PL209752B1

PL209752B1 - Zastosowanie peptydów lub białek do wytwarzania leku do leczenia chorób zapalnych o podłożu zakaźnym

Info

Publication number: PL209752B1
Application number: PL390342A
Authority: PL
Inventors: Peter Petzelbauer
Original assignee: Fibrex Medical Res & Dev Gmbh
Priority date: 2000-12-12
Filing date: 2001-12-07
Publication date: 2011-10-31
Also published as: PT1341819E; EP1586586A2; CY1109107T1; ES2323963T3; IL156360A; PT1586586E; KR100864069B1; SI1341819T1; US20040192596A1; US20090088384A1; SK7062003A3; US20070037749A1; CA2430972C; EP1341819B1; CN1518558A; NO20032656L; BR0116122A; KR20030060988A; DE50110182D1; AU2002221316A1

Description

Opis wynalazku

Przedmiotem wynalazku jest zastosowanie peptydów lub białek do wytwarzania leku terapeutycznego i/lub profilaktycznego w szczególności do leczenia chorób zapalnych o podłożu zakaźnym.

Substancje hamujące reakcje zapalne lub zapobiegające reakcjom zapalnym, zwane immunosupresantami, które dotychczas stosowano w profilaktyce i terapii, ogólnie są podzielone na dwie grupy. Pierwszą grupę stanowią pochodne hormonu naturalnie występującego w ludzkim organizmie, kortyzonu, drugą grupę zaś stanowią immunosupresanty, takie jak cyklosporyna i jej pochodne, azatiopryna, cyklofosfamid itp. Wszystkie te substancje mają działanie przeciwzapalne, ale wykazują również znaczące działania uboczne przy długotrwałym stosowaniu. Takie działania uboczne ograniczają terapie długoterminowe, dlatego też substancje te są stosowane na przemian lub w połączeniu, dla zmniejszenia działań ubocznych do dopuszczalnego poziomu, względnie dla umożliwienia kontynuowania terapii. Jako działania uboczne można wymienić patologiczne złamania kości związane ze stosowaniem kortyzonu, wskutek działania kortyzonu wywołującego osteoporozę, bądź ostrą niewydolność nerek, która może być spowodowana przez cyklosporynę. Takie działania uboczne są nieuniknione przy stosowaniu związków należących do obu grup, a zatem czas trwania terapii i całkowita dawka decydują o tym, w którym momencie terapia musi być przerwana.

Wiadomo, że fibrynogen ma łańcuch peptydowy α i β i że synteza fibrynogenu jest silnie zwiększona podczas procesów zapalnych (Herrick i in., The International Journal of Biochemistry & Cell Biology, tom 31, 1999, str. 741-746). Ponadto wymieniono łańcuch peptydowy Ββ₁₅-₄₂ (Ikematsu, Rinsho Kensa, tom 28, nr 1, 1984, str. 20-24). Z Thrombosis Research 56, 1989, str. 757-762 znane są różne tri- i tetrapeptydy, które wykazują działanie przeciwzakrzepowe. Fizjologiczna rola produktów rozszczepienia fibrynogenu jest również ujawniona w Blood, tom 71, 1988, str.1475-1479.

Istniało zapotrzebowanie na nowe farmaceutyki odpowiednie do profilaktyki lub hamowania reakcji zapalnych, oraz wykazujące minimalne działania uboczne, a ponadto umożliwiające terapię długoterminową.

Wynalazek dotyczy zastosowania peptydów lub białek o ogólnym wzorze

H O

R1 I II > N-C-C-Z₁-Arg-Z₃-Z₄-Z₅

R2 I

H w którym R1 i R2 są takie same lub różne i oznaczają atom wodoru, nasyconą lub nienasyconą grupę węglowodorową zawierającą od 1 do 10, w szczególności do 3 atomów węgla, przy czym

a) Z5 oznacza ugrupowanie peptydu o następującej sekwencji aminokwasów (SEQ ID NO: 11):

Asp Lys Lys Arg Glu Glu Ala Pro Ser Leu Arg Pro

Ala Pro Pro Pro Ile Ser Gly Gly Gly Tyr Arg

Z1 oznacza resztę histydyny,

Arg oznacza resztę argininy,

Z3 oznacza resztę proliny,

Z4 oznacza resztę leucyny, albo

b) Z5 oznacza ugrupowanie peptydu o następującej sekwencji aminokwasów (SEQ ID NO: 12):

Glu Arg His Gln Ser Ala Cys Lys Asp Ser Asp Trp

Pro Phe Cys Ser Asp Glu Asp Trp Asn Tyr Lys a

Z1 oznacza resztę proliny,

Arg oznacza resztę argininy,

Z3 oznacza resztę waliny,

Z4 oznacza resztę waliny, oraz ich soli, a także amidów, albo mieszanin wzajemnych i/lub mieszanin z co najmniej jedną dodatkową substancją, do wytwarzania leku do terapii lub profilaktyki miejscowych i/lub uogólnionych stanów zapalnych w organizmie, na podłożu zakaźnym, na podłożu reakcji autoimmunologicznej, na podłożu choroby reumatycznej, na podłożu zaburzenia układu odpornościowego bądź na podłożu choroby genetycznej, do profilaktyki i/lub terapii odrzucenia przeszczepów narządów, stwardnienia

PL 209 752 B1 tętnic, uszkodzenia reperfuzyjnego na podłożu stwardnienia tętnic i/lub chorób zakrzepowych oraz zwiększonego odkładania fibryny.

