ES2917613T3 - Procedimiento de purificación de fibrinógeno - Google Patents

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Ju Ho Lee
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Abstract

La presente divulgación se relaciona con un método para purificar el fibrinógeno, y más particularmente con un método para purificar el fibrinógeno, que comprende los pasos de: (a) fibrinógeno precipitante de una solución que contiene fibrinógeno agregando glicina a la solución para una concentración de glicina para ser 1.5 a 2.5m, y luego eliminando un sobrenadante y recuperando un precipitado (1 st precipitación de glicina); (b) Disolver el precipitado de la precipitación de 1 st de la PASA (A) en un tampón de disolución para obtener una solución, precipitando la solución agregando glicina a la misma para una concentración de glicina de 0.2 a 1.2M, y recuperando un sobrenadante (2 (2 (2 (2 nd precipitación de glicina); (c) precipitar el sobrenadante del paso (b) agregando glicina en el mismo para que una concentración de glicina sea 1.5 a 2.5M, y recuperando un precipitado (precipitación de 3 rd); y (d) disolver el precipitado del paso (c) en un tampón de disolución para obtener una solución y someter la solución a la nanofiltración (NF) usando un nanofilter. El nuevo método para purificar la proteína de fibrinógeno de acuerdo con la presente divulgación es un método altamente seguro que bloquea fundamentalmente la entrada de virus. Además, puede purificar la proteína de fibrinógeno con alta pureza y alta tasa de recuperación en un proceso simple, y por lo tanto es muy económico y eficiente. Además, el fibrinógeno purificado por el método de la presente divulgación tiene una ventaja sobre el fibrinógeno purificado por un método convencional en que tiene mayor pureza y, por lo tanto, ha aumentado la actividad local, lo que indica que puede usarse efectivamente para la prevención y el tratamiento de la sangre de la sangre. -No enfermedades relacionadas, particularmente enfermedades de coagulación de sangre. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)

Description

DESCRIPCIÓN
Procedimiento de purificación de fibrinógeno
Campo técnico
La presente divulgación se refiere a un procedimiento de purificación de fibrinógeno, y más particularmente, a un procedimiento de purificación de fibrinógeno, que comprende las etapas de: (a) precipitar el fibrinógeno de una solución que contiene fibrinógeno añadiendo glicina a la solución para que la concentración de glicina sea de 1,5 a 2,5M, y luego eliminar un sobrenadante y recuperar un precipitado (1a precipitación con glicina); (b) disolver el precipitado de la ia precipitación con glicina de la etapa (a) en un tampón de disolución para obtener una solución, precipitar la solución añadiendo glicina a la misma para que la concentración de glicina sea de 0,5 a 0,9M, y recuperar un sobrenadante (2a precipitación con glicina); (c) precipitar el sobrenadante de la etapa (b) añadiendo glicina al mismo para una concentración de glicina de 1,5 a 2,5M, y recuperar un precipitado (3a precipitación con glicina); y (d) disolver el precipitado de la etapa (c) en un tampón de disolución para obtener una solución, y someter la solución a nanofiltración (NF) utilizando un nanofiltro.
Técnica antecedente
El fibrinógeno, también conocido como factor I de coagulación, desempeña un papel fundamental en la hemostasia y la cicatrización de heridas. Es una glicoproteína sintetizada en el hígado con un peso molecular aparente de 340 kDa, y está compuesta por dos dímeros, cada uno de ellos construido por tres pares de cadenas polipeptídicas no idénticas llamadas Aa, Bp y y unidas por puentes disulfuro. Circula en el torrente sanguíneo a una concentración de aproximadamente 150-400 pg/ml. Al lesionarse los vasos sanguíneos, las plaquetas se activan y se forma un tapón. El fibrinógeno interviene en la hemostasia primaria al contribuir a la reticulación de las plaquetas activadas.
Al mismo tiempo, se inicia la activación de la cascada de coagulación. Como punto final, el fibrinógeno se convierte en fibrina por la liberación proteolítica del fibrinopéptido A y , a un ritmo más lento, del fibrinopéptido B por la trombina. Los monómeros de fibrina solubles se ensamblan en fibrillas retorcidas de doble cadena. Posteriormente, estas fibrillas se disponen de forma lateral, dando lugar a fibras más gruesas. A continuación, estas fibras son reticuladas por el FXIIIa a una red de fibrina, que estabiliza el tapón plaquetario por las interacciones de la fibrina con las plaquetas activadas, dando lugar a un coágulo estable.
BLOMBACK, "Purificación del fibrinógeno bovino y humano", ACTA CHEMICA SCANDINAVICA, vol. 10, n° 1, 1 de enero de 1956, página 147 divulga la purificación del fibrinógeno bovino y humano. Se ha comprobado que el efecto de la salificación en el fibrinógeno aumenta bruscamente al aumentar la concentración de glicina a 0,5M con una fuerza iónica de 0,3 y que a mayor concentración de glicina se produce un efecto de desplazamiento salino.
OKUDA MASAHIRO ET AL, "Un nuevo procedimiento de purificación de fibrinógeno con actividad tanto biológica como inmunológica a partir de plasma humano", PREPARATIVE BIOCHEMISTRY & BIOTECHNOLOGY, vol. 33, No. 4, páginas 239-252 divulga un procedimiento de purificación de fibrinógeno con actividad tanto biológica como inmunológica a partir de plasma humano. Mediante una combinación de fraccionamiento en etanol de Cohn, virus, inactivación, precipitación con glicina y cloruro sódico, y cromatografía de afinidad con licina-Sepharose, se desarrolló un procedimiento único y rápido simplificado para obtener fibrinógeno altamente purificado para uso diagnóstico con actividad biológica e inmunológica.
