HRP20030564A2

HRP20030564A2 - Peptides and/or proteins and use thereof for the production of a therapeutic and/or prophylactic medicament

Info

Publication number: HRP20030564A2
Application number: HR20030564A
Authority: HR
Inventors: Petzelbauer Peter
Original assignee: Fibrex Medical Research & Development Gmbh
Priority date: 2000-12-12
Filing date: 2003-07-10
Publication date: 2005-06-30
Also published as: NZ550619A; NO20032656L; IL156360A; KR20030060988A; ATE329614T1; EE200300283A; KR100864069B1; PL362924A1; AU2002221316A1; DK1341819T3; CN1518558B; ZA200304545B; PT1341819E; JP4181874B2; CA2430972A1; SI1341819T1; CZ20031630A3; CN1518558A; WO2002048180A3; DK1586586T3

Description

Izum se odnosi na peptide i/ili proteine, njihovu primjenu za pripravu terapijskog i/ili preventivnog lijeka, kao i na lijek.

Do sada u profilaksi t terapiji primjenjivane supstancije za smanjenje ili sprječavanje upalnih reakcija, takozvani imunosupresori, obuhvaćaju poglavito dvije različite skupine. Prvo, derivate hormona, kortizona, koji se prirodno pojavljuje u tijelu, te drugo, egzogene imunosupresore kao što je ciklosporin i njegovi derivati, azatioprin, ciklofosfamid, itd. Tim supstancijama je zajedničko protuupalno djelovanje, ali te supstancije imaju u dugotrajnoj terapiji znatna popratna djelovanja. Ta popratna djelovanja imaju ograničujući učinak na dugotrajnu terapiju, stoga se te supstancije daju alternirajuće ili u kombinacijama, zbog smanjenja popratnih djelovanja do podnošljive razine ili uopće zbog mogućnosti nastavka terapije. Kao popratna djelovanja treba uz kortizon spomenuti patološke frakture, koje su prouzročene osteoporotičnim učinkom kortizona, ili otkazivanje bubrega koje može biti izazvano ciklosporinom. Ta popratna djelovanja neizbježna su u obje skupine spojeva, te je stoga trenutak prekida terapije samo pitanje trajanja terapije i ukupne doze.

Predmet sadašnjeg izuma je pribaviti nove farmaceutske proizvode koji su sposobni spriječiti ili inhibirati upalne reakcije i imati tek neznatne popratne učinke. Daljnji predmet sastoji se u omogućenju dugotrajne terapije.

Nadalje će se aminokiseline peptida prema izumu označavati uobičajenim skraćenicama, kojima se označuju α-aminokiseline.

Pod "analozima" se podrazumijeva peptid koji se izvodi iz sekvencije fibrina i ponajprije iz sekvencija koje su u prednosti, derivatizacijom, supstitucijom, ponajprije homolognom supstitucijom, delecijom i/ili insercijom.

Peptidi ili proteini prema izumu imaju općenitu formulu I (SEQ ID NO 1, 2)

[image]

gdje su

R1 i R2 isti ili različiti i predstavljaju vodik, neki zasićeni ili nezasićeni ugljikovodični ostatak sa 1 do 3, ponajprije do 10 ugljikovih atoma,

Z1 predstavlja histidinski ili prolinski ostatak,

Z2 predstavlja argininski ostatak, neki peptidni ostatak ili proteinski ostatak koji sadrži inicijalni argininski ostatak, ponajprije sa 2 do 30 aminokiselina,

i njihove soli, kao i primjerice amidi, ili međusobne smjese tvari i/ili s barem jednom daljnjom tvari za terapijsku i/ili preventivnuprimjenu u humanoj medicini ili veterini, pri čemu ponajprije postoje samo L-aminokiseline.

Bilo je potpuno neočekivano, da specificirana aminokiselinska sekvencija sprječava adheziju stanica iz krvotoka na endotelijske stanice žilnih stijenaka i/ili njihovu kasniju transmigraciju iz krvi u tkivo.

Peptidi ili proteini prema izumu imaju općenitu formulu II (SEQID NO 3 do 10)

[image]

gdje su

R1 i R2 isti ili različiti, te predstavljaju vodik, neki zasićeni ili nezasićeni ugljikovodični ostatak sa 1 do 3, ponajprije do 10 ugljikovih atoma,

Z1 predstavlja histidinski ili prolinski ostatak

Arg predstavlja argininski ostatak

Z3 predstavlja prolinski ili valinski ostatak

Z4 predstavlja leucinski ili valinski ostatak

Z5 predstavlja proteinski ostatak ili peptidni ostatak, ponajprije sa 2 do 30 aminokiselina, ili alkoholni ostatak sa 1 do 3, ponajprije do 10 ugljikovih atoma

ili organski ili anorganski bazni ostatak,

kao i njihove soli, te također primjerice amidi, ili međusobne smjese tih tvari i/ili s barem jednom daljnjom tvari za terapijsku i/ili preventivnu primjenu u humanoj medicini i/ili veterini, pri čemu ponajprije postoje samo L-aminokiseline.