Nieoczekiwane jest to, że określona sekwencja aminokwasów zapobiega adhezji komórek znajdujących się w prądzie krwi do komórek śródbłonka ściany naczynia i/lub zachodzącej następnie ich transmigracji z krwi do tkanki.

Ponadto nieoczekiwane jest to, że części sekwencji, peptydów lub fragmentów fibrynogenu wykazują działanie przeciwzapalne. Bez wiązania się takimi rozważaniami teoretycznymi działania te mogą być oparte na tym, że fibryna wiąże się z komórkami śródbłonka poprzez neo-N-koniec łańcucha Ββ oraz z komórkami w prądzie krwi poprzez sekwencję łańcucha Aa, co prowadzi do adhezji i transmigracji komórek do tkanek. Ubocznym skutkiem tego rodzaju wiązania jest hamowanie powstawania fibryny. Takie hamowanie powstawania fibryny nie stanowi jednak potencjalnego zagrożenia dla pacjenta, gdyż nawet w nieobecności fibryny krzepnięcie krwi przy małych zranieniach jest wystarczające. Jedynie w przypadku zabiegów chirurgicznych dogodne mogłoby być ewentualnie wstrzymanie tego rodzaju terapii. Inne działania uboczne można zasadniczo wykluczyć, gdyż tego rodzaju substancje oddziałują jedynie z naturalnymi ligandami. Co więcej, naturalne procesy obronne nie ulegają zakłóceniu ze strony leukocytów krwi. Tak więc ich skład, np. granulocytów, limfocytów i monocytów pozostaje niezmieniony, co wiąże się z podtrzymaniem naturalnych procesów obronnych, a ochrona przed zakażeniami we krwi pozostaje niezmieniona.

Fibrynogen jest wytwarzany w wątrobie i w tej postaci pozostaje biologicznie nieaktywny i występuje zazwyczaj we krwi w stężeniu około 3 g/litr. W wyniku proteolitycznego rozszczepienia proenzymu protrombiny powstaje trombina, która odszczepia z fibrynogenu fibrynopeptydy A i B. W ten sposób fibrynogen ulega przemianie w postać biologicznie aktywną. Powstaje fibryna i produkty rozszczepienia fibryny.

Trombina powstaje w wyniku aktywacji każdego procesu krzepnięcia krwi, czyli wskutek każdego uszkodzenia tkanek na podłożu zapalnym, urazowym lub zwyrodnieniowym. Powstawanie fibryny pośredniczone przez trombinę jest zasadniczo procesem ochronnym mającym na celu zasklepienie wszelkich defektów wywołanych w układzie naczyniowym. Jednakże powstawanie fibryny jest również procesem patologicznym. Pojawienie się zatoru fibrynowego jako przyczyna wywołująca zawał serca stanowi jeden z najważniejszych problemów w medycynie.

Rola, jaką ogrywa fibryna w wynaczynianiu komórek zapalnych z prądu krwi do tkanek, będącym z jednej strony pożądanym procesem związanym z ochroną przed patogennymi drobnoustrojami lub komórkami nowotworowymi obecnymi w tkance, ale z drugiej strony procesem wywołującym lub przedłużającym uszkodzenia tkanek, dotychczas nie została zbadana wcale lub w wystarczającym stopniu. Fibryna wiąże się z komórkami śródbłonka poprzez neo-N-koniec łańcucha Be poprzez sekwencję Be, oraz z komórkami w prądzie krwi poprzez sekwencję Aa, co prowadzi do adhezji i transmigracji komórek do tkanek.

W niniejszym opisie aminokwasy peptydów są określane za pomocą powszechnie stosowanych skrótów, dotyczących a-aminokwasów.

Peptydy lub białka stosowane zgodnie z wynalazkiem mogą zapobiegać adhezji komórek z prądu krwi do komórek śródbłonka ściany naczynia i/lub zachodzącej następnie ich transmigracji z krwi do tkanki.

Peptyd lub białko stosowane zgodnie z wynalazkiem, w których Z5 oznacza ugrupowanie peptydu o następującej sekwencji aminokwasów (SEQ ID NO: 11):

Asp Lys Lys Arg Glu Glu Ala Pro Ser Leu Arg Pro Ala

Pro Pro Pro Ile Ser Gly Gly Gly Tyr Arg a Z1 oznacza resztę histydyny,

Arg oznacza resztę argininy,

Z3 oznacza resztę proliny,

Z4 oznacza resztę leucyny, zapobiega odkładaniu się lub przywieraniu fragmentów fibryny do ściany naczynia. Tak więc niemożliwe staje się zatrzymywanie komórek zapalnych na komórkach śródbłonka ścian naczyniowych tętnic i żył, co zapobiega zatrzymywaniu tych komórek na ścianach naczyń, a tym samym zapobiega następnie infiltracji tkanek.

Peptyd lub białko stosowane zgodnie z wynalazkiem, w którym Z5 oznacza ugrupowanie peptydu o następującej sekwencji aminokwasów (SEQ ID NO: 12):

PL 209 752 B1

Glu Arg His Gln Ser Ala Cys Lys Asp Ser Asp Trp Pro

Phe Cys Ser Asp Glu Asp Trp Asn Tyr Lys a Z1 oznacza resztę proliny,

Arg oznacza resztę argininy,

Z3 oznacza resztę waliny,

Z4 oznacza resztę waliny, zapobiega przywieraniu komórek krwi obwodowej do fibryny lub fragmentów fibryny, a tym samym uniemożliwia ich migrację do tkanek.

