ES2641042T3 - Procedimiento para la fabricación de un fármaco proteínico - Google Patents

Abstract

Procedimiento para fabricar un fármaco proteínico con bajo nivel vírico, que comprende la siguiente etapa (a): (a) una etapa de filtración para filtrar una solución proteínica que contiene virus a través de una membrana de eliminación de virus de tamaño de poro pequeño, en la que la membrana de eliminación de virus de tamaño de poro pequeño tiene un tamaño de poro que no permite la permeación de virus, pero permite la permeación de moléculas de proteína, - comprendiendo la etapa de filtración (a) la siguiente etapa (p) realizada antes de la etapa de filtración a presión baja (q): (p) una etapa de filtración a presión elevada para filtrar la solución proteínica que contiene virus a través de la membrana de eliminación de virus de tamaño de poro pequeño a una presión superior a 29,54 kPa (0,30 kgf/cm2), y - comprendiendo la etapa de filtración (a) la siguiente etapa (q): (q) aliviar la presión de filtración después de la etapa (p), y una etapa de filtración a presión baja para filtrar una solución de lavado o la solución proteínica que contiene virus a través de una membrana de eliminación de virus de tamaño de poro pequeño a una presión de filtración de 29,4 kPa (0,30 kgf/cm220 ) o inferior, en la que la solución de lavado o la solución proteínica que contiene virus antes de la filtración en la etapa de filtración a presión baja (q) tiene un pH X y una fuerza iónica salina Y que satisfacen las siguientes ecuaciones 1 y 5: 0 <= Y mM <=150X - 590 (Ecuación 1) 3,5 <= X <= 8,0 (Ecuación 5) o las siguientes ecuaciones 4 y 5: Y >= 0 mM (Ecuación 4) 3,5 <= X <= 8,0 (Ecuación 5).

Description

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DESCRIPCION

Procedimiento para la fabricacion de un farmaco proteinico Sector tecnico

La presente invencion se refiere a un procedimiento para fabricar un farmaco proteinico con bajo nivel virico y a un farmaco proteinico con bajo nivel virico obtenido por el procedimiento de fabricacion.

Tecnica anterior

Los farmacos proteinicos, tipificados por biomedicinas, derivados del plasma y similares, han suscitado preocupacion por la contaminacion por virus derivados de los ingredientes o derivados de los procesos. De este modo, cuando se fabrican estos farmacos proteinicos, la inactivacion o la eliminacion de los virus en los farmacos es muy importante desde el punto de vista de la seguridad y la estabilidad de los farmacos. Esta inactivacion de los virus se ha llevado a cabo mediante procedimientos como el tratamiento termico o el tratamiento con agentes quimicos. Sin embargo, estos tratamientos no son suficientes en si mismos para la inactivacion de los virus. Ademas, estos procedimientos podrian desnaturalizar las propias proteinas de los farmacos. En este contexto, los virus se separan y se eliminan por filtracion, utilizando membranas de eliminacion de virus como medios fisicos de eliminacion de virus sin desnaturalizacion quimica (por ejemplo, referencias de patente 1 a 3).

Se conocen membranas de eliminacion de virus realizadas de materiales naturales, tales como celulosa o de materiales polimericos sinteticos, tales como fluoruro de polivinilideno (PVDF) o polieter sulfona (PES) (referencias de patente 1 a 4). En particular, en el caso de soluciones proteinicas que contienen moleculas de proteina pequenas, se utilizan membranas de eliminacion de virus de tamano de poro pequeno, que tienen un tamano de poro que no permite la permeacion de virus pero que permite la permeacion de las moleculas de proteina.

Idealmente, la filtracion de soluciones que contienen virus, utilizando un aparato de eliminacion de virus equipado con una membrana de eliminacion de virus, debe filtrar cantidades grandes de soluciones proteinicas en un tiempo corto y debe proporcionar un rendimiento de eliminacion de virus suficientemente elevado. Para tratar cantidades grandes de soluciones proteinicas en un tiempo corto, generalmente, la filtracion de soluciones que contienen virus se lleva a cabo a una presion lo mas elevada posible. Sin embargo, la prolongacion de esta filtracion a presion elevada puede dejar dentro de la membrana proteinas que se supone que estan contenidas en los filtrados. Ademas, los farmacos proteinicos recientes tienden a tener concentraciones de proteinas mayores. Junto con esta tendencia, existe tambien una creciente demanda de concentraciones de proteina mayores en la etapa de filtracion para eliminar los virus. En el caso de filtrar soluciones proteinicas de concentracion elevada a traves de una membrana de eliminacion de virus de tamano de poro pequeno, con frecuencia se produce una obstruccion, particularmente, debido a las proteinas que permanecen dentro de la membrana.

Estas proteinas que quedan dentro de la membrana de eliminacion de virus de tamano de poro pequeno se recuperan por filtracion con una solucion tampon sin proteinas (habitualmente, la misma que una solucion tampon utilizada para disolver las proteinas) como solucion de lavado. Esta etapa de filtracion se anade despues de la filtracion de las proteinas y, por lo tanto, se denomina lavado posterior o filtracion posterior. Para este lavado posterior, normalmente, se alivia temporalmente la presion de filtracion para tener una conmutacion, en la entrada de la solucion a filtrar, de una linea para soluciones proteinicas a una linea para soluciones de lavado. Si la presion de filtracion no disminuye, la solucion retrocede hacia el lado de la solucion de lavado.

Entre los ejemplos de esta disminucion de la presion de filtracion durante la filtracion a traves de una membrana de eliminacion de virus, como en la etapa de lavado posterior, se incluye un caso en el que la aplicacion de presion se suspende durante la filtracion por una razon tal como una falla de alimentacion (este caso se denomina parada e inicio).

Dependiendo del tipo de farmaco proteinico, pueden ser deseables presiones de filtracion bajas para la filtracion a traves de una membrana de eliminacion de virus durante la fabricacion de los farmacos. Esta filtracion a presiones bajas de filtracion se lleva a cabo, a menudo, para incrementar las productividades finales de las soluciones que tienden a provocar la obstruccion o para aumentar la tasa de permeacion o recuperacion de soluciones proteinicas de alto peso molecular con formas alargadas. Cuando se adoptan presiones de filtracion bajas, a menudo se determinan presiones de filtracion especificas para equilibrar la permeabilidad y la productividad, y tambien dependen de las concentraciones, etc. de los farmacos proteinicos que se van a obtener. Por ejemplo, la referencia de patente 4 ha adoptado una presion de filtracion del orden de 14,7 kPa (0,15 kgf/cm2).

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Lista de citas Referencias de patente

Referencia de patente 1: Patente japonesa abierta a inspeccion publica No. 2001-335509 Referencia de patente 2: Patente japonesa abierta a inspeccion publica No. 2003-274941 Referencia de patente 3: Publicacion internacional No. WO 2010/109920 Referencia de patente 4: Patente de EE.UU. No. 7.932.355

El documento W096/00237 da a conocer el filtrado de virus de composiciones de factor IX utilizando membranas Viresolve/70 y una presion transmembranaria de 200-300 mbar. El contenido de sal es NaCl 144 mM + NaCit 5,5 mM. El pH es 7. El LRV es 3,7-4,0 log10. El virus es un parvovirus no especificado. Y = 1/2E (Ci x Zi2) = aproximadamente 150 mM.

El documento EP 2078730 da a conocer la filtracion de la solucion de FVIII/vWF (pH 6,8, histidina 25 mM, Ca2+ 140 mM) a traves de Planova 20 N a presiones de entre 0,2-0,4 bar. En el ejemplo 5, se utiliza una presion baja de 0,3 bar sobre Planova 20, que no provoca un ensuciamiento significativo. Se da a conocer que dicho procedimiento puede eliminar eficazmente y de forma simultanea el virus de la hepatitis A o el eritrovirus B19. Y = resultante de CaCl2 es de aproximadamente 420 mM.

El documento EP 0911037 da a conocer la filtracion en Planova 35 de una solucion de Ig al 5% a una presion de 0,2 kgf/cm2. La solucion es de Ig al 5% en agua y pH 5,5. Comprende un 5% de sorbitol anionico. La filtracion se lleva a cabo especificamente para esterilizar la solucion para inyeccion intravenosa utilizando la membrana de eliminacion de virus. Y = aproximadamente 0 mM.

El documento WO 2011/058284 da a conocer la filtracion en Planova 20 y 15 de una solucion de factor H. La presion es de, aproximadamente, 0,3 kgf/cm2. El pH de la solucion filtrada es de pH 6,5 o pH 7,5. La solucion filtrada es el eluato de la etapa de Q-Sepharose. El eluato comprende fosfato sodico 20 mM, NaCl 165 mM, ArgHCl 4,5 g/l (= 21 mM, PM 210 g/mol). Y = aproximadamente 327 mM.

Referencias no de patente

Referencia no de patente 1: Manabe S., Dev. Biol. Stand., (1996) 88: 81 - 90

Referencia no de patente 2: Brandwein H. y otros, Dev. Biol. (Basel), (2000) 102: 157 - 63

Referencia no de patente 3: Aranha-Creado y otros, Biologicals, (1998) Jun; 26 (2): 167 - 72

Referencia no de patente 4: L. Moce - Llivina y otros, Journal of Virological Methods, (2003) abril, Vol. 109, Numero

1, paginas 99-101

Caracteristicas de la invencion

Problema tecnico

En la filtracion convencional de soluciones proteinicas utilizando membranas de eliminacion de virus, la atencion se ha centrado en procedimientos realizados a una presion lo mas elevada posible con el fin de incrementar las productividades y mejorar la eficiencia. No se han obtenido resultados suficientes sobre la filtracion a bajas presiones de filtracion.