Bilo je potpuno neočekivano, da sekvencijski dijelovi, peptidi ili odsječci fibrinogena imaju protuupalno djelovanje. Bez ograničavanja tim teorijskim promišljanjima, popratni učinci bi mogli počivati na činjenici, da se fibrin veže na endotelijske stanice preko svog neo-N-terminusa Bbeta-lanca i na stanice krvotoka preko sekvencije Aalfa-lanca, te time vodi do adhezije i transmigracije stanica u tkivo. Ta vezivanja imaju popratno djelovanje koje se sastoji u inhibiciji tvorbe fibrina. Ta inhibicija međutim ne znači za pacijente nikakav potencijalni nedostatak, jer je zgrušavanje krvi i u odsutnosti fibrina kod banalnih povreda sasvim dovoljno. Samo kod kirurških zahvata mogao bi u danom slučaju biti svrhovit prekid takve terapije. Druga popratna djelovanja treba uglavnom isključiti, jer ove supstancije interagiraju samo s prirodnim ligandima. Nadalje, leukociti u krvi nemaju negativnog utjecaja na prirodnu obranu. Time nema utjecaja na sastav krvi, kao na granulocite, limfocite i monocite, te prirodni obrambeni proces ostaje zadržan, a obrana od infekcije u krvi nepromijenjena.

Fibrinogen nastaje u jetri i u tom je obliku biološki neaktivan, a normalno postoji u krvi u koncentracijama od oko 3 g/l. Proteolitičkim cijepanjem proencima protrombina nastaje trombin, koji iz fibrinogena odcjepljuje fibrinske peptide A i B. Time se fibrinogen pretvara u svoj biološki aktivan oblik. Nastaju fibrin i produkti cijepanja fibrina.

Trombin nastaje tijekom svake aktivacije zgrušavanja krvi, to jest pri svakom oštećenju tkiva, bez obzira jesu li ona upalne, traumatične ili degenerativne geneze. Trombinom posredovana tvorba fibrina je u principu zaštitni proces za brzo zacjeljivanje nastalih defekata u žilnom sustavu. Tvorba fibrina je međutim također patogeni proces. Nastanak fibrinskog tromba kao uzročnika u srčanom infarktu je jedan od najvažnijih problema u humanoj medicini.

Uloga fibrina u ekstravazaciji upalnih stanica iz krvi u tkivo, stoje sa svoje strane poželjan proces u obrani od patogenih mikroorganizama ili tumorskih stanica u tkivu, ali s druge strane proces koji sam po sebi Inducira ili dalje održava oštećenje tkiva, do sada nije bila istražena ili nije bila dovoljno istražena. Fibrin se veže na endotelijske stanice preko svojeg neo-N-terminusa Bbeta pomoću sekvencije na Bbeta i na stanice u krvnoj struji pomoću sekvencije Aalfa, te time dovodi do adhezije i transmigracije stanica u tkivo.

Peptidi i proteini prema izumu mogu spriječiti adheziju stanica iz krvotoka na endotelijske stanice žilnih stijena ka i/ili njihovu naknadnu transmigraciju iz krvi u tkivo.

Peptid ili protein prema izumu, općenite formule II, gdje Z5 predstavlja peptidni ostatak sljedeće aminokiselinske sekvencije (SEQ ID NO 11):

Asp Lys Lys Arg Glu Glu Ala Pro Ser Leu Arg Pro Ala Pro Pro Pro Ile Ser Gly Gly Gly Tyr Arg

i

Z1 predstavlja histidinski ostatak

Arg predstavlja argininski ostatak

Z3 predstavlja prolinski ostatak

Z4predstavlja leucinski ostatak

sprječava taloženje, odnosno vezivanje fibrinskih odsječaka na žilne stijenke. Time se upalne stanice ne mogu zadržati na endotelijskim stanicama žilnih stijenaka arterija i vena, te se sprječava da takve stanice ostaju na žilnim stijenkama i time prodru dalje u tkivo.

Peptid ili protein općenite formule n, gdje Z5 predstavlja peptidni ostatak sa sljedećom aminokiselinskom sekvencijom (SEQ ID NO 12):

Glu Arg His Gln Ser Ala Cys Lys Asp Ser Asp Trp Pro Phe Cys Ser Asp Glu Asp Trp Asn Tyr Lys

i

Z1 predstavlja prolinski ostatak

Arg predstavlja argininski ostatak

Z3 predstavlja valinski ostatak

Z4predstavlja valinski ostatak

djeluje tako, da se stanice periferne krvi ne mogu povezati na fibrin ili fibrinske odsječke i time se sprječava njihova migracija u tkivo.

Opisani produkti cijepanja također su poznati u literaturi kao peptid Bbeta i peptid Aalfa. Ovaj gore navedeni proadhezivni i promigratorični put potpuno je nov za sustav upravljanja migracije stanica iz krvi u tkivo. Ova funkcija fibrina može se blokirati kako peptidom Bbeta tako i peptidom Aalfa.

Ovi peptidi prema izumu stoga se nude kao terapeutski agensi za ljude i životinje, za blokiranje putovanja stanica iz krvi u tkivo. Budući da fibrin ili drugi produkti fibrinogena, koji nastaju proteolitičkim cijepanjem, kao npr. fibrinogen cijepan urokinaza-plazminogen-aktivatorom, nastaju samo specifično i regionalno ograničeno, dakle na mjestima upale, smetnja zgrušavanja, arterioskleroze, tromboze i/ili tumorskog rasta, radi se pri tome o regionalno ograničenom terapijskom agensu, te stoga patološka popratna djelovanja na drugim mjestima ne treba očekivati ili ih treba očekivati tek u ograničenoj mjeri.

