ES2331958T3 - Uso de peptidos derivados de la cadena b beta de fibrinogeno humano para el tratamiento del choque. - Google Patents
Uso de peptidos derivados de la cadena b beta de fibrinogeno humano para el tratamiento del choque. Download PDFInfo
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Abstract
Uso de un péptido con la fórmula general II ** ver fórmula** en donde R 1 y R 2, iguales o diferentes, representan hidrógeno, un grupo hidrocarburo saturado o insaturado de 1 a 10, especialmente de 1 a 3 átomos de carbono, Z1 representa un residuo de histidina, Arg representa un residuo de arginina, Z3 representa un residuo de prolina o valina, Z 4 representa un residuo de leucina o valina, Z5 es un residuo peptídico derivado de la cadena Bbeta de la fibrina, péptido que posee la propiedad biológica de ajustarse al motivo de unión de la VE-cadherina inducible en la cadena BBeta (es decir, BBeta 15-42) de la fibrina humana, para la producción de un composición farmacéutica para el tratamiento de choque.
Description
Uso de péptidos derivados de la cadena B\beta
de fibrinógeno humano para el tratamiento del choque.
La presente invención se refiere a una
composición farmacéutica para el tratamiento del choque.
Un choque es una complicación aguda de muchos
estados patológicos diferentes, que se caracteriza por la
incapacidad del sistema cardiovascular de mantener una presión de
perfusión suficiente. Los agentes infecciosos pueden causar de
forma directa o indirecta una insuficiencia del sistema
cardiovascular. Bacterias, toxinas bacterianas, virus y no en
último lugar una reacción celular o humoral insuficiente del
huésped, acompañados de inflamación y coagulación, pueden producir
una pérdida del tono vascular, una pérdida de la función barrera
vascular, una pérdida de la potencia de contracción del miocardio y
una pérdida de la función de órganos, lo que solo o en combinación
puede producir choque y por último la muerte del paciente. El
tratamiento de una infección bacteriana se basa en un tratamiento
antibiótico que mata las bacterias, sin embargo no trata la toxemia
ni corrige la reacción celular o humoral insuficiente. En las
bacterias gram negativas el lipopolisacárido (LPS o endotoxina) es
responsable de la activación de un choque gram negativo. Las
bacterias gram positivas pueden causar una insuficiencia múltiple
de órganos y choque séptico sin endotoxemia, la pared celular de las
bacterias gram positivas contiene asimismo toxinas como el ácido
lipotecoico (LTA) y peptidoglicano (PepG). LTA y PepG actúan en
sinergia para liberar citoquinas, como por ejemplo, el factor de
necrosis tumoral (TNF)\alpha e interferón
(IFN)\gamma, y para inducir iNOS por último producir choque
e insuficiencia de órganos.
La endotoxemia, septicemia y choque séptico
están relacionados con la generación de grandes cantidades de óxido
nítrico (NO). La vasodilatación excesiva y la hiporreactividad
vascular frente a agentes hipertensores, que van acompañados de un
choque circulatorio, se pueden anular con inhibidores de la isoforma
inducible de NO-sintasa (iNOS) (Southan y Szabo,
Biochem Pharmacol. 1996; 51:383-94, Thiemermann Gen
Pharmacol 1997; 29:159-66); sin embargo, los
inhibidores de la iNOS no reducen el daño en órganos producido por
las toxinas (Wray et al. Shock 1998;
9:329-335).