En este contexto, los inventores de la presente invencion han llevado a cabo sus propios estudios sobre la filtracion de soluciones proteinicas utilizando membranas de eliminacion de virus de tamano de poro pequeno a bajas presiones de filtracion y, sorprendentemente, han descubierto que cuando se lleva a cabo la filtracion a bajas presiones de filtracion en condiciones de solucion similares a las de las presiones de filtracion elevadas, los virus se pueden fugar hacia los filtrados, dependiendo de las condiciones de la solucion, dando como resultado farmacos proteinicos que tienen tasas bajas de eliminacion de virus. Los inventores de la presente invencion han descubierto tambien que la filtracion en la etapa de lavado posterior o en la etapa de parada e inicio, que tambien se realiza a presiones de filtracion bajas, pueden por lo tanto tener una tasa reducida de eliminacion de virus, dependiendo de las condiciones de la solucion.

Sobre la base de estos descubrimientos, un objetivo de la presente invencion es dar a conocer un procedimiento para fabricar un farmaco proteinico con bajo nivel virico, que comprende una etapa de filtrar una solucion proteinica que contiene virus a traves de una membrana de eliminacion de virus de tamano de poro pequeno a una presion de filtracion baja, en la que la tasa de eliminacion de virus mediante el procedimiento para fabricar la proteina con bajo nivel virico es elevada.

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Solucion al problema

Los inventores de la presente invencion han llevado a cabo estudios diligentes para alcanzar el objetivo y, en consecuencia, han completado la presente invencion descubriendo que se puede obtener un farmaco proteinico que tiene una tasa elevada de eliminacion de virus incluso a una presion de filtracion baja ajustando el pH y la fuerza ionica salina de una solucion a filtrar a valores particulares.

Especificamente, la presente invencion se refiere a lo siguiente:

[1] Un procedimiento para fabricar un farmaco proteinico con bajo nivel virico, que comprende la siguiente etapa (a):

(a) una etapa de filtracion para filtrar una solucion proteinica que contiene virus a traves de una membrana de eliminacion de virus de tamano de poro pequeno, en la que la membrana de eliminacion de virus de tamano de poro pequeno tiene un tamano de poro que no permite la permeacion de virus, pero permite la permeacion de moleculas de proteina,

- comprendiendo la etapa de filtracion (a) la siguiente etapa (p), realizada antes de la etapa de filtracion a presion baja (q):

(p) una etapa de filtracion a presion elevada para filtrar la solucion proteinica que contiene virus a traves de la membrana de eliminacion de virus de tamano de poro pequeno a una presion superior a 29,4 kPa (0,30 kgf/cm2), y

- comprendiendo la etapa de filtracion (a) la siguiente etapa (q):

(q) aliviar la presion de filtracion despues de la etapa (p), y una etapa de filtracion a presion baja para filtrar una solucion de lavado o la solucion proteinica que contiene virus a traves de una membrana de eliminacion de virus de tamano de poro pequeno a una presion de filtracion de 29,4 KPa (0,30 kgf/cm2) o inferior,

en la que la solucion de lavado o la solucion proteinica que contiene virus antes de la filtracion en la etapa de filtracion a presion baja (q) tiene un pH X y una fuerza ionica salina Y que satisfacen las siguientes ecuaciones 1 y 5:

0 < Y mM < 150X - 590 (Ecuacion 1)

3.5 < X < 8,0 (Ecuacion 5)

o las siguientes ecuaciones 4 y 5:

Y = 0 mM (Ecuacion 4)

3.5 < X < 8,0 (Ecuacion 5)

[2] El procedimiento, segun el punto [1], en el que la solucion proteinica que contiene virus se filtra en la etapa (q), y en la que el 50% o mas de la solucion proteinica completa que contiene virus a filtrar en la etapa de filtracion (a) se filtra en la etapa de filtracion a presion baja (q).

[3] El procedimiento, segun el punto [1], en el que la etapa de filtracion (a) es una etapa para filtrar la solucion proteinica que contiene virus a traves de la membrana de eliminacion de virus de tamano de poro pequeno a una presion de filtracion de 29,4 kPa (0,30 kgf/cm2) o inferior, en la que la solucion proteinica que contiene virus antes de la filtracion en la etapa de filtracion (a) tiene un pH X y una fuerza ionica salina Y que satisfacen las siguientes ecuaciones 1 y 5:

0 < Y mM < 150X - 590 (Ecuacion 1)

3.5 < X < 8,0 (Ecuacion 5)

o las siguientes ecuaciones 4 y 5:

Y = 0 mM (Ecuacion 4)

3.5 < X < 8,0 (Ecuacion 5)

[4] El procedimiento, segun el punto [1], en el que la solucion de lavado en la etapa (q) de filtracion a presion baja es una solucion tampon para lavado.

[5] El procedimiento, segun los puntos [1] o [4], en el que la etapa (q) de filtracion a presion baja es una etapa de lavado posterior o una etapa de parada e inicio.

[6] El procedimiento, segun cualquiera de los puntos [1] a [5], en el que la solucion de filtracion en la etapa (q) de filtracion a presion baja tiene un pH X y una fuerza ionica salina Y que satisfacen las siguientes ecuaciones 2 y 5:

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0 < Y mM < 50X - 200 (Ecuacion 2)

3.5 < X < 8,0 (Ecuacion 5)

o las siguientes ecuaciones 4 y 5:

Y = 0 mM (Ecuacion 4)

3.5 < X < 8,0 (Ecuacion 5)

[7] El procedimiento, segun cualquiera de los puntos [1] a [5], en el que la solucion de lavado o la solucion proteinica que contiene virus antes de la filtracion en la etapa (q) de filtracion a presion baja tiene un pH X y una fuerza ionica salina Y que satisfacen las siguientes ecuaciones 3 y 5:

0 < Y mM < 50X - 250 (Ecuacion 3)

3.5 < X < 8,0 (Ecuacion 5)

o las siguientes ecuaciones 4 y 5:

Y = 0 mM (Ecuacion 4)

3.5 < X < 8,0 (Ecuacion 5)

[8] El procedimiento, segun cualquiera de los puntos [1] a [7], en el que la etapa (q) de filtracion a presion baja es una etapa para filtrar la solucion de lavado o la solucion proteinica que contiene virus a traves de la membrana de eliminacion de virus de tamano de poro pequeno a una presion de filtracion de 19,6 KPa (0,20 kgf/cm2) o inferior.

[9] El procedimiento, segun cualquiera de los puntos [1] a [3], en el que un valor de reduccion logaritmica (LRV), calculado segun la siguiente ecuacion 6, es 4 o superior:

LRV = log10 (Cq/Cf) (Ecuacion 6)

en la que Cq representa la concentracion virica de la solucion proteinica que contiene virus antes de la etapa de filtracion (a), y Cf representa la concentracion virica de la solucion proteinica con bajo nivel virico despues de la filtracion.

[10] El procedimiento segun el punto [4] o [5], en el que un valor de reduccion logaritmica (LRV), calculado segun la siguiente ecuacion 6, es 4 o superior:

LRV = log10 (Cq/Cf) (Ecuacion 6)

en la que Cq representa la concentracion virica de la solucion proteinica que contiene virus antes de la etapa de filtracion (a) y Cf representa la concentracion virica de la solucion proteinica con bajo nivel virico despues de la filtracion y

LRV’, calculado segun la siguiente ecuacion 7, es 4 o superior:

LRV’ = log10 (Cq/Cw) (Ecuacion 7)

en la que Cq representa la concentracion virica de la solucion proteinica que contiene virus antes de la etapa de filtracion (a), y Cw representa la concentracion virica del filtrado de la solucion tampon para el lavado despues de la etapa de filtracion (a).

[11] El procedimiento, segun cualquiera de los puntos [1] a [10], en el que el material de la membrana de eliminacion de virus de tamano de poro pequeno es celulosa o un polimero sintetico hidrofilizado.

[12] El procedimiento, segun cualquiera de los puntos [1] a [11], en el que el material de la membrana de eliminacion de virus de tamano de poro pequeno es un polimero sintetico hidrofilizado, y en el que el polimero sintetico se selecciona entre el grupo que comprende fluoruro de polivinilideno, polieter sulfona, polisulfona y polietileno.

[13] El procedimiento, segun cualquiera de los puntos [1] a [12], en el que la forma de la membrana de eliminacion de virus de tamano de poro pequeno es una membrana plana o una membrana de fibras huecas.

[14] El procedimiento, segun cualquiera de los puntos [1] a [13], en el que la solucion proteinica que contiene virus tiene una concentracion proteinica de 1 mg/ml a 100 mg/ml.

[15] El procedimiento, segun cualquiera de los puntos [1] a [14], en el que la solucion proteinica que contiene virus comprende una o mas proteinas seleccionadas entre el grupo que comprende anticuerpos monoclonales, factor de

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coagulacion sanguinea recombinante, interferon, hormonas, enzimas, inmunoglobulina, albumina, factor VIII de coagulacion sanguinea, factor IX de coagulacion sanguinea, fibrinogeno y antitrombina III.

[16] El procedimiento, segun cualquiera de los puntos [1] a [14], en el que la solucion proteinica que contiene virus comprende un anticuerpo como proteina.

[17] El procedimiento, segun cualquiera de los puntos [1] a [14], en el que la solucion proteinica que contiene virus comprende factor VIII de coagulacion sanguinea o fibrinogeno como proteina.

[18] El procedimiento, segun cualquiera de los puntos [1] a [17], en el que la solucion proteinica que contiene virus comprende uno o mas virus seleccionados entre el grupo que comprende parvovirus humano B19 (B19), virus diminuto del raton (MVM), parvovirus porcino (PPV), parvovirus bovino (BPV), parvovirus canino (CPV), poliovirus (Polio), circovirus, virus de la hepatitis A (HAV) y virus de la hepatitis E (HEV).

[19] El procedimiento, segun cualquiera de los puntos [1] a [18], en el que la solucion proteinica que contiene virus comprende un virus de 32 nm o menor en diametro que no tiene envoltura.

[20] El procedimiento, segun cualquiera de los puntos [1] a [19], en el que la solucion proteinica que contiene virus comprende uno o mas componentes seleccionados entre el grupo que comprende una sal inorganica, un componente de solucion tampon, un surfactante y un sacarido.

