MXPA06002514A - Uso de peptidos derivados de la cadena a-alfa o b-beta del fibrinogeno humano para el tratamiento de choque - Google Patents

Abstract

La presente invención se refiere a un péptido de la fórmula general (I) en donde R1 y R2 son iguales o diferentes y representan hidrógeno, un residuo de hidrocarburo saturado o insaturado con 1 a 10, particularmente 1 a 3átomos de carbono, Z1 representa un residuo de histidina o prolina, Z2 representa un residuo de arginina, un residuo de péptido o un residuo de proteína con un residuo de arginina en posición inicial, particularmente con 2 a 30 aminoácidos;este péptido tiene la propiedad biológica de tener afinidad con el motivo de unión de cadherina VE inducible a la cadena Bß(es decir, Bß15-42) de la fibrina humana, para la fabricación de un preparado farmacéutico para el tratamiento de choque.

Description

USO DE PEPTIDOS DERIVADOS DE LA CADENA A-ALFA O B-BETA DEL FIBRINOGENO HUMANO PARA EL TRATAMIENTO DE CHOQUE ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN La presente invención se refiere a una preparación farmacéutica para el tratamiento de choque. El choque es una complicación aguda de varios estados patológicos que se caracterizan por la incapacidad del sistema circulatorio de mantener una presión suficiente del riego sanguíneo. Los patógenos infecciosos pueden provocar directa o indirectamente un fallo del sistema circulatorio. Bacterias, toxinas bacterianas, virus y finalmente una reacción de huésped celular o humoral, acompañada por una inflamación o coagulación, pueden ocasionar una pérdida del tono vascular, una pérdida de la función de barrera vascular, una pérdida de la fuerza de contracción y una pérdida de la función de órganos, lo que por sí solo o en combinación produce el choque y finalmente la muerte del paciente. El tratamiento de una infección bacterial se basa en un tratamiento antibiótico que mata las bacterias, pero no trata las toxinemia y no corrige una reacción celular o humoral insuficiente. En le caso de bacterias gramnegativas, lipopolisacárido (LPS o endotoxina) es responsable de un choque gramnegativo. Las bacterias grampositivas pueden provocar un fallo múltiple de órganos y choque séptico sin endotoxemia, sin embargo, la pared celular de bacterias grampositivas contiene también toxinas tales como ácido lipotecoico (LTA) y péptidoglicano (PepG). LTA y PepG actúan en sinergia para liberar citocinas como, por ejemplo, el factor de necrosis tumoral (TNF) a e interferón (IFN) ?, para inducir ¡NOS y producir finalmente el choque y el fallo de órganos. La endotoxemia, sepsis y el choque séptico se relacionan con la generación de grandes cantidades de óxido de nitrógeno (NO). La dilatación excesiva de vasos y hiporreactividad vascular frente a medicamentos que aumentan la presión arteria, que acompañan un choque circulatorio, pueden anularse con inhibidores de la isoforma inducible de sintasa NO (iNOS) (Southan y Szabo, Biochem Pharmacol. 1996;51 :383-94, Thiemermann Gen Pharmacol 1997; 29:159-66); sin embargo, los inhibidores ¡NOS no reducen los daños orgánicos producidos por toxinas (Wray et al. Shock 1998; 9:329-335). El tratamiento de un choque causado por infecciones virales representa un reto aún mayor, ya que no hay medicamentos antivirales para la mayoría de las infecciones. Los tratamientos de se encauzan solamente a la eliminación del patógeno infeccioso, no son suficientes en pacientes con choque por patógenos infecciosos porque procesos secundarios desencadenados por el patógeno infeccioso que son acompañados por una reacción inflamatoria y alteraciones del sistema de coagulación, posiblemente se independizaron, causando la muerte del paciente, independientemente de la cuestión si se neutralizó o no el patógeno infeccioso causal. Un tratamiento específico no está disponible y, por lo tanto, tales procedimientos tratan de aliviar los síntomas lo que incluye una ventilación mecánica, la sustitución de líquido, la aplicación de medicamentos que estimulan la acción cardiaca, el estricto control de la saturación con oxígeno, hemoglobina, glucosa y la función renal. El control exclusivo de la reacción inflamatoria, por ejemplo, mediante esteroides altamente dosificadas, o la inhibición de la coagulación con antitrombina no conducen a un mejoramiento de la tasa de supervivencia. La única molécula en la que se ha comprobado hasta ahora que posee un efecto notable con respecto a la reducción de mortalidad es la 'proteína C activada' que interactúa con la coagulación/fibrinólisis y los procesos inflamatorios. Un choque durante el curso de una infección se relaciona, en la mayoría de los casos, con alteraciones evidentes o no evidentes del fibrinógeno plasmático, acompañado por una formación de fibrina y un aumento de los fragmentos de fibrina. Esta activación de la coagulación y los pasos fibrinolíticos puede ocasionar una coagulación intravascular diseminada manifiesta o no manifiesta (DIC) que tiene como consecuencia una obstrucción de vasos y daños de órganos terminales y un consumo de factores de coagulación que origina hemorragias. Una sepsis es la causa más frecuente de una DIC. Es importante que el fibrinógeno, la fibrina y fragmentos de fibrina no sólo sean relevantes en la coagulación sanguínea, sino que presentan varios sitios de enlace para proteínas celulares y de matriz que les facilitan la interacción con los glóbulos blancos, plaquetas sanguíneas, células endoteliales y estructuras de matriz. Esto origina la activación celular, migración celular, una liberación de citocinas y, finalmente, una reacción inflamatoria. La importancia de fibrinógeno o fibrina en la inflamación se encuentra ampliamente documentada (discutido por Altieri Tbromb Haemost 82:781-786; Herrick et al. Int J Biochem Cell Biol 31 :741-46). La región D de la molécula comprende varios sitios de enlace para moléculas de matriz, células endoteliales, plaquetas sanguíneas y células inflamatorias. La región E de la fibrina se une con CD11 c (Loike et al. Proc Nati Acad Sci USA 88:1044-48). Hace poco describimos un nuevo papel para la secuencia de Bbeta?5- 2 de la fibrina en la inflamación (WO 02/48180). Esta secuencia también se localiza en la región E de la fibrina y sólo es activa cuando se disocia fibrinopéptido. Los fragmentos de fibrina que contienen esta secuencia en su N-terminal libre de la cadena beta, se unen con el endotelio y producen una inflamación, y un péptido que armoniza con los aminoácidos 15- 42 de la cadena Bbeta de la fibrina bloquea la unión de fragmentos de fibrina en las superficies de endotelio y bloquea la inflamación in vitro (WO 02/48180). Este péptido impide in vivo una inflamación miocárdica y reduce la magnitud de un infarto del miocardio en situaciones de isquemia / reperfusión (WO 02/48180). Los fragmentos de fibrina surgen en cualquier situación junto con una formación reducida de fibrina y fibrinólisis reducida. Particularmente en situaciones de choque debido a un patógeno infeccioso, esta formación de fibrina alterada y la fibrinólisis alterada representan un problema considerable.