Trastornos y deficiencias
La afibrinogenemia congénita es un trastorno hemorrágico raro, en el que los pacientes sufren una coagulación inadecuada de la sangre debido a la falta o al mal funcionamiento del fibrinógeno. Este trastorno puede provocar una hemorragia espontánea o una hemorragia excesiva después de un traumatismo menor o durante procedimientos intervencionistas.
Las deficiencias adquiridas de fibrinógeno son mucho más comunes que la afibrinogenemia congénita y pueden ser inducidas por la hemodilución u otros eventos como las pérdidas de sangre durante la cirugía, los traumatismos, la coagulación intravascular diseminada (CID) o la sepsis.
Las deficiencias de fibrinógeno pueden corregirse hasta alcanzar niveles normales de fibrinógeno de aproximadamente 1,5-3 g/l en el plasma mediante una terapia de sustitución con infusión intravenosa de plasma fresco congelado o crioprecipitado. Sin embargo, estos tratamientos tienen el riesgo de introducir agentes patógenos, por ejemplo, virus o priones, en el paciente, lo que provoca trastornos adicionales. Por lo tanto, es aconsejable aplicar por vía intravenosa composiciones de fibrinógeno inactivado por virus para restablecer el fibrinógeno a niveles fisiológicos de forma segura.
Purificación del fibrinógeno
El plasma humano contiene una mezcla compleja de más de 100 proteínas, y el fibrinógeno representa aproximadamente el 2% de la cantidad total de proteínas. Por lo tanto, la purificación y el aislamiento del fibrinógeno suelen requerir una pluralidad de etapas, y son posibles diversas combinaciones para estas etapas individuales del procedimiento.
Un componente importante de la purificación del fibrinógeno del plasma humano es la precipitación convencional. Los procedimientos de precipitación conocidos utilizan aminoácidos como glicina o alanina (véase: Patente europea n° EP0383234 Publicación internacional n° WO2001/48016 Jakobsen & Kierulf, Thrombosis Research, 3:145-159, 1973), sulfato de amonio (véase: Patente de EE.UU. n° 5.773.033 Patente estadounidense n° 6.037.457 Takeda, Y, Journal of Clinical Investigation, 45:103-111, 1966), polímeros como el polietilenglicol (PEG) (véase: Publicación Internacional No WO1995/25748 Vila et al., Thrombosis Research 39:651-656, 1985), etanol (véase Patente europea n° EP0408029 en la que el fibrinógeno se precipita y se separa de otras proteínas plasmáticas con etanol al 5-10% Blomback & Blomback, Arkiv For Kemi, 10:415-443, 1956), polisacáridos sulfatados (SPS, por ejemplo, heparina) (véase Publicación internacional n° WO1999/37680 Patente estadounidense n° 4.210.580), y soluciones de baja fuerza iónica (ver: Patente de EE.UU. n° 4.188.318).
Entre los ejemplos de las tecnologías convencionales divulgadas asociadas a la precipitación con glicina en los procedimientos de purificación de fibrinógeno humano se incluyen un procedimiento de precipitación con glicina de dos etapas que comprende la eliminación de impurezas producidas en un procedimiento de pasteurización para eliminar partículas patógenas (por ejemplo, virus) y la concentración de fibrinógeno (CSL Behring, 2009), y un procedimiento de precipitación con glicina de tres etapas que obtiene un precipitado de fibrinógeno mediante el uso de sólo glicina de alta concentración 1,5-1,7M (Para una referencia: Patente de EE.UU. n° 7.442.308; Grifols, ES). Sin embargo, aún no se ha informado de que se elimine un precipitado de glicina que contenga impurezas y sustancias insolubles al realizar un procedimiento de precipitación utilizando glicina a una concentración que es de 2 a 4 veces menor que la concentración de glicina utilizada en el procedimiento descrito anteriormente, el sobrenadante recuperado se precipita con una alta concentración de glicina, y la tasa de recuperación de fibrinógeno de alta pureza se incrementa al mejorar la eficiencia de la nanofiltración, cuando se nanofiltra una solución de fibrinógeno que contiene el precipitado disuelto en ella.
Bajo estos antecedentes técnicos, los presentes inventores se han esforzado por desarrollar un procedimiento de purificación de fibrinógeno, que comprende las etapas de: (a) precipitar el fibrinógeno de una solución que contiene fibrinógeno añadiendo glicina a la solución para que la concentración de glicina sea de 1,5 a 2,5M, eliminando a continuación un sobrenadante y recuperando un precipitado (1a precipitación con glicina); b) disolver el precipitado de la 1a precipitación con glicina de la etapa a) en un tampón de disolución para obtener una solución, precipitar la solución añadiendo glicina a la misma para una concentración de glicina de 0,5 a 0,9M, y recuperar un sobrenadante (2a precipitación con glicina); (c) precipitar el sobrenadante de la etapa (b) añadiendo glicina al mismo para una concentración de glicina de 1,5 a 2,5M, y recuperar un precipitado (3‘ precipitación con glicina); y (d) disolver el precipitado de la etapa (c) en un tampón de disolución para obtener una solución, y someter la solución a nanofiltración (NF) utilizando un nanofiltro, la eficiencia de la filtración aumenta al menos 2 veces, de modo que se puede recuperar fibrinógeno de alta pureza del que se eliminó el virus, completando así las invenciones de la presente divulgación.
Divulgación de la invención
Problema técnico
Es un objeto de la presente divulgación proporcionar un procedimiento de purificación de fibrinógeno de alta pureza, que puede aumentar la eficiencia de la nanofiltración.