Efectos ventajosos de la invencion

La presente invencion puede proporcionar un farmaco proteinico que tiene una tasa elevada de eliminacion de virus mediante un procedimiento para fabricar un farmaco proteinico sin virus, que comprende una etapa de filtrar una solucion proteinica que contiene virus a traves de una membrana de eliminacion de virus de tamano de poro pequeno a una presion de filtracion baja. De este modo, por ejemplo, en el caso en el que las soluciones proteinicas que contienen virus se filtran continuamente a una presion de filtracion baja, se incluye una etapa de lavado posterior o una etapa de parada e inicio, se puede proporcionar un farmaco proteinico que tiene una tasa elevada de eliminacion de virus.

Descripcion breve del dibujo

La figura 1 es un grafico que muestra la relacion entre el pH X y la fuerza ionica salina Y de una solucion antes de la filtracion en ausencia de fugas de virus en el ejemplo 2. Las lineas correspondientes a las ecuaciones 1, 2 y 3 determinadas en el ejemplo 2 se indican de izquierda a derecha.

Descripcion de las realizaciones

A continuacion, se describira en detalle cada realizacion para llevar a cabo la presente invencion (en lo sucesivo, denominada "presente realizacion").

Un procedimiento para fabricar un farmaco proteinico sin virus, segun la presente realizacion, comprende una etapa de filtracion (a) para filtrar una solucion proteinica que contiene virus a traves de una membrana de eliminacion de virus de tamano de poro pequeno para obtener una solucion proteinica sin virus.

La "solucion proteinica que contiene virus" filtrada en la etapa (a) no esta particularmente limitada, siempre que la solucion contenga una proteina que pase a traves de la membrana de filtracion de virus de tamano de poro pequeno, descrita a continuacion, cuando se filtra a traves de la membrana de filtracion, y pueda contener un virus. Particularmente, una solucion que contiene un componente derivado de un animal, que incluye un ser humano, un gen o similar como ingrediente es probable que contenga un virus y, como tal, puede utilizarse como la solucion proteinica que contiene virus en el procedimiento de fabricacion de la presente realizacion para de este modo proporcionar eficientemente un farmaco proteinico sin virus.

Entre los ejemplos de la solucion proteinica que contiene virus se incluyen soluciones que contienen, como ingredientes activos, peptidos o proteinas que sirven como ingredientes para biomedicinas y que se fabrican utilizando biotecnologia, tal como ingenieria genetica o cultivo celular. Entre los ejemplos especificos de los mismos se incluyen, sin que constituyan limitacion, soluciones que contienen diversos anticuerpos monoclonales (IgG, IgM, etc.), factor de coagulacion sanguinea recombinante, interferon, diversas hormonas (hormona del crecimiento, eritropoyetina, etc.), diversas enzimas, proteinas modificadas tipificadas por proteinas con azucares modificados y proteinas PEGiladas y/o proteinas artificiales.

Entre otros ejemplos de la solucion proteinica que contiene virus se incluyen tambien ingredientes para derivados de plasma que se obtienen mediante purificacion a partir de plasma. Entre los ejemplos de los derivados de plasma se incluyen farmacos de inmunoglobulina, farmacos de albumina y farmacos de factor de coagulacion sanguinea. Particularmente, entre los ejemplos de los farmacos del factor de coagulacion sanguinea se incluyen farmacos del

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factor VIII de coagulacion sanguinea, farmacos de factor IX de coagulacion sanguinea, farmacos de fibrinogeno y farmacos de la antitrombina III. De este modo, entre los ejemplos especificos de la solucion proteinica que contiene virus se incluyen, sin que constituyan limitacion, soluciones que contienen inmunoglobulina, albumina y/o factores de coagulacion sanguinea (factor VIII de coagulacion sanguinea, factor IX de coagulacion sanguinea, fibrinogeno, antitrombina III, etc.). Preferentemente, en un aspecto, la solucion proteinica que contiene virus segun la presente realizacion puede contener un anticuerpo como proteina. Preferentemente, en un aspecto, la solucion proteinica que contiene virus segun la presente realizacion puede contener factor VIII de coagulacion sanguinea o fibrinogeno como proteina.

La concentracion de proteina de la solucion proteinica que contiene virus no esta particularmente limitada, siempre y cuando la concentracion permita la filtracion a traves de la membrana de eliminacion de virus de tamano de poro pequeno. La concentracion de proteina es, por ejemplo, de 1 mg/ml a 100 mg/ml, preferentemente, de 1 mg/ml a 80 mg/ml, mas preferentemente, de 1 mg/ml a 70 mg/ml, de forma adicionalmente preferente, de 1 mg/ml a 50 mg/ml. Una concentracion de proteina mas elevada tiende a disminuir la tasa de filtracion utilizando la membrana de eliminacion de virus.

Entre los ejemplos del virus contenido en la solucion proteinica que contiene virus se incluyen, pero sin que constituyan limitacion particular, parvovirus humano B19 (B19), virus diminuto del raton (MVM), parvovirus porcino (PPV), parvovirus bovino (BPV), parvovirus canino (CPV), poliovirus (Polio), circovirus, virus de la hepatitis A (HAV) y virus de la hepatitis E (HEV). Preferentemente, el virus se selecciona entre el grupo que comprende parvovirus humano B19 (B19), virus diminuto del raton (MVM), parvovirus porcino (PPV), parvovirus bovino (BPV), parvovirus canino (CPV), poliovirus (Polio) y virus de la hepatitis A (HAV).

De estos virus, en particular, en cuanto a los parvovirus, se han notificado casos de infeccion por parvovirus humano B19 (B19) en el sector de los derivados del plasma, y la Agencia Europea de Medicamentos (EMEA) ha presentado un informe sobre la seguridad virica de farmacos derivados de plasma. Tambien en el sector de las biomedicinas, han ocurrido casos de contaminacion de anticuerpos monoclonales durante los procesos de fabricacion debido a la contaminacion de celulas CHO (derivadas de raton) por parvovirus de raton. La Food and Drug Administration (FDA) ha emitido la guia “Viral Safety Evaluation of Biotechnology Products Derived from Cell Lines of Human or Animal Origin” (ICH Q5A).

Los parvovirus pertenecen a la familia Parvoviridae y son los virus mas pequenos (diametro: 18 a 24 nm) conocidos. Entre los ejemplos de parvovirus se incluyen parvovirus humano B19 (B19), parvovirus de raton (virus diminuto del raton: MVM), parvovirus porcino (PPV), parvovirus canino (CPV) y parvovirus bovino (BPV).

Dado que los parvovirus no tienen envoltura, estos virus son fisicoquimicamente estables y son resistentes al calor, al pH bajo o al tratamiento con agentes quimicos, que se realiza generalmente en una etapa de inactivacion durante el proceso de fabricacion de farmacos biologicos. De este modo, hay una necesidad creciente de eliminacion de parvovirus utilizando membranas de eliminacion de virus como procedimiento para la eliminacion de virus con un mecanismo de accion diferente al del procedimiento de inactivacion. En un aspecto, la presente realizacion da a conocer un procedimiento para fabricar un farmaco proteinico sin parvovirus.

Entre los ejemplos de virus pequenos que no tienen envoltura, aparte de los parvovirus, se incluyen circovirus (17 a 22 nm), virus de la hepatitis A (27 a 30 nm) y poliovirus (30 nm) pertenecientes a la familia Picornaviridae y virus de la hepatitis E (32 nm). En un aspecto, la presente realizacion da a conocer un procedimiento para fabricar un farmaco proteinico con bajo nivel virico dirigido a un virus que no tiene envoltura (virus que tiene un diametro, preferentemente, de 32 nm o menor, mas preferentemente, de 30 nm o menor, de forma adicionalmente preferente, de 24 nm o menor).

La solucion proteinica que contiene virus puede contener uno o mas componentes seleccionados entre el grupo que comprende un aminoacido basico, una sal inorganica, un componente de solucion tampon, un surfactante y un sacarido, ademas de la proteina y el virus.

Entre los ejemplos del aminoacido basico se incluyen arginina, histidina, guanidina, lisina y sus derivados, y sales de estos aminoacidos o derivados. Preferentemente, el aminoacido basico es arginina, histidina, lisina, o un derivado del mismo, o una sal del aminoacido o el derivado, mas preferentemente arginina o un derivado del mismo, o una sal de arginina o del derivado.

Entre las sales inorganicas pueden incluirse NaCl y sales tampon. Como componente de solucion tampon se puede utilizar una solucion tampon de acetato, una solucion tampon de citrato, una solucion tampon de fosfato, una solucion tampon de Tris-HCl o similar. Las concentraciones de la sal inorganica y del componente de solucion tampon pueden determinarse con referencia a una fuerza ionica salina descrita en detalle a continuacion.

Entre los ejemplos del surfactante se incluyen los surfactantes no ionicos Tween 20 y Tween 80. El surfactante puede estar contenido en una concentracion del 0,01 al 0,05% en peso.

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Entre los ejemplos del sacarido se incluyen, pero sin que constituyan limitacion particular, monosacaridos, disacaridos, trisacaridos, oligosacaridos y alcoholes de azucar. Especificamente, sacaridos tales como glucosa, manosa, galactosa, fructosa, sorbosa, maltosa, sacarosa (azucar de cana), sorbitol, manitol y dextrano pueden estar contenidos solos o en combinacion de dos o mas de ellos a una concentracion del 1 al 10% en peso, preferentemente, del 1 al 5% en peso.

La temperatura de la solucion proteinica que contiene virus antes de la filtracion se puede ajustar a cualquier intervalo de temperaturas que no afecte al estado del farmaco proteinico que se va a obtener y, preferentemente, esta en el intervalo de 4°C a 40°C, mas preferentemente, de 4°C a 35°C, desde el punto de vista de evitar la desnaturalizacion de las proteinas. La temperatura influye en la viscosidad de la solucion proteinica y tambien influye en el flujo durante la filtracion a traves de la membrana de eliminacion de virus. De este modo, la temperatura esta ademas en el intervalo, preferentemente, de 20°C a 35°C, aunque difiere dependiendo de la estabilidad de la propia proteina a la temperatura.

