KR20070022636A - 인간 섬유소원의 알파 또는 베타 체인으로부터 유래된펩티드의 쇼크 치료 용도 - Google Patents

Abstract

본 발명은 쇼크 치료용 약학적 조제물의 제조를 위한, 인간 섬유소의 Bβ-체인(즉, Bβ_15-42)상의 유도성 VE-카드헤린 결합 모티프에 부합되는 생물학적 특성을 가지는 일반식 I의 펩티드의 용도에 관한 것이다.

상기에서, R₁ 및 R₂는 동일하거나 상이하며, 수소, 1 내지 10개의 탄소 원자, 특히 1 내지 3개의 탄소 원자를 포함하는 포화 또는 불포화 탄화수소 모이어티이고,

Z₁은 히스티딘 또는 프롤린 모이어티이고,

Z₂는 아르기닌 모이어티, 첫번째에 아르기닌 모이어티 포함하며 특히, 2 내지 30개의 아미노산을 포함하는 펩티드 모이어티 또는 단백질 모이어티이다.

쇼크, 섬유소의 VE-카드헤린 결합 모티프

Description

인간 섬유소원의 알파 또는 베타 체인으로부터 유래된 펩티드의 쇼크 치료 용도{USE OF PEPTIDES DERIVED FROM THE A ALPHA OR B BETA CHAIN OF HUMAN FIBRINOGEN FOR THE TREATMENT OF SHOCK}

본 발명의 쇼크 치료용 약학적 조제물에 관한 것이다.

쇼크는 심혈관 시스템의 적절한 관류압 유지 장애를 특징으로 하는 여러가지 다수 병리학적 증상들의 복합적인 급성 증상이다. 감염성 물질은 직접적으로 또는 간접적으로 심혈관 시스템의 기능 상실을 초래할 수 있다. 세균, 세균성 독소, 바이러스 및 마지막으로 염증 및 응고가 관여되는 부적절한 세포성 또는 체액성 숙주 반응은 혈관 긴장도(vascular tone)의 소실, 혈관 장벽 기능의 소실, 심근 수축성 상실 및 기관의 기능 상실에 이르게 할 수 있으며, 단독 또는 조합적인 증상은 쇼크를 발생시켜 궁극적으로 환자를 죽음에 이르게 한다. 세균 감염 치료는, 항생제를 이용한 치료에 의존되어 있으나, 이러한 치료는 세균을 사멸시킬 뿐 독혈증(toxinemia)을 치료하지는 못하며 부적절한 세포성 또는 체액성 반응을 바로잡지 못한다. 그람 음성 세균의 리포폴리사카라이드(LPS 또는 내독소)는 그람 음성 쇼크를 발생시키는 원인이다. 그람 양성 세균은 다수 기관의 기능 상실 및 내독혈증을 수반하지 않는 패혈 쇼크를 초래할 수 있으며, 그람 양성 세균의 세포벽 또는 리포타이코산(LTA) 및 펩티도글리칸(PepG)과 같은 독소를 함유하고 있다. LTA 및 PepG는 상승적으로 작용하여 종양 괴사 인자(TNF) α 및 인터페론(IFN) γ와 같은 사이토카인을 분비하여, iNOS을 유도하고, 최종적으로 쇼크 및 기관의 기능 상실을 초래한다.

내독혈증, 패혈증 및 패혈 쇼크는 대량의 질소 산화물(NO) 발생과 관련있다. 과도한 혈관 확장 및 순환 발작과 관련된 증압제에 대한 혈관 반응성 저하는 NO 합성효소(iNOS)의 유도성 아이소형(isoform)의 저해제를 이용하여 회복될 수 있지만(Southan and Szabo, Biochem Pharmacol. 1996; 51: 383-94, Thiemermann Gen Pharmacol 1997; 29: 159-66), iNOS 저해제는 독소에 의해 초래된 기관 손상을 경감시키지는 못한다(Wray et al. Shock 1998; 9: 329-335).

항-바이러스 약물이 대부분의 감염에 유효하지 않아, 바이러스 감염으로 초래된 쇼크 치료제가 더욱 시도되고 있다. 염증 반응 및 응고 시스템의 변이가 수반되는 감염성 물질에 의해 촉발된 부차적인 증상이 독자적으로 진행될 수 있으며 원인 감염성 물질이 중화되었는지 여부에 대한 논점과는 별도로 환자를 죽음에 이르게 할 수 있기 때문에, 감염성 물질만을 제거하는 치료는 감염성 물질로 인한 쇼크 환자들에겐 충분하지 않다. 특수 치료는 유효하지 않아, 따라서, 현단계에서는 기계 호흡, 체액 보충, 심활성 약물 사용, 산소 포화의 엄격 통제, 헤모글로빈, 글루코스 및 신장 기능을를 포함한, 증상을 완화시키는 것을 목표로 삼고 있다. 예컨대, 스테로이드류의 다량 투여 또는 항트롬빈을 이용한 응고 저해를 통한 염증 반응의 통제만으로는, 생존율을 향상시키지 못한다. 사망율 감소에 주목할만한 효 능이 있는 것으로 지금까지 입증된 분자는 응고/섬유소 분해 및 염증 경로와 상호작용하는 단백질 C를 활성화시킨다.