En un sinnúmero de enfermedades se documentó una interacción entre el resultado y la reducción de la formación de fibrina / fibrinólisis. Dengue, por ejemplo, (van Gorp et al. 3 Med Virol 2002, 67:549-54, Mairuhu et al. Lancet Inf Dis 2003; 3:33.-41). El síndrome de disnea en el adulto (ARDS) es una forma de daños pulmonar agudo que se caracteriza por la sedimentación extravascular de fibrina rojiza (Idell Am 3 Respir Med. 2002; 1 :383-91). Una trombosis en los vasos pulmonares y una coagulación intravascular diseminada también se observaron en relación con ARDS. Las razones por una subsistencia / aparición mundial de la fiebre de Dengue (DF) y la fiebre de Dengue hemorrágica (DHF) como gran problema de la salud popular son complejas; medidas de control vectorial no tuvieron éxito para eliminar DF/DHF. En la actualidad, los medios financieros en el sector público en la investigación de Dengue (en el año 2001 estimado en 15 millones de dólares estadounidenses) se centran principalmente en la epidemiología molecular, la fisiología inmunopatológica, la investigación para descubrir vacunas de la segunda generación y planteamientos nuevos o mejorados para el control vectorial. En EUA y Tailandia, varios candidatos de vacunas se encuentran en la etapa experimental clínica; sin embargo, en el mercado aún no hay ningún medicamento para el tratamiento de pacientes infectados y, lo que es peor, aparentemente no se están realizando actividades comerciales para la investigación y el desarrollo de una quimioterapia. La Organización Mundial de la Salud publicó directivas estratégicas para el combate de DF/DHF que -como metas de alta prioridad - se centran en el desarrollo de medicamentos antivirales dirigidos a la proteasa u otras enzimas casi no investigadas; el desarrollo de antimediadores que se dirigen a las causas de una mayor permeabilidad vascular o hemostasis alterada.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN La ¡nvención se refiere al uso de un péptido con la fórmula general en donde R-i y R2 son iguales o diferentes y representan hidrógeno, un residuo de hidrocarburo saturado o insaturado con 1 a 10, particularmente 1 a 3 átomos de carbono, Z-? representa un residuo de histidina o prolina, Z2 representa un residuo de arginina, un residuo de péptido o un residuo de proteína con un residuo de arginina en posición inicial, particularmente con 2 a 30 aminoácidos, este péptido tiene la propiedad biológica de tener afinidad con el motivo de unión de cadherina VE inducible a la cadena Bß (es decir, Bß?5-42) de la fibrina humana, para la fabricación de un preparado farmacéutico para el tratamiento de choque. De preferencia, se utiliza un péptido de la fórmula general II R N— CH2— C— Zi — Arg — Z3 — Z4 — Z£ 01) en donde Zi representa un residuo de histidina o prolina, Arg representa un residuo de arginina, Z3 representa un residuo de prolina o valina, Z representa un residuo de leucina o valina, Z5 representa un residuo de péptido o un residuo de proteína con, particularmente, 2 a 30 aminoácidos o un residuo de alcohol con 1 a 10, particularmente 1 a 3 átomos de carbono o un residuo básico orgánico o inorgánico. Además, se utiliza de preferencia un péptido en el que Z5 es un residuo de péptido derivado de la cadena A-alfa o la cadena B-beta de la fibrina. Además, se utiliza de preferencia un péptido en el que ?5 es un residuo de péptido con la secuencia de aminoácido Asp Lys Lys Arg Glu Glu Ala Pro Ser Leu Arg Pro Ala Pro Pro He Ser Gly Gly Gly Tyr Arg Zi es un residuo de histidina, Arg es un residuo de arginina, Z3 es un residuo de prolina y Z4 es un residuo de leucina.