Solución técnica
Para lograr el objeto anterior, la presente divulgación proporciona un procedimiento de purificación de fibrinógeno, que comprende las etapas de: (a) precipitar el fibrinógeno de una solución que contiene fibrinógeno añadiendo glicina a la solución para que la concentración de glicina sea de 1,5 a 2,5M, y luego eliminar un sobrenadante y recuperar un precipitado (1a precipitación con glicina); (b) disolver el precipitado de la 1a precipitación con glicina de la etapa (a) en un tampón de disolución para obtener una solución, precipitar la solución añadiendo glicina a la misma para que la concentración de glicina sea de 0,5 a 0,9M, y recuperar un sobrenadante (2a precipitación con glicina); (c) precipitar el sobrenadante de la etapa (b) añadiendo glicina al mismo para una concentración de glicina de 1,5 a 2,5M, y recuperar un precipitado (3a precipitación con glicina); y (d) disolver el precipitado de la etapa (c) en un tampón de disolución para obtener una solución, y someter la solución a nanofiltración (NF) utilizando un nanofiltro.
Breve descripción de los dibujos
La FIG. 1 muestra un procedimiento de purificación de fibrinógeno según la presente divulgación.
La FIG. 2 muestra un procedimiento de preparación específi
de criopasta mediante el uso de un procedimiento de purificación de fibrinógeno según la presente divulgación.
La FIG. 3 muestra la pureza del fibrinógeno obtenida al realizar sólo el primer y el tercer procedimiento de precipitación con glicina sin un segundo procedimiento de precipitación con glicina.
La FIG. 4 muestra la pureza del fibrinógeno obtenida al realizar todos los procedimientos de precipitación con glicina primero y tercero (en las condiciones de 20°C, 0,75M y 15 mg/mL).
La FIG. 5 muestra la pureza del fibrinógeno obtenida al realizar todos los procedimientos de precipitación con glicina primero a tercero (en las condiciones de 25°C, 0,8M y 20 mg/mL).
La FIG. 6 muestra la pureza del fibrinógeno obtenida al realizar todos los procedimientos de precipitación con glicina primero a tercero (en las condiciones de 15°C, 0,8M y 10 mg/mL).
La FIG. 7 muestra la pureza del fibrinógeno obtenida al realizar todos los procedimientos de precipitación con glicina primero a tercero (en las condiciones de 15°C, 0,5M y 20 mg/mL).
La FIG. 8 muestra la cantidad de fibrinógeno filtrado a través de un filtro Planova 20N después de realizar o no un segundo procedimiento de precipitación con glicina.
Mejor modo de llevar a cabo la invención
A menos que se definan de otro modo, todos los términos técnicos y científicos utilizados en el presente documento tienen el mismo significado que los entendidos generalmente por una persona con conocimientos ordinarios en la técnica a la que pertenece la invención. En general, la nomenclatura utilizada aquí y los procedimientos de experimentación, que se describirán a continuación, son los bien conocidos y comúnmente empleados en la técnica. Los términos "procedimiento", "purificación", "separación" y "aislamiento", utilizados indistintamente en el presente documento, se refieren al uso de al menos un procedimiento o sistema para lograr un propósito específico (por ejemplo, la purificación del fibrinógeno) en un procedimiento de purificación.
En un aspecto, la presente divulgación se dirige a un procedimiento de purificación de fibrinógeno, que comprende las etapas de: (a) precipitar el fibrinógeno de una solución que contiene fibrinógeno añadiendo glicina a la solución para que la concentración de glicina sea de 1,5 a 2,5M, y luego eliminar un sobrenadante y recuperar un precipitado (1a precipitación con glicina); (b) disolver el precipitado de la 1a precipitación con glicina de la etapa (a) en un tampón de disolución para obtener una solución, precipitar la solución añadiendo glicina a la misma para que la concentración de glicina sea de 0,5 a 0,9M, y recuperar un sobrenadante (2a precipitación con glicina); (c) precipitar el sobrenadante de la etapa (b) añadiendo glicina al mismo para una concentración de glicina de 1,5 a 2,5M, y recuperar un precipitado (3a precipitación con glicina); y (d) disolver el precipitado de la etapa (c) en un tampón de disolución para obtener una solución, y someter la solución a nanofiltración (Nf ) utilizando un nanofiltro.
A diferencia del procedimiento convencional que comprende una etapa de obtención de un precipitado a partir de un procedimiento de precipitación con glicina, el procedimiento de purificación del fibrinógeno según la presente divulgación, que comprende un procedimiento de precipitación realizado con glicina a una concentración relativamente baja, y luego el sobrenadante, pero no el precipitado, se recupera y se nanofiltra, permite obtener fibrinógeno con una pureza muy elevada. Específicamente, el procedimiento de purificación de fibrinógeno según la presente divulgación tiene efectos en cuanto a que el uso del procedimiento inventivo aumenta la eficiencia de filtración de un nanofiltro en más del doble para exhibir una alta recuperación de fibrinógeno con una pureza del 98%, y los procedimientos de precipitación se realizan usando glicina a concentraciones reducidas para que las impurezas producidas en el procedimiento de inactivación del virus puedan ser eliminadas así como la eficiencia de filtración del nanofiltro pueda ser aumentada como se muestra en la Tabla 2 y las FIGS. 3 a 8.
En una realización, la concentración de glicina en la 1a precipitación con glicina en la etapa (a) es de 1,5 a 2,5M, preferiblemente de 1,8 a 2,2M, más preferiblemente de 1,9 a 2,1M.
La concentración de glicina en la 2a precipitación con glicina en la etapa (b) es de 0,5 a 0,9M.
En una realización, la concentración de glicina en la 3a precipitación con glicina en la etapa (c) es de 1,5 a 2,5M, preferiblemente de 1,8 a 2,3M, más preferiblemente de 1,9 a 2,2M.
El tampón de disolución utilizado para disolver el precipitado en las etapas (b) y (d) puede ser un tampón de disolución utilizado comúnmente en la técnica a la que pertenece la presente divulgación, y la disolución del precipitado puede realizarse utilizando un tampón que contenga preferentemente de 10 a 100mM, más preferentemente de 30 a 70mM de citrato de sodio a un pH de 6,0 a 9,0, preferentemente de 7,0 a 8,0, más preferentemente de 7,5.