El tratamiento del choque causado por una
infección vírica es un reto aún mayor, ya que para la mayoría de
las infecciones no hay agentes antivirales disponibles. Los
tratamientos que solo pretenden la eliminación del agente
infeccioso, no son suficientes para los pacientes con choque debido
a un agente infeccioso, puesto que los procesos secundarios
producidos por el agente infeccioso, que están acompañados por una
reacción de inflamación y cambios en el sistema de coagulación,
posiblemente sean independientes y produzcan la muerte del
paciente, a pesar de la cuestión de si el agente infeccioso causal
se neutraliza o no. No hay un tratamiento específico disponible y
por lo tanto los procedimientos actuales tienen como fin aliviar los
síntomas, lo que incluye ventilación mecánica, reemplazo de
líquidos, el uso de medicamentos cardioactivos, el control riguroso
de la saturación de oxígeno, la hemoglobina, la glucosa y la función
renal. El control exclusivo de la reacción de inflamación, por
ejemplo mediante altas dosis de esteroides, o la inhibición de la
coagulación con antitrombina no produce mejora de la tasa de
supervivencia. La única molécula que hasta ahora ha mostrado que
posee una notable eficacia respecto a la disminución de la
mortalidad es la "proteína C activada", que interacciona con
la coagulación/fibrinólisis y los procesos de inflamación.
Un choque durante el curso de una infección está
relacionado en la mayoría de los casos con cambios aparentes o no
aparentes en el fibrinógeno plasmático, acompañado de la formación
de fibrina y un aumento de los fragmentos de fibrina. Esta
activación de la coagulación y vías fibrinolíticas puede producir
una coagulación intravascular diseminada (DIC) evidente o no
evidente, que tiene como consecuencia el cierre de los vasos y daño
a órganos, y un uso de los factores de coagulación que tiene como
consecuencia hemorragias. La causa más frecuente de una DIC es una
septicemia. Es importante que fibrinógeno, fibrina y fragmentos de
fibrina no solo desempeñan un papel en la coagulación de la sangre,
sino que muestran varios sitios de unión para células y proteínas
de matriz, lo que facilita su interacción con glóbulos blancos,
plaquetas, células endoteliales y estructuras de la matriz. Esto
produce activación celular, migración celular, liberación de
citoquinas y por último una reacción de inflamación. El papel
desempeñado por el fibrinógeno o la fibrina en la inflamación, está
ampliamente documentado (tratado por Altieri Thromb Haemost
82:781-786; Herrick et al. Int J Biochem Cell
Biol 31:741-46). La región D de la molécula
contiene numerosos sitios de unión para moléculas de la matriz,
células endoteliales, plaquetas y células inflamatorias. La región
E de la fibrina se une a CD11c (Loike et al. Proc Natl Acad
Sci USA 88:1044-48).
Recientemente se ha descrito un nuevo papel para
la secuencia Bbeta_{15-42} de la fibrina en la
inflamación (WO 02/48180). Esta secuencia también está localizada
en la región E de la fibrina y solo se activa cuando se procesa
fibrinopéptido. Los fragmentos de fibrina, que contienen esta
secuencia en el extremo N-terminal libre de la
cadena beta, se unen al endotelio y causan una inflamación, y un
péptido que se ajusta a los aminoácidos 15-42 de la
cadena Bbeta de la fibrina, bloquea la unión de fragmentos de
fibrina a la superficie del endotelio y bloquea la inflamación
in vitro (WO 02/48180). In vivo este péptido impide
una inflamación del miocardio y disminuye la extensión de un
infarto de miocardio en situaciones de isquemia/reperfusión (WO
02/48180).
Los fragmentos de fibrina aparecen en cualquier
situación con formación de fibrina dañada y fibrinólisis dañada.
Especialmente en situaciones de choque debido a un agente infeccioso
esta formación de fibrina alterada y esta fibrinólisis alterada
representan un gran problema. En muchas enfermedades se ha
documentado una reciprocidad directa entre el resultado y el
deterioro de la formación de fibrina/fibrinólisis. Por ejemplo el
dengue (van Gorp et al. J Med Virol 2002,
67:549-54, Mairuhu et al. Lancet Inf Dis
2003; 3:33-41). En el documento WO 99/02565 se
divulga el uso de un ligando de fibrinógeno y/o fibrina para la
producción de un agente para el tratamiento y/o profilaxis de
trastornos de microcirculación y/o para la influencia en la reología
de un mamífero. El síndrome de dificultad respiratoria en adultos
(ARDS) es una forma de lesión pulmonar aguda que se caracteriza
mediante un almacenamiento extravascular rojizo de fibrina (Idell Am
J Respir Med. 2002; 1:383-91). También se observa
trombosis en los vasos pulmonares y coagulación intravascular
diseminada en relación con ARDS.