Además se utiliza de preferencia un péptido en el que Z5 es un residuo de péptido con la secuencia de aminoácidos Glu Arg His Gln Ser Ala Cys Lys Asp Ser Asp Trp Pro Phe Cys Ser Asp Glu Asp Trp Asn Tyr Lys Zi es un residuo de prolina, Arg es un residuo de arginina, Z3 es un residuo de valina y Z4 es un residuo de valina. La invención se refiere además al uso de un péptido que presenta la secuencia N-terminal Gly-His-Arg-Pro-Leu-Asp-Lys-Lys-Arg-Glu-Glu-Ala-Pro-Ser-Leu-Arg-Pro-Ala -Pro-Pro-Pro-lle-Ser-Gly-Gly-Gly-Tyr-Arg y que tiene la propiedad biológica de tener afinidad con el motivo de unión de cadherina VE inducible. El motivo de unión de cadherina a la cadena Bß (es decir, Bß15. 2) de la fibrina humana, para la fabricación de un preparado farmacéutico para el tratamiento de choque. Otra modalidad preferida del uso de conformidad con la invención se caracteriza porque el péptido es Gly-His-Arg-Pro-Leu-Asp-Lys-Lys-Arg-Glu-Glu-Ala-Pro-Ser-Leu-Arg-Pro-Ala-Pro-Pro-Pro-lle-Ser-Gly-Gly-Gly-Tyr-Arg. Se ha demostrado que con los péptidos que se mencionan con anterioridad es posible tratar particularmente estados de choque, en donde el choque se relaciona con uno o varios elementos del grupo que comprende toxinas bacterianas, coagulopatía intravascular diseminada, fascütis necrotizante, choque hemorrágico a consecuencia de una infección viral, particularmente causado por filovirus, arenaviridae, bunyaviridae, flavivirus, Dengue, fallo respiratorio hemorrágico agudo, causado por patógenos infecciosos o enfermedades autoinmunológicas, fallo orgánico después de daños orgánicos, particularmente por un infarto del miocardio, una operación vascular, un estrangulamiento de órganos, un choque hemorrágico, infarto pulmonar, infarto hepático, infarto intestinal, intervenciones operativas y apoplejía, y la función defectuosa de órganos en el caso de órganos transplantados.

DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN Péptidos y proteínas Los péptidos se fabricaron mediante síntesis peptídico de fase sólida y se limpiaron mediante HPLC de fase invertida, utilizando columnas nucleosil 100-10C18 (PiChem, Graz, Austria). Cabe mencionar que la región beta 15-42 es 100% similar entre las especies cuando se facilitan sustituciones convencionales de aminoácidos. El puente de disulfuro N-terminal de fibrinógeno (NSDK)compuesto de los aminoácidos Aa1-51 , Bß1-118 y ?1 -78 se fabricó como se describe con anterioridad (WO 02/48180). El puente de disulfuro N-terminal de fibrina (NSDK-ll, en el que faltan los fibrino-péptidos A y B) compuesto de los aminoácidos Aa17-51 , Bß15-118 y ?1-78 se fabricó tratando NDSK a 37°C por 3 horas con trombina (20 U/ 1 mg de NDSK). La trombina restante se neutralizó a 37 °C por 2 horas con 10 mM de diisopropilfluorofosfato (Fluka, Milwaukee, Wl). Después, todos los productos se dializaron en una solución salina tamponada con fosfato (PBS).