En una realización, la precipitación con glicina y la recuperación del precipitado pueden realizarse añadiendo una concentración adecuada de glicina en cada etapa, y agitando con 200 a 1.000 rpm a 4 a 30°C, seguido de centrifugación bajo 3.000 a 10.000 rpm a 4 a 25°C, pero el alcance de la presente divulgación no está limitado a ello.
Además, la nanofiltración en la etapa (d) puede realizarse utilizando un sistema de nanofiltración disponible en el mercado, y el tipo de filtro que puede utilizarse en la presente divulgación es preferentemente SV4 20N de Pall Corporation o Planova 20N de Asahi Kasei Co., Ltd., pero no está limitado a ello, y puede realizarse utilizando un tampón adecuado. Preferiblemente, se puede utilizar un tampón que contenga de 10 a 30mM de citrato de sodio, de 50 a 150mM de NaCl, de 1 a 7%, preferiblemente de 2 a 5% de arginina a un pH de 6,0 a 9,0, preferiblemente de 7,0 a 8,0, más preferiblemente de 7,2 a 7,8. La nanofiltración en la etapa (d) puede realizarse entre 20 y 37°C, preferentemente entre 28 y 35°C, y más preferentemente entre 25 y 35°C, bajo una presión de 100 a 200 kPa cuando se utiliza SV420N y de 50 a 100 kPa cuando se utiliza Planova 20N.
Preferentemente, la solución que contiene fibrinógeno de la etapa (a) puede obtenerse mediante un procedimiento que comprende las etapas siguientes, pero no se limita a ellas:
(i) disolver una criopasta que contenga fibrinógeno utilizando un tampón de disolución para obtener una solución;
(ii) añadir un adsorbente a la solución, eliminando así las impurezas por adsorción; y
(iii) inactivar los virus, contenidos en la criopasta, mediante un tratamiento con disolvente/detergente (S/D). La criopasta de la etapa (i) puede disolverse utilizando el tampón de disolución en una proporción de volumen de 1:2 a 1:6, preferiblemente de 1:3 a 1:5, más preferiblemente de 1:4. El tampón de disolución en la etapa (i) puede ser un tampón que contenga de 10 a 30 mM, preferiblemente 20 mM de citrato de sodio, de 50 a 150 mM, preferiblemente 100 mM de NaCl, y de 50 a 150 mM, preferiblemente 100 mM de glicina, pero no está limitado a ello.
Además, el adsorbente utilizado en la etapa (ii) es preferentemente hidróxido de aluminio (Al(OH)3 ), pero no está limitado a ello. El gel de adsorción de Al(OH)3 , que es un precipitado de adsorción de impurezas, puede ser eliminado por centrifugación. El adsorbente, el hidróxido de aluminio, puede tener una concentración del 1,0 al 5,0%, preferentemente del 1,5 al 3,0%, más preferentemente del 2,0%, y puede utilizarse en una cantidad del 0,05 al 0,5 % en peso, preferentemente del 0,07 al 0,3 % en peso, más preferentemente del 0,9 al 0,15 % en peso, sobre el peso de la criopasta.
En el tratamiento con disolvente/detergente de la etapa (iii), se puede utilizar cualquier disolvente y detergente sin limitaciones, siempre que tengan la capacidad de inactivar los virus, especialmente los virus con envoltura lipídica. El detergente puede seleccionarse del grupo que consiste en detergentes no iónicos e iónicos y se selecciona preferentemente para que sea sustancialmente no desnaturalizante. En particular, es preferible un detergente no iónico en términos de conveniencia de eliminación, y el disolvente es más preferentemente fosfato de tri-n-butilo (TNBP) como se divulga en Patente estadounidense n° 4.764.369pero no se limita a ello.
Preferiblemente, el tratamiento con disolvente/detergente de la etapa (iii) puede realizarse utilizando una solución de disolvente/detergente que contenga un detergente no iónico y tri-n-butil fosfato (TNBP). El agente inactivador de virus que se utiliza en la presente divulgación es preferentemente una mezcla de TNBP y al menos uno seleccionado entre polisorbato 80 (Tween 80), polisorbato 20 (Tween 20), Tritón X-100 y Tritón X-45, pero no se limita a ello.
La mezcla preferida de disolvente/detergente se añade para que la concentración de TNBP en la solución que contiene fibrinógeno sea de 0,2 a 0,6 % en peso, preferiblemente de 0,24 a 0,36 % en peso, y para que la concentración de Tween 80 sea de 0,5 a 1,5 % en peso, preferiblemente de 0,8 a 1,2 % en peso.
Además, el procedimiento de la presente divulgación puede comprender además, entre las etapas (c) y (d), la etapa (c') de disolver el precipitado recuperado en la etapa (c) en tampón de disolución para obtener una solución, precipitando la solución mediante la adición de glicina a la misma para que una concentración de glicina sea idéntica a la concentración de glicina de la etapa (a), para obtener un precipitado (4a precipitación con glicina).
El procedimiento de la presente divulgación puede comprender opcionalmente, después de la nanofiltración de la etapa (d)
(e) etapa de ultrafiltración/diafiltración (UF/DF) o ultrafiltración; y/o
(f) etapa de formulación.
Tal y como se utiliza en el presente documento, la "diafiltración" se refiere a una técnica que elimina o recoge cualquier componente (por ejemplo, partículas) de una sustancia objetivo (solución) utilizando un filtro permeable capaz de lograr la separación según el peso molecular (tamaño molecular) del componente, aumentando así la pureza de la sustancia objetivo. La ultrafiltración/diafiltración (UF/DF) en la etapa (e) puede realizarse utilizando un sistema típico de UF/DF, y puede comprender un cambio a una presión osmótica constante, un intercambio de un tampón y un ajuste de la concentración del tampón.