Ponajbolja i potpuno neočekivana primjenska područja peptida l/ili proteina prema izumu pojavljuju se u pripravi lijekova za terapiju ili za prevenciju lokalnih i/ili općenitih upala tijela pri infektivnoj genezi, na bazi neke autoimune reakcije, na bazi neke reumatične bolesti, na bazi smetnje imunog sustava, na bazi neke genetičke bolesti, za prevenciju i/ili terapiju reakcije odbacivanja pri transplantacjii organa, arterioskleroze reperfuzijskih trauma, na bazi arterioskleroticnih i/ili trombotičnih bolesti i pojačane depozicije fibrina. Takav peptid, ponajprije Bbeta, izvanredno je podoban i za pripravu farmaceutskog pripravka koji izvršava transport nekog drugog lijeka na ljudske ili životinjske endotelijske stanice. Pri tome je lijek koji se transportira na jednom kraju povezan s peptidom i skladišti se time putem VE-cadherina na nekom slobodnom mjestu žitne stijenke, tj. na endotelijskoj stanici.

Nadalje, izum se podrobnije opisuje pomoću sljedećih primjera.

Primjer 1:

Priprava produkata cijepanja fibrinogena:

Nepolimerizirajući degradacijski produkti fibrinogena dobiveni su razgradnjom s cijanogenbromidom prema Blomback et al. (Nature 1968, 218; 130-134). Tako razgrađeni fibrinogen sastoji se uglavnom od 63 kD fragmenta, i to N-terminalnog disulfidnog čvora, NDSK, a sadrži Aalfa Lanac 1-51, Bbeta lanac 1-118 i gama lanac 1-78. Za dobivanje NDSK-II (NDSK minus fibrinski peptidi A i B) odcijepljene su N-terminalne aminokiseline iz Aalfa i Bbeta lanaca pomoću trombina (20 jedinica/1 μg NDSK) kroz tri sata pri sobnoj temperaturi i potom obrađeni s diizopropilfluoro-fosfatom zbog blokiranja trombinske aktivnosti. Tako dobiveni NDSK-II sastojao se od Aalfa-lanca 17-51, Bbeta-lanca 15-118 i gama-lanca 1-78.

Za dobivanje NDSK-uPA, obrađeno je 500 μg NDSK kroz jedan sat pri 37 °C sa 200 jedinica urokinaza-plazminogen-aktivatorom (uPA) tvrtke Technoclone, Wien, Österreich. Reakcija je prekinuta sa 5 mM fenilmetilsulfonilfluorida. Tako dobiveni NDSK-uPA je NDSK i ne posjeduje fibrinski peptid B.

Za negativnu kontrolu, načinjena je druga frakcija iz produkta cijepanja fibrinogena, nazvana FCB-2 prema Nieuwenhuizen etal. (Biochem Biophys Acta 1983, 755; 531 - 533), pri čemu su produkti cijepanja proizvedeni obradbom sa cijanogenbromidom, FCB-2 je protein veličine 43 kD i sastoji se od Aalfa-lanca 148-208, Bbeta-lanca 191-305 i gama-lanca 95-265. Rečenom proteinu dodani su za kontrolne svrhe također trombin i diizopropilfluorofosfat. To međutim nije dovelo ni do kakve promjene proteina (dalje nazivan FCB-2-thr).

Za daljnje negativne kontrole, kulturni medij (RPMI tvrtke Life techn. Inc., Paisky, UK) je obrađen s trombinom kao gore i potom inaktiviran (RPMI-thr) ili obrađen s uPA obrađen kao gore i inaktiviran (RPMI-uPA).

Primjer 2:

Peptid Aalfa (SEQ ID NO 12) odgovara aminokiselinama 1 do 28 alfa-lanca fibrina t identičan je aminokiselinama 17 do 45 sekvencije Aalfa-tanca fibrinogena:

Gly Pro Arg Val Val Glu Arg His Gln Ser Ala Cvs Lys Asp Ser Asp Trp Pro Phe Cys Ser Asp Glu Asp Trp Asn Tyr Lvs

Peptid Bbeta (SEQ ID NO 11) odgovara aminokiselinama 1 do 28 beta-lanca fibrina, koja je identična aminokiselinama 15 do 43 Bbeta lanca fibrinogena, koja ima sljedeću sekvenciju:

Gly His Arg Pro Leu Asp Lys Lys Arg Glu Glu Ala Pro Ser Leu Arg Pro Ala Pro Pro Pro Ile Ser Gly Gly Gly Tyr Arg

Oba peptida sintetizirana su peptidnom sintezom na čvrstoj fazi prema Merrifield R. B., J. Amer. Chem. Soc. 1963; 85, 2149-2154 pomoću višestrukog uređaja za peptidnu sintezu uz primjenu strategije fluorenilmetiloksikarbonil (FMOC)-zaštitne skupine prema Carpino L. A. i Han. G Y, J. Amer. Chem. Soc. 1981; 37; 3404-3409. Čišćenje sirovog peptida provedeno je pomoću preparativne reverzno-fazne HPLC preko kolone Nucleosil 100-10, C18 prema Engelhart H. i Müller H. Chromatography 1984 19:77 kao i Henschen A., Hupe K. P. i Lottspeich F. High Performance Liquid Chromatography VCH 1985. Kao kontrolni peptidi primijenjeni su peptidi iste duljine ali koji su sadržavali randomiziranu aminokiselinsku sekvenciju.