ELISA Péptido Bß?5-42 se une a cadherina VE La interacción de la cadena Bbeta (Bbeta?5- 2) de fibrina con células endoteliales origina alteraciones morfológicas (Bunce et al. J Clin Invest 89:842-50; Bach et al. Exp Cell Res 238:324-34; Chalupowicz et al. J Cell Biol 130:207-15; Hamaguchi et al. Blood 81 :2348-56; Francis et al. Blood cells 19:291-306), una proliferación (Sporn et al. Blood 86:1802-10), la liberación del factor von Willebrand (Ribes et al. J Clin Invest 79:117-23, Ribes et al. J Clin Invest 84: 435-42; Erban y Wagner, J Biol Chem 267,2451-58) y posiblemente IL-8 (Qi et al. Blood 90:3593-3602) y una expresión de membrana de CD54 (Harley et al. Art Thromb Vasc Biol 20:652-658). Cadherina VE se identificó como ligando de unión de la secuencia Bbeta-i5-42 y se desarrollaron ELISAs para comprobar esta interacción de células endoteliales y/o cadherina VE con fibrina o fragmentos de fibrina. Martínez et al. utilizaron anticuerpos de anti-pan-cadherina para captar cadherinas de células endoteliales, seguido por una incubación con fibrina (Martínez et al. Ann NY Acad Sci 936:386-405), monocapas HUVEC (que exprimen cadherina VE) se recubrieron con fragmentos de fibrina o péptido Bbeta-?5-42 radiomarcados (Bach et al. J Biol Chem 273:30719-28; Harley et al. Art Thromb Vasc Biol 20:652-658), y Gorlatov y Medved utilizaron cadherina VE recombinante (Biochemistry 41 :4107-16). Otros emplearon un ELISA para comprobar fragmentos de fibrina en la sangre, utilizando principalmente anticuerpos contra diferentes secuencias dentro de la molécula de fibrinógeno, incluyendo anticuerpos contra el motivo de Bbeta-i5-42 (discutido en Fareed et al. Clin Chem 8:1245-53). Nosotros desarrollamos un ELISA que trabaja con los mismo principios que otros ya han descrito, pero el propósito del ELISA descrito en la presente no consiste en determinar los productos de degradación de fibrina sino en buscar proteínas, péptidos o compuestos que perturban la unión de la secuencia Bbeta-i5-42 y la cadherina VE. El principio consiste en que la cadherina VE puede interactuar ya sea como proteína acortada, proteína completa o acoplada con otras proteínas que no perturban el sitio de unión de de Bbeta?5- 2, con la secuencia de Bbeta?5-42 de fibrina. Es posible introducir cualquier otra sustancia adicional en este sistema y medir si esta sustancia inhibe la unión de cadherina VE/Bbeta15.42- En detalle, se recubrieron placas de inmovilización de proteína con 96 pozos (Exiqon, Vedbaek, Dinamarca) con proteína de fusión FC de cadherina VE recombinante (8 nM; R&D Systems, Minneapolis) en PBS y se dejaron reposar durante la noche a 4 °C. Subsecuentemente, las placas se lavaron con péptido Bß15- 2 (GHRPLDKKREEAPSLRPAPPPISGGGYR) marcado en el C-terminal del péptido con una secuencia SEÑAL (DYKDDDDK) o se incubaron con un péptido aleatorio marcado con SEÑAL (DRGAPAHRPPRGPISGRSTPEKEKLLPG), a una concentración de 0-80 µMol. Después del lavado se comprobó mediante incubación con un anticuerpo anti-SEÑAL marcado con peroxidasa (Sigma, St. Louis, EUA) y un péptido marcada con SEÑAL unido a un sustrato cromógeno. La densidad óptica se determinó mediante un lector de placas ELISA ajustado a una longitud de onda de 450 nm. Los datos representan la media de tres experimentos independientes, realizando cada uno tres veces. El cuadro que se presenta a continuación muestra que el péptido unió Bß15-42 de manera independiente de la concentración a cadherina VE. En contraste, el péptido aleatorio sólo mostró una unión insignificante. Unión dependiente de la dosis de péptido Bß? -42 a cadherina VE El péptido Bß15-42 y fragmentos de fibrina compiten con respecto a la unión a cadherina VE.