El término "fibrinógeno" se refiere preferentemente al fibrinógeno humano que puede ser purificado, por ejemplo, a partir de una mezcla que contiene fibrinógeno y que ha sido obtenida de la sangre humana. La frase "mezcla obtenida de la sangre" se refiere, por ejemplo, a la sangre total, el plasma sanguíneo, las fracciones de plasma o los precipitados de plasma. Se prefiere el fibrinógeno del plasma humano o del crioprecipitado, en particular el fibrinógeno de la fracción 1 de Cohn. El fibrinógeno se puede aislar tanto de donaciones de plasma agrupadas como de donaciones individuales.
El fibrinógeno humano también puede obtenerse de los fluidos corporales (por ejemplo, la leche) de animales transgénicos (Patente de EE.UU. n° 5.639.940) o por expresión recombinante a partir de cultivos celulares (Patente estadounidense n° 6.037.457). Además, el fibrinógeno puede aislarse de los sobrenadantes de fermentación apropiados o de las fracciones producidas a partir de ellos. Por su parte, el fibrinógeno puede aislarse de sangre animal que contenga fibrinógeno, preferentemente de mamíferos (por ejemplo, cerdos, caballos, vacas, cabras, ovejas y perros).
Las impurezas o proteínas insolubles en la presente divulgación se refieren a todas las proteínas que se encuentran en el plasma que no son fibrinógeno o que aparecen en los fluidos corporales (por ejemplo, leche) de los animales transgénicos o en el sobrenadante de los cultivos celulares, y preferentemente, a las proteínas degradantes del fibrinógeno que son capaces de degradar el fibrinógeno por proteólisis, o a los precursores de las proteínas degradantes del fibrinógeno (proenzimas) que deben ser activados previamente para la degradación proteolítica del fibrinógeno, o a los activadores de las proteasas degradantes del fibrinógeno, y podrían incluirse los fragmentos de degradación del fibrinógeno que tienen pesos moleculares bajos.
La expresión "criopasta que contiene fibrinógeno" se refiere a un crioprecipitado que contiene fibrinógeno derivado de los animales descritos anteriormente (preferiblemente humanos).
En la presente divulgación, el "pH" de una solución (por ejemplo, una solución disuelta) mide la acidez o alcalinidad relativa a la ionización de una muestra de agua. El pH del agua es neutro, es decir, 7. La mayoría de las lecturas de pH oscilan entre 0 y 14. Las soluciones con un [H+] mayor que el agua (pH inferior a 7) son ácidas; las soluciones con un [H+] menor que el agua (pH superior a 7) son básicas o alcalinas. El pH puede medirse con un medidor de pH. El pH del tampón puede ajustarse utilizando un ácido o una base como HCl o NaOH. El tampón de disolución utilizado en la presente divulgación se encuentra preferentemente en el rango de pH neutro.
Tal y como se utiliza en este documento, el término "purificación" puede utilizarse indistintamente con el término "clarificación" y se refiere a la redisolución de un precipitado o similar utilizando un tampón, y a la posterior eliminación de impurezas de la solución resultante de la redisolución.
El fibrinógeno purificado por el procedimiento de la presente divulgación tiene una pureza de al menos el 90%, preferiblemente al menos el 93%, más preferiblemente al menos el 98%. En particular, la proteína de fibrinógeno producida en la presente divulgación puede ser una proteína de fibrinógeno con una pureza de al menos el 98%. Ejemplos
En lo sucesivo, la presente divulgación se describirá con más detalle haciendo referencia a ejemplos. Será obvio para una persona con conocimientos ordinarios de la técnica que estos ejemplos son sólo para fines ilustrativos y no deben interpretarse para limitar el alcance de la presente divulgación.
Ejemplo 1: Procedimiento de disolución de la criopasta que contiene fibrinógeno y tratamiento con gel de Al(OH) 3
1) Se colocaron 4L de tampón de disolución (que contenía 50mM de citrato de sodio a pH 7,5, 100mM de cloruro de sodio (NaCl) y 100mM de glicina) para disolver la criopasta que contenía fibrinógeno en un vaso de precipitados encamisado, y luego se agitó a una temperatura de circulación controlada de 37°C durante 30 minutos o más. En este momento, la temperatura del tampón se mantuvo a 37°C.
2) Se añadió 1 kg de criopasta con fibrinógeno a 4 L del tampón de disolución (criopasta con fibrinógeno: tampón de disolución =1 kg: 4 L), y luego se agitó a una velocidad controlada del agitador de 150 rpm a 37°C durante 2 horas.
3) La solución de criopasta que contiene fibrinógeno se controló hasta una temperatura de 20 a 25°C, y a continuación se añadieron 150 g de hidróxido de aluminio (Al(OH)3 ) por kg de la criopasta que contiene fibrinógeno (preferentemente, se añadió un 2% de hidróxido de aluminio en una proporción del 0,5% en peso), y a continuación se agitó a una velocidad controlada del agitador de 150 rpm a 20 a 25°C durante 1 hora.
4) Una vez completada la reacción, se centrifugó a 4000 rpm a 15°C durante 30 minutos.
5) Tras completar la centrifugación, el sobrenadante se filtró a través del filtro Opticap XL2 Polysep II (Merck Millipore).
Procedimiento de inactivación del virus: Tratamiento con disolvente/detergente (S/D)
Se añadieron 55,7 mL de solución de inactivación de virus (1% de Tween 80, 0,3% de TNBP (tri-N-butil fosfato)) por 1 L de la solución de criopasta filtrada que contenía fibrinógeno, y se agitó a 150 rpm a 25°C durante 1 hora.
Como resultado, se obtuvo una solución en la que se inactivaron los componentes putativos del virus tratando la solución criopastosa que contenía fibrinógeno filtrado con disolvente/detergente (S/D).