Primjer 3:

HU-SCID mišji model:

Humana koža transptantirana je na leđa SCID miševa i dva tjedna potom injektirani su humani limfociti u pertoneum. Postupak je proveden prema Petzelbauer et al. (J. Invest. Dermatol. 1996, 107; 576 - 581). Potom je u repne vene petnaest tako pripremljenih miševa injektirano sljedeće:

a) 100 μg humanog NDSK-II

b) 100 μg humanog FCB-2

c) 100 μg peptida Aalfa

d) 100 μg peptida Bbeta

e) 100 μg Aalfa slučajnog poretka

f) 100 μg Bbeta slučajnog poretka

Dvadesetčetiri sada potom uklonjena je humana koža i procijenjen je broj upalnih mjesta, izražen u stanicama po 0,3 mm2, i srednja vrijednost je određena sa standardnim odstupanjem.

za a: 22 ± 2.8

za b: 9 ± 2.1

za c: 4 ± 1.1

za d: 6 ±1.1

za e: 5 ± 1.2

za f: 7 ± 1.3

Iz toga se može zaključiti da NDSK-II dovodi do upala, te je stoga taj protein uveden kao patogena supstancija. Drugi spojevi sami po sebi nisu pokazali nikakvo bitno povišenje upalnih stanica.

Usporedbeni primjer 4:

U repne vene petnaest miševa prema Primjeru 3 injektirano je

100 μg humanog NDSK-II i

100 μg randomiziranog peptida Aalfa.

Dalje je postupak proveden prema Primjeru 3. Određeno je postojanje 23 +/- 3,5 upalnih mjesta po 0,3 mm2.

Usporedbeni primjer 5:

U repne vene petnaest miševa prema Primjeru 3 injektirano je

100 μg humanog NDSK-II prema Primjeru 1 i

100 μg randomiziranog peptida Bbeta.

Dalje je postupak proveden prema Primjeru 3. Određeno je postojanje 24 +/- 2 upalna mjesta po 0,3 mm2.

Primjer 6:

U petnaest miševa prema Primjeru 3 injektirano je

100 μg humanog NDSK-II i

100 μg sintetiziranog peptida Aalfa.

Dalje je postupak proveden prema Primjeru 3. Određeno je postojanje 21 +/- 2,2 upalnih mjesta po 0,3 mm2.

Primjer 7:

U repne vene petnaest miševa prema Primjeru 3 injektirano je

100 μg humanog NDSK-II i

100 μg sintetiziranog peptida Bbeta.

Dalje je postupak proveden prema Primjeru 3. Određeno je postojanje 14 +/- 2 upalna mjesta po 0,3 mm2.

Iz Primjera 4 do 7 može se uočiti da peptid Bbeta blokira limfocitnu upalu.

Usporedbeni primjer 8:

Humane umbilikalne venske endotelijske stanice (HUVEC) markirane su crvenim fluorescentnim bojilom (Cell Tracker Orange, 1 μl/ml, Molecular Probes, Eugene, OR) i dispergirane su na kolagensku matricu (Collaborative Biomedical Products, Bedford, MA). Nakon konfluencije endotelijskih stanica, superponirane su periferne mononuklearne stanice (PBMC) (105 Zellen pro 25 mm2) markirane zelenim fluorescentnim bojilom (Cell Tracker Green, 1 μl/ml, Molecular Probes der Firma Eugene Origon). Potom su stanice inkubirane kroz dvanaest sati na 37 °C.

Adherirane stanice koje su transmigrirale u gel fotografirane su laserskim skenirajućim mikroskopom, pretvorene su u piksele i procijenjene pomoću ,,NIH image" prema Gröger et al. (J. Immunol. Method 1999; 222: 101-109).

Broj adherentnih stanica po 0,1 mm2 određen je kako je opisano pod adhezijom. Broj migriranih stanica po 0,04 mm2 dobiven je kako je opisano pod migracijom. Određena je srednja vrijednost iz tri puta po tri pokusa uz standardno odstupanje.

[image]

Iz toga se može zaključiti, da NDSK-II rezultira znatnim migracijama perifernih krvnih monocelularnih stanica (PBMC) i djeluje jače od NDSK-uPA, te stoga posjeduje patogenu aktivnost. Nijedna od kontrola a), b), e), f) i g) nije dovela do znatne migracije.

Primjer 9:

Kolagenskoj matrici prema primjeru 8 koja je sadržavala suspenziju PBMC dodano je 100 μg NDSK-II i Bbeta ili randomiziranog Bbeta, te je postupak dalje proveden prema Primjeru 8.

adhezija migracija

a) bez dodatka NDSK-II 38 +/- 15 6 +/- 4

b) samo 100 μg NDSK-II 73 +/- 29 16 +/- 7

c) 10 μg Bbeta + NSDK-II 63 +/- 33 7 +/- 4

d) 100 μg Bbeta + NDSK-II 47 +/- 34 5 +/- 4

e) 1000 μg Bbeta + NDSK-II 52 +/- 27 10 +/- 6

f) 10 μg Bbeta randomizirano + NDSK-II 77 +/- 33 16 +/- 6

g) 100 μg Bbeta randomizirano +NDSK-II 86 +/- 35 15 +/- 6

h) 1000 μg Bbeta randomizirano +NDSK-II 78 +/- 31 13 +/- 8

Kao što se iz ovih pokusa može razabrati, peptid Bbeta blokira upale.