Las razones para la persistencia/aparición
mundial de fiebre del dengue (DF) y fiebre hemorrágica del dengue
(DHF) como gran problema de la sanidad pública son complejas, las
medidas de control de los vectores no tuvieron éxito en eliminar
DF/DHF. Actualmente, el punto principal de los medios de
financiación en el sector público para la investigación del dengue
(en el año 2001 se estimó en 15 millones de dólares) está en la
epidemiología molecular, la inmunopatofisiología, la investigación
para el descubrimiento de vacunas de segunda generación y en
enfoques nuevos o mejorados para el control de los vectores.
La mayoría de las vacunas candidatas se
encuentran en los Estados Unidos y en Tailandia en fase experimental
clínica, sin embargo en el mercado no hay todavía fármacos para el
tratamiento de los pacientes infectados y, lo que es aún peor,
actualmente no parece estar en marcha ningún tipo de actividad
comercial para la investigación y el desarrollo de una
quimioterapia. La Organización Mundial de la Salud publicó
directrices estratégicas para la lucha de DF/DHF que, como metas de
mayor prioridad, comprenden el desarrollo de agente antivíricos,
dirigidos a proteasas u otras enzimas apenas estudiadas; el
desarrollo de antimediadores, que se dirigen a las causas de la
permeabilidad vascular aumentada o la hemostasia modificada.
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La invención se refiere al uso de un péptido con
la fórmula general II:
en
donde
R_{1} y R_{2}, iguales o diferentes,
representan hidrógeno, un grupo hidrocarburo saturado o insaturado
de 1 a 10, especialmente de 1 a 3 átomos de carbono,
Z_{1} representa un residuo de histidina,
Arg representa un residuo de arginina,
Z_{3} representa un residuo de prolina o
valina,
Z_{4} representa un residuo de leucina o
valina,
Z_{5} es un residuo peptídico derivado de la
cadena Bbeta de la fibrina,
péptido que posee la propiedad biológica de
ajustarse al motivo de unión de la VE-cadherina
inducible en la cadena B\beta (es decir,
B\beta_{15-42}) de la fibrina humana, para la
producción de una composición farmacéutica para el tratamiento de
choque.
Además se usa preferiblemente un péptido en el
que Z_{5} es un residuo peptídico con la secuencia de
aminoácidos
Z_{1} es un residuo de histidina,
Arg es un residuo de arginina,
Z_{3} es un residuo de prolina y
Z_{4} es un residuo de leucina.
La invención se refiere además al uso de un
péptido, que muestra la secuencia N-terminal
y que posee la propiedad biológica
de ajustarse al motivo de unión a VE-cadherina
inducible en la cadena B\beta (es decir,
B\beta_{15-42}) de la fibrina humana, para la
producción de un composición farmacéutica para el tratamiento de
choque.
Una forma de realización preferida adicional del
uso según la invención se caracteriza en que el péptido es
Se ha mostrado que con el péptido mencionado
anteriormente se pueden tratar especialmente estados de choque, en
donde el choque está relacionado con uno o varios del grupo que
comprende toxinas bacterianas, coagulapatía intravascular
diseminada, fascitis necrotizante, choque hemorrágico debido a una
infección vírica en particular producida por filovirus,
Arenaviridae, Bunyaviridae, flavivirus, dengue, insuficiencia
respiratoria hemorrágica aguda, producida por agentes infecciosos o
enfermedades autoinmunes, insuficiencia de órganos después de una
lesión de órganos, en particular por un infarto de miocardio, una
operación vascular, un pinzamiento de órganos, un choque
hemorrágico, infarto pulmonar, infarto hepático, infarto intestinal,
intervención quirúrgica y apoplejía y malfuncionamiento de un
órgano en órganos trasplantados.