Ejemplo 2: primer procedimiento de precipitación con glicina
1) A la solución criopastosa filtrada que contiene fibrinógeno, inactivada por el componente viral putativo, del ejemplo 1, se añadió glicina hasta que la concentración final de la glicina fuera de 1,9 a 2 M. En este momento, la glicina se añadió de manera que el contenido proteico de la solución criopastosa que contiene fibrinógeno fuera de 20 a 30 mg/mL.
2) La agitación se realizó a una velocidad controlada de 300 rpm a una temperatura de 4 a 25°C durante 90 minutos.
3) La solución de criopasta agitada, con glicina y que contiene fibrinógeno de 2) se centrifugó a 4000 rpm a 15°C durante 30 minutos.
4) Se eliminó el sobrenadante y se pesó el precipitado (en lo sucesivo denominado primer precipitado con glicina), que se congeló a -70°C o menos.
Ejemplo 3: 2° Procedimiento de Precipitación con Glicina
3-1: 2° Procedimiento de Precipitación con Glicina (Condiciones bajo 20°C, 0,75M y 15mg/mL)
1) Para disolver el precipitado de la 1a precipitación con glicina congelado del Ejemplo 2, se colocó el tampón de disolución (citrato de sodio 50 mM, pH 7,5) en un vaso de precipitados encamisado, y se agitó a una temperatura de circulación controlada de 37°C durante 30 minutos o más. En este momento, la temperatura del tampón se mantuvo a 37°C.
2) El precipitado de la 1a precipitación con glicina congelado del Ejemplo 2 se añadió al tampón de disolución de 1), y luego se agitó a una velocidad controlada de 150 rpm a 37°C durante 90 minutos.
3) La solución de precipitado de la 1a precipitación con glicina agitada de 2) se filtró a través del filtro Opticap XL2 Polysep II (Merck Millipore).
4) El filtrado del primer precipitado con glicina de 3) se colocó en un vaso de precipitados encamisado, y luego se controló la temperatura del circulador a 20°C.
5) Cuando la solución del precipitado de la 1a precipitación con glicina alcanzó una temperatura predeterminada, se añadió glicina hasta que la concentración final de la glicina pasó a ser de 0,5 a 0,9m . En este momento, la glicina se añade para que el contenido de proteínas de la solución de precipitado de la 1a precipitación con glicina añadida sea de 14 a 15mg/mL.
6) La agitación se realizó a 300 rpm durante 90 minutos mientras la temperatura del circulador se mantenía a 20°C.
7) La solución del precipitado de la 1a precipitación con glicina de 6) glicina-añadida, agitada, se centrifugó a 4000 rpm a 15°C durante 30 minutos.
8) Se eliminó el precipitado de 7) y se midió la cantidad de sobrenadante (en lo sucesivo denominado sobrenadante de la 2a precipitación con glicina).
3-2: 2° Procedimiento de Precipitación con Glicina (Condiciones bajo 25°C, 0,8 M y 20 mg/mL)
Se realizó un experimento de la misma manera que se describe en el Ejemplo 3-1, excepto que se utilizaron las siguientes condiciones: concentración de glicina: 0,8M; temperatura: 25°C; y la concentración de proteínas: 19 a 20mg/mL.
3-3: 2° Procedimiento de Precipitación con Glicina (Condiciones bajo 15°C, 0,8M y 10mg/mL)
Se realizó un experimento de la misma manera que se describe en el Ejemplo 3-1, excepto que se utilizaron las siguientes condiciones: concentración de glicina: 0,8M; temperatura: 15°C; y la concentración de proteínas: 9 a 10mg/mL.
3-4: 2° Procedimiento de Precipitación con Glicina (Condiciones bajo 15°C, 0,5M y 20mg/mL)
Se realizó un experimento de la misma manera que se describe en el Ejemplo 3-1, excepto que se utilizaron las siguientes condiciones: concentración de glicina: 0,5M; temperatura: 15°C; y la concentración de proteínas: 19 a 20mg/mL.
Ejemplo 4: tercer Procedimiento de Precipitación con Glicina
1) La temperatura del circulador se controló a 20°C. Cuando la temperatura del sobrenadante de la 2a precipitación con glicina obtenida en el Ejemplo 3 alcanzó los 20°C, se añadió glicina al sobrenadante hasta que la concentración final de la glicina fuera de 2,1M. En un ejemplo comparativo, el 1er precipitado con glicina obtenido en el Ejemplo 2 se disolvió en un tampón de citrato de sodio 50 mM (pH 7,5) a 35°C durante 90 minutos. A continuación, se añadió glicina a la solución hasta llegar a una concentración final de 2,1M de glicina.
2) La agitación se realizó a 300 rpm durante 90 minutos.
3) El sobrenadante de la 2a precipitación con glicina de 2), agitado y con adición de glicina, se centrifugó a 4000 rpm a 15°C durante 30 minutos.
4) Se eliminó el sobrenadante y se pesó el precipitado (en lo sucesivo denominado precipitado de la 3' precipitación con glicina), que se congeló a -30°C o menos.
Análisis de la pureza de la muestra mediante SEC-LC
La pureza del fibrinógeno en el precipitado de la 3 ' precipitación con glicina, sometido al procedimiento de la 2 ' precipitación con glicina, y la pureza del fibrinógeno en el precipitado de la 3 ' precipitación con glicina no sometido al procedimiento de la 2 ' precipitación con glicina se midieron mediante el siguiente procedimiento de prueba y se compararon entre sí.
a. Preparación de la solución de la muestra: la concentración de la muestra se corrigió a 2 mg/mL, y se añadieron 200 pl de la muestra a cada vial de LC.
b. Condiciones de la prueba: se realizó una prueba en las siguientes condiciones: caudal: 0,5 mL/min; temperatura de la columna: temperatura ambiente (RT); volumen de inyección: 20 pL; tiempo de análisis: 30 minutos; longitud de onda de detección: UV 280 nm; y distribución de la bomba: 100% isocrático.
c. Procedimiento de prueba:
1) De acuerdo con las instrucciones de funcionamiento de la HPLC de Waters, se preparó un sistema de HPLC.