En la presente realizacion, la "membrana de eliminacion de virus de tamano de poro pequeno" utilizada en la eliminacion de virus, esta definida por la Parenteral Drug Association (PDA) y significa que la tasa de eliminacion del bacteriofago PP7 (fago 7 de pseudomonas), que tiene un tamano de particula de 30 a 33 nm, por una membrana es mayor que 4log10, medida sobre la base del enfoque descrito en PDA Technical Report 41 (revisado en 2008, Apendice 1).

Alternativamente, la membrana de eliminacion de virus de tamano de poro pequeno esta definida por la PDA como una membrana que tiene una tasa de permeacion o recuperacion de proteina mayor del 90%, sometida a ensayo con un enfoque similar al del bacteriofago PP7, utilizando una solucion acuosa de inmunoglobulina intravenosa (IglV) o una solucion tampon que contiene IgIV. La tasa de permeacion de la proteina se representa por la relacion de la concentracion de proteina de una solucion despues de la filtracion a traves de la membrana respecto a la concentracion de proteina de una solucion antes de la filtracion, y se mide despues de la filtracion a traves de la membrana de una solucion en un volumen suficiente hasta que se estabiliza la concentracion de proteina de la solucion despues de la filtracion a traves de la membrana. La concentracion de proteina se puede medir utilizando espectrometria UV (A280).

De forma deseable, la membrana de eliminacion de virus de tamano de poro pequeno tiene un LRV de 4 o superior, calculado segun la ecuacion 6 descrita a continuacion, en cuanto a rendimiento de eliminacion de parvovirus a una presion recomendada para cada membrana de eliminacion de virus.

Preferentemente, el material de la membrana de eliminacion de virus de tamano de poro pequeno es celulosa o un polimero sintetico hidrofilizado. Como celulosa, se puede utilizar celulosa regenerada, celulosa natural, acetato de celulosa o similares. Como polimero sintetico hidrofilizado, se puede utilizar fluoruro de polivinilideno (PVDF) hidrofilizado, polieter sulfona (PES) hidrofilizada, polietileno (PE) hidrofilizado, polisulfona (PS) hidrofilizada o similar. Entre los ejemplos del procedimiento para la hidrofilizacion se incluyen: procedimientos para introducir grupos funcionales hidrofilos a la superficie de la membrana por un procedimiento tal como revestimiento, reaccion de injerto o reaccion de reticulacion; y procedimientos para inmovilizar polimeros hidrofilos en la superficie de la membrana.

La forma de la membrana puede ser cualquiera de entre una membrana plana y una membrana de fibras huecas. Sin embargo, es preferente una membrana de fibras huecas, ya que es posible miniaturizar una membrana conformada cargando la membrana en un recipiente, incluso aunque la membrana tenga un area grande. Se puede preparar un filtro de modo que su espacio quede dividido por la membrana en un espacio primario por el lado de entrada de una solucion a filtrar y un espacio secundario por el lado de salida del filtro. Para su utilizacion en filtracion, la membrana de eliminacion de virus puede utilizarse en forma de filtro.

Entre los ejemplos de membranas de eliminacion de virus de tamano de poro pequeno disponibles en el mercado, dirigidas a la eliminacion de virus pequenos, tales como parvovirus, se incluyen: Planova (marca registrada) 15N (fabricada por Asahi Kasei Medical Co., Ltd.) y Planova (marca registrada) 20N (fabricada por Asahi Kasei Medical Co., Ltd.), fabricadas con celulosa; Planova (marca registrada) BioEX (fabricada por Asahi Kasei Medical Co., Ltd.), Ultipore (marca registrada) VF DV20 (fabricada por Pall Corp.) y Viresolve NFP (fabricada por EMD Millipore Corp.) fabricadas con PVDF hidrofilizado; y Virosart CPV (fabricada por Sartorius K.K.) y Viresolve Pro (fabricada por eMD Millipore Corp.), fabricadas con PES hidrofilizado. La membrana de eliminacion de virus puede seleccionarse apropiadamente segun el tipo de virus a eliminar o segun el farmaco proteinico a fabricar.

La filtracion de la solucion proteinica que contiene virus a traves de la membrana de eliminacion de virus de tamano de poro pequeno se puede llevar a cabo mediante un procedimiento habitual para utilizar cada membrana de eliminacion de virus de tamano de poro pequeno. Preferentemente, la filtracion es una filtracion en linea desde el punto de vista de su tasa de recuperacion elevada. Puede utilizarse cualquier procedimiento de filtracion, entre los que se incluyen la filtracion a presion constante, en la que la presion de filtracion se mantiene constante, la filtracion en la que se varia la presion de filtracion, la filtracion a tasa constante, en la que la tasa de filtracion se mantiene

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constante, etc. Se adopta un procedimiento de filtracion preferente segun la composicion de la solucion antes de la filtracion.

El intervalo de la presion de filtracion en la etapa (a) esta por debajo de la presion de resistencia de la membrana de eliminacion de virus de tamano de poro pequeno, aunque difiere dependiendo del material de la membrana. En el caso, por ejemplo, de una membrana de eliminacion de virus de tamano de poro pequeno realizada de celulosa, la presion de filtracion optima esta en el intervalo de 0,00 kgf/cm2 (0,0 kPa) a 1,00 kgf/cm2 (9,8 x 10 kPa). En el caso de una membrana de eliminacion de virus de tamano de poro pequeno realizada de PVDF hidrofilizado, PES hidrofilizado o PS hidrofilizado, la presion de filtracion optima esta en el intervalo de 0,00 kgf/cm2 (0,0 kPa) a 5,00 kgf/cm2 (4,9 x 102 kPa).

En el procedimiento de fabricacion de la presente realizacion, la etapa (q) es una etapa de filtracion a presion baja para filtrar la solucion a traves de la membrana de eliminacion de virus de tamano de poro pequeno a una presion de filtracion de 29,4 kPa (0,30 kgf/cm2) o inferior para obtener la solucion proteinica con bajo nivel virico. Esta etapa se incluye en la etapa (a). Especificamente, la etapa (q) se refiere a una etapa de realizar la filtracion a una presion de filtracion de 29,4 kPa (0,30 kgf/cm2) o inferior en la etapa (a).

La filtracion de una solucion que contiene virus utilizando una membrana de eliminacion de virus se lleva a cabo normalmente a una presion de filtracion lo mas elevada posible, con el fin de tratar cantidades mayores de soluciones proteinicas en un tiempo corto. Los inventores de la presente invencion, sin embargo, han descubierto que esta etapa de filtracion a presion baja para filtrar una solucion que contiene virus a traves de la membrana de eliminacion de virus de tamano de poro pequeno, a una presion de filtracion baja, puede no conseguir eliminar los virus debido a su fuga a los filtrados. Ademas, los inventores de la presente invencion han descubierto que, en esta etapa de filtracion a presion baja, el pH X y la fuerza ionica salina Y de la solucion antes de la filtracion pueden ajustarse de modo que X e Y satisfagan las ecuaciones 1 y 5 o las ecuaciones 4 y 5, mostradas a continuacion, para obtener de este modo un filtrado con bajo contenido en virus sin fuga de virus a los filtrados.

En la presente realizacion, la presion de filtracion se puede medir facilmente utilizando un manometro dispuesto en un aparato de eliminacion de virus equipado con la membrana de eliminacion de virus de tamano de poro pequeno. Alternativamente, se puede colocar un manometro en el lado del recipiente de la solucion de alimentacion y utilizarlo en la medicion. Dependiendo de la composicion de la solucion antes de la filtracion, los virus se filtran a los filtrados a una presion de filtracion de 29,4 kPa (0,30 kgf/cm2) o inferior (por ejemplo, aproximadamente 19,6 kPa (0,20 kgf/cm2), como se muestra en los ejemplos descritos a continuacion). Sin quedar limitado por la teoria, esto es probablemente porque: una presion de filtracion inferior debilita la capacidad de la membrana de eliminacion de virus de tamano de poro pequeno para retener los virus y en su lugar aumenta el grado de libertad de los virus, que a su vez se fugan a los filtrados; y particularmente, este fenomeno se hace evidente a una presion de filtracion de 29,4 kPa (0,30 kgf/cm2) o inferior.

Sin embargo, en la etapa de filtracion a presion baja, se puede obtener un filtrado con bajo nivel virico si la solucion antes de la filtracion tiene un pH X y una fuerza ionica salina Y que satisfacen las siguientes ecuaciones 1 y 5:

0 < Y mM < 150X - 590 (Ecuacion 1)

3,5 < X < 8,0 (Ecuacion 5)

o las siguientes ecuaciones 4 y 5:

Y = 0 mM (Ecuacion 4)

3,5 < X < 8,0 (Ecuacion 5)

Preferentemente, la solucion antes de la filtracion en la etapa de filtracion a presion baja puede tener un pH X y una fuerza ionica salina Y que satisfagan las siguientes ecuaciones 2 y 5:

0 < Y mM < 50X - 200 (Ecuacion 2)

3,5 < X < 8,0 (Ecuacion 5)

o las siguientes ecuaciones 4 y 5:

Y = 0 mM (Ecuacion 4)

3,5 < X < 8,0 (Ecuacion 5)

segun la tasa de eliminacion de virus en el farmaco proteinico a obtener. De manera especialmente preferente, la solucion antes de la filtracion en la etapa de filtracion a presion baja puede tener un pH X y una fuerza ionica salina Y que satisfagan las siguientes ecuaciones 3 y 5:

0 < Y mM < 50X - 250 (Ecuacion 3)

3,5 < X < 8,0 (Ecuacion 5)

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o las siguientes ecuaciones 4 y 5:

Y = 0 mM (Ecuacion 4)

3,5 < X < 8,0 (Ecuacion 5)

Tal como se muestra en los ejemplos descritos a continuacion, los inventores de la presente invencion han confirmado que, si una presion de filtracion es de 29,4 kPa (0,30 kgf/cm2) o inferior, por ejemplo, de aproximadamente 19,6 kPa (0,20 kgf/cm2) (por ejemplo, de 9,81 kPa a 29 4 kPa (0,10 kgf/cm2 a 0,30 kgf/cm2) y, como ejemplo adicional, de 14,7 kPa a 24,5 kPa (0,15 kgf/cm2 a 0,25 kgf/cm2) y el pH X y la fuerza ionica salina Y de la solucion antes de la filtracion satisfacen la ecuacion 1, la tasa de eliminacion de virus es elevada.