\vskip1.000000\baselineskip
Los péptidos se produjeron mediante síntesis de
péptidos en fase sólida y se purificaron mediante HPLC de fase
reversa, en la que se utilizaron columnas Nucleosil
100-10C18 (PiChem, Graz, Austria). Se debe observar
que la región beta 15-42 es 100% idéntica entre
especies, cuando se permiten sustituciones conservadoras de
aminoácidos. El nudo disulfuro N-terminal de
fibrinógeno (NDSK) compuesto de los aminoácidos
A\alpha1-51, B\beta1-118 y
\gamma1-78 se produjo como se ha descrito
anteriormente (WO 02/48180). Se produjo el nudo disulfuro
N-terminal de fibrina (NDSK-II, en
el que faltan los fibrinopéptidos A y B) compuesto de los
aminoácidos A\alpha17-51,
B\beta15-118 y \gamma1-78,
tratando NDSK a 37ºC durante 3 horas con trombina (20 U/1 mg de
NDSK). El resto de la trombina se neutralizó a 37ºC durante 2 horas
con fluorofosfato de diisopropilo 10 mM (Fluka, Milwaukee, WI).
Todos los productos se dializaron después en una solución salina
tamponada con fosfato (PBS).
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La interacción de la cadena Bbeta
(Bbeta_{15-42}) de fibrina con células
endoteliales produce cambios morfológicos (Bunce et al. J
Clin Invest 89:842-50; Bach et al. Exp Cell
Res 238:324-34; Chalupowicz et al. J Cell
Biol 130:207-15; Hamaguchi et al. Blood
81:2348-56; Francis et al. Blood cells
19:291-306) proliferación (Sporn et al.
Blood 86:1802-10), liberación del factor de von
Willebrand (Ribes et al. J Clin Invest
79:117-23, Ribes et al. J Clin Invest 84:
435-42; Erban y Wagner, J Biol Chem 267,
2451-58) y posiblemente de IL-8 (Qi
et al. Blood 90:3593-3602) y expresión de
CD54 en la membrana (Harley et al. Art Thromb Vasc Biol
20:652-658). La VE-cadherina se
identificó como ligando de unión a la secuencia
Bbeta_{15-42} y se desarrollaron ELISA para
demostrar esta interacción de células endoteliales y/o
VE-cadherina con fibrina o fragmentos de fibrina.
Martínez y col. usaron anticuerpos
anti-pan-cadherina para la captura
de cadherina de células endoteliales, seguido por una incubación
con fibrina (Martínez et al. Ann NY Acad Sci
936:386-405), se recubrieron monocapas de HUVEC
(que expresan VE-cadherina) con fragmentos de
fibrina radiomarcados o péptido Bbeta_{15-42}
(Bach et al. J Biol Chem 273:30719-28;
Harley et al. Art Thromb Vasc Biol
20:652-658) y Gorlatov y Medved usaron
VE-cadherina recombinante de (Biochemistry
41:4107-16). Otros establecieron un ELISA para
detectar fragmentos de fibrina en sangre, para lo cual usaron
principalmente anticuerpos contra varias secuencias dentro de la
molécula de fibrinógeno, en particular anticuerpos contra el motivo
Bbeta_{15-42} (revisado por Fareed et al.
Clin Chem 8:1845-53).
Se desarrolló un ELISA modificado, que funciona
con los mismos principios descritos por otros; sin embargo, el fin
del ELISA descrito aquí no consiste en determinar de manera
cuantitativa los productos de degradación de la fibrina, sino
buscar proteínas, péptidos o compuestos que interfieran en la unión
de la secuencia Bbeta_{15-42} y la
VE-cadherina. El principio consiste en que la
VE-cadherina bien como proteína truncada, como
proteína completa o acoplada a otras proteínas que no interfieren
con el sitio de unión de Bbeta_{15-42}, puede
interaccionar con la secuencia Bbeta_{15-42} de
la fibrina. Se puede introducir cualquier otra sustancia adicional
en este sistema y medir si esta sustancia inhibe la unión
VE-cadherina/Bbeta_{15-42}.