2) Una columna TSK-gel G3000SWXL y una columna de guarda TSKgel SWXL fueron dispuestas a lo largo de la dirección del flujo de líquido.
3) Equilibrio de la columna: se dejó fluir la fase móvil a un caudal de 0,5 mL/min durante al menos 30 minutos, y cuando se alcanzó el equilibrio en el cromatograma, se detuvo el flujo.
4) El análisis se realizó en las mismas condiciones que las condiciones de ensayo descritas anteriormente.
La tabla 1 siguiente muestra la pureza del fibrinógeno obtenido cuando se realizó o no el segundo procedimiento de precipitación con glicina.
Además, la FIG. 3 muestra los resultados obtenidos al realizar sólo los procedimientos de precipitación con glicina 1° y 3° sin el 2° procedimiento de precipitación con glicina , y las FIGS. 4 (condiciones del ejemplo 3-1), 5 (condiciones del ejemplo 3-2), 6 (condiciones del ejemplo 3-3) y 7 (condiciones del ejemplo 3-4) muestran los resultados obtenidos al realizar todos los procedimientos de precipitación con glicina del primero al tercero.
En resumen, como se muestra en la Tabla 1 a continuación y en las FIG. 3 a 7, cuando se llevaron a cabo todos los procedimientos de precipitación con glicina 1° a 3°, la pureza del fibrinógeno finalmente obtenido fue significativamente alta, independientemente de las condiciones de los procedimientos de precipitación, en comparación con cuando sólo se llevaron a cabo los procedimientos de precipitación con glicina 1° y 3° sin el segundo procedimiento de precipitación con glicina. Así, se pudo comprobar que cuando los procedimientos de precipitación se realizan utilizando glicina a concentraciones más bajas, se obtiene el efecto de eliminar las impurezas producidas en el procedimiento de inactivación del virus.
Tabla 1
Figure imgf000009_0001
Ejemplo 5: Opcional 4° Procedimiento de Precipitación de Glicina
Se demostró que cuando se realizaban todos los procedimientos de precipitación con glicina 1° a 3°, como se describe en los Ejemplos 1 a 4 anteriores, se podía obtener fibrinógeno con una pureza muy alta. En este Ejemplo, se investigó para determinar si, cuando se realizaba opcionalmente un procedimiento adicional de precipitación con glicina que no es un procedimiento esencial, se podía aumentar aún más la pureza del fibrinógeno.
1) Para disolver el precipitado de la 3a precipitación con glicina del Ejemplo 4 almacenado por congelación, se colocó un tampón de disolución (citrato de sodio 50 mM (pH 7,5)) en un vaso de precipitados encamisado, y luego se agitó a una temperatura de circulación controlada de 37°C durante 30 minutos.
2) El precipitado de la 3a precipitación con glicina del Ejemplo 4, almacenado por congelación, se añadió al tampón de 1), y luego se agitó a una velocidad controlada del agitador de 290 a 31o rpm a 30 a 35°C durante 90 minutos.
3) La temperatura de la solución del precipitado de la 3a precipitación con glicina se redujo a 25°C, y se añadió glicina a la solución hasta una concentración final de 2,1M.
4) La agitación se realizó a 300 rpm durante 90 minutos mientras la temperatura del circulador se mantenía a 25°C.
5) La solución del precipitado de la 3a precipitación con glicina, agitada y añadida, se centrifugó a 4000 rpm a 15°C durante 30 minutos.
6) El precipitado de la 4a precipitación con glicina de 5) se recuperó, se pesó y a continuación se almacenó congelado a -30°C o menos.
Ejemplo 6: Experimento DoE sobre el procedimiento de nanofiltración
1) Se prepararon 250 mg o más del precipitado de la 3a o 4a precipitación con glicina obtenido en el Ejemplo 4 o 5.
2) El tampón de disolución (que contiene 20mM de citrato de sodio a pH 7,5, 100mM de cloruro de sodio (NaCl), y de 1 a 6% de arginina) se añadió al precipitado de la 3a o 4a precipitación con glicina, y el precipitado se disolvió agitando a temperatura ambiente (20 a 25°C) durante 2 horas para que la concentración final de proteína fuera de aproximadamente 3 mg/mL.
3) Se midió la concentración del precipitado disuelto de la 4a precipitación con glicina de 2) a una longitud de onda UV de 280 nm, y luego se diluyó el precipitado a una concentración de 0,7-3 mg/mL mediante el uso de un tampón de disolución (que contiene 20mM de citrato de sodio a pH 7,5, 100mM de cloruro de sodio (NaCl), y 1 a 6% de arginina), y se midió la concentración final a una longitud de onda UV de 280 nm.
4) Tras la corrección de la concentración, la muestra se filtró a través de un filtro tipo tapa de botella (0,2 pm).
5) La muestra filtrada de 4) se filtró a través de un filtro Pall 100N (área de 10cm2) a temperatura ambiente (20 a 25°C) y a una presión de 200 kPa.
6) La muestra filtrada de 5) se filtró de nuevo a través de un filtro Pall 50N (o Planova 35N) (área de 10 cm2). En este momento, la filtración se realizó en condiciones de temperatura ambiente (20 a 25°C) y 200 kPa (100 kPa para Planova 35N).
7) La muestra filtrada de 6) se filtró a través de una Planova 20N (o SV4 20N) (área de 10 cm2). En este momento, la filtración se realizó en condiciones de 25 a 35°C y de 50 a 200 kPa (Planova 20N: 50 a 100 kPa; SV4 20N: 100 a 200 kPa) (tiempo del procedimiento de nanofiltración: 15 a 20 horas) (después de realizar el ejemplo 6, se puede realizar el procedimiento adicional de UF/DF).