La tasa de eliminacion de virus mediante filtracion puede estar indicada por un valor de reduccion logaritmico (LRV). LRV se calcula segun la siguiente ecuacion 6:

LRV = log10 (Cq/Cf) (Ecuacion 6)

en la que Cq representa la concentracion virica de la solucion antes de la filtracion y Cf representa la concentracion virica de la solucion filtrada. Un valor inferior de LRV representa una tasa mas baja de eliminacion de virus.

Cada concentracion virica en el calculo de LRV puede estar indicada por un titulo de infectividad, el numero de copias de acidos nucleicos virales, etc. Entre los ejemplos de procedimientos para medir el titulo de infectividad se incluyen TCID50 y procedimientos de placa. El numero de copias de acidos nucleicos virales se puede medir utilizando, por ejemplo, PCR.

En general, un LRV de 4 o superior en la evaluacion del rendimiento de la membrana de eliminacion de virus significa que los virus son eliminados suficientemente mediante la filtracion por membrana. Del mismo modo, un LRV de 5 o superior significa que los virus se eliminan hasta 1/105 o menos. Un LRV de 6 o superior significa que los virus se eliminan hasta 1/106 o menos y rara vez se filtran a los filtrados.

En la presente realizacion, el LRV calculado segun la ecuacion 6 a partir de la concentracion virica (Cq) de la solucion proteinica que contiene virus antes de la etapa de filtracion (a) y la concentracion virica (Cf) de la solucion proteinica con bajo nivel virico despues de la filtracion es, preferentemente, de 4 o superior, mas preferentemente, de 5 o superior, de forma adicionalmente preferente, de 6 o superior. Tambien es preferente una concentracion virica (Cf) igual o inferior al limite de deteccion.

Tal como es evidente a partir de los resultados de los ejemplos descritos a continuacion, un pH mas bajo de la solucion antes de la filtracion en la etapa de filtracion a presion baja aumenta la fuga de virus hacia los filtrados y disminuye el LRV. Este fenomeno se hace mas evidente en presencia de una mayor fuerza ionica salina de la solucion antes de la filtracion. La fuga mas grande de virus a los filtrados se observa cuando la solucion antes de la filtracion tiene un pH bajo y una fuerza ionica salina elevada.

Tal como se muestra en los ejemplos descritos a continuacion, la etapa de filtracion a presion baja puede realizarse con una tasa de eliminacion de virus (LRV) de 4 o mas cuando el pH X y la fuerza ionica salina Y de la solucion antes de la filtracion satisfacen la combinacion de las ecuaciones 1 y 5 o de las ecuaciones 4 y 5. Por el contrario, los virus se filtran a los filtrados debido a una tasa baja de eliminacion de virus cuando X e Y no satisfacen ninguna combinacion de las ecuaciones 1 y 5 ni de las ecuaciones 4 y 5. Ademas, la etapa de filtracion a presion baja puede realizarse con una tasa de eliminacion de virus (LRV) de 5 o superior cuando X e Y satisfacen la combinacion de las ecuaciones 2 y 5 o las ecuaciones 4 y 5. La etapa de filtracion a presion baja puede llevarse a cabo con una tasa mayor de eliminacion de virus que consigue una concentracion virica igual o inferior al limite de deteccion en el filtrado cuando X e Y satisfacen la combinacion de las ecuaciones 3 y 5 o las ecuaciones 4 y 5. De este modo, el pH X y la fuerza ionica salina Y de la solucion antes de la filtracion pueden ajustarse de modo que X e Y satisfagan la combinacion de las ecuaciones descritas anteriormente para de esta manera obtener una solucion con bajo nivel virico sin fuga de virus a los filtrados incluso a una presion de filtracion baja.

En la etapa de filtracion a presion baja, el pH X de la solucion antes de la filtracion es deseablemente 3,5 o superior y 8,0 o inferior, mas preferentemente 4,0 o superior y 8,0 o inferior. A un pH inferior a 3,5 o superior a 8,0, la proteina puede desnaturalizarse o degradarse.

La concentracion ionica salina Y de la solucion antes de la filtracion se obtiene calculando el producto de la concentracion de ion por el cuadrado de su carga para cada una de las especies ionicas derivadas de sales liberadas en la solucion, sumando los productos y calculando posteriormente la mitad de los productos sumados, y esta representado por la siguiente formula 8:

Y = 1/2 I (Ci x Zi2) (Ecuacion 8)

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en la que Ci representa la concentracion molar de cada ion y Zi representa el numero de carga de cada ion.

Entre los ejemplos de las especies ionicas derivadas de sales se incluyen iones derivados de sales inorganicas y iones derivados de sales que constituyen componentes de la solucion tampon. En el caso de una solucion que no contenga un componente de solucion tampon y que contenga solo una sal inorganica, su fuerza ionica salina puede calcularse como la fuerza ionica de solo la sal inorganica. Cuando la sal inorganica es NaCl, la fuerza ionica salina es identica a la concentracion salina de NaCl.

Normalmente, en la solucion que contiene el componente de solucion tampon, el componente de solucion tampon juega un papel en el ajuste del pH. La fuerza ionica salina se ajusta a menudo anadiendo una sal inorganica (por ejemplo, NaCl).

En la etapa de filtracion a presion baja, la fuerza ionica salina Y de la solucion antes de la filtracion esta deseablemente en el intervalo de 500 mM o inferior, que ni desnaturaliza la proteina ni influye en la formacion de agregados. Y es, preferentemente, 300 mM o inferior, mas preferentemente, 150 mM o inferior.

En un aspecto de la presente realizacion, la etapa de filtracion a presion baja tambien se puede realizar con una tasa elevada de eliminacion de virus cuando el pH X y la fuerza ionica salina Y de la solucion antes de la filtracion estan en los siguientes intervalos:

3.5 < X < 4 e Y = 0 mM;

4 < X < 4,6 y 0 < Y mM < 50, preferentemente 0 < Y < 10, mas preferentemente, Y = 0 mM;

4.6 < X < 5 y 0 < Y mM < 100, preferentemente 0 < Y mM < 50, mas preferentemente, 0 < Y mM < 10, de forma adicionalmente preferente, Y = 0 mM;

5 < X < 6 y 0 < Y mM < 150, preferentemente, 0 < Y mM < 100, mas preferentemente, 0 < Y mM < 50, de forma adicionalmente preferente, Y = 0 mM; y

6 < X < 8 y 0 < Y mM < 300, preferentemente, 0 < Y mM < 150, mas preferentemente, 0 < Y mM < 100.

El pH de la solucion antes de la filtracion puede ajustarse mediante la seleccion y el aumento o la disminucion de la cantidad de un componente de solucion tampon, tal como una solucion tampon de acetato, una solucion tampon de citrato, una solucion tampon de fosfato o una solucion tampon de Tris-HCl, mediante la adicion de una base, tal como NaOH, o mediante la adicion de un acido, tal como HCl. La fuerza ionica salina de la solucion antes de la filtracion puede ajustarse mediante el aumento o disminucion de la cantidad de una sal, tal como NaCl o una sal tampon. Asimismo, el pH y la fuerza ionica salina de la solucion antes de la filtracion pueden medirse mediante un enfoque conocido por los tecnicos en la materia.

La solucion antes de la filtracion que se filtra en la etapa (q) no esta particularmente limitada, siempre y cuando la solucion antes de la filtracion tenga un pH X y una fuerza ionica salina Y que satisfagan las ecuaciones 1 y 5 o las ecuaciones 4 y 5. Entre los ejemplos de la misma se incluyen las soluciones proteinicas que contienen virus descritas anteriormente, asi como soluciones tampon (por ejemplo, una solucion tampon para el lavado descrita a continuacion) y agua. La composicion de las soluciones tampon no esta particularmente limitada. Las soluciones tampon pueden contener cualquiera de los componentes de la solucion tampon descritos anteriormente, asi como cualquiera de los aminoacidos basicos, sales inorganicas, surfactantes, sacaridos, etc., descritos anteriormente. Preferentemente, la solucion antes de la filtracion contiene un componente que se superpone con el de la solucion proteinica que contiene virus en la etapa (a).

En un aspecto de la presente realizacion, la solucion antes de la filtracion en la etapa (q) es la solucion proteinica que contiene virus, en la que el 50% o mas de la solucion de proteinas completa, que contiene el virus a filtrar en la etapa de filtracion (a), se filtra en la etapa de filtracion a presion baja (q).

En general, la filtracion de una solucion proteinica que contiene virus utilizando una membrana de filtracion de virus de tamano de poro pequeno se realiza a una presion de filtracion lo mas elevada posible, con el fin de mejorar la eficacia del tratamiento. Sin embargo, la filtracion a una presion de filtracion baja es preferente para algunas proteinas. Un ejemplo de estas proteinas incluye un anticuerpo. Entre los ejemplos del anticuerpo se incluyen anticuerpos monoclonales y anticuerpos policlonales. En el caso de una solucion proteinica que contiene virus que contenga esta proteina, deseablemente, el 50% o mas, preferentemente el 75% o mas, mas preferentemente el 90% o mas, de forma adicionalmente preferente, el 95% o mas de la solucion proteinica que contiene virus en la etapa de filtracion (a) se filtra en la etapa de filtracion a presion baja (q).