En detalle, se recubrieron placas de 96 pocillos
para la inmovilización de proteínas (Exiqon, Vedbaek, DK) con
proteína de fusión VE-cadherina humana
recombinante-FC (8 nM; R&D Systems, Minneapolis)
en PBS y se dejaron reposar durante la noche a 4ºC. Las placas se
lavaron después y se incubaron con péptido
B\beta_{15-42} (GHRPLDKKREEAPSLRPAPPPISGGGYR),
que estaba marcado en el extremo C-terminal del
péptido con una secuencia FLAG (DYKDDDDK), o con un péptido
aleatorio marcado con FLAG (DRGAPAHRPPRGPISGRSTPEKEKLLPG), y a una
concentración de 0-80 \muM. Después del lavado se
detectó el péptido marcado con FLAG unido mediante incubación con un
anticuerpo anti-FLAG marcado con peroxidasa (Sigma,
San Luis, EE.UU.) y un sustrato cromógeno. Se determinó la densidad
óptica mediante un lector de placas de ELISA ajustado a una longitud
de onda de 450 nm. Los datos representan la media de tres ensayos
independientes, que se realizaron cada uno por triplicado. La tabla
siguiente muestra que el péptido B\beta_{15-42}
se unió a VE-cadherina en una forma dependiente de
la concentración. Por el contrario el péptido aleatorio muestra
solo una unión insignificante.
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El péptido B\beta_{15-42} y
fragmentos de fibrina compiten respecto a la unión a
VE-cadherina.
En un paso posterior se analizó si se podría
utilizar este ELISA para cribar para otros péptidos/compuestos, de
modo que estos compitan con la unión de la secuencia
B\beta_{15-42} a VE-cadherina.
Como era de esperar el péptido B\beta_{15-42}
inhibió por completo la unión del péptido
B\beta_{15-42} marcado con flag y se usó como
control positivo, y el péptido aleatorio o un disolvente no tuvieron
ningún efecto y se usaron como controles negativos. Los péptidos
más cortos inhibieron parcialmente la unión de
B\beta_{15-42} a VE-cadherina.
NDSK-II inhibió la unión de
B\beta_{15-42} en una manera dependiente de la
concentración. Se alcanzó un equilibrio entre
B\beta_{15-42} y NDSK-II
(inhibición al 50%) a una relación molar de 24:1. NDSK tuvo poco o
ningún efecto.
Se recubrió la superficie de plástico con
VE-cadherina a una concentración de 8 nM. Después se
añadieron los péptidos indicados a concentraciones de 200 \muM,
se añadieron NDSK o NDSK-II a las concentraciones
indicadas. La detección de la unión de
Bbeta_{15-42} marcado con FLAG (12 \muM) se
realizó como se ha descrito anteriormente.
Se obtuvo el virus del dengue de tipo 2
(DEN-2), cepa P23085, de la Colección Nacional de
Virus, Moscú, Rusia, en forma de una suspensión liofilizada de
cerebros de ratón ICR infectados. El virus del dengue obtenido se
sometió a pase en cerebro de crías de ratones ICR, como se ha
descrito anteriormente (Atrasheuskaya et al. FEMS Immunology
and Medical Microbiology. 35, 33-423). Una
suspensión de cerebro al 10% sirvió como solución madre de virus y
se almacenó a -40ºC. Se determinó el título del virus mediante la
dilución en serie de la suspensión de cerebro. La suspensión de
cerebro se inoculó en grupos de respectivamente 10 ratones (BALB/c
de 4 semanas de edad) por vía i.p., y se registró la mortalidad. Se
calculó el título del virus y ascendió a 7,4 log DL50/ml.