감염 진행중의 쇼크는 대개 섬유소 형성 및 섬유소 단편의 증가를 동반한 혈장 섬유소원의 현적 또는 비현적 변화와 관련되어 있다. 응고 및 섬유소 분해 경로의 활성화는, 혈관 폐색 및 종말 기관 손상 및 출혈을 초래하는 응고 인자의 소모를 발생시키는, 현적 또는 비현적으로 전파된 정맥내 응고(DIC)를 초래할 수 있다. 패혈증은 DIC의 가장 일반적인 원인이다. 중요하게도, 섬유소원, 섬유소 및 섬유소 단편은 혈액 응고에 작용할 뿐만 아니라, 세포성 단백질 및 기질 단백질에 대한 여러 결합 부위를 가지고 있어, 백혈구 세포, 혈소판, 내피 세포 및 기질 구조와의 상호작용을 허용한다. 이로 인하여 세포 활성화, 세포 이동, 사이토카인 분비 및 궁극적으로는 염증 반응이 이루어진다. 섬유소원 또는 섬유소의 염증에서의 역할은 상세히 보고되어 있다(Altieri Thromb Haemost 82: 781-786; Herrick et al. Int J Biochem Cell Biol 31: 741-46). 상기 분자의 D-부위는 기질 분자, 내피 세포, 혈소판 및 염증성 세포에 대한 다수의 결합부를 함유하고 있다. 피브린의 E-부위는 CD11c에 결합한다(Loike et al. Proc Natl Acad Sci USA 88: 1044-48).

염증에서 피브린의 Bβ_15-42 서열의 신규 역할을 최근에 개시하였다(WO 02/48180). 또한, 상기 서열은 피브린의 E-부위내에 위치하고 있으며, 피브리노펩티드가 절단될때에만 활성화 된다. β 체인의 유리 N-말단에 상기 서열을 함유하 고 있는 섬유소 단편은 내피에 결합하여 염증을 초래하고, 피브린의 Bβ 체인의 15-42 아미노산에 부합되는 펩티드는 섬유소 단편의 내피 표면과의 결합을 차단하며, 시험관내에서 염증을 차단한다(WO 02/48180). 상기 펩티드는 생체내에서 심근 염증을 예방하고, 허혈증/재관류 상태에서 심근 경색 정도를 경감시킨다(WO 02/48180).

섬유소 단편은 모든 섬유소 형성 장애 및 섬유소 분해 장애 상태에서 발생된다. 특히, 감염성 물질로 인한 쇼크 상태에서는, 이러한 섬유소 형성 변이 및 섬유소 분해 변이가 주된 문제이다. 다수 질환들에서 섬유소 형성/섬유소 분해의 형성과 손상간의 직접적인 관련성이 보고되었다. 예, 뎅기(van Gorp et al. J Med Virol 2002, 67: 549-54, Mairuhu et al. Lancet Inf Dis 2003; 3: 33-41). 성인의 호흡곤란증후군(ARDS)은 플로리(florid) 혈관외 섬유소 침착을 특징으로 하는 급성 폐 손상형이다(Idell Am J Respir Med. 2002; 1: 383-91). 폐 혈관계의 혈전증 및 전파된 혈관내 응고 역시 ARDS와 관련있는 것으로 관찰되었다.

공중 보건의 주된 문제점으로서 뎅기열(DF) 및 출혈성 뎅기열(DHF)의 지속/대규모 출현의 이유는 복합적이며, 벡터 통제 측정법(vector control measures)은 DF/DHF 제거에 성공적이지 않았다. 현재, 뎅기 연구위의 공중 분야 자금(public sector funding for dengue research)은 분자 역학, 면역 병리생리학, 제2 세대 백신 발견 연구 및 신규 또는 개선된 벡터 통제 접근법에 주로 집중되어 있다(2001년에 150만 US 달러).

여러가지 백신 후보물질들이 미국 및 태국에서 임상 연구 중이며, 아직까지 감염 환자의 치료제가 시판되지 않고 있으며, 현재, 상업적 화학요법 R&D 활동들도 진행되고 있지 않은 것으로 보인다. 세계 보건기구는, 최우선 과제로서 단백질분해효소 또는 연구가 충분히 이루어지지 않은 그외 효소에 대한 항바이러스제의 개발, 혈관 투과성 증가 또는 지혈 변이의 원인에 대한 항매개제의 개발을 포함하여, DF/DHF와의 전투로 전략적 방향을 공표하였다.

발명의 요약

본 발명은 쇼크 치료용 약학적 조제물의 제조를 위한, 인간 섬유소의 Bβ-체인(즉, Bβ_15-42)상의 유도성 VE-카드헤린 결합 모티프에 부합(matching)매치되는 생물학적 특성을 가지는 일반식 I의 펩티드의 용도에 관한 것이다.

상기 식에서, R₁ 및 R₂는 동일하거나 상이하며, 수소, 1 내지 10개의 탄소 원자, 특히 1 내지 3개의 탄소 원자를 포함하는 포화 또는 불포화 탄화수소 모이어티이고,

Z₁은 히스티딘 또는 프롤린 모이어티이고,

Z₂는 아르기닌 모이어티, 또는 첫번째에 아르기닌 모이어티를 포함하며 특히, 2 내지 30개의 아미노산을 포함하는 펩티드 모이어티 또는 단백질 모이어티이다.