Opisane produkty rozszczepienia są również znane w literaturze jako peptyd Be i peptyd Aa. Wyżej wspomniany szlak sprzyjający adhezji i migracji stanowi całkowicie nowy system kontroli migracji komórek z krwi do tkanek. Tego rodzaju działanie fibryny może zostać zablokowane przez peptyd Be i peptyd Aa.

Tak więc peptydy stosowane zgodnie z wynalazkiem są odpowiednimi środkami terapeutycznymi dla ludzi i zwierząt do blokowania migracji komórek z krwi do tkanek. Ponieważ fibryna i inne produkty fibrynogenu powstające w wyniku proteolitycznego rozszczepienia, takie jak np. fibrynogen rozszczepiony przez aktywator urokinazy-plazminogenu, powstają tylko w sposób specyficzny i regionalnie ograniczony, to znaczy w miejscach ze stanem zapalnym, zaburzonym krzepnięciem, stwardnieniem tętnic, zakrzepicą i/lub wzrostem nowotworu, wpływ tego środka terapeutycznego jest ograniczony lokalnie, co oznacza, że nie należy oczekiwać występowania działań ubocznych w innych miejscach, bądź wystąpią one w ograniczonym zakresie.

Do korzystnych i całkowicie nieoczekiwanych dziedzin zastosowania opisanych peptydów i/lub białek należy wytwarzanie leków do terapii lub profilaktyki miejscowych i/lub uogólnionych stanów zapalnych w organizmie, na podłożu zakaźnym, na podłożu reakcji autoimmunologicznej, na podłożu choroby reumatycznej, na podłożu zaburzenia układu odpornościowego bądź na podłożu choroby genetycznej; do profilaktyki i/lub terapii odrzucenia przeszczepów narządów, stwardnienia tętnic, uszkodzenia reperfuzyjnego, na podłożu stwardnienia tętnic i/lub chorób zakrzepowych oraz zwiększonego odkładania fibryny. Taki peptyd, zwłaszcza Be, doskonale nadaje się również do wytwarzania leku umożliwiającego transport dodatkowego leku do ludzkich lub zwierzęcych komórek śródbłonka. W tym celu lek, który ma być transportowany, sprzęga się na jednym z końców z peptydem, a następnie poprzez VE-kadhedrynę odkłada się na wolnym miejscu na powierzchni ściany naczynia, np. na komórce śródbłonka.

Zastosowanie opisanych substancji do wytwarzania leku ma szczególne znaczenie w przypadku stanów opisanych poniżej.

Użyteczny jest lek do leczenia chorób wywołanych przez uszkadzające działanie autoreaktywnych limfocytów.

Do chorób związanych z reakcjami autoimmunologicznymi należą kolagenozy, choroby reumatyczne, łuszczyca oraz choroby post/parazakaźne i choroby powodowane przez reakcję przeszczepu przeciwko gospodarzowi. Działanie lecznicze występuje gdy ten lek blokuje migrację limfocytów do tkanek. Tak więc limfocyty pozostają w prądzie krwi i są niezdolne do wywoływania autoreaktywnych uszkodzeń tkanek.

Działanie lecznicze pod wpływem leku występuje w terapii i/lub profilaktyce odrzucenia przeszczepów, gdyż wspomniany lek zapobiega migracji limfocytów z krwi do przeszczepu, a tym samym obcy narząd nie może ulec uszkodzeniu przez limfocyty autoreaktywne.

Działanie lecznicze pod wpływem leku występuje w terapii i/lub zapobieganiu stwardnieniu tętnic po przeszczepie narządów, gdyż ten lek zapobiega migracji limfocytów i monocytów do ściany naczynia, a więc zapobiega aktywacji komórek ściany naczynia. W ten sposób ogranicza się do minimum lub zapobiega występowaniu stwardnienia tętnic po przeszczepie.

Działanie lecznicze pod wpływem leku występuje w terapii i/lub profilaktyce uszkodzeń reperfuzyjnych wynikających z chirurgicznego lub farmaceutycznego przywrócenia przepływu krwi, np. po zawale serca, udarze mózgowym, chirurgii naczyniowej, po wykonaniu przepływu omijającego oraz przeszczepach narządów, gdyż wspomniany lek hamuje migrację limfocytów i monocytów do ściany naczynia. Uszkodzenie reperfuzyjne jest spowodowane niedotlenieniem/kwasicą występującymi w komórkach naczyń podczas przywrócenia przepływu krwi, co prowadzi do ich uaktywnienia. W wyniku tego limfocyty i monocyty przywierają do ściany naczynia i wnikają do niej. Zapobieganie adhezji i migracji limfocytów i monocytów do ściany naczynia powoduje zmniejszenie uszkodzeń spoPL 209 752 B1 wodowanych niedotlenieniem/kwasicą, bez jakiegokolwiek trwałego uszkodzenia naczynia spowodowanego przez wywołaną następnie reakcję zapalną.

Działanie lecznicze pod wpływem leku występuje w terapii i/lub profilaktyce stwardnienia tętnic po chorobach metabolicznych i w procesach starzenia się, gdyż wspomniany lek hamuje migrację limfocytów i monocytów do ściany naczynia, a tym samym hamuje rozwój pojawiającej się w wyniku tego płytki miażdżycowej.