Todos los trabajos con los virus infecciosos se
realizaron en laboratorios de seguridad con el nivel de bioseguridad
más alto (BSL-3) en el laboratorio de SRC VB
"Vector" (Rusia).
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Los ratones BALB/c (haplotipo
H-2d) machos de cuatro semanas de edad producidos
mediante cruzamiento consanguíneo se obtuvieron del vivario del
Centro Nacional de Investigación para Virología y Biotecnología
"Vector". Los animales se introdujeron en jaulas individuales
y se les suministró comida y agua, disponible ad libitum.
\vskip1.000000\baselineskip
Se extrajo sangre de los senos orbitales de los
ratones antes de la infección y después de la exposición a
DEN-2 bajo anestesia con metoxiflurano. En cada
punto temporal se emplearon tres ratones para la extracción de
sangre.
Se determinaron las plaquetas (PLT) circulantes,
glóbulos rojos (RBC), glóbulos blancos (WBC), hemoglobina (HGB) y
hematocrito (HCT) mediante el uso de un analizador hematológico
Cell-Dyn 900 (Sequoia-Turner
Corporation, EE.UU., CA).
Se centrifugó una parte de la sangre extraída,
para obtener el suero, que se almacenó a -80ºC hasta el final del
experimento. Se midieron los niveles en suero de citoquinas, para lo
cual se usaron los kits de enzimas para inmunoensayo producidos por
R&D Systems (Minneapolis, EE.UU.) según las instrucciones del
fabricante. Los límites de detección fueron como sigue:
TNF-\alpha, menor de 5,1 pg/ml; Interleuquina
(IL)-1\beta, 3,0 pg/ml; IL-6, 3,1
pg/ml; IFN-\gamma, menor de 20 pg/ml.
El virus del dengue en la sangre de los animales
se identificó por medio de RT-PCR, como se ha
descrito anteriormente (Harris et al. J. Clin. Microbiol.
36, 2634-2639). Se aisló el ARN total de la sangre
usando un kit de Qiagen (Alemania). Los cebadores fueron como
sigue: directo 5'AATATGCTGAAACGCGAGAGAAACCG (posición
136-161), inverso 5'AAGGAACGCCACCAAGGCCATG
(posición 237-258), amplificándose así un producto
de 119 pb. Para determinar de forma cuantitativa la carga de virus,
se tituló DEN-2 como se ha descrito anteriormente en
cultivos de células Vero E6 (Harris et al. J. Clin.
Microbiol. 36, 2634-2639). En los días 0 y 22
después de la exposición se analizó la sangre de los ratones
supervivientes mediante ELISA respecto al anticuerpo
anti-DEN-2 (IgG), como se ha
descrito anteriormente (Ignatyev et al. J. Biotechnology. 44,
111-118).
\vskip1.000000\baselineskip
Se distribuyeron los ratones BALB/c machos de
cuatro semanas de edad producidos mediante cruzamiento consanguíneo
en 6 grupos principales. Cada grupo contenía 50 ratones. Todos los
ratones se infectaron por vía intraperitoneal (i.p.) con la cepa
P23085 de DEN-2 pasada en ratón (como se ha descrito
anteriormente) a una dosis de 1 DL_{50} y se examinaron a diario
para señales de morbilidad. Los ratones del primer subgrupo de todos
los grupos principales (A1-F1) se emplearon para el
control de mortalidad. Cada subgrupo contenía 20 ratones. Los
animales del segundo subgrupo (A2-F2) se usaron
para la obtención de muestras de suero. Cada subgrupo contenía
30
ratones.
ratones.
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El grupo control recibió solo el virus.
El tratamiento con el péptido
B\beta_{15-42} se realizó dos veces al día con
4800 \mug/kg, respectivamente mediante una inyección
intraperitoneal, y eso a partir del día 3 después de la infección
hasta el día 8 después de la infección.
Se recogieron muestras de sangre y suero de los
puntos temporales seleccionados: en los días 1, 3, 5, 7, 11 y 22
después de la exposición.