Primjer 10:

Kolagenskoj matrici prema Primjeru 8 koja je sadržavala suspenziju PBMC dodano je 100 μg NDSK-II i Aalfa ili randomizirani Aalfa, te je postupak dalje proveden prema Primjeru 8.

adhezija migracija

a) bez dodatka NDSK-II 42 +/- 6 10 +/- 1

b) samo 100 μg NDSK-II 96 +/- 11 24 +/- 3

c) 10 μg Aalfa + NSDK-II 69 +/- 12 21 +/- 4

d) 100 μg Aalfa + NDSK-II 73 +/- 13 15 +/- 6

e) 1000 μg Aalfa + NDSK-II 70 +/- 6 13 +/- 5

f) 10 μg Aalfa randomizirano + NDSK-II 70 +/- 6 25 +/- 2

g) 100 μg Aalfa randomizirano +NDSK-II 65 +/- 16 24 +/- 3

h) 1000 μg Aalfa randomizirano +NDSK-II 70 +/- 12 26 +/- 3

Iz rezultata pokusa može se razabrati, da peptid Aalfa samo djelomice blokira migraciju PBMC.

Primjer 11:

Budući da se PBMC suštinski sastoji od smjese limfocita i monocita, u Primjeru 11 su primijenjeni čisti limfociti umjesto PBMC (kao u Primjerima 8 -10).

Kolagenskoj matrici prema Primjeru 8 koja je sadržavala endotelijske stanice i limfocite dodano je 100 μg NDSK-uPA odnosno 100 μg NDSK-II i Aalfa odnosno Bbeta.

adhezija migracija

a) bez dodatka 68 +/- 8 16 +/- 3

b) NDSK-uPA 143 +/- 11 53 +/- 5

c) NDSK-II 119 +/- 11 43 +/- 4

d) samo 100 μg Bbeta 58 +/- 18 14 +/- 1

e) NDSK-uPA + 100 μg Bbeta 74 +/- 8 19 +/- 2

f) NDSK-II + 100 μg Bbeta 74 +/- 8 17 +/- 3

g) samo 100 μg Aalfa 77 +/- 4 18 +/- l

h) NDSK-uPA + 100 μg Aalfa 131 +/- 4 40 +/- 3

i) NDSK-II + 100 μg Aalfa 131 +/- 4 44 +/- 4

j) samo 100 μg Bbeta randomizirano 75 +/- 5 19 +/- 1

k) NDSK-uPA + 100 μg Bbeta randomizirano 134 +/- 13 46 +/- 4

l) NDSK-II + 100 μg Bbeta randomizirano 120 +/- 12 42 +/- 4

Iz rezultata ovih pokusa slijedi da:

1) kako NDSK-II, tako i NDSK-uPA Izaziva limfocitnu upalu,

2) peptid Bbeta potpuno blokira adheziju i migraciju limfocita Induciranih s NDSK-II i NDSK-uPA, dok peptid Aalfa nema blokirajući učinak, iz čega se može zaključiti da slobodni alfa-lanac nije potreban za indukciju adhezije i migracije limfocita.

Primjer 12:

Postupano je prema Primjeru 11, ali su umjesto limfocita uporabljeni čisti monociti. Dodano je 100 μg NDSK-uPA odnosno 100 μg NDSK-II u peptid Aalfa, randomizirani Aalfa, Bbeta ili randomizirani Bbeta.

adhezija migracija

a) bez dodatka 43 +/- 8 7 +/- 1

b) NDSK-uPA 48 +/- 10 10 +/- 2

C) NDSK-II 90 +/- 11 19 +/- 6

d) 100 μg Bbeta 59 +/- 7 5 +/- 1

e) NDSK-uPA + 100 μg Bbeta 61 +/- 11 8 +/- 3

O NDSK-II + 100 μg Bbeta 70 +/- 7 7 +/- 5

g) 100 μg Bbeta randomiziran 40 +/- 7 6 +/- 1

h) NDSK-uPA + 100 μg Bbeta randomiziran 45+/- 5 8+/-3

i) NDSK-II + 100 μg Bbeta randomiziran 92 +/-10 20 +/- 7

j) 100 μg Aalpha 59 +/- 6 5 +/- 1

k) NDSK-uPA + 100 μg Aalfa 62 +/- 4 8 +/- 5

l) NDSK-II + 100 μg Aalfa 68 +/- 10 9 +/- 6

m) 100 μg Aalfa randomiziran 58 +/- 7 6+/- 1

n) NDSK-uPA + 100 μg Aalfa randomiziran 50 +/-10 10 +/- 4

o) NDSK-II 4- 100 μg Aatfa randomiziran 108 +/- 8 21 +/- 5

Iz tih rezultata pokusa slijedi, da migraciju monocita izaziva samo NDSK-II, ali ne 1 NDSK-uPA, što znači da kako alfa-lanac tako i beta-lanac mora imati slobodni N-terminalni kraj i blokirati migraciju monocita.

Primjer 13:

Postupak je proveden prema Primjeru 11 sa čistim limfocitima. Dodano je 100 μg NDSK-uPA odnosno 100 μg NDSK-II malim peptidnim solima izvedenim iz Aalfa Gly Pro Arg (Pro)-NH2 acetata (Aalfa-derivat) ili izvedenih iz Bbeta Gly His Arg Pro-OH acetata (Bbeta-derivat).

adhezija migracija

a) bez dodatka 60 +/- 8 14 +/- l

b) NDSK-uPA 149 +/- 12 57 +/- 5

c) NDSK-II 121 +/- 11 48 +/- 7

d) samo 100 μg Bbeta-derivata 58 +/- 10 5 +/- 1

e) NDSK-uPA + 100 μg Bbeta-derivata 70 +/- 8 16 +/- 3

f) NDSK-II + 100 μg Bbeta-derivata 69 +/- 7 14 +/- 5

g) samo 100 μg Aalfa-derivata 77 +/- 4 18 +/- 1

h) NDSK-uPA + 100 μg Aalfa-derlvata 134 +/- 4 48 +/- 5

g) NDSK-II + 100 μg Aalfa-derivata 131 +/- 7 49 +/- 6

j) samo 100 μg Bbeta-derivata random. 70 +/- 5 14 +/- 7

k) NDSK-uPA + 100 μg Bbeta-derivata 130 +/- 12 49 +/- 6

l) NDSK-II + 100 μg Bbeta-derivata random 120 +/-10 55 +/- 8

Iz ovog eksperimenta može se zaključiti, da su u Inhibiciji migracije limfocita ovi kratki peptidi, dodani na podoban kontinuirani, način jednako djelotvorni kao dugački peptidi.