바람직하기로는 일반식 II를 사용하며,

Z₁은 히스티딘 또는 프롤린 모이어티이고,

Arg는 아르기닌 모이어티이고,

Z₃은 프롤린 또는 발린 모이어티이고,

Z₄는 루신 또는 발린 모이어티이고,

Z₅는 2 내지 30개의 아미노산을 포함하는 펩티드 모이어티 또는 단백질 모이어티, 또는 1 내지 10개의 탄소 원자, 특히 1개 내지 3개의 탄소 원자를 포함하는 알콜 모이어티, 또는 유기 또는 무기 염기 모이어티를 포함한다.

또한, Z₅가 섬유소의 α-체인 또는 β-체인으로부터 유래된 펩티드 모이어티인 펩티드가 바람직하게 사용된다.

또한, Z₅가 Asp Lys Lys Arg Glu Glu Ala Pro Ser Leu Arg Pro Ala Pro Pro Ile Ser Gly Gly Gly Tyr Arg의 아미노산 서열을 포함하는 펩티드 모이어티이고,

Z₁이 히스티딘 모이어티이고,

Arg가 아르기닌 모이어티이고,

Z₃이 프롤린 모이어티이고, 및

Z₄가 루신 모이어티인, 펩티드가 바람직하게 사용된다.

또한, Z₅가 Glu Arg His Gln Ser Ala Cys Lys Asp Ser Asp Trp Pro Phe Cys Ser Asp Glu Asp Trp Asn Tyr Lys의 아미노산 서열을 포함하는 펩티드 모이어티이고,

Z₁이 프롤린 모이어티이고,

Arg가 아르기닌 모이어티이고,

Z₃이 발린 모이어티이고, 및

Z₄가 발린 모이어티인, 펩티드가 바람직하게 사용된다.

또한, N 말단 서열 Glu-His-Arg-Pro-Leu-Asp-Lys-Lys-Arg-Glu-Glu-Ala-Pro-Ser-Leu-Arg-Pro-Ala-Pro-Pro-Pro-Ile-Ser-Gly-Gly-Gly-Tyr-Arg를 가지며, 쇼크 치료용 약학적 조제물의 제조를 위한, 인간 섬유소의 Bβ-체인(즉, Bβ_15-42)상의 유도성 VE-카드헤린 결합 모티프에 부합되는 생물학적 특성을 가지는, 펩티드의 용도에 관한 것이다.

더욱 바람직한 본 발명에 따른 용도는, 펩티드가 Gly-His-Arg-Pro-Leu-Asp-Lys-Lys-Arg-Glu-Glu-Ala-Pro-Ser-Leu-Arg-Pro-Ala-Pro-Pro-Pro-Ile-Ser-Gly-Gly-Gly-Tyr-Arg의 아미노산 서열을 갖는 것을 특징으로 한다.

특히 쇼크 증상은 전술한 펩티드로 치유될 수 있는 것으로 확인되었으며, 쇼크는 세균성 독소, 파종성 혈관내 응고증(disseminated intravascular coagulopathy), 괴사성 근막염(necrotizing fasciitis), 바이러스 감염, 특히 필로바이러스, 아레비리데(arenaviridae), 부니아비이데(bunyaviridae), 플라비바이러스, 뎅기에 의해 초래된 출혈성 쇼크, 감염성 물질 또는 자가면역 질환에 의한 급성 출혈성 호흡기능 상실, 기관 손상이후의 기관 기능 상실, 특히 심근 경색, 혈관 수술, 기관의 클램핑(clamping), 출혈성 쇼크, 폐 경색, 간 경색, 장 경색, 외과 수술 및 발작, 및 이식된 기관의 기관 기능장애로 이루어진 군으로부터 선택된 한 가지 이상과 관련되어 있다.

펩티드 및 단백질

펩티드는 고상 펩티드 합성에 의해 제조되며, 뉴클레오실 100-10C18 컬럼(PiChem, Graz, Austria)를 이용하여 역상 HPLC로 정제하였다. 보존적 아미노산 치환을 허용할때의 β15-42 부위는 종들간에 100% 유사하다는 것을 유념하여야 한다. 아미노산 Aα1-51, Bβ1-118 및 γ1-78로 구성된 섬유소원의 N-말단의 이황화 결합(N-terminal disulfide knot, NDSK)은 기존에 개시된 바에 따라 준비하였다(WO 02/48180). 아미노산 Aα17-51, Bβ15-118 및 γ1-78로 구성된 섬유소의 N-말단의 이황화 결합(NDSK-II, 섬유소펩티드 A 및 B가 결핍)은, NDSK에 트롬빈(20U/1 mg NDSK)을 37 ℃에서 3시간 처리하여 제조하였다. 잔여 트롬빈은 10 mM 디소프로필 플루오로포스페이트(Fluka, Milwaukee, WI)을 이용하여 37 ℃에서 2시간동안 중화하였다. 모든 산물은 이후 포스페이트 완충화된 염수(PBS)에서 투석하 였다.

ELISA

펩티드 Bβ_15-42는 VE-카드헤린에 결합한다.