Lek opisany powyżej może być również stosowany do transportowania innego leku. Ten opisany lek wiąże w sposób specyficzny cząsteczki powierzchniowe z komórkami śródbłonka. Zatem sprzęgnięty z nim lek może w wysokim stężeniu kontaktować się w komórkami śródbłonka, bez wywoływania reakcji ubocznych w innych miejscach. Jako przykład można podać zastosowanie substancji hamujących podział komórkowy, które to substancje mogą mieć działanie przeciwangiogenne po utworzeniu specyficznych adduktów z komórkami śródbłonka. W tym przypadku pacjenci onkologiczni mogą doświadczać poprawy, gdyż wzrost nowotworu zostanie zablokowany przez zapobieganie proliferacji komórek śródbłonka, a tym samym uniknięcie neoangiogenezy.

Wynalazek ilustrują poniższe przykłady.

P r z y k ł a d 1

Wytwarzanie produktów rozszczepienia fibrynogenu

Niepolimeryzujące produkty degradacji fibrynogenu otrzymano w wyniku rozpadu pod wpływem bromku cyjanogenu według Blomback i in. (Nature 1968, 218:130-134). W wyniku tej reakcji fibrynogen ulega degradacji głównie do fragmentu 63 kDa, czyli N-końcowego węzła disulfidowego, NDSK, oraz zawiera łańcuch Aa 1-51, łańcuch Be 1-118 i łańcuch γ 1-78. W celu otrzymania NDSK-II (NDSK bez fibrynopeptydów A i B), N-końcowe aminokwasy łańcuchów Aa i Be. odszczepiono za pomocą trombiny (20 jednostek/1 μg NDSK) w ciągu trzech godzin w temperaturze pokojowej, a następnie poddano działaniu fluorofosforanu diizopropylu w celu zablokowania aktywności trombiny. Tak otrzymany NDSK-II zawierał łańcuch Aa 17-51, łańcuch Be 15-118 i łańcuch γ 1-78.

W celu otrzymania NDSK-uPA, 500 μg NDSK poddawano działaniu 200 jednostek aktywatora urokinazy-plazminogenu (uPA) z Messrs. Technoclone, Wiedeń, Austria przez 1 godzinę w 37°C. Reakcję przerwano dodawszy 5 mM fluorku fenylometylosulfonylu. Tak otrzymany NDSK-uPA stanowił NDSK i był pozbawiony fibrynopeptydu B.

Jako kontrolę negatywną otrzymano drugą frakcję produktów rozszczepienia fibrynogenu, określoną jako FCB-2 według Nieuwenhuizen i in., (Biochem Biophys Acta 1983, 755:531-533), przy czym produkty rozszczepienia otrzymano przez podziałanie bromkiem cyjanogenu. FCB-2 stanowi białko o wielkości 43 kDa i zawiera łańcuch Aa 148-208, łańcuch Be 191-305 i łańcuch γ 95-265. W celach kontrolnych do tego białka dodano trombiny i fluorofosforanu diizopropylu. Nie prowadziło to do jakichkolwiek zmian w białku (oznaczanym jako FCB-2-thr).

Dla kolejnej kontroli negatywnej, pożywkę (RPMI z Messrs. Life techn. Inc., Paisky, UK) poddano działaniu trombiny, jak wyżej, a następnie inaktywowano (RPMI-thr), albo poddano działaniu uPA jak wyżej i inaktywowano (RPMI-uPA).

P r z y k ł a d 2

Peptyd Aa (SEQ ID NO: 12) odpowiada aminokwasom 1-28 łańcucha a fibryny i jest identyczny z aminokwasami 17-45 łańcucha Aa fibrynogenu:

Gly Pro Arg Val Val Glu Arg His Gln Ser Ala Cys Lys Asp Ser Asp Trp Pro Phe Cys Ser Asp Glu Asp Trp Asn Tyr Lys

Peptyd Be (SEQ ID NO: 11) odpowiada aminokwasom 1-28 łańcucha e fibryny i jest identyczny z aminokwasami 15-43 łańcucha Be fibrynogenu, o następującej sekwencji:

Gly His Arg Pro Leu Asp Lys Lys Arg Glu Glu Ala Pro Ser Leu Arg Pro Ala Pro Pro Pro Ile Ser Gly Gly Gly Tyr Arg

Oba peptydy zsyntetyzowano metodą syntezy peptydów w fazie stałej według Merrifield R.B., J. Amer. Chem. Soc. 1963:85, 2149-2154, w syntetyzatorze peptydów, przy użyciu strategii z zabezpieczającą grupą fluorenylometyloksykarbonylową (FMOC) według Carpino L.A. i Han G.Y., J. Amer. Chem. Soc. 1981; 37: 3404-3409. Surowe peptydy oczyszczono metodą preparatywnej HPLC w odwróconym układzie faz w kolumnie Nucleosil 100-10, C18, według Engelhart H. i M^ler H., Chromatography 1984 19:77, oraz według Henschen A., Hupe K.P. i Lottspeich F., High Performance Liguid

PL 209 752 B1

Chromatography VCH 1985. Jako peptydy kontrolne stosowano peptydy o tej samej długości ale zawierające przypadkową sekwencję aminokwasów.