Primjer 14:

Postupak je proveden kao u Primjeru 12, a uporabljeni su čisti monociti. Dodano je 100 μg NDSK-uPA odnosno 100 μg NDSK-II kratkim peptidnim solima Aalfa Gly Pro Arg (Pro)NH2 acetatu (Aalfa-derivat) ili Bbeta Giy His Arg Pro-OH acetatu (Bbeta-derivat).

adhezija migracija

a) bez dodatka 40 +/- 8 5 +/- 1

b) NDSK-uPA 54 +/- 9 7 +/- 2

c) NDSK-II 85 +/- 11 22 +/- 6

d) 100 μg Bbeta-derivata 52 +/- 7 6 +/- 1

e) NDSK-uPA + 100 μg Bbeta-derivata 61 +/-11 8 +/- 3

f) NDSK-II + 100 μg Bbeta-derivata 68 +/- 7 8 +/- 4

g) 100 μg Bbeta-derivata randomiziranog 40 +/- 7 6 +/- 1

h) NDSK-uPA + 100 μg Bbeta-derivata randomiziranog 44 +/- 6 8+7-2

i) NDSK-II + 100 μg Bbeta-derivata randomiziranog 92 +/- 10 23 +/- 7

j) 100 μg Aalfa-derivata 50 +/- 5 4 +/- 4

k) NDSK-uPA + 100 μg Aalfa-derivata 60 +/- 5 7 +/- 6

l) NDSK-II + 100 μg Alpha-derivata 64 +/- 11 8 +/- 2

m)100 μg Aalfa-derivata randomiziranog 4 +/-10 6 +/- 3

n) NDSK-uPA + 100 μg Aalfa-derivata randomiziranog 50 +/- 10 10 +/- 4

o) NDSK-II + 100 μ.g Aalfa-derivata randomiziranog 99 +/- 8 21 +/- 7

Iz ovog pokusa može se zaključiti, da su u inhibiciji migracije monocita ovi kratki peptidi, dodani na podoban kontinuirani način, jednako djelotvorni kao i dugački peptidi.

Primjer 15:

Pokusi su provedeni na štakorima mužjacima Wistar, težine između 220 g i 280 g. Štakori su se prehranjivali standardnom dijetom i vodom. Za provedbu pokusa štakori su anestezirani i potom je provedeno umjetno disanje uz frekvenciju od 70 pulseva po minuti, pri čemu je odpušteno 8 ml do 10 ml po kilogramu plina sa 30 vol.-% kisika uz nadtlak od 1 mm do 2 mm žive. Desna srčana arterija opremljena je mjernom kanilom, a određeni su krvni tlak u arteriji i broj otkucaja srca. Udio tlaka je određen kao produkt krvnog tlaka u arteriji i brzine broja otkucaja srca, uz dimenziju mm žive / minuta / 103. Desna vena opremljena je mjernom kanilom za davanje pokusnih supstancija. Nakon provedbe kirurške obradbe, dovedena su srcu 2 ml štakorske krvi. Nakon trideset minuta zatvorene su lijeve srčane arterije. Nakon daljnjih dvadesetpet minuta spona je odpuštena zbog ponovnog prokrvljavanja ishaemijskog područja. Tada je polovici životinja intravenski dano 800 μg/kg peptida Bbeta odnosno peptida Bbeta randomiziranog, te je ostavljeno kroz dva sata.

Za razlikovanje oštećenog i neoštećenog srčanog tkiva, dodana je tada lijevoj srčanoj arteriji boja evans blue koncentracije 2 mas.-%. Izvađeno srce potom je podijeljno s pet horizontalnih rezova, stijenka desne vene uklonjena, a odsječci su obrađeni s trifeniltetratolkloridom (1 mas.%) kroz dvadeset minuta pri 37 °C, zbog razlikovanja između normalnog i infarktnog tkiva. Odsječci su procijenjeni računalno podržanom planimetrijom.

Zbog vaskularne okluzije bilo je u srcima usporedbenih štakora ugroženo 62,5 % srčanog mišića, a u srcima pokusnih štakora 60 %. U srcima usporedbenih štakora odumrlo je 46 % ugroženog tkiva, a nasuprot tome u srcima pokusnih štakora 29 %. To odgovara 37 %-tnom smanjenju od umrlog tkiva (p<0,05).

Supstancije prema izumu, kao i primjena supstancija prema izumu za pripravu farmaceutskog pripravka od posebnog je značenja:

Za farmaceutski pripravak za terapiju bolesti koje nastaju djelovanjem autoreaktivnih limfocita na oštećenje tkiva.

Tu se ubrajaju bolesti koje spadaju u krug autoimunosti, primjerice kolagenoze, reumatske bolesti, psorijaza i post-/parainfektivne bolesti i bolesti koje nastaju reakcijom «graft versus host». Do ljekovitog djelovanja dolazi jer taj lijek blokira migraciju limfocita u tkivo. Time limfociti ostaju u krvotoku i ne mogu prouzročiti učinak autoreaktivog oštećenja tkiva.