En un siguieníe paso analizaremos si esíe ELISA puede aplicarse para la selección de oíros pépíidos/compuesíos para que ésíos compiían con la unión de la secuencia de Bß?5-42 a cadherina VE. Como era de esperarse, el pépíido Bß15-42 inhibió por completo la unión del pépíido Bß?5- 42 marcado con SEÑAL y se uíilizó como conírol positivo, y péptidos aleatorios o un solvente no tuvieron ningún efecto y se utilizaron como controles negativos. Los péptidos más cortos inhibieron parcialmente la unión de Bß15-42 a cadherina VE. NDSK-II inhibió la unión de Bß?5- 2 de modo dependiente de la dosis. Un equilibrio entre Bßi5-42 y NDSK-II (inhibición del 50%) se alcanzó a una relación molar de 24:1. NDSK tuvo poco o ningún efecío. La superficie de plásíico se recubrió con cadherina VE a una conceníración de 8 nM. Después se añadieron los pépíidos indicados a conceníraciones de 200 µM, NDSK o NDSK — II se agregaron a las conceníraciones indicadas. La comprobación de la unión del Bß-?5-42 marcada con SEÑAL (12 µm) se realizó según se describe con aníerioridad.

Reactivo bloqueador % de inhibición de la unión SEÑAL 15-42 a cadherina VE Péptido 15-42 (28mer) Media ± desviación estándar Péptido aleatorio (4mer) 100 + 10 Péptido aleatorio (28mer) 3±3 Solvente 10±3 Péptido 15-18 (4mer) 200 µM Péptido 15- 0 + 0 26 (12mer) 200 µM Péptido 15-30 (16mer) 65 ±12 200 µM Péptido 15-34 (20mer) 200 µM 64 ±10 Péptido 15-37 (24mer) 200 µM Péptido 16- 61 ±13 42 (27mer) 200 µM 67 ±17 17± 19 Péptido 15-18 (4mer) 12 µM Péptido 15-26 55 ±13 (12mer) 12 µM Péptido 15-30 (16mer) 12 7±2 µM Péptido 15-34 (20mer) 12 µM Péptido 6±1 15-31 (24mer)12µM 6±3 Péptido 16-42 (27mer) 12 µM 7 + 1 7±2 NDSK-ll 0.06 µM 5±2 NDSK-ll 0.12 µM NDSK-ll 0.20 µM 1 +0 NDSK-ll 0.60 µM 39 + 18 NDSK-ll 1.2 µM 42 + 14 NDSK-ll 2.4 µM 52 + 16 NDSK-ll 4.0 µM 63 + 13 NDSK 0.06 µM 79 + 9 NDSK 0.12 µM 82 + 12 NDSK 0.20 µM 0 + 0 NDSK 0.60 µM 2 + 1 NDSK 1.2 µM 1 +1 7 + 6 NDSK 2.4 µM 15 + 13 NDSK 4.0 µM 16 + 9 Anti-cadherina-VE Ab (TEA1/31.1 mg/ml) 20 + 10 2 + 1 Eficacia del péptido Bßts.4? en el tratamiento de ratones infectados con el virus Dengue.

Materiales y métodos Virus. El virus Dengue de tipo 2 (DEN-2), cepa P23085, se obtuvo de la Colección Estatal de Virus, Moscú, Rusia, en forma de un< suspensión liofilizada de cerebro de ratón ICR infecíado. El virus Dengue obíenido en el cerebro de raíones ICR jóvenes se someíió a pasajes como se describen con aníerioridad (Aírasheuskaya eí al. FEMS Immunology and Medical Microbiology. 35, 33-423). Una suspensión cerebral al 10% sirvió como cepa viral y se almacenó a 400 °C. El fííulo del virus fue deíerminado mediante las diluciones seriales de la suspensión cerebral. La suspensión cerebral se inyectó i.p. a grupos de 10 ratones cada uno (BALB/c de 4 semanas de edad) y se regisfró la mortalidad. Se calculó el tííulo del virus y fue de 7.4 Ig LD50/ml. Cualquier írabajo cori el virus infeccioso se realizó en el cuarto seguro del nivel máximo de seguridad biológica 3 (BSL-3) en el laboratorio de SRC VB «Vector» (Rusia).

Animales Se obtuvieron ratones BALB/c machos, de 4 semanas de edad, engendrados por incesto (Haplotipo H-2d) del Vivario del Ceníro Esíaíal de Invesíigación para Virología y Bioíecnología «Vecíor». Los animales se colocaron con alimento y agua, disponible ad libitum, en jaulas individuales.

Análisis Aníes de la infección y después de la exposición a DEN-2 bajo anestesia con meíoxiflurano se les lomó sangre a los raíones del seno orbiíal. Para cada momenío se tomaron tres ratones para la obtención de sangre.