P r z y k ł a d 3

Model myszy HU-SCID

Ludzką skórę przeszczepiono na plecy myszy SCID, a po upływie 2 tygodni wstrzyknięto ludzkie limfocyty dootrzewnowe. Dalej postępowano zgodnie z procedurą Petzelbauer'a i in. (J. Invest. Dermatol. 1996, 107:576-581). Następnie piętnastu myszom przygotowanym w ten sposób wstrzyknięto do żył ogonowych następujące związki:

a) 100 Liq ludzkiego NDSK-II

b) 100 Lig ludzkiego FCB-2

c) 100 ug peptydu Aa

d) 100 ug peptydu Ββ

e) 100 ug randomizowanego Aa

f) 100 ug randomizowanego Be

Po upływie 24 godzin ludzką skórę usunięto i oceniono liczbę miejsc zapalnych, wyrażoną jako liczba komórek na 0,3 mm², jako wartość średnią z odchyleniem standardowym.

dla a: 22 ± 2,8 dla b: 9 ± 2,1 dla c: 4 ± 1,1 dla d: 6 ± 1,1 dla e: 5 ± 1,2 dla f: 7 ± 1,3

Na podstawie tych wyników stwierdzono, że NDSK-II powoduje stan zapalny, a więc białko to zostało użyte jako substancja patogenna. Inne związki per se nie powodują żadnego znaczącego wzrostu liczby komórek zapalnych.

P r z y k ł a d p o r ó w n a w c z y 4

Piętnastu myszom z przykładu 3 wstrzyknięto do żył ogonowych:

100 ug ludzkiego NDSK-II i

100 ug randomizowanego peptydu Aa.

Dalej postępowano zgodnie z przykładem 3. Określono liczbę miejsc zapalnych na 0,3 mm² jako 23 ± 3,5.

P r z y k ł a d p o r ó w n a w c z y 5

Piętnastu myszom z przykładu 3 wstrzyknięto do żył ogonowych:

100 ug ludzkiego NDSK-II z przykładu 1 i

100 ug randomizowanego peptydu Be.

Dalej postępowano zgodnie z przykładem 3. Określono liczbę miejsc zapalnych na 0,3 mm²jako 24 ± 2.

P r z y k ł a d 6

Piętnastu myszom z przykładu 3 wstrzyknięto do żył ogonowych:

100 ug ludzkiego NDSK-II i

100 ug zsyntetyzowanego peptydu Aa.

Dalej postępowano zgodnie z przykładem 3. Określono liczbę miejsc zapalnych na 0,3 mm²jako 21 ± 2,2.

P r z y k ł a d 7

Piętnastu myszom z przykładu 3 wstrzyknięto do żył ogonowych:

100 ug ludzkiego NDSK-II i

100 ug zsyntetyzowanego peptydu Be.

Dalej postępowano zgodnie z przykładem 3. Określono liczbę miejsc zapalnych na 0,3 mm²jako 14 ± 2.

Przykłady 4-7 wykazują, że peptyd Be blokuje zapalenie wywołane przez limfocyty.

P r z y k ł a d p o r ó w n a w c z y 8

Komórki śródbłonka z ludzkich żył pępkowych (HUVEC) oznakowano czerwonym barwnikiem fluorescencyjnym (Cell Tracker Orange, 1 ul/ml. Molecular Probes, Eugene, OR) i rozprowadzano na matrycy kolagenowej (Collaborative Biomedical Products, Bedford, MA). Po osiągnięciu konfluencji przez komórki śródbłonka, naniesiono na nie komórki jednojądrzaste krwi obwodowej (PBMC)

PL 209 752 B1 (10⁵ komórek na 25 mm²) oznakowane zielonym barwnikiem fluorescencyjnym (Cell Tracker Green, 1 μ^^ Molecular Probes, Eugene, OR). Następnie komórki inkubowano w 37°C przez 12 godzin.

Przywierające komórki, które wniknęły do żelu sfotografowano pod laserowym mikroskopem skaningowym, obrazy przekształcono w piksele i zanalizowano z użyciem „NIH image według Grotger i in. (J. Immunol. Method 1999: 222: 101-109).

Określono liczbę przywartych komórek na 0,1 mm², wymienionej w rubryce „adhezja, oraz liczby migrujących komórek na 0,04 mm³, wymienionej w rubryce „migracja. Określano średnią wartość z trzech powtórzeń z trzech eksperymentów wraz z odchyleniem standardowym.

a) RPMI-uPA	0,1 μg/ml	adhezja 40 ± 4	migracja 4 ± 3
	1,0 μg/ml	38 ± 2	5 ± 2
	10,0 μg/ml	32 ± 4	5 ± 1
b) NDSK	0,1 μg/ml	31 ± 18	6 ± 3
	1,0 μg/ml	35 ± 18	5 ± 2
	10,0 μg/ml	36 ± 24	6 ± 3
c) NDSK-II	0,1 μg/ml	55 ± 21	12 ± 5
	1,0 μg/ml	67 ± 31	19 ± 12
	10,0 μg/ml	65 ± 31	19 ± 10
d) NDSK-uPA	0,1 μg/ml	58 ± 3	10 ± 2
	1,0 μg/ml	60 ± 3,5	14 ± 3
	10,0 μg/ml	65 ± 3	18 ± 1,5
e) FCB2	0,1 μg/ml	30 ± 26	6 ± 4
	1,0 μg/ml	10 ± 10	3 ± 2
	10,0 μg/ml	21 ± 7	5 ± 4
f) FCB-2-thr	0,1 μg/ml	20 ± 12	6 ± 5
	1,0 μg/ml	23 ± 13	7 ± 5
	10,0 μg/ml	26 ± 11	4 ± 2
g) RPMI-thr	0,1 μg/ml	29 ± 15	4 ± 5
	1,0 μg/ml	26 ± 14	5 ± 5
	10,0 μg/ml	41 ± 20	5 ± 4