Kod lijeka za terapiju i/ili prevenciju reakcija odbacivanja u transplantaciji organa dolazi do ljekovitog djelovanja jer taj lijek sprječava migraciju limfocita iz krvotoka u strani organ, te time autoreaktivni limfociti ne mogu razoriti strani organ.

Kod lijeka za terapiju i/ili prevenciju arterioskleroze u transplantaciji organa dolazi do ljekovitog djelovanja jer taj lijek prekida migraciju limfocita i monocita u žilnu stijenku, a time i aktivaciju stanica žilne stijenke. Time se arterioskleroza kao posljedica transplantacije minimizira ili sprječava.

Kod lijeka za terapiju i/ili prevenciju reperfuzijskih trauma poslije kirurških ili farmaceutski prouzročenih ponovnih prokrvljenja, primjerice poslije srčanog infarkta, napadaja kapi, poslije operacije žila, operacije premosnice i transplantacije organa dolazi do ljekovitog djelovanja, jer taj lijek inhibira migraciju iimfocita i monocita u žilne stijenke. Reperfuzijska trauma nastaje zbog manjka kisika/acidoze žilnih stanica tijekom ponovnog prokrvljenja i dovodi do njihove aktivacije. Pri tome limfociti i monociti prijanjaju na žilnu stijenku i ulaze u nju. Prekid prijanjanja i ulaska limfocita i monocita u žilnu stijenku rezultira uklanjanjem šteta zbog hipoksije/acidoze, bez stalnog oštećenja krvnih žila zbog kasnije upalne reakcije.

Kod lijeka za terapiju i/ili prevenciju arterioskleroze kao posljedice bolesti izmjene tvari ili procesa starenja dolazi do ljekovitog djelovanja, jer taj lijek inhibira migraciju limfocita i monocita u žilne stijenke i time inhibira iz toga rezultirajuću progredijenciju arteriosklerotičnih pločica.

Lijek prema izumu može se dodati i za transport drugog lijeka. Lijek prema izumu specifično veže površinsku molekulu na endotelijske stanice. Time se na njega vezani lijekovi mogu dovesti na endotelijske stanice u visokim koncentracijama, bez mogućnosti da oni prouzroče popratna djelovanja na drugim mjestima. Kao primjer može se ovdje navesti primjena supstancija za inhibiciju stanične diobe, koji pri specifičnom dovođenju na endotelijske stanice mogu imati antiangiogenetički učinak. Ovdje dolazi do ljekovitog djelovanja u tumorskih pacijenata, jer se blokira rast tumora sprječavanjem proliferacije endotelijskih stanica i time sprječavanjem neoangiogeneze.

Claims

1. Primjena peptida ili proteina općenite formule II (SEQ ID NO 3 do 10) [image] naznačenih time, da su R1 i R2 isti ili različiti, te predstavljaju vodik, neki zasićeni ili nezasićeni ugljikovodični ostatak sa 1 do 3, ponajprije do 10 ugljikovih atoma, Z5 predstavlja proteinski ostatak ili peptidni ostatak, ponajprije sa 2 do 30 aminokiselina, ili alkoholni ostatak sa 1 do 3, ponajprije do 10 ugljikovih atoma, ili organski ili anorganski bazni ostatak, kao i njihovih soli, te također primjerice amida, ili međusobnih smjesa tih tvari i/ili s barem jednom daljnjom tvari za terapijsku i/ili preventivnu primjenu protiv upala u humanoj medicini i/ili u veterini.

2. Primjena peptida ili proteina općenite formule II prema zahtjevu 1, naznačena time, da Z5 predstavlja peptidni ostatak sljedeće aminokiselinske sekvencije (SEQ ID NO 11): Asp Lys Lys Arg Glu Glu Ala Pro Ser Leu Arg Pro Ala Pro Pro Pro Ile Ser Glv Gly Gly Tyr Arg za pripravu lijeka za terapijsku i/ili preventivnu primjenu protiv upala u humanoj medicini ili u veterini.

3. Primjena peptida i/ili proteina prema nekom od zahtjeva 1 ili 2, naznačena time, da je za pripravu lijeka za terapiju lokalnih i/ili općenitih tjelesnih upala infektivne geneze.

4. Primjena peptida i/ili proteina prema nekom od zahtjeva 1, 2 ili 3, naznačena time, da je za pripravu lijeka za terapiju lokalnih i/ili općenitih tjelesnih upala na bazi autoimune reakcije.

5. Primjena peptida i/ili proteina prema nekom od zahtjeva 1 do 4, naznačena time, da je za pripravu lijeka za terapiju lokalnih i/ili općenitih tjelesnih upala na bazi reumatičnih bolesti.

6. Primjena peptida i/ili proteina prema nekom od zahtjeva 1 do 5, naznačena time, da je za pripravu lijeka za terapiju lokalnih i/ili općenitih tjelesnih upala na bazi smetnja u imunom sustavu.

7. Primjena peptida i/ili proteina prema nekom od zahtjeva 1 do 6, naznačena time, da je za pripravu lijeka za terapiju lokalnih i/ili općenitih tjelesnih upala na bazi neke genetičke bolesti.

8. Primjena peptida i/ili proteina prema nekom od zahtjeva 1 do 7, naznačena time, da je za pripravu lijeka za prevenciju i/ili terapiju reakcije odbacivanja u transplantaciji organa, arterioskleroze, reperfuzijskih trauma, arterioskleroznih bolesti i/ili pojačane depozicije fibrina u procesu starenja.