Las plaquetas sanguíneas en circulación (PLT), glóbulos rojos (RBC), glóbulos blancos (WBC), hemoglobina (HGB) y hemaíocriío (HCT) se determinaron mediante un analizador de hematología Cell-Dyn 900 (Sequoia-Turner corporalion, EUA, CA). Una parte de la sangre obtenida se cenírifugó para obtener suero que se almacenó a -80°C hasfa el final del experimenío. Se midió el nivel sérico de ciíocinas, uíilizando los equipos de inmunoensayo enzimáíico fabricado por R&D Systems (Minneapolis, EUA) conforme a las insírucciones del fabricante. Los límites de detección fueron los siguieníes: TNF-a, menos que 5.1 pg/ml; Iníerleucina (IL)-1ß, 3.0 pg/ml; IL-6, 3.1 pg/ml; 1 FN?- menos que 20 pg/ml. El virus Dengue en la sangre de los animales se ideníificó medianíe RT-PCR, como se describe con aníerioridad (Harris el al. J. Clin. Microbiol. 36, 2634-2639). El RNA ioíal de la sangre se aisló utilizando el equipo de Quiagen (Alemania). Los iniciadores fueron los siguieníes: superior 5'AATATGCTGAAACGCGAGAGAAACCG (Posición 136-161), ¡nferior 5'AAGGAACGCCACCAAGGCCATG (Posición 237-258), amplificando un producto 119 bp. Para deíerminar la carga del virus de modo cuaníiíaíivo, DEN-2 se íiíuló, como se describe con aníerioridad, en culíivos celulares Veto E6 (Harris eí al. J. Clin. Microbiol. 36, 2634-2639). En el día 0 y 22 después de la exposición se analizó la sangre de los raíones supervivientes medianíe ELISA con respecfo aníicuerpos de aníi-DEN-2 (IgG), según se describe con anterioridad (Ignaíyev eí al. J. Bioíechnology. 44, 111-118).

Desarrollo del experimenío Raíones BALB/c machos de 4 semanas de edad, engendrados por incesto se dividieron en 6 grupos principales. Cada grupo comprendía 50 ratones. Todos los animales se infecíaron por vía iníraperifoneal (i.p.) con la cepa de DEN-2 P23085 adapíada a raíones (como se describe con aníerioridad) a una dosis de 1 LD50, examinándolos diario por signos de enfermedad. Los raíones de los primeros subgrupos de iodos los grupos principales (A1 - F1) se tomaron para el conlrol de la mortalidad. Cada subgrupo comprendía 20 ratones. Los animales de los segundos subgrupos (A2 - F2) se utilizaron para la obtención de muesíras de suero. Cada subgrupo coníenía 30 ratones. Descripción del grupo, n = 50 en cada grupo. El grupo de control sólo recibió el virus. El tralamienío con el péplido Bßi5-42 se efecíuó dos veces al día con 4800 µg/kg, en cada caso, medianíe inyección por vía iníraperitoneal, a partir del tercer día después de la infección hasía el ocíavo día después de la infección. Las mueslras de sangre y suero se obíuvieron en los momentos elegidos: el día 1 , 3, 5, 7, 11 y 22 después de la exposición. Se realizó un análisis esíadístico utilizando la prueba t de Sludent o la prueba chi cuadrado. Los valores P <0.05 se consideraron significativos.