Na podstawie tych wyników stwierdzono, że NDSK-II powoduje znaczącą migrację komórek jednojądrzastych krwi obwodowej (PBMC) w większym stopniu niż NDSK-uPA, a więc wykazuje działanie patogenne. Żadna z kontroli a), b), e), f) i g) nie wykazywała znaczącej migracji.

P r z y k ł a d 9

Do matrycy kolagenowej z przykładu 8, zawierającej zawiesinę PBMC dodano 100 μg NDSK-II oraz Be lub randomizowanego Be, a dalej postępowano zgodnie z przykładem 8.

a) bez NDSK-II	adhezja 38 ± 15	migracja 6 ± 4
b) tylko 100 μg NDSK-II	73 ± 29	16 ± 7
c) 10 μg Ββ + NDSK-II	63 ± 33	7 ± 4
d) 100 μg Ββ + NDSK-II	47 ± 34	5 ± 4
e) 1000 μg Ββ + NDSK-II	52 ± 27	10 ± 6
f) 10 μg randomizowanego Ββ + NDSK-II	77 ± 33	16 ± 6
g) 100 μg randomizowanego Ββ + NDSK-II	86 ± 35	15 ± 6
h) 1000 μg randomizowanego Ββ + NDSK-II	78 ± 31	13 ± 8

Jak widać z powyższych wyników badań, peptyd Be hamuje zapalenie.

P r z y k ł a d 10

Do matrycy kolagenowej z przykładu 8, zawierającej zawiesinę PBMC dodano 100 μg NDSK-II oraz Aa lub randomizowanego Aa, a dalej postępowano zgodnie z przykładem 8.

a) bez NDSK-II	adhezja 42 ± 6	migracja 10 ± 1
b) tylko 100 μg NDSK-II	96 ± 11	24 ± 3
c) 10 μg Aa + NDSK-II	69 ± 12	21 ± 4
d) 100 μg Aa + NDSK-II	37 ± 13	15 ± 6
e) 1000 μg Aa + NDSK-II	70 ± 6	13 ± 5
f) 10 μg randomizowanego Aa + NDSK-II	70 ± 6	25 ± 2

PL 209 752 B1

g) 100 μg randomizowanego Aa + NDSK-II 65 ± 16 24 ± 3

h) 1000 μg randomizowanego Aa + NDSK-II 70 ± 12 26 ± 3

Jak widać z powyższych wyników badań, peptyd Aa tylko częściowo blokuje migrację PBMC.

P r z y k ł a d 11

Z uwagi na to, że PBMC stanowi zasadniczo mieszaninę limfocytów i monocytów, w przykładzie 11 zamiast PBMC zastosowano czyste limfocyty.

Do matrycy kolagenowej według przykładu 8 zawierającej komórki śródbłonka i limfocyty doda-

no odpowiednio 100 μg NDSK-uPA lub 100 μg NDSK-II oraz Aa lub Be.
a) bez dodatków	adhezja 68 ± 8	migracja 16 ± 3
b) NDSK-uPA	143 ± 11	53 ± 5
c) NDSK-II	119 ± 11	43 ± 4
d) tylko 100 μg Be	58 ± 18	14 ± 1
e) NDSK-uPA + 100 μg Be	74 ± 8	19 ± 2
f) NDSK-II + 100 μg Be	74 ± 8	17 ± 3
g) tylko 100 μg Aa	77 ± 4	18 ± 1
h) NDSK-uPA + 100 μg Aa	131 ± 4	40 ± 3
i) NDSK-II + 100 μg Aa	131 ± 4	44 ± 4
j) tylko 100 μg randomizowanego Be	75 ± 5	19 ± 1
k) NDSK-uPA + 100 μg randomizowanego Be	134 ± 13	46 ± 4
l) NDSK-II + 100 μg randomizowanego Be	120 ± 12	42 ± 4

Powyższe wyniki badań wykazują, że:

1) zarówno NDSK-II, jak i NDSK-uPA sprzyjają zapaleniu limfocytarnemu,

2) peptyd Be całkowicie blokuje adhezję limfocytów i migrację indukowaną przez NDSK-II i NDSK-uPA, a peptyd Aa nie wykazuje właściwości blokujących, co wskazuje, że wolny łańcuch a nie jest potrzebny do wywoływania adhezji i migracji limfocytów.