섬유소의 Bβ 체인(Bβ_15-42)과 내피 세포간의 상호작용은 형태학적 변화(Bunce et al. J Clin Invest 89:842-50; Bach et al. Exp Cell Res 238:324-34; Chalupowicz et al. J Cell Biol 130: 207-15; Hamaguchi et al. Blood 81: 2348-56; Francis et al. Blood cells 19: 291-306), 증식(Sporn et al. Blood 86: 1802-10), 본 빌레브란트 인자의 분비(von Willebrand factor)(Ribes et al. J Clin Invest 79:117-23, Ribes et al. J Clin Invest 84: 435-42; Erban and Wagner, J Biol Chem 267, 2451-58), 아마도 IL-8의 분비(Qi et al. Blood 90:3 593-3602), 및 CD54의 멤브레인 발현(Harley et al. Art Thromb Vasc Biol 20: 652-658)를 초래한다. VE-카드헤린은 서열 Bβ_15-42의 결합성 리간드로서 동정되었고, 내피세포 및/또는 VE-카드헤린과 섬유소 또는 섬유소 단편과의 상호작용을 입증하기 위한 ELISA가 개발되었다. Martinez는 내피세포로부터 카드헤린을 포획하기 위해 항-판 카드헤린 항체를 이용하였고, 이후 섬유소와 배양하고(Martinez et al. Ann NY Acad Sci 936: 386-405), HUVEC 단일층(VE-카드헤린을 발현함)을 방사능 표지된 섬유소 단편 또는 펩티드 Bβ_15-42로 적층하였고(Bach et al. J Biol Chem 273:30719-28; Harley et al. Art Thromb Vasc Biol 20:652-658), 재조합 VE-카드헤린을 Gorlatov 및 Medved(Biochemistry 41: 4107-16)에 따라 사용하였다. 그외 에는 대부분 Bβ_15-42 모티프에 대한 항체를 포함한 섬유소원 분자내 각 서열에 대한 항체를 이용함으로써 혈중 섬유소 단편을 검출하기 위한 ELISA를 사용하였다(reviewed in Fareed et al. Clin Chem 8:1845-53).

본 출원인은 다른 이들에 의해 개시된 동일한 원리를 이용하여 변형된 ELISA 기법을 개발하였으며, 본 명세서에 기재된 ELISA의 목적은 섬유소 분해 산물을 정량하기 위한 것이 아니며, Bβ_15-42 서열과 VE-카드헤린의 결합을 간섭하는 단백질, 펩티드 또는 화합물을 검색하기 위한 것이다. 이 원칙은, 절단된 단백질로서 또는 전장 단백질로서 또는 Bβ_15-42 결합 부위를 간섭하지 않는 다른 단백질과 커플을 이룬 VE-카드헤린은, 섬유소의 Bβ_15-42서열과 상호작용하도록 허용된다는 것이다. 이러한 시스템에, 다른 임의의 추가적인 물질을 도입할 수 있으며, 상기 물질이 VE-카드헤린/ Bβ_15-42 결합을 저해하지는를 측정할 수 있다.

구체적으로는, 96 웰 단백질 고정 플레이트(Exiqon, Vedbaek, DK)를 PBS내 재조합 인간 VE-카드헤린 FC 융합 단백질(8 nM/ml; R&D Systems, Minneapolis)로 코팅하고, 4℃에서 하룻밤 두었다. 이후 플레이트를 세척하고, FLAG-서열(DYKDDDDK)이 펩티드의 C 말단에 연결된 펩티드 Bβ_15-42(GHRPLDKKREEAPSLRPAPPPISGGGYR) 또는 FLAG-테깅된(tagged) 랜덤 펩티드(DRGAPAHRPPRGPISGRSTPEKEKLLPG)의 0 - 80 μMol과 배양하였다. 세척한 다음, 결합된 FLAG-테깅된 펩티드를 페록시다제 표지된 항-FLAG 항체(Sigma, St. Louis, USA) 및 색소 기질과 반응시켜 검출하였다. ELISA 플레이트 리더로 450 nm에서의 광학 밀도를 측정하였다. 실험치는 각각 3배수로 실시한, 3번의 독립적인 실험들의 평균으로 나타내었다. 하기 표는 펩티드 Bβ_15-42가 농도 의존적인 양상으로 VE-카드헤린에 결합함을 나타낸다. 이와는 대조적으로 랜덤 펩티드는 무의미한 결합성을 나타내었다.

펩티드 Bβ_15-42의 VE-카드헤린에 대한 농도 의존적 결합성.

μM		0	0.23	0.7	2.3	7	14	21	35	46	70
15-42 FLAG	평균	0	0.01	0.02	0.08	0.33	0.92	1.3	1.5	1.93	2.1
	표준편차	0	0.01	0.01	0.03	0.17	0.19	0.2	0	0	0
랜덤 FLAG	평균	0	0.01	0	0.01	0.03	0.12	0.2		0.35	0.5
	표준편차	0	0.01	0	0.01	0.02	0.04	0.1		0	0

펩티드 Bβ_15-42 및 섬유소 단편은 VE-카드헤린에 대한 결합에서 경쟁한다.