CUADRO 1 MORTALIDAD Y TITULO IGG. P<0.05 ENTRE GRUPOS CUADRO 2 Viremia Iq PFU/ml Choque gramnegativo Ratas Wistar hembra con un peso de 230-280 g se encontraron en las instalaciones para experimentos en animales (Universidad Dusseldorf) recibiendo alimento estándar y agua ad libitum. Todos los procedimientos se realizaron de conformidad con las Directivas AAALAC y el Handbuch für die Pflege und Verwendung von Labortieren (Amt für Gesundheií und Soziales, Naíionale Gesundheiísinsíiíute, publicación No. 86-23). Además, todos los experimentos fueron autorizados por un Departamento de Etica e Invesíigación de la Universidad de Dusseldorf y el esíado. Como se describe con aníerioridad (Zacharowski eí al. Crit Care Med 2000, Zacharowski et al. Crit Care Med 2001 ; 29:1599-1608), las ratas se anestesiaron con íiopeníona de sodio (120 mg/kg i.p.) y la anestesia se mantuvo, cuando era necesario, con dosis complementarias de tiopentona de sodio. Se introdujo una cánula en la tráquea para facilitar la respiración, y la temperatura rectal se mantuvo con un manto homeotérmico a 37°C. La arteria carótida derecha se cateterizó y se unió con un sensor de presión para medir la presión arterial fásica y media (MAP) y el pulso (NR) indicado en un sislema de registro de datos (MacLab 8e, ADI Instruments, Alemania) que fue instalado en una computadora IBM. En la vena yugular derecha se introdujo una cánula para suministrar los fármacos. Asimismo se introdujo una cánula en la vejiga para facilitar el flujo de la orina y para evitar la posibilidad de que se desarrollara posteriormente una insuficiencia renal. Todos los animales recibieron durante todo el experimenío un sustituto completo de líquido de 1.0 ml/kg/h (cloruro de sodio al 0.9 %, solución salina, como infusión i.v. en la vena yugular). Después de la intervención quirúrgica se facilitó que los parámeíros cardiovasculares se estabilizaran por 15 minutos y se registraron duraníe 6 horas coníinuameníe. En este modelo de un fallo orgánico inducido por LPS, un periodo de 6 horas es susíancial para alcanzar un aumenío considerable de los niveles séricos de AST y ALT, mientras que un aumento considerable de los niveles séricos de urea y creatinlna ya se puede observar después de 2 horas. Se examinaron íres grupos: Las rafas se sometieron a una operación ficticia: (simulación). Las raías se expusieron a un choque gramnegaíivo. El lipopolisacárido de E. coli, serolipo 0,127:B8 (6 mg/kg i.v.), se adminisíró por 5 minuíos por vía iniravenosa; 1 hora más farde los animales recibieron una solución salina (2.4 ml/kg): (LPS + solución salina). Las raías se expusieron a un choque gramnegaíivo. El lipopolisacárido de E. coli, serolipo 0,127:B8 (6 mg/kg i.v.), se administró por 5 minutos por vía intravenosa, los animales recibieron Bß15-42 (2.4 mg/kg): (LPS + Bß15-42).

Supervivencia n = 20 en cada grupo Seis horas después del desencadenamiento de de un choque gramnegativo se tomó sangre del catéter colocado en la arteria carótida derecha. La muesíra de sangre se cenlrifugó (1610 x g duraníe 3 minuíos a íemperaíura ambiente) para separar plasma. Las siguieníes enzimas marcadoras se midieron en el plasma como indicadores bioquímicos para un fallo orgánico múltiple/función defecíuosa: Un daño hepáíico se evaluó midiendo el aumenío de los niveles plasmáíicos de alanina-aminoíransferasa (ALT, un marcador específico para un daño del parénquima hepáfico) y aspartalo-aminoíransferasa (AST, un marcador no específico para un daño hepáíico). Una función defectuosa renal se estimó midiendo los aumentos de los niveles plasmáticos de urea (un indicador para una función eliminatoria reducida del riñon y/o y catabolismo aumenfado) y creaíinina (un indicador para una íasa de filíración de glomérulo y, por ende, una función renal defecíuosa). Los niveles plasmáíicos de glucosa y amilasa se midieron como marcadores indirectos de la función y el daño pancreáficos. Además se midió el pO2 arterial como marcador indirecto de la función/daño pulmonar. Valores de laboratorio Presión arterial media Tiempo LPS + Simulación LPS (h) Media SEM Media SEM Media SEM 0 1209 5.5 118.9 5.4 128.9 5.2 1 111.5 10.6 90.7 5.5 83.7 4.6 2 113.2 7.3 100.2 5.1 102.3 4 3 116.4 5.4 90 7.4 103.2 4 4 108.7 8.9 81.1 7.9 101.2 3 5 104.1 9.6 60.1 10.8 97.1 5.4 6 104.1 9.6 34.1 7.7 107.7 9.6 Pulso Tiempo LPS + Simulación LPS (h) Media SEM Media SEM Media SEM 0 482.2 17 457 18.1 436.9 6.4 1 461.7 12.1 511.2 27.4 484.8 18.6 2 488.1 13.6 523.3 27.3 484.1 10.3 3 506.6 26.6 518.5 24.9 509.8 12 4 488.9 17.4 516.7 32.1 516.7 13.4 5 470.4 13.9 515.5 26.1 533.7 30.7 6 443.7 OJ 530.1 27.7 541.6 24.4 Al final del experimento se tomaron biopsias de órganos (pulmón, hígado, corazón y ríñones) de todos los grupos. Las biopsias se fijaron a íemperalura ambiente en una solución de formaldehído tamponada (4% en solución salina tamponada con fosfaío) y se enviaron a Viena. Los segmeníos teñidos con H&E eslándar no mosíraron diferencias. Sin embargo, en los coníroles que sólo contenían LPS enconíramos en segmeníos que se íiñeron uíilizando fucsina ácida-naranja G con respecfo a sedimeníaciones de fibrina, números de írombos de fibrina que demosíraron un aumenío significativo en comparación con los animales tratados con LPS más Bß15- 2 (p<0.05). En los animales que recibieron un íraíamiento simulado no se enconíraron írombos de fibrina. Número medio de írombos de fibrina en vasos