P r z y k ł a d 12 Postępowano zgodnie z przykładem 11, z tym, że zamiast limfocytów zastosowano czyste mo-
nocyty. Do peptydu Aa, randomizowanego Aa, Be lub randomizowanego Be dodano odpowiednio
100 μg NDSK-uPA lub 100 μg NDSK-II.	adhezja	migracja
a) bez dodatków	43 ± 8	7 ± 1
b) NDSK-uPA	48 ± 10	10 ± 2
c) NDSK-II	90 ± 11	19 ± 6
d) 100 μg Be	59 ± 7	5 ± 1
e) NDSK-uPA + 100 μg Be	61 ± 11	8 ± 3
f) NDSK-II + 100 μg Be	70 ± 7	7 ± 5
g) 100 μg randomizowanego Be	40 ± 7	6 ± 1
h) NDSK-uPA + 100 μg randomizowanego Be	45 ± 5	8 ± 3
i) NDSK-II + 100 μq randomizowanego Be	92 ± 10	20 ± 7
j) tylko 100 μg Aa	59 ± 6	5 ± 1
k) NDSK-uPA + 100 μg Aa	62 ± 4	8 ± 5
l) NDSK-II + 100 μg Aa	68 ± 10	9 ± 6
m) 100 μg randomizowanego Aa	58 ± 7	6 ± 1
n) NDSK-uPA + 100 μg randomizowanego Aa	50 ± 10	10 ± 4
o) NDSK-II + 100 μg randomizowanego Aa	108 ± 8	21 ± 5

Wyniki tych badań wykazują, że tylko NDSK-II, a nie NDSK-uPA, sprzyja migracji monocytów, co oznacza, że zarówno łańcuch a, jak i łańcuch β muszą mieć wolny N-koniec, aby blokować migrację monocytów.

P r z y k ł a d 13

Postępowano zgodnie z przykładem 11, z tym, że użyto czystych limfocytów. Do soli krótkiego peptydu otrzymanej z octanu Aa Gly Pro Arg (Pro)-NH2 (pochodna Aa) lub otrzymanej z octanu Be Gly His Arg Pro-OH (pochodna Be) dodano odpowiednio 100 μg NDSK-uPA lub 100 μg NDSK-II.

PL 209 752 B1

a) bez dodatków	adhezja 60 ± 8	migracja 14 ± 1
b) NDSK-uPA	149 ± 12	57 ± 5
c) NDSK-II	121 ± 11	48 ± 7
d) tylko 100 μg pochodnej Be	58 ± 10	12 ± 9
e) NDSK-uPA + 100 μg pochodnej Be	70 ± 8	16 ± 3
f) NDSK-II + 100 μg pochodnej Be	69 ± 7	14 ± 5
g) tylko 100 μg randomizowanego Aa	77 ± 4	18 ± 1
h) NDSK-uPA + 100 μg randomizowanego Aa	134 ± 4	48 ± 5
i) NDSK-II + 100 μg randomizowanego Aa	131 ± 7	49 ± 6
j) tylko 100 μg randomizowanej pochodnej Be	70 ± 5	14 ± 7
k) NDSK-uPA + 100 μg randomizowanej pochodnej Be	130 ± 12	49 ± 6
l) NDSK-II + 100 μg randomizowanej pochodnej Be	68 ± 10	55 ± 8

Na podstawie tego eksperymentu można wyciągnąć wniosek, że gdy dochodzi do zahamowania migracji limfocytów, krótkie peptydy dodawane w odpowiedni ciągły sposób mają taką samą ak-

tywność jak długie peptydy.
P r z y k ł a d 14 Postępowano zgodnie z przykładem 12, z tym że użyto czystych monocytów. Do soli krótkiego
peptydu otrzymanej z octanu Aa Gly Pro Arg (Pro)-NH2 (pochodna Aa) lub otrzymanej z octanu Be
Gly His Arg Pro-OH (pochodna Be) dodano odpowiednio 100 μg NDSK-uPA lub 100 μg NDSK-II.
a) bez dodatków	adhezja 40 ± 8	migracja 5 ± 1
b) NDSK-uPA	54 ± 9	7 ± 2
c) NDSK-II	85 ± 11	22 ± 6
d) tylko 100 μg pochodnej Be	52 ± 7	6 ± 1
e) NDSK-uPA + 100 μg pochodnej Be	61 ± 11	8 ± 3
f) NDSK-II + 100 μg pochodnej Be	68 ± 7	8 ± 4
g) tylko 100μg randomizowanej pochodnej Be	40 ± 7	6 ± 1
h) NDSK-uPA + 100 μg randomizowanej pochodnej Be	44 ± 6	8 ± 2
i) NDSK-II + 100 μq randomizowanej pochodnej Be	92 ± 10	23 ± 7
j) tylko 100 μg pochodnej Aa	50 ± 5	4 ± 4
k) NDSK-uPA + 100 μg pochodnej Aa	60 ± 5	7 ± 6
l) NDSK-II + 100 μg pochodnej Aa	64 ± 11	8 ± 2
m) 100 μg randomizowanej pochodnej Aa	54 ± 10	6 ± 3
n) NDSK-II + 100 μg randomizowanej pochodnej Aa	50 ± 10	10 ± 4
o) NDSK-II + 100 μg randomizowanej pochodnej Aa	99 ± 8	21 ± 7

Na podstawie tego eksperymentu można wyciągnąć wniosek, że gdy migracja monocytów ulega zahamowaniu, krótkie peptydy dodane w odpowiedni ciągły sposób mają taką samą aktywność jak długie peptydy.