다음 단계로, 상기 ELISA로 Bβ_15-42 서열의 VE-카드헤린에 대한 결합과 경쟁하는 다른 펩티드/화합물을 검색 가능한지 분석하였다. 예상한대로, 펩티드 Bβ_15-42는 FLAG-테깅된 펩티드 Bβ_15-42의 결합을 완전히 저해하여, 이를 양성 대조군으로 사용하였으며, 랜덤 펩티드 또는 용매는 효과가 없어 음성 대조군으로 사용하였다. 보다 짧은 펩티드들은 펩티드 Bβ_15-42의 VE-카드헤린 결합을 부분적으로 저해하였다. NDSK-II는 농도 의존적인 양상으로 Bβ_15-42 결합을 저해하였다. Bβ_15-42과 NDSK-II (50% 저해) 사이의 평형은 몰 비율 24:1에서 이루어졌다. NDSK는 거의 또 는 전혀 효과가 없었다.

VE-카드헤린을 8 nM 농도로 플라스틱 표면에 코팅하였다. 이후, 각 펩티드를 200 μM의 농도로 첨가하였고, NDSK 또는 NDSK-II를 지정된 농도로 첨가하였다. FLAG-테깅된 Bβ_15-42(12 μM)의 결합성은 아래와 같이 검출하였다.

블롯킹 시약 VE-카드헤린에 대한 15-42 FLAG의 결합 저해율%

평균 ± 표준편차

펩티드 15-42(28mer) 100 ± 10

펩티드 랜덤(4mer) 3 ± 3

펩티드 랜덤(28mer) 10 ± 3

용매 0 + 0

펩티드 15-18 (4mer) 200 μM 65 ± 12

펩티드 15-26 (l2mer) 200 μM 64 ± 10

펩티드 15-30 (l6mer) 200 μM 61 ± 13

펩티드 15-34 (20mer) 200 μM 67 ± 17

펩티드 15-37 (24mer) 200 μM 17 ± 19

펩티드 16-42 (27mer) 200 μM 55 ± 13

펩티드 15-18 (4mer) 12 μM 7 ± 2

펩티드 15-26 (l2mer) 12 μM 6 ± 1

펩티드 15-30 (l6mer) 12 μM 6 ± 3

펩티드 15-34 (20mer) 12 μM 7 ± 1

펩티드 15-37 (24mer) 12 μM 7 ± 2

펩티드 16-42 (27mer) 12 μM 5 ± 2

NDSK-1I 0.06 μM 1 + 0

NDSK-I1 0.12 μM 39 + 18

NDSK-1I 0.20 μM 42 + 14

NDSK-II 0.60 μM 52 + 16

NDSK-II 1.2 μM 63 + 13

NDSK-II 2.4 μM 79 + 9

NDSK-II 4.OμM 82 + 12

NDSK 0.06 μM 0 + 0

NDSK 0.12 μM 2 + 1

NDSK 0.20 μM 1 + 1

NDSK 0.60 μM 7 + 6

NDSK 1.2 μM 15 + 13

NDSK 2.4 μM 16 + 9

NDSK 4.0 μM 20 + 10

항-VE-카드헤린 Ab(TEA1/31, 1 mg/ml) 2 + 1

뎅기 바이러스로 감염된 마우스의 치료에 있어서의 펩티드 Bβ_15-42의 효능

재료 및 방법

바이러스. 뎅기 바이러스 타입 2 (DEN-2), 균주 P23085는 러시아 모스크바의 국립 바이러스 컬렉션(State Collection of Viruses)로부터 감염된 ICR 마우스 뇌를 동결건조한 것의 현탁물 형태로 제공받았다. 제공받은 뎅기 바이러스는 기존에 알려진 방법에 따라 어린 ICR 마우스의 뇌에서 계대배양하였다(Atrasheuskaya et al. FEMS Immunology and Medical Microbiology. 35, 33-423). 바이러스 원액으로 10% 뇌 현탁물을 사용하였고, -40℃에 보관하였다. 바이러스 역가는 뇌 현탁물의 연속 희석으로 결정하였다. 뇌 현탁물을 10마리의 마우스(4주령의 BALB/c)로 이루어진 그룹 각각에 복막내 접종하였고, 사망율을 기록하였다. 바이러스 역가를 계산한 결과, 7.4l g LD5O/ml이었다. 감염성 바이러스를 이용한 모든 작업은 SRC VB<<Vector>>(러시아)의 오염의 최대 생물학적 안전 단계-3(BSL-3) 실험실에서 수행하였다.

동물.

4주령의 동종 번식 웅성 BALB/c 마우스(일배체형 H-2d)를 국립 바이러스 및 생명공학 연구 센터 <<Vector>>의 사육원에서 제공받았다. 동물은 개별적인 사육장에 두고 사료와 물을 자유롭게 이용가능하게 하였다.

분석.

감염전 및 DEN-2로 기회감염한 후 메톡시플루란으로 마취된 마우스의 안와동(orbital sinus)에서 채혈하였다. 각 시간별로 3마리의 마우스에서 채혈하였다.

순환성 혈소판(PLT), 적혈구 세포(RBC), 백혈구 세포(WBC), 헤모글로빈(HGB) 및 적혈구용적률(hematocrit, HCT)을 Cell-Dyn 900 혈액 분석기(Sequoia-Turner corporation, USA, CA)을 이용하여 분석하였다. 채혈한 혈액 일부를 원심분리하여 혈청을 수득하고, 이를 실험 종결때까지 -80℃에 보관하였다. 혈청내 사이토카인의 수치는 제조사의 설명서에 따라 R&D Systems (Minneapolis, USA)사의 효소 면역분석 키트로 측정하였다. 검출 한계는 다음과 같다: TNF-α, 5.1 pg/ml 이하; 인터루킨(IL)-1β, 3.0 pg/ml; IL-6, 3.1 pg/ml; IFNγ- 20 pg/ml 이하.