Claims (9)

NOVEDAD DE LA INVENCIÓN REIVINDICACIONES

1.- El uso de un pépíido de la fórmula general en donde: Ri y R2 son iguales o difereníes y represenían hidrógeno, un residuo de hidrocarburo saíurado o insafurado con 1 a 10, particularmeníe 1 a 3 áíomos de carbono, Zi represenfa un residuo de hisíidina o prolina, Z2 represenía un residuo de arginina, un residuo de pépíido o un residuo de proíeína con un residuo de arginína en posición inicial, particularmeníe con 2 a 30 aminoácidos, este pépfido liene la propiedad biológica de íener afinidad con el molivo de unión de cadherina VE inducible a la cadena Bß (es decir, Bßi5-42) de la fibrina humana, para la fabricación de un preparado farmacéutico para el tratamiento de choque.

2.- El uso que se reclama en la reivindicación 1 , en donde el péptido tiene la fórmula general II en donde Zi representa un residuo de histidina o prolina, Arg representa un residuo de arginina, Z3 representa un residuo de prolina o valina, Z4 represenía un residuo de leucina o valina, Z5 representa un residuo de péptido o un residuo de proteína con, particularmente, 2 a 30 aminoácidos o un residuo de alcohol con 1 a 10, particularmente 1 a 3 átomos de carbono o un residuo básico orgánico o inorgánico.

3.- El uso que se reclama en la reivindicación 2, en donde Z5 es un residuo de péptido derivado de la cadena A-alfa de la fibrina.

4.- El uso que se reclama en la reivindicación 2, en donde Z5 es un residuo de péptido derivado de la cadena A-beta de la fibrina.

5.- El uso que se reclama en la reivindicación 2, en donde Z5 es un residuo de péptido con la secuencia de aminoácido Asp Lys Lys Arg Glu Glu Ala Pro Ser Leu Arg Pro Ala Pro Pro Me Ser Gly Gly Gly Tyr Arg; Z^ es un residuo de histidina, Arg es un residuo de arginina, Z3 es un residuo de prolina y Z4 es un residuo de leucina.

6.- El uso que se reclama en la reivindicación 2, en donde Z5 es un residuo de pépíido con la secuencia de aminoácidos Glu Arg His Gln Ser Ala Cys Lys Asp Ser Asp Trp Pro Phe Cys Ser Asp Glu Asp Trp Asn Tyr Lys; Z-i es un residuo de prolina, Arg es un residuo de arginina, Z3 es un residuo de valina y Z4 es un residuo de valina.

7.- El uso de un pépíido que presenía la secuencia N-lerminal Gly-His-Arg-Pro-Leu-Asp-Lys-Lys-Arg-Glu-Glu-Ala-Pro-Ser-Leu-Arg-Pro-Ala -Pro-Pro-Pro-lle-Ser-Gly-Gly-Gly-Tyr-Arg; y que tiene la propiedad biológica de tener afinidad con el motivo de unión de cadherina VE inducible; el moíivo de unión de cadherina a la cadena Bß (es decir, Bß?5-42) de la fibrina humana, para la fabricación de un preparado farmacéuíico para el íratamiento de choque.

8.- El uso que se reclama en la reivindicación 7, en donde el péptido es Gly-His-Arg-Pro-Leu-Asp-Lys-Lys-Arg-Glu-Glu-Ala-Pro-Ser-Leu-Arg-Pro-Ala-Pro-Pro-Pro-lle-Ser-Gly-Gly-Gly-Tyr-Arg.

9.- El uso que se reclama en una de las reivindicaciones 1 a 8, en donde el choque se relaciona con uno o varios elementos del grupo que comprende toxinas bacterianas, coagulopatía intravascular diseminada, fasciítis necrolizanle, choque hemorrágico a consecuencia de una infección viral, paríicularmeníe causado por filovirus, arenaviridae, bunyaviridae, flavivirus, dengue, fallo respiratorio hemorrágico agudo, causado por paíógenos infecciosos o enfermedades auíoinmunológicas, fallo orgánico después de daños orgánicos, particularmeníe por un infarto del miocardio, una operación vascular, un estrangulamiento de órganos, un choque hemorrágico, infarto pulmonar, infarto hepático, infarto iníesíinal, intervenciones operaíivas y apoplejía, y la función orgánica defecíuosa en el caso de órganos fransplantados.