En un aspecto de la presente realizacion, toda la solucion proteinica completa que contiene virus a filtrar en la etapa de filtracion (a) se puede filtrar en la etapa de filtracion a presion baja (q). En este caso, la etapa de filtracion (a) es una etapa para filtrar la solucion proteinica que contiene virus a traves de la membrana de eliminacion de virus de tamano de poro pequeno a una presion de filtracion de 29,4 kPa (0,30 kgf/cm2) o inferior para obtener la solucion con bajo contenido de virus, en la que la solucion antes de la filtracion en la etapa de filtracion (a) tiene un pH X y una fuerza ionica salina Y que satisfacen las siguientes ecuaciones 1 y 5:

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0 < Y mM < 150X - 590

(Ecuacion 1)

3,5 < X < 8,0

(Ecuacion 5)

o las siguientes ecuaciones 4 y 5:

Y = 0 mM

(Ecuacion 4)

3,5 < X < 8,0

(Ecuacion 5)

En este caso, la presion de filtracion y las ecuaciones 1, 4 y 5 son como las descritas sobre la etapa (q). La solucion proteinica que contiene virus adecuada para dicha filtracion es una solucion de anticuerpos monoclonales.

Segun la presente invencion, la etapa de filtracion (a) comprende la siguiente etapa (p) realizada antes de la etapa de filtracion a presion baja (q):

(p) una etapa de filtracion a presion elevada para filtrar la solucion proteinica que contiene virus a traves de la

membrana de eliminacion de virus de tamano de poro pequeno a una presion de filtracion superior a 29,4 kPa (0,30

kgf/cm2) para obtener la solucion proteinica con bajo nivel virico.

La etapa (p) se incluye, como en la etapa (q), en la etapa (a) y se refiere a una etapa para realizar la filtracion a una

presion de filtracion superior a 29,4 kPa (0,30 kgf/cm2) en la etapa (a).

La membrana de eliminacion de virus de tamano de poro pequeno, la solucion proteinica que contiene virus y el procedimiento de filtracion de la etapa (p) son tal como se describen en relacion con la etapa (a).

La presion de filtracion en la etapa (p) difiere dependiendo del material de la membrana de eliminacion de virus de tamano de poro pequeno, pero no esta particularmente limitada, siempre y cuando la presion de filtracion sea mayor de 29,4 kPa (0,30 kgf/cm2) y este en el intervalo de presiones igual o inferior a la presion de resistencia de la membrana. En el caso, por ejemplo, de una membrana de eliminacion de virus de tamano de poro pequeno constituida por celulosa, la presion de filtracion optima esta en el intervalo de 0,50 kgf/cm2 (4,9 x 10 kPa) a 1,00 kgf/cm2, (9,8 x 10 kPa). En el caso de una membrana de eliminacion de virus de tamano de poro pequeno constituida por PVDF hidrofilizado, PES hidrofilizado o PS hidrofilizado, la presion de filtracion optima esta en el intervalo de 1,00 kgf/cm2 (9,8 x 10 kPa) a 5,00 kgf/cm2 (4,9 x 102 kPa).

La filtracion continua (que se realiza a una presion de filtracion lo mas elevada posible para mejorar la eficacia del tratamiento) de soluciones proteinicas que contienen virus, utilizando una membrana de filtracion de virus de tamano de poro pequeno, puede dejar particulas de proteina dentro de la membrana (en un lado opuesto al filtrado) con el aumento de la cantidad de la solucion filtrada, dando lugar a la obstruccion. De este modo, se puede realizar una operacion denominada etapa de lavado posterior, en la que las proteinas que quedan dentro de la membrana se lavan a los filtrados mediante filtracion de una solucion sin proteinas (solucion de lavado). En la presente realizacion, la etapa de lavado posterior se refiere a la filtracion anadida despues de la filtracion de proteinas con el fin de recuperar las proteinas que quedan dentro de la membrana de eliminacion de virus de tamano de poro pequeno. En el caso de realizar la etapa de lavado posterior, se conmuta una linea en la que se introduce la solucion antes de la filtracion, porque se filtra la solucion de lavado en lugar de la solucion que contiene proteinas. Si la presion de filtracion se mantiene elevada durante esta conmutacion de linea, la solucion retrocede hacia el lado de la solucion de lavado. De este modo, la presion de filtracion se alivia temporalmente a 0,0 kPa. Despues de la conmutacion de la linea, se aplica de nuevo la presion de filtracion para filtrar la solucion de lavado. El tiempo transcurrido entre la caida de la presion hasta cero y el reinicio de la filtracion de la solucion de lavado bajo presion de filtracion no esta particularmente limitado. Una caida de presion suficiente se produce, por ejemplo, despues 5 segundos o mas. Una caida de presion mas suficiente se produce despues de 1 minuto o mas, 5 minutos o mas, o 30 minutos o mas. Desde el punto de vista de la capacidad de trabajo, a menudo se reinicia la filtracion, por ejemplo, dentro de un periodo de 7 dias, 5 dias, 3 dias, o 24 horas. Dado que la presion de filtracion disminuye temporalmente durante la conmutacion de linea, los virus se fugan a los filtrados, dependiendo de la composicion de la solucion antes de la filtracion. Esta fuga de virus puede evitarse mediante la etapa (q), tal como se ha mencionado anteriormente.

Especificamente, en un aspecto de la presente realizacion, las particulas de proteina que quedan en el interior de la membrana durante el transcurso de la etapa (p) son lavadas mediante la etapa de lavado posterior, que incluye la etapa (q) de filtracion a presion baja. Cuando la etapa de filtracion a presion baja (q) se incluye en la etapa de lavado posterior, la solucion antes de la filtracion en la etapa (q) es, preferentemente, una solucion de lavado sin proteinas. La composicion de la solucion de lavado no esta particularmente limitada. Preferentemente, la solucion de lavado contiene un componente que se superpone con el de la solucion proteinica que contiene virus en la etapa (a) o (p) y, mas preferentemente, es una solucion tampon para el lavado. La solucion tampon para el lavado es una solucion tampon utilizada para disolver las proteinas en la produccion de la solucion proteinica que contiene virus para su utilizacion en la etapa (a). La etapa de lavado posterior puede realizarse dos o mas veces, si es necesario.

Cuando la etapa (a) comprende la etapa de lavado posterior, preferentemente, el LRV calculado segun la ecuacion 6, a partir de la concentracion virica (Cq) de la solucion proteinica que contiene virus antes de la etapa de filtracion

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(a) y la concentracion virica (Cf) de la solucion proteinica con bajo nivel virico despues de la filtracion, es 4 o superior (preferentemente 5 o superior), y el LRV' calculado segun la siguiente ecuacion 7 es 4 o superior (preferentemente 5 o superior):

LRV' = logi0 (C0/Cw) (Ecuacion 7)

en la que C0 representa la concentracion virica de la solucion proteinica que contiene virus antes de la etapa de filtracion (a), y Cw representa la concentracion virica del filtrado de la solucion tampon para lavado despues de la etapa de filtracion (a). La concentracion virica puede medirse utilizando la aproximacion descrita anteriormente, en relacion con la ecuacion 6.

En la ecuacion 7, la concentracion virica (Cw) del filtrado de la solucion tampon para el lavado despues de la etapa de filtracion (a) se refiere a la concentracion virica solo del filtrado de la solucion tampon para el lavado, filtrada en la etapa de lavado posterior. Los virus derivados de la solucion proteinica que contiene virus, filtrada antes de la etapa de lavado posterior, pueden permanecer dentro de la membrana de filtracion de virus de tamano de poro pequeno. En la etapa de lavado posterior, que comprende la filtracion a una presion de filtracion baja, los virus pueden filtrarse hacia el filtrado de la solucion tampon para lavado, dependiendo del pH y la fuerza ionica salina de la solucion antes de la filtracion. El pH X y la fuerza ionica salina Y de la solucion antes de la filtracion pueden ajustarse de modo que X e Y satisfagan las ecuaciones 1 y 5 o las ecuaciones 4 y 5, para evitar de este modo esta fuga de virus, incluso en el lavado posterior.

Entre los ejemplos de esta disminucion en la presion de filtracion durante la filtracion a traves de una membrana de eliminacion de virus, como en la etapa de lavado posterior, se incluyen una etapa que implica un caso en el que la aplicacion de presion se suspende durante la filtracion y luego se reinicia (etapa de parada e inicio). Un ejemplo posible es un caso en el que se detiene una presion de filtracion por una razon, tal como la desconexion de la alimentacion durante la filtracion de una solucion proteinica que contiene virus a traves de una membrana de filtracion de virus de tamano de poro pequeno y, posteriormente, se aplica de nuevo mediante la conexion de la alimentacion. El tiempo transcurrido entre la caida de presion hasta cero y el reinicio de la filtracion de la solucion de lavado bajo presion de filtracion no esta particularmente limitado. Una caida de presion suficiente se produce, por ejemplo, despues 5 segundos o mas. Una caida de presion mas suficiente se produce despues de 1 minuto o mas, 5 minutos o mas, o 30 minutos o mas. Desde el punto de vista de la capacidad de trabajo, a menudo se reinicia la filtracion, por ejemplo, dentro de un periodo de 7 dias, 5 dias, 3 dias o 24 horas. Dado que la presion de filtracion disminuye tambien temporalmente en este caso, los virus se pueden fugar a los filtrados, dependiendo de la composicion de la solucion antes de la filtracion. Esta fuga de virus puede evitarse mediante la etapa (q), tal como se ha mencionado anteriormente.

Especificamente, en un aspecto de la presente realizacion, se puede obtener una solucion proteinica con bajo nivel virico mediante la etapa de filtracion a presion baja (q), en la que el pH X y la fuerza ionica salina Y de la solucion antes de la filtracion se encuentran dentro de los intervalos predeterminados, incluso si la presion de filtracion disminuye durante la etapa (p).