동물 혈액내 뎅기 바이러스는 기존 문헌(Harris et al. J. Clin. Microbiol. 36, 2634-2639)에 따라 Rt-PCR로 동정하였다. 혈액의 총 RNA를 Quiagen(독일)의 키트로 분리하였다. 프라이머는 다음과 같다: 119 bp의 산물을 증폭하는 상위 5' AATATGCTGAAACGCGAGAGAAACCG (위치 136-161), 하위 5' AAGGAACGCCACCAAGGCCATG (위치 237-258). 바이러스 함량을 정량하기 위해, 기존에 개시된 바(Harris et al. J. Clin. Microbiol. 36, 2634-2639)와 같이 Vero E6 세포에서 DEN-2를 적정하였다. 기회감염 후 0일 및 22일째에, 생존 마우스의 혈액에서 종래 방법에 따라(Ignatyev et al. 3. Biotechnology. 44, 111-118) ELISA로 항-DEN-2 항체(lgG)를 분석하였다.

실험 설계

동종 번식시킨 4주령의 BALB/c 웅성 마우스를 6개의 주 그룹으로 나누었다. 각 그룹에는 50마리의 마우스가 포함된다. 모든 동물에 마우스 순응시킨 DEN-2 균주 P23085(전술됨)를 1 LD₅₀의 투여량으로 복막내 감염시키고, 매일 이환률을 조사하였다. 전체 주 그룹들의 첫번째 서브그룹(Al-F1)에 속한 마우스는 사망율 대조군으로 사용하였다. 각 서브그룹에는 마우스 20마리가 포함되어 있다. 두번째 서브그룹(A2-F2)의 동물은 혈청 시료를 얻기 위한 용도로 사용하였다. 각 서브그룹에는 마우스 30마리가 포함되어 있다.

그룹 설명. 각 그룹에서 n = 50

대조군은 바이러스만 투여하였다.

감염 후 3일째부터 8일째까지 펩티드 Bβ_15-42를 하루에 2번씩 4800 ㎍/ml로 복막 주입하였다.

혈액 및 혈청 시료는 채택한 시기에 수득하였다: 기회감염 후 1, 3, 5, 7, 11, 22일.

통계학적 분석은 Student's t 또는 Chi-square test로 수행하였다. P <0.05는 유의성이 있는 것으로 간주하였다.

표 1. 사망율 및 IgG 역가. 그룹간 p<0.05.

그룹	사망율(%)	생존율(%)	사망까지의 시간의 평균	IgG 역가
무처리	40	60	6.800±0.245	1:160
Bβ15-42	0	100	마우스 모두 생존	1;20

표 2

	대조군			Bβ15-42 처리군
	3일	5일	7일	3일	5일	7일
헤모글로빈 g/ml	14	10	10	15	10	15
적혈구용적률%	15	22	35	15	33	43
TNF pg/ml	33	71	65	32	65	45
IL-6 pg/ml	210	210	150	140	110	100
IL-1 pg/ml	32	55	59	32	29	28

바이러스 혈증 lg PFU/ml

	대조군	Bβ15-42
일	0	0
2	1.2 ± 0.1	1.2 ± 0.2
3b	2.4 ± 0.3	2.2 ± 0.2
4	4.4 ± 0.2	4.2 ± 0.2
5	6.0 ± 0.4	5.6 ± 0.4
6	6.2 ± 0.4	6.0 ± 0.4
7	6.3 ± 0.3	5.9 ± 0.4
28	0	0

그람 음성 쇼크

230 - 280g의 웅성 Wistar 랫을 티에르베르츠산라쥐(Tierversuchsanlage, 뒤셀도르프 대학)에서 사육하였고, 자유롭게 물과 표준 식이를 제공하였다. 모든 과정은 AAALAC 지침서 및 실험 동물의 보호 및 사용에 대한 안내서(Department of Health and Human Services, National Institutes of Health, Publication No. 86-23)에 따라 수행하였다. 또한, 모든 실험은 뒤셀도르프 대학 및 국가의 윤리 연구 위원회로부터 승인받았다. 종래에 기술된 바와 같이(Zacharowski et al. Crit Care Med 2000, Zacharowski et al. Crit Care Med 2001; 29: 1599-1608), 랫을 소듐 티오펜톤(120 mg/kg i.p.)로 마취시키고 소듐 티오펜톤 적량을 공급하여 마취상태를 유지시켰다.