Se llevó a cabo un análisis estadístico mediante
el uso de las pruebas t de Student o Chi cuadrado. Se consideraron
como significativos los valores de p <0,05.
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Viremia log PFU/ml
\newpage
Se alojaron ratas Wistar machos con un peso de
230-280 g en el animalario (Universidad de
Dusseldorf) y se alimentaron con pienso estándar y agua ad
libitum. Todos los procedimientos se realizaron según las
directrices la AAALAC y el Manual para el Cuidado y Uso de
Animales de Laboratorio (Departamento de salud y Asuntos
Sociales, Institutos Nacionales de Salud, Publicación Nr.
86-23). Además, todos los ensayos fueron autorizados
por la Autoridad de Ética e Investigación de la Universidad de
Dusseldorf y del Estado. Como se ha descrito anteriormente
(Zacharowski et al. Crit Care Med 2000, Zacharowski
et al. Crit Care Med 2001;
29:1599-1608), se anestesiaron las ratas con
tiopentato de sodio (120 mg/kg, i.p.) y la anestesia se mantuvo
según la necesidad con dosis adicionales de tiopentato de
sodio.
Se introdujo una cánula en la tráquea para
permitir la respiración y la temperatura rectal se mantuvo a 37ºC
con una manta homotérmica. Se introdujo un catéter en la arteria
carótida derecha y se unió a un sensor de presión para medir la
presión arterial media (MAP) y fásica y el número de pulsaciones
(HR), que se indicaron en un sistema de recogida de datos (MacLab
8e, ADI Instruments, Alemania) que se instaló en un ordenador IBM.
En la vena yugular derecha se introdujo una cánula para la
administración de fármacos. En la vejiga se introdujo asimismo una
cánula para permitir el flujo de orina y para evitar la posibilidad
de desarrollo de una insuficiencia renal de aparición posterior.
Todos los animales recibieron durante todo el ensayo un reemplazo de
fluido completo de 1,0 ml/kg/h (cloruro de sodio al 0,9%, solución
salina, como infusión i.v. en la vena yugular). Después de terminar
la operación quirúrgica se dejo que los parámetros cardiovasculares
se estabilizaran durante 15 minutos, y se registraron durante seis
horas de forma continua. En este modelo de una insuficiencia
múltiple de órganos inducida por LPS es esencial un periodo de 6
horas para obtener un aumento considerable del nivel en suero de
AST y ALT, mientras que ya se puede observar un aumento considerable
en el nivel en suero de urea y creatinina después de 2 horas.
Se estudiaron tres grupos:
Las ratas se sometieron a operación simulada
(Simulación).
Las ratas se expusieron a un choque por
bacterias gram negativas. Se administró lipopolisacárido de E.
coli, serotipo 0,127:B8 (6 mg/kg i.v.) durante 5 minutos por
vía i.v., 1 hora más tarde los animales recibieron una solución
salina (2,4 ml/kg): (LPS + solución salina).
Las ratas se expusieron a un choque por bacteria
gram negativas. Se administró lipopolisacárido de E. coli,
serotipo 0,127:B8 (6 mg/kg i.v.) durante 5 minutos por vía i.v., los
animales recibieron B\beta_{15-42} (2,4 mg/kg):
(LPS + B\beta_{15-42}).
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Seis horas después de producir un choque por
bacterias gram negativas se sacó sangre del catéter colocado en la
arteria carótida derecha. La muestra de sangre se centrifugó (1610 x
g durante 3 minutos a temperatura ambiente), para separar el
plasma. Se midieron las siguientes enzimas marcadoras en plasma como
indicadores bioquímicos de un daño múltiple/malfuncionamiento de
órganos:
Se estimó el daño hepático cuando se midieron un
aumento en el nivel en plasma de alanina amino transferasa (ALT, un
marcador específico para daño del parénquima hepático) y aspartato
amino transferasa (AST, un marcador no específico de daño
hepático).
