한 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 따르는펩타이드 및/또는 단백질의 용도.
면역계 질환을 기초로 하는 체내의 국소성 및/또는 전신성 염증의 치료를 위한 제약 조성물을 제조하기 위한 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 따르는 펩타이드 및/또는 단백질의 용도.
유전적 질환을 기초로 하는 체내의 국소성 및/또는 전신성 염증의 치료를 위한 제약 조성물을 제조하기 위한 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 따르는 펩타이드 및/또는 단백질의 용도.
기관 이식 후 발생하는 거부반응, 동맥 경화증, 재관류성 외상(reperfusion trauma), 동맥 경화성 질환 및/또는 노화 과정 중의 피브린 침착 증가의 예방 및/또는 치료를 위한 제약 조성물을 제조하기 위한 제1항 내지 제11항 중 어느 한 항에 따르는 펩타이드 및/또는 단백질의 용도.
기관 이식 후의 동맥 경화증의 예방 및/또는 치료를 위한 제약 조성물을 제조하기 위한 제1항 내지 제12항 중 어느 한 항에 따르는 펩타이드 및/또는 단백질의 용도.
재관류성 외상의 예방 및/또는 치료를 위한 제약 조성물을 제조하기 위한제1항 내지 제13항 중 어느 한 항에 따르는 펩타이드 및/또는 단백질의 용도.
동맥 경화성 및/또는 혈전성 질환의 예방 및/또는 치료를 위한 제약 조성물을 제조하기 위한 제1항 내지 제14항 중 어느 한 항에 따르는 펩타이드 및/또는 단백질의 용도.
노화 과정 중의 피브린 침작 증가의 예방 및/또는 치료를 위한 제약 조성물을 제조하기 위한 제1항 내지 제15항 중 어느 한 항에 따르는 펩타이드 및/또는 단백질의 용도.
추가의 약물을 인간 또는 동물의 내피 세포로 운반하는 데 사용되는 제약 조성물을 제조하기 위한 제1항 내지 제16항 중 어느 한 항에 따르는 펩타이드 및/또는 단백질의 용도.
제1항 내지 제17항 중 어느 한 항의 펩타이드 및/또는 단백질을 적어도 1종 포함하는 제약 조성물.
주사에 적합한 형태로 제공되는 제1항 내지 제18항 중 어느 한 항에 따르는 제약 조성물.