En un aspecto de la presente realizacion, si la etapa de filtracion (a) comprende la etapa (p) realizada antes de la etapa de filtracion a presion baja (q), la presion de filtracion en la etapa (q) podria llegar a ser casi 0,0 kPa. La presion de filtracion puede llegar a ser de casi 0,0 kPa, por ejemplo, cuando una linea en la cual se introduce la solucion antes de la filtracion se conmuta a la etapa de lavado posterior o cuando se desconecta la corriente en la etapa de parada e inicio. En este caso, la aplicacion de presion puede reiniciarse: cerrando la linea entre la membrana de eliminacion de virus de tamano de poro pequeno y un recipiente para la alimentacion de la solucion antes de la filtracion; a continuacion, ajustando la presion en el lado del recipiente de alimentacion a la presion de filtracion optima descrita en relacion con la etapa (a); y posteriormente, abriendo la linea entre la membrana de eliminacion de virus de tamano de poro pequeno y el recipiente para la alimentacion de la solucion antes de la filtracion, seguido de filtracion a presion constante, o abriendo la linea entre la membrana de eliminacion de virus de tamano de poro pequeno y el recipiente para la alimentacion de la solucion antes de la filtracion, seguido por filtracion con la presion aumentada gradualmente hasta el valor predeterminado. Por ejemplo, el periodo durante el cual se alivia la presion de filtracion hasta llegar a 0,0 kPa (duracion de la filtracion realizada a una presion de filtracion baja) es de 3 horas, y a continuacion se puede reiniciar la aplicacion de presion para realizar la filtracion. Con la tasa de eliminacion de virus por esta filtracion como una pauta, se supone que un periodo inferior a 3 horas en el cual se alivia la presion de filtracion ofrece una tasa de eliminacion de virus mas elevada que la ofrecida por un periodo de 3 horas.

En el procedimiento para fabricar un farmaco proteinico con bajo nivel virico, segun la presente realizacion, se puede realizar antes de la etapa (a) una filtracion preliminar a traves de un filtro de membrana que tiene un tamano de poro mayor que el de la membrana de eliminacion de virus de tamano de poro pequeno. En este contexto, se puede utilizar Planova (marca registrada) 35N, Planova (marca registrada) 75N (ambos fabricadas por Asahi Kasei Medical Co., Ltd.), un filtro de 0,1 pm, un filtro de 0,2 pm, o similar, como el filtro que tiene un tamano de poro mayor. La etapa (a) puede realizarse directamente utilizando la membrana de eliminacion de virus de tamano de poro pequeno sin la filtracion preliminar.

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Pueden realizarse uno o mas tratamientos de entre cromatografia, tratamiento S/D, tratamiento de concentracion y tratamiento de sustitucion de tampon antes de la etapa (a).

Entre los ejemplos del tratamiento de cromatografia se pueden incluir cromatografia en columna utilizando una columna rellena con una resina de intercambio ionico o una resina de filtracion en gel, y cromatografia de membrana utilizando una membrana porosa que tiene un grupo de intercambio ionico anadido a la superficie. Entre los ejemplos del modo de separacion de la cromatografia se incluyen cromatografia de filtracion en gel, cromatografia de intercambio ionico (intercambio de cationes: CEX, intercambio de aniones: AEX), cromatografia de interaccion hidrofobica (HIC), cromatografia de afinidad, cromatografia de afinidad por quelatos metalicos y cromatografia de hidroxiapatita. Se pueden utilizar en combinacion una cromatografia que utiliza intercambio ionico y ligandos de cromatografia de interaccion hidrofobica.

El tratamiento S/D se puede llevar a cabo mediante inactivacion de virus, segun un procedimiento conocido en la tecnica utilizando un disolvente organico, tal como fosfato de tri-n-butilo (TNBP) y un surfactante, tal como Tween 80.

El tratamiento de concentracion se puede realizar, segun un procedimiento conocido en la tecnica, utilizando una membrana de ultrafiltracion (UF). Este tratamiento se puede realizar por concentracion centrifuga.

El tratamiento de sustitucion del tampon puede realizarse simultaneamente con la concentracion, segun un procedimiento conocido en la tecnica, utilizando una membrana de ultrafiltracion. Este tratamiento se puede realizar por filtracion en gel. Alternativamente, el tratamiento puede realizarse tambien mediante dialisis utilizando una membrana de dialisis.

Posteriormente a la etapa (a), la solucion proteinica con bajo nivel virico obtenida puede purificarse por tratamiento de cromatografia. Ademas, la solucion proteinica con bajo nivel virico puede concentrarse adicionalmente mediante tratamiento con UF. La solucion proteinica con bajo nivel virico obtenida en la etapa (a) o su producto purificado o concentrado puede utilizarse como un farmaco final con su composicion liquida sin cambios. Alternativamente, la solucion proteinica con bajo nivel virico obtenida en la etapa (a) o su producto purificado o concentrado puede complementarse con un sacarido, un surfactante, o similar y utilizarse como un farmaco final. El tampon presente en la solucion puede ser reemplazado por un disolvente de composicion diferente. Ademas, la solucion puede liofilizarse.

En un aspecto, la presente realizacion se refiere ademas a un procedimiento para fabricar un farmaco proteinico con bajo nivel virico, que comprende la siguiente etapa (a):

(a) una etapa de filtracion para filtrar una solucion proteinica que contiene virus a traves de una membrana de eliminacion de virus de tamano de poro pequeno para obtener una solucion con bajo nivel virico,

comprendiendo la etapa (a) la siguiente etapa (q)

(q) una etapa de filtracion a presion baja para filtrar la solucion a traves de la membrana de eliminacion de virus de tamano de poro pequeno a una presion de filtracion de 29,4 kPa (0,30 kgf/cm2) o inferior para obtener la solucion proteinica con bajo nivel virico,

y que comprende, antes de la etapa de filtracion a presion baja (q), una etapa de ajuste de la solucion antes de la filtracion, de modo que la solucion antes de la filtracion en la etapa (q) tenga un pH X y una fuerza ionica salina Y que satisfacen las siguientes ecuaciones 1 y 5:

0 < Y mM < 150X - 590 (Ecuacion 1) 3,5 < X < 8,0 (Ecuacion 5)

o las siguientes ecuaciones 4 y 5:

Y = 0 mM (Ecuacion 4)

3,5 < X < 8,0 (Ecuacion 5)

Se puede obtener un farmaco proteinico con bajo nivel virico mediante el procedimiento de fabricacion de la presente invencion.

La presente realizacion se refiere ademas a un procedimiento para eliminar un virus en una solucion proteinica que contiene virus, que comprende realizar la etapa (a) (que comprende la etapa (q)).

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Ejemplos

A continuacion, la presente invencion se describira con referenda a los ejemplos.

En los ejemplos que se muestran a continuacion, se utilizo una membrana de fibras huecas Planova (marca registrada) 20N (fabricada por Asahi Kasei Medical Co., Ltd.) compuesta por celulosa, como la membrana de eliminacion de virus de tamano de poro pequeno. Se midio el pH utilizando un medidor de pH. Se calculo la fuerza ionica salina a partir de la cantidad de sal (concentracion de sal) utilizada para ajustar cada solucion.

(i) Preparacion de la solucion proteinica

Se utilizaron anticuerpos policlonales (IgG humana) (Venoglobulina-IH, fabricada por Benesis Corp.). Los anticuerpos se diluyeron con agua inyectable (Otsuka Pharmaceutical Co., Ltd.) a una concentracion de anticuerpos de 10 mg/ml. La fuerza ionica salina de cada solucion se ajusto a un valor mostrado a continuacion en cada ejemplo, utilizando una solucion acuosa de NaCl 1 M. El pH se ajusto a un valor mostrado a continuacion en cada ejemplo, utilizando HCl 0,1 M o NaOH 0,1 M.

(ii) Medicion de la tasa de eliminacion de virus (LRV)

Se diluyeron celulas PK-13 cultivadas (obtenidas de ATCC, ATCC No. CRL-6489) con D-MEM (fabricado por Invitrogen Corp., alto contenido de glucosa) que contenia el 3% en volumen de suero bovino (fabricado por EMD Millipore Corp. (Upstate); utilizado despues de haber sido inactivado mediante calentamiento durante 30 minutos en un bano de agua a 56°C) y el 1% en volumen de penicilina/estreptomicina (+10.000 unidades/ml de penicilina, +10.000 pg/ml de estreptomicina, fabricado por Invitrogen Corp.) (a continuacion, esta solucion mixta se denomina "FBS al 3%/D-MEM") para preparar una suspension diluida que tiene una concentracion celular de 2,0 x 105 celulas/ml. Se prepararon diez placas de cultivo celular de 96 pocillos de fondo redondo (fabricadas por Becton, Dickinson and Company (BD Falcon)), y esta suspension celular se introdujo en una concentracion de 100 pl/pocillo a todos los pocillos.

Posteriormente, se diluyo un filtrado obtenido por filtracion en cada ejemplo a continuacion, con FBS al 3%/D-MEM para preparar diluciones con un factor de dilucion de 10, 102, 103, 104 y 105. Cada disolucion no filtrada (solucion proteinica que contenia virus), recogida inmediatamente antes de la filtracion, se diluyo con FBS al 3%/D-MEM para preparar diluciones con un factor de dilucion de 102, 103, 104, 105, 106 y 10. Cada filtrado y las diluciones con un factor de dilucion de 10, 102, 103, 104 y 105 del filtrado, asi como las diluciones con un factor de dilucion de 102, 103, 104, 105, 106 y 107 de la solucion no filtrada, se distribuyeron por separado, a una concentracion de 100 pl/pocillo, a 8 pocillos de las placas de cultivo celular de 96 pocillos en las que se habia introducido la suspension celular. Las celulas se cultivaron a 37°C durante 10 dias en una atmosfera de CO2 al 5% en un incubador.

Posteriormente, las placas de cultivo celular despues del cultivo de 10 dias se sometieron a medicion de TCID50 (titulo del 50% de infectividad) mediante el procedimiento de adsorcion de eritrocitos (vease “Virus Jikken Gaku”, articulo "Experimental Study of Viruses in English”, General, Ed., National Institute of Infectious Diseases, pag. 173). Se diluyo sangre de pollo conservada (fabricada por Nippon Bio-Test Laboratories Inc.) 5 veces con PBS (-) (fabricado por Nissui Pharmaceutical Co., Ltd., preparado por el procedimiento descrito en la instruccion adjunta al producto) y a continuacion se centrifugo a 2.500 rpm a 4°C durante 5 minutos para precipitar los eritrocitos. A continuacion, el sobrenadante se elimino por aspiracion. Los precipitados que contenian eritrocitos obtenidos se diluyeron de nuevo 200 veces con PBS (-).