P r z y k ł a d 15

Badania przeprowadzono na samcach szczurów wistar o masie 220 - 280 g. Szczurom podano zwykłą karmę i wodę. W celu przeprowadzenia badań szczury znieczulono i sztucznie respirowano z czę stością 70 pulsów na minutę , przepuszczają c na kilogram masy ciał a 8 - 10 ml gazu zawierają cego 30% obj. tlenu, pod nadciśnieniem 1 - 2 mm słupa rtęci. W tętnicy serca po prawej stronie umieszczono kaniulę pomiarową i mierzono ciśnienie krwi i uderzenia serca. Ciśnienie określano jako iloczyn ciśnienia krwi w tętnicy i częstości uderzeń serca, w jednostkach mm słupa rtęci/minutę/10³. W żyle po prawej stronie umieszczono kaniulę pomiarową do podawania badanych substancji. Po przeprowadzeniu zabiegu chirurgicznego, do serca wprowadzono 2 ml krwi. W trzydzieści minut później zamknięto tętnicę po prawej stronie. Po kolejnych 25 minutach zamknięcie zwolniono w celu ponownego dostarczenia krwi do niedotlenionego obszaru. W tym punkcie czasowym połowie zwierząt podano dożylnie 800 μg peptydu Ββ lub randomizowanego peptydu Ββ i pozostawiono na dwie godziny.

W celu rozróżnienia uszkodzonej i nieuszkodzonej tkanki serca, tętnicę serca po lewej stronie napełniono błękitem Evansa w stężeniu 2%. Następnie usunięte serce rozcięto pięcioma poziomymi cięciami, prawą ścianę żyły usunięto, a preparaty poddawano działaniu chlorku trifenylotetratolu

PL 209 752 B1 (1% wagowy) przez 20 minut w 37°C w celu rozróżnienia pomiędzy tkanką normalną z tkanką niedotlenioną. Preparaty oceniano metodą planimetrii wspomaganej komputerowo.

Z powodu zamknię cia naczynia, zagroż one był o 62,5% mięśnia sercowego u szczurów kontrolnych, w porównaniu z 60% mięśnia sercowego u szczurów poddanych badaniom. W sercach szczurów kontrolnych, 46% zagrożonego mięśnia sercowego było martwe w porównaniu z 29% mięśnia sercowego u szczurów poddanych badaniom. Odpowiada to zmniejszeniu tkanki martwej o 37% (p < 0,05).

Wykaz sekwencji <110> FIBREX Medical Research & Development GmbH Petzelbauer, Peter <120> Zastosowanie peptydów lub białek do wytwarzania leku do leczenia chorób zapalnych o podł oż u zakaź nym <130> 2760 PCT <140> PCT/AT 01/00387 <141> 2001-12-07 <150> AT A 2063/2000 <151> 2000-12-12 <160> 2 <170> Patentin wersja 3.1 <210> 11 <211> 25 <212> BRT <213> Sekwencja sztuczna;

<220>

<221> Źródło <223> /uwaga = „odpowiada aminokwasom 6-28 sekwencji łańcucha Ββ fibryny <400> 1

Asp Lys Lys Arg Glu Glu Ala Pro Ser Leu Arg

Pro Ala Pro Pro Pro Ile Ser Gly Gly Gly Tyr Arg <210> 12 <211> 25 <212> PRT <213> Sekwencja sztuczna;

<220>

<221> Źródło <223> /uwaga = „odpowiada aminokwasom 6-28 sekwencji łańcucha Aa fibryny <400> 2

Glu Arg His Gln Ser Ala Cys Lys Asp Ser Asp Trp Pro Phe Cys Ser Asp Glu Asp Trp Asn Tyr Lys

PL 209 752 B1

Claims

Zastosowanie peptydów lub białek o ogólnym wzorze

H O R1 I II > N-C-C-Z₁-Arg-Z₃-Z₄-Z₅R2 I

H w którym R1 i R2 są takie same lub różne i oznaczają atom wodoru, nasyconą lub nienasyconą grupę węglowodorową zawierającą od 1 do 10, w szczególności do 3 atomów węgla, przy czym

a) Z5 oznacza ugrupowanie peptydu o następującej sekwencji aminokwasów (SEQ ID NO: 11): Asp Lys Lys Arg Glu Glu Ala Pro Ser Leu Arg Pro

Ala Pro Pro Pro Ile Ser Gly Gly Gly Tyr Arg a

Z1 oznacza resztę histydyny,

Arg oznacza resztę argininy,

Z3 oznacza resztę proliny,

Z4 oznacza resztę leucyny, albo

b) Z5 oznacza ugrupowanie peptydu o następującej sekwencji aminokwasów (SEQ ID NO: 12): Glu Arg His Gln Ser Ala Cys Lys Asp Ser Asp Trp

Pro Phe Cys Ser Asp Glu Asp Trp Asn Tyr Lys a

Z1 oznacza resztę proliny,

Arg oznacza resztę argininy,

Z3 oznacza resztę waliny,

Z4 oznacza resztę waliny, oraz ich soli, a także amidów, albo mieszanin wzajemnych i/lub mieszanin z co najmniej jedną dodatkową substancją, do wytwarzania leku do terapii lub profilaktyki miejscowych i/lub uogólnionych stanów zapalnych w organizmie, na podłożu zakaźnym, na podłożu reakcji autoimmunologicznej, na podłożu choroby reumatycznej, na podłożu zaburzenia układu odpornościowego bądź na podłożu choroby genetycznej, do profilaktyki i/lub terapii odrzucenia przeszczepów narządów, stwardnienia tętnic, uszkodzenia reperfuzyjnego na podłożu stwardnienia tętnic i/lub chorób zakrzepowych oraz zwiększonego odkładania fibryny.