9. Primjena peptida i/ili proteina prema nekom od zahtjeva 1 do 8, naznačena time, da je za pripravu lijeka za prevenciju i/ili terapiju arterioskleroze u transplantaciji organa.

10. Primjena peptida i/ili proteina prema nekom od zahtjeva 1 do 9, naznačena time, da je za pripravu lijeka za prevenciju i/ili terapiju reperfuzijskih trauma.

11. Primjena peptida i/ili proteina prema nekom od zahtjeva 1do 10, naznačena time, da je za pripravu lijeka za prevenciju i/ili terapiju arterioskleroznih i/ili tromboznih bolesti.

12. Primjena peptida I/III proteina prema nekom od zahtjeva 1 do 11, naznačena time, da je za pripravu lijeka za prevenciju i/ili terapiju pojačane depozicije fibrina u procesu starenja.

13. Primjena peptida i/ili proteina prema nekom od zahtjeva 1 do 12, naznačena time, da je za pripravu lijeka za transport drugog lijeka do ljudskih ili životinjskih endotelijskih stanica.

14. Lijek, naznačen time, da sadrži barem jedan peptid i/ili protein prema nekom od zahtjeva 1 do 13.

15. Lijek prema nekom od zahtjeva 1 do 14, naznačen time, da postoji u obliku podobnom za injekcije.

16. Primjena peptida ili proteina općenite formule I (SEQ ID NO 1,2) [image] naznačenih time, da su R1 i R2 isti ili različiti i predstavljaju vodik, neki zasićeni ili nezasićeni ugljikovodični ostatak sa 1 do 3, ponajprije do 10 ugljikovih atoma, Z1predstavlja histidinski iti prolinski ostatak, Z2 predstavlja argininski ostatak, neki peptidni ostatak ili proteinski ostatak na čijem je početku argininski ostatak, ponajprije sa 2 do 30 aminokiselina, kao i njihovih soli, te primjerice amida, ili međusobnih smjesa tvari i/ili s barem jednom dodatnom tvari za pripravu lijeka za terapijsku i/ili preventivnu primjenu u humanoj medicini ili veterini za sprječavanje adhezije stanica iz krvotoka na endotelijske stanice žilne stijenke i/ili potom transmigraciju iz krvi u tkivo.

17. Primjena peptida ili proteina prema zahtjevu 16 općenite formule II (SEQ ID NO 3 do 10) [image] naznačenih time, da su R1 i R2 isti ili različiti, te predstavljaju vodik, neki zasićeni ili nezasićeni ugljikovodični ostatak sa 1 do 3, ponajprije do 10 ugljikovih atoma, Z1predstavlja histidinski ili prolinski ostatak, Arg predstavlja argininski ostatak, Z3 predstavlja prolinski ili valinski ostatak, Z4predstavlja leucinski ili vatinski ostatak, Z5predstavlja proteinski ostatak ili peptidni ostatak, ponajprije sa 2 do 30 aminokiselina, ili alkoholni ostatak sa 1 do 3, ponajprije do 10 ugljikovih atoma, ili organski ili anorganski bazni ostatak, kao i njihovih soli, te također primjerice amida, ili međusobnih smjesa tih tvari i/ili s barem jednom daljnjom tvari za pripravu lijeka za terapijsku i/ili preventivnu primjenu u humanoj medicini i/ili veterini za sprječavanje adhezije stanica iz krvotoka na endotelijske stanice žilne stijenke i/ili potom transmigraciju iz krvi u tkivo.

18. Primjena peptida ili proteina općenite formule II prema zahtjevu 17, naznačenih time, da Z5 predstavlja peptidni ostatak sljedeće aminokiselinske sekvencije (SEQID NO 11): Asp Lys Lys Arg Glu Giu Ala Pro Ser Leu Arg Pro Ala Pro Pro Pro Ile Ser Gly Gly Gly Tyr Arg i Z1predstavlja histidinski ostatak, Arg predstavlja argininski ostatak, Z3predstavlja prolinski ostatak, Z4predstavlja leucinski ostatak, za pripravu lijeka za terapijsku i/ili preventivnu primjenu u humanoj medicini ili veterini za sprječavanje adhezije stanica iz krvotoka na endotelijske stanice žilne stijenke i/ili potom transmigraciju iz krvi u tkivo.

19. Primjena peptida ili proteina općenite formule II prema zahtjevu 17, naznačenih time, da Z5 predstavlja peptidni ostatak sljedeće aminokiselinske sekvencije (SEQ ID NO 12): Glu Arg His Gin Ser Ala Cys Lys Asp Ser Asp Trp Pro Phe Cvs Ser Asp Glu Asp Trp Asn Tyr Lys i Z1predstavlja prolinski ostatak, Arg predstavlja argininski ostatak, Z3 predstavlja valinski ostatak, Z4 predstavlja valinski ostatak, za pripravu lijeka za terapijsku i/ili preventivnu primjenu u humanoj medicini ili veterini za sprječavanje adhezije stanica iz krvotoka na endotelijske stanice žilne stijenke i/ili potom transmigraciju iz krvi u tkivo.

20. Lijek, naznačen time, da sadrži barem jedan peptid i/ili protein prema nekom od zahtjeva 16 do 19.

21. Lijek prema nekom od zahtjeva 16 do 20, naznačen time, da postoji u obliku podobnom za injekcije.