Se apreció malfuncionamiento renal cuando se
midieron un aumento en los niveles en plasma de urea (un indicador
de daño en la función excretora de los riñones y/o de un aumento del
catabolismo) y creatinina (un indicador de una velocidad de
filtración glomerular reducida y por lo tanto malfuncionamiento del
riñón).
Los niveles en plasma de glucosa y amilasa se
midieron como marcadores indirectos de la función y daño del
páncreas.
Además, se midió la pO_{2} arterial como
marcador indirecto de la función/daño de los pulmones.
\vskip1.000000\baselineskip
Al final del ensayo se cogieron biopsias de
órganos (pulmón, hígado, corazón y riñones) de todos los grupos
estudiados. Las biopsias se fijaron a temperatura ambiente en una
solución tamponada de formaldehído (al 4% en solución salina
tamponada con fosfato) y se enviaron a Viena. Las secciones teñidas
con H&E estándar no mostraron ningún tipo de diferencia. En los
controles, que sólo recibieron LPS, se encontraron en las secciones
teñidas usando fucsina ácida-naranja G respecto a
depósitos de fibrina, cantidades de trombos de fibrina, que en
comparación con los animales que se habían tratado con LPS más
B\beta_{15-42} (p<0,05) estaban
significativamente aumentadas. En animales con tratamiento simulado
no había presente ningún trombo de fibrina.
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Claims (6)
1. Uso de un péptido con la fórmula general
II
en
donde
R_{1} y R_{2}, iguales o diferentes,
representan hidrógeno, un grupo hidrocarburo saturado o insaturado
de 1 a 10, especialmente de 1 a 3 átomos de carbono,
Z_{1} representa un residuo de histidina,
Arg representa un residuo de arginina,
Z_{3} representa un residuo de prolina o
valina,
Z_{4} representa un residuo de leucina o
valina,
Z_{5} es un residuo peptídico derivado de la
cadena Bbeta de la fibrina,
péptido que posee la propiedad biológica de
ajustarse al motivo de unión de la VE-cadherina
inducible en la cadena B\beta (es decir,
B\beta_{15-42}) de la fibrina humana, para la
producción de un composición farmacéutica para el tratamiento de
choque.
2. Uso según la reivindicación 1, en donde el
grupo hidrocarburo saturado o insaturado en el significado de
R_{1} y R_{2} comprende de 1 a 3 átomos de carbono.
3. Uso según cualquiera de las reivindicaciones
1 ó 2, caracterizado en que Z_{5} es un residuo peptídico
con la secuencia de aminoácidos
Z_{1} es un residuo de histidina,
Arg es un residuo de arginina,
Z_{3} es un residuo de prolina y
Z_{4} es un residuo de leucina.
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4. Uso de un péptido que muestra la secuencia
N-terminal
péptido que tiene la propiedad
biológica de ajustarse al motivo de unión de
VE-cadherina inducible en la cadena B\beta (es
decir, B\beta_{15-42}) de la fibrina humana,
para la producción de una composición farmacéutica para el
tratamiento de
choque.
5. Uso según la reivindicación 4,
caracterizado en que el péptido es
6. Uso según cualquiera de las reivindicaciones
1 a 5, en donde el choque está relacionado con uno o más del grupo
que comprende toxinas bacterianas, coagulapatía intravascular
diseminada, fascitis necrotizante, choque hemorrágico debido a
infección vírica, en particular producida por filovirus,
Arenaviridae, Bunyaviridae, flavivirus, dengue, insuficiencia
respiratoria hemorrágica aguda, causada por agentes infecciosos o
enfermedades autoinmunes, insuficiencia de órganos después de una
lesión de órganos, en particular por infarto de miocardio, una
operación vascular, un pinzamiento de órganos, un choque
hemorrágico, infarto pulmonar, infarto hepático, infarto
intestinal, intervenciones quirúrgicas, apoplejía, y el mal
funcionamiento de órganos en órganos trasplantados.
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