La Tabla 2, a continuación, muestra la eficiencia y la tasa de recuperación del filtro Planova 20N y SV4 20N, obtenida cuando se realizó o no el segundo procedimiento de precipitación con glicina.
Tabla 2
Figure imgf000010_0001
Como resultado, como se muestra en la Tabla 2 anterior y en la FIG. 8, se comparó la pureza del fibrinógeno filtrado a través del nanofiltro entre los casos en los que se realizó el segundo procedimiento de precipitación con glicina y los que no se realizó como se describe en el Ejemplo 3. Como resultado de la comparación, se demostró que cuando se realizó el segundo procedimiento de precipitación con glicina, la recuperación de fibrinógeno con una pureza del 98% fue alta. Por lo tanto, cuando los procedimientos de precipitación se realizan utilizando glicina a concentraciones reducidas, se obtuvieron los efectos de eliminar las impurezas producidas en el procedimiento de inactivación del virus y de aumentar la eficacia de filtración del nanofiltro al menos 2 veces.
Aplicabilidad industrial
El novedoso procedimiento de purificación de la proteína fibrinógeno según la presente divulgación es un procedimiento altamente seguro que bloquea fundamentalmente la entrada de componentes patógenos derivados de animales (virus). Además, puede purificar la proteína de fibrinógeno con una alta pureza y un alto índice de recuperación mediante un procedimiento sencillo, por lo que resulta muy económico y eficiente. Además, el fibrinógeno purificado por el procedimiento de la presente divulgación tiene una ventaja sobre el fibrinógeno purificado por un procedimiento convencional en el sentido de que tiene una mayor pureza, y por lo tanto tiene una mayor actividad local, lo que indica que puede ser utilizado eficazmente para la prevención y el tratamiento de enfermedades relacionadas con la sangre, en particular las enfermedades de coagulación de la sangre.

Claims (12)

REIVINDICACIONES
1. Un procedimiento de purificación de fibrinógeno, que comprende las etapas de:
(a) precipitar el fibrinógeno de una solución que contiene fibrinógeno añadiendo glicina a la solución para que la concentración de glicina sea de 1,5 a 2,5M, y luego eliminar un sobrenadante y recuperar un precipitado (1a precipitación con glicina);
(b) disolver el precipitado de la ia precipitación con glicina de la etapa (a) en un tampón de disolución para obtener una solución, precipitar la solución añadiendo glicina a la misma para que la concentración de glicina sea de 0,5 a 0,9M, y recuperar un sobrenadante (2a precipitación con glicina);
(c) precipitar el sobrenadante de la etapa b) añadiendo glicina al mismo para que la concentración de glicina sea de 1,5 a 2,5M, y recuperar un precipitado (3a precipitación con glicina); y
(d) disolver el precipitado de la etapa c) en un tampón de disolución para obtener una solución, y someter la solución a nanofiltración (NF) utilizando un nanofiltro.
2. El procedimiento de la reivindicación 1, en el que el tampón de disolución utilizado para disolver el precipitado en las etapas (b) y (d) comprende citrato de sodio de 10 a 100 mM de pH 6,0 a 9,0.
3. El procedimiento de la reivindicación 1, en el que la nanofiltración en la etapa (d) se realiza entre 20 y 37°C bajo una presión de 50 a 250 kPa.
4. El procedimiento de la reivindicación 1, en el que la solución que contiene fibrinógeno de la etapa (a) se obtiene mediante un procedimiento que comprende las etapas de:
(i) disolver una criopasta que contenga fibrinógeno utilizando un tampón de disolución para obtener una solución;
(ii) añadir un adsorbente a la solución, eliminando así las impurezas por adsorción; y
(iii) inactivar los virus, contenidos en la criopasta, mediante un tratamiento con disolvente/detergente (S/D).
5. El procedimiento de la reivindicación 4, en el que la criopasta de la etapa (i) se disuelve utilizando el tampón de disolución en una proporción de volumen de 1:2 a 1:6.
6. El procedimiento de la reivindicación 4, en el que el tampón de disolución de la etapa (i) es un tampón que comprende citrato de sodio 20mM, NaCl 100mM y glicina 100mM.
7. El procedimiento de la reivindicación 4, en el que el adsorbente utilizado en la etapa (ii) es hidróxido de aluminio (Al(OH)a).
8. El procedimiento de la reivindicación 7, en el que el hidróxido de aluminio se utiliza en una cantidad de 0,05 a 0,5 % en peso basada en el peso de la criopasta.
9. El procedimiento de la reivindicación 4, en el que el tratamiento con disolvente/detergente de la etapa (iii) se realiza utilizando una solución de disolvente/detergente que comprende un detergente no iónico y tri-n-butil fosfato (TNBP).
10. El procedimiento de la reivindicación 9, en el que el detergente no iónico es al menos uno seleccionado del grupo que consiste en polisorbato 80 (Tween 80), polisorbato 20 (Tween 20), Tritón X-100 y Tritón X-45.
11. El procedimiento de la reivindicación 1, que comprende además, entre las etapas (c) y (d), una etapa (c') en la que se disuelve el precipitado recuperado en la etapa (c) en tampón de disolución para obtener una solución, precipitando la solución mediante la adición de glicina a la misma para que una concentración de glicina sea idéntica a la concentración de glicina de la etapa (a), para obtener un precipitado (4a precipitación con glicina).
12. El procedimiento de la reivindicación 1, comprende además, después de la nanofiltración de la etapa (d), al menos una etapa seleccionada entre (e) etapa de ultrafiltración/diafiltración (UF/DF); y etapa de formulación (f).
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