호흡을 용이하게하기 위해 기관에 캐뉼러를 꽂고, 항온성 담요를 사용하여 직장온도를 37 ℃로 유지시켰다. 우측 목동맥에 카테터를 꽂고, IBM 컴퓨터에 설 치된 데이타 입수 시스템(MacLab 8e, ADI Instruments, Germany)상에 표시되는 위상 및 평균 동맥압(MAP)과 심장박동수(HR)를 측정하기 위해 압력 변환기에 연결하였다. 우측 목정맥에 약물 투여를 위해 캐뉼러를 꽂았다. 또한, 방광에 캐뉼러를 꽂아 뇨의 흐름을 용이하게 하였고, 포스트-신부전증 발생 가능성을 예방하였다. 동물 모두에게 실험동안 1.0 ml/kg/h(0.9% 소듐 클로라이드, 염수, 목정맥에 정맥내 주입으로)으로 총 체액 보충을 실시하였다. 외과적 과정이 완료되면, 심혈관 매개변수가 15분간 안정되도록 하였고, 6시간 동안 계속적으로 기록하였다. LPS-유도성 다중 기관 기능상실 모델에서, 6시간은 AST 및 ALT의 혈청 수치가 현저하게 증가하기에 필수적이지만, 유레아 및 크레아티닌의 혈청 수치상의 현저한 증가는 2시간 후에 이미 관찰되었다.

3 그룹을 연구하였다:

랫 모의 조작을 실시하였다:(모의)

랫에서 그람 음성 쇼크를 수행하였다. E.coli, 혈청형 0.127:B8(6 mg/kg i.v.) 유래의 리포폴리사카라이드를 5분간 정맥내로 제공하고, 1 시간 후 동물에 염수(2.4 ml/kg):(LPS + 염수)를 제공하였다.

랫에서 그람 음성 쇼크를 수행하였다. E.coli, 혈청형 0.127:B8(6 mg/kg i.v.) 유래의 리포폴리사카라이드를 5분간 정맥내로 제공하고, 1 시간 후 동물에 Bβ_15-42(2.4 mg/kg):(LPS + Bβ_15-42)를 제공하였다.

각 그룹에서 생존율 n = 20, p<0.05

모의	LPs + 염수	LPS + Bβ15-42
100%	25%	88%

그람 음성 쇼크 도입후 6시간 후, 우측 목동맥에 설치한 카테터로부터 혈액을 채혈하였다. 혈액 시료를 원심분리(상온에서 3분간 1610 xg)하여 혈장을 분리하였다. 다중 기관 손상/기능 장애의 생화학적 지표로서 하기 마커 효소를 혈장에서 측정하였다:

알라닌 아미노트랜스퍼라제(ALT, 간 실질 손상에 대한 특이 마커) 및 아스파르테이트 아미노트랜스퍼라제(AST, 간 손상의 비특이적 마커)의 혈장 수치 증가를 측정함으로써, 간 손상을 분석하였다.

신장 기능 장애는, 혈장내 유레아(신장의 배출 기능 손상 및/또는 분해대사 증가의 지표) 및 크레아티닌(사구체 여과율 감소, 즉 신장 기능 장애의 지표) 증가를 측정함으로써, 평가하였다. 혈장내 글루코스 및 아밀라제 수치는, 이자 기능 및 손상의 간접 지표로서 측정하였다.

또한, 동맥 PO₂를 폐 기능/손상의 간접 지표로서 측정하였다. 실험 값

	모의	대조군	Bβ15-42
ALT	39.8	542.3	261.9
표준오차평균	5.2	117.2	42.7
AST	194.1	908.8	529.0
표준오차평균	30.8	140.9	75.7
크레아티닌	0.5	0.7	0.6
표준오차평균	0.0	0.1	0.1
유레아	49.1	123.2	107.8
표준오차평균	5.8	4.6	5.9
글루코스	131.5	75.3	45.8
표준오차평균	7.5	5.4	9.1
아밀라제	1713.3	1837.4	1945.1
표준오차평균	131.5	122.7	176.8
PO2	90.0	67.0	98.7
표준오차평균	1.8	3.7	8.2

평균 동맥압

시간(h)	모의	LPS	LPS + Bβ15-42
	평균 표준오차평균	평균 표준오차평균	평균 표준오차평균
0	120.9 5.5	118.9 5.4	128.9 5.2
1	111.5 10.6	90.7 5.5	83.7 4.6
2	113.2 7.3	100.2 5.1	102.3 4
3	116.4 5.4	90 7.4	103.2 4
4	108.7 8.9	81.1 7.9	101.2 3
5	104.1 9.6	60.1 10.8	97.1 5.4
6	104.1 9.6	34.1 7.7	107.7 9.6

심장 박동수

시간(h)	모의	LPS	LPS + Bβ15-42
	평균 표준오차평균	평균 표준오차평균	평균 표준오차평균
0	482.2 17	457 18.1	436.9 6.4
1	461.7 12.1	511.2 27.4	484.8 18.6
2	488.1 13.6	523.3 27.3	484.1 10.3
3	506.6 26.6	518.5 24.9	509.8 12
4	488.9 17.4	516.7 32.1	516.7 13.4
5	470.4 13.9	515.5 26.1	533.7 30.7
6	443.7 0.7	530.1 27.7	541.6 24.4

모든 실험 그룹의 기관(폐, 간, 심장 및 신장) 생체시료를 실험 종료시 취하였다. 이들 생체시료는 완충화된 포름알데하이드 용액(포스페이트 완충화된 염수내 4%)로 상온에서 고정시켜 비엔나로 보내었다. 표준 H & E 염색된 부분에서 차 이점은 나타나지 않았다. 그로나, 산성 푸친(fuchin)-오렌지 G를 이용한 섬유소 침전물을 염색한 부위에서, LPS + Bβ_15-42(p<0.05)를 처리한 동물에 비하여 LPS를 단독으로 투여한 대조군에서 섬유소 혈전이 매우 증가된 수치로 관찰되었다. 모의 처리한 동물에서는 섬유소 혈전이 없었다.

혈관내 평균 섬유소 혈전 수

	LPS + 염수	LPS + Bβ15-42
심장	28 + 13	5 + 2
신장	17 + 8	2 + 9
간	47 + 41	78 + 37
폐	1.7 + 1	1 + 0

Claims (9)

1. 쇼크 치료용 약학적 조제물의 제조를 위한, 인간 섬유소의 Bβ-체인(즉, Bβ_15-42)상의 유도성 VE-카드헤린 결합 모티프에 부합되는 생물학적 특성을 가지는 일반식 I의 펩티드의 용도:

   

   상기 식에서, R₁ 및 R₂는 동일하거나 상이하며, 수소, 1 내지 10개의 탄소 원자, 특히 1 내지 3개의 탄소 원자를 포함하는 포화 또는 불포화 탄화수소 모이어티이고,

   Z₁은 히스티딘 또는 프롤린 모이어티이고,

   Z₂는 아르기닌 모이어티, 또는 첫번째에 아르기닌 모이어티를 포함하며 특히, 2 내지 30개의 아미노산을 포함하는 펩티드 모이어티 또는 단백질 모이어티이다.
2. 제 1항에 있어서, 상기 펩티드는 일반식 II로 표시되는 것을 특징으로 하는, 용도:

   

   상기 식에서,

   Z₁은 히스티딘 또는 프롤린 모이어티이고,

   Arg는 아르기닌 모이어티이고,

   Z₃은 프롤린 또는 발린 모이어티이고,

   Z₄는 루신 또는 발린 모이어티이고,

   Z₅는 2 내지 30개의 아미노산을 포함하는 펩티드 모이어티 또는 단백질 모이어티, 또는 1 내지 10개의 탄소 원자, 특히 1개 내지 3개의 탄소 원자를 포함하는 알콜 모이어티, 또는 유기 또는 무기 염기 모이어티를 포함한다.
3. 제 2항에 있어서, Z₅는 섬유소의 α-체인으로부터 유래된 펩티드 모이어티인 것을 특징으로 하는, 용도.
4. 제 2항에 있어서, Z₅는 섬유소의 β-체인으로부터 유래된 펩티드 모이어티인 것을 특징으로 하는, 용도.
5. 제 2항에 있어서,

   Z₅는 Asp Lys Lys Arg Glu Glu Ala Pro Ser Leu Arg Pro Ala Pro Pro Ile Ser Gly Gly Gly Tyr Arg의 아미노산 서열을 포함하는 펩티드 모이어티이고,

   Z₁은 히스티딘 모이어티이고,

   Arg는 아르기닌 모이어티이고,

   Z₃는 프롤린 모이어티이고, 및

   Z₄는 루신 모이어티인 것을 특징으로 하는, 용도.
6. 제 2항에 있어서,

   Z₅는 Glu Arg His Gln Ser Ala Cys Lys Asp Ser Asp Trp Pro Phe Cys Ser Asp Glu Asp Trp Asn Tyr Lys의 아미노산 서열을 포함하는 펩티드 모이어티이고,

   Z₁은 프롤린 모이어티이고,

   Arg는 아르기닌 모이어티이고,

   Z₃는 발린 모이어티이고, 및

   Z₄는 발린 모이어티인 것을 특징으로 하는, 용도.
7. N-말단 서열 Glu-His-Arg-Pro-Leu-Asp-Lys-Lys-Arg-Glu-Glu-Ala-Pro-Ser-Leu-Arg-Pro-Ala-Pro-Pro-Pro-Ile-Ser-Gly-Gly-Gly-Tyr-Arg을 가지며, 쇼크 치료용 약학적 조제물의 제조를 위한, 인간 섬유소의 Bβ-체인(즉, Bβ_15-42)상의 유도성 VE-카드헤린 결합 모티프에 부합되는 생물학적 특성을 가지는, 펩티드의 용도
8. 제 7항에 있어서, 펩티드는 Gly-His-Arg-Pro-Leu-Asp-Lys-Lys-Arg-Glu-Glu-Ala-Pro-Ser-Leu-Arg-Pro-Ala-Pro-Pro-Pro-Ile-Ser-Gly-Gly-Gly-Tyr-Arg의 아미노산 서열을 갖는 것을 특징으로 하는, 용도.
9. 제 1항 내지 8항중 어느 한항에 있어서, 쇼크는 세균성 독소, 파종성 혈관내 응고증(disseminated intravascular coagulopathy), 괴사성 근막염(necrotizing fasciitis), 바이러스 감염, 특히 필로바이러스, 아레비리데(arenaviridae), 부니아비이데(bunyaviridae), 플라비바이러스, 뎅기에 의해 초래된 출혈성 쇼크, 감염성 물질 또는 자가면역 질환에 의한 급성 출혈성 호흡기능 상실, 기관 손상 이후의 기관 기능 상실, 특히 심근 경색, 혈관 수술, 기관의 클램핑(clamping), 출혈성 쇼크, 폐 경색, 간 경색, 장 경색, 외과 수술 및 발작, 및 이식된 기관의 기관 기능 장애로 이루어진 군으로부터 선택된 한 가지 이상과 관련있는 것을 특징으로 하는, 용도.