Posteriormente, se introdujo la dilucion de PBS (-) de los precipitados de eritrocitos preparados a una concentracion de 100 pl/pocillo en todos los pocillos de las placas de cultivo celular y se dejo en reposo durante 2 horas. A continuacion, se confirmo visualmente la presencia o ausencia de la adsorcion de eritrocitos a la superficie del tejido celular cultivado. Los pocillos en los que se confirmo la adsorcion se contaron como pocillos con infeccion virica, mientras que los pocillos en los que se confirmo que no tenian esta adsorcion se contaron como pocillos sin infeccion virica. En cuanto a la presencia o ausencia de infeccion virica en cada solucion de cultivo obtenida, el porcentaje se confirmo en base a cada filtrado o cada una de sus diluciones, o cada dilucion de la solucion no filtrada. Se calculo el log (TCID50/ml) como un titulo de infectividad mediante el procedimiento de Reed-Muench (vease “Virus Jikken Gaku”, articulo "Experimental Study of Viruses in English”, General, Ed., National Institute of Infectious Diseases, pags. 479-480). La tasa de eliminacion de virus (LRV) se calculo segun la siguiente ecuacion:

LRV = log10 (Cq/Cf)

en la que

Cq representa el titulo de infectividad de la solucion no filtrada (solucion proteinica que contiene virus) antes de la filtracion a traves de la membrana de eliminacion de virus de tamano de poro pequeno; y

Cf representa el titulo de infectividad de la solucion filtrada a traves de la membrana de eliminacion de virus de tamano de poro pequeno.

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(Ejemplo 1: Filtracion utilizando la membrana de eliminacion de virus a diferentes presiones de filtracion)

Se preparo cada solucion protemica (solucion de anticuerpo policlonal) que tenfa un pH de 4, 4,6, 5, 6, 7 u 8 y una fuerza ionica salina fijada a 100 mM, mediante el procedimiento descrito anteriormente en (i) (ejemplos experimentales 1 a 16). A continuacion, se anadio a cada solucion parvovirus porcino (PPV, Asociacion Japonesa de Productos Biologicos Veterinarios, lo mismo es valido para los siguientes ejemplos 2 a 4) a una solucion del 0,5% en volumen y se agito bien la mezcla para obtener una solucion protemica que contema virus.

Cada solucion obtenida de este modo se sometio a filtracion en lfnea a traves de una membrana de eliminacion de virus de tamano de poro pequeno (Planova (marca registrada) 20N) que tenfa un area de membrana de 0,001 m2 a una presion de filtracion de 9,8, 19,6, 49, 78,5 kPa (0,10, 0,20, 0,50 o 0,80 kgf/cm2) hasta que la cantidad de la solucion filtrada alcanzo 50 l/m2. La presion de filtracion se midio utilizando un manometro colocado en el lado del recipiente de la solucion de alimentacion. La tasa de eliminacion de PPV en el lote de 50 l/m2 se midio mediante el procedimiento descrito anteriormente en (ii).

La relacion de cada presion de filtracion y cada pH con la tasa de eliminacion de virus (LRV) se muestra en la tabla 1 siguiente. Como se muestra en la tabla 1, aunque el pH vario, la tasa de eliminacion de virus se mantuvo elevada incluso en el caso de una presion de filtracion elevada. En contraste, se demostro que un pH menor de la solucion protemica que contema el virus antes de la filtracion produjo una tasa menor de eliminacion de virus, en el caso de una presion de filtracion baja, dando como resultado fuga de virus.

[Tabla 1]

pH Fuerza ionica salina (mM) Presion de filtracion kPa (kgf/cm2) ] LRV

Ejemplo experimental 1

4,0 100 78,5 (0,80) >5,92

Ejemplo experimental 2

5,0 100 78,5 (o,80> >6,00

Ejemplo experimental 3

6,0 100 78,5 ( 0,80 ) >5,59

Ejemplo experimental 4

7,0 100 78,5(0,80 ) >5,78

Ejemplo experimental 5

4,0 100 4 9 (0,50 ) >5,87

Ejemplo experimental 6

5,0 100 49 (0,50 ) >5,83

Ejemplo experimental 7

6,0 100 4 9 (0,50) >6,00

Ejemplo experimental 8

7,0 100 4 9 ( 0,50 ) >5,84

Ejemplo experimental 9

4,0 100 19,6 (0,20 ) 3,88

Ejemplo experimental 10

5,0 100 19,6 (o,20 ) 4,69

Ejemplo experimental 11

6,0 100 19,6(0,20 ) 5,17

Ejemplo experimental 12

7,0 100 19,6 (0,20 ) >5,34

Ejemplo experimental 13

4,0 100 9,8 (0,10 ) 3,50

Ejemplo experimental 14

5,0 100 9,8 (0,10 ) 4,40

Ejemplo experimental 15

6,0 100 9,8 (0,10 ) 5,00

Ejemplo experimental 16

7,0 100 9,8 (0,10 ) >5,34

(Ejemplo 2: Filtracion continua a presion baja de soluciones protemicas que contienen virus que difieren en el pH y la fuerza ionica salina)

Se preparo, mediante el procedimiento descrito anteriormente en (i), cada solucion protemica (solucion de anticuerpos policlonales) con cualquiera de los valores de pH y fuerzas ionicas salinas de los ejemplos experimentales 17 a 31, mostrados en la tabla 2. A continuacion, se anadio parvovirus porcino (PPV) a una concentracion del 0,5% en volumen a cada solucion, y la mezcla se agito bien para obtener una solucion protemica que contema virus.

Se sometio cada disolucion obtenida de este modo a filtracion continua a traves de una membrana de eliminacion de virus de tamano de poro pequeno (Planova (marca registrada) 20N) que tema un area de membrana de 0,001 m2 a una presion de filtracion de 0,20 kgf/cm2 (1,96 x 10 kPa) hasta que la cantidad de la solucion filtrada alcanzo 50 l/m2. La presion de filtracion se midio utilizando un manometro colocado en el lado del recipiente de la solucion de

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alimentacion. Se midio la tasa de eliminacion de PPV (LRV) en el lote de 50 l/m2 mediante el procedimiento descrito anteriormente en (ii). Los resultados se muestran en la tabla 2.

Tal como se muestra en la tabla 2, se demostro que la tasa de eliminacion de virus era elevada, sin fuga de virus a los filtrados, dependiendo de la fuerza ionica salina, incluso en el caso de una presion de filtracion baja y un pH bajo de la solucion proteinica que contenia virus antes de la filtracion.

[Tabla 2]

pH Fuerza ionica salina (mM) LRV

Ejemplo experimental 17

4,0 0 >5,92

Ejemplo experimental 18

4,0 10 4,67

Ejemplo experimental 19

4,0 100 3,88

Ejemplo experimental 20

4,6 0 >5,17

Ejemplo experimental 21

4,6 100 4,74

Ejemplo experimental 22

5,0 0 >6,22

Ejemplo experimental 23

5,0 10 5,37

Ejemplo experimental 24

5,0 50 5,14

Ejemplo experimental 25

5,0 100 4,69

Ejemplo experimental 26

6,0 0 >6,00

Ejemplo experimental 27

6,0 100 5,17

Ejemplo experimental 28

7,0 0 >6,00

Ejemplo experimental 29

7,0 100 >5,34

Ejemplo experimental 30

8,0 0 >6,00

Ejemplo experimental 31

8,0 100 >5,50

Los resultados mostrados en la tabla 2 demostraron tambien que la filtracion de la solucion proteinica que contenia virus a traves de la membrana de eliminacion de virus de tamano de poro pequeno, a una presion de filtracion baja, mostro la correlacion entre el pH X y la fuerza ionica salina Y de la solucion en ausencia de fugas de virus. Las ecuaciones relacionales que se muestran a continuacion se dan para el pH X y la fuerza ionica salina Y de la solucion antes de la filtracion. La relacion entre X e Y mostrada en las ecuaciones 1 a 3 mostradas a continuacion se ilustra en la figura 1.

Los intervalos de X e Y que alcanzan un LRV de 4 o superior satisfacen la siguiente ecuacion 1 o 4 (basados en los resultados del ejemplo experimental 18 (pH: 4, fuerza ionica salina: 10 mM) y el ejemplo experimental 21 (pH: 4,6, fuerza ionica salina: 100 mM)):

0 < Y mM < 150 X - 590 (Ecuacion 1)

0 = 0 mM (Ecuacion 4)

Los intervalos de X e Y que alcanzan un LRV de 5 o superior satisfacen la siguiente ecuacion 2 o 4 (basados en los resultados del ejemplo experimental 24 (pH: 5, fuerza ionica salina: 50 mM) y el ejemplo experimental 27 (pH 6, fuerza ionica salina: 100 mM)):

0 < Y mM < 50 X - 200 (Ecuacion 2)

Y = 0 mM (Ecuacion 4)

En el caso de un LRV indicado por un valor mas la marca > (en la ecuacion para el calculo de LRV, Cf (= titulo de infectividad de la solucion filtrada a traves de la membrana de eliminacion de virus de tamano de poro pequeno) igual o inferior al limite de deteccion), los intervalos de X e Y satisfacen la siguiente ecuacion 3 o 4 (basada en los resultados del ejemplo experimental 22 (pH: 5, fuerza ionica salina: 0 mM) y el ejemplo experimental 29 (pH: 7, fuerza ionica salina: 100 mM)):

Y mM < 50 X - 250 (Ecuacion 3)

Y = 0 mM (Ecuacion 4)

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En general, la tasa de eliminacion de virus mediante una membrana de filtracion de virus de tamano de poro pequeno, rara vez es susceptible al tipo de proteinas antes de la filtracion. De este modo, se penso que se obtendrian resultados similares incluso en el caso de utilizar soluciones proteinicas distintas a las soluciones de anticuerpos policlonales. Ademas, se creyo que produciria resultados similares una presion de filtracion de, aproximadamente, 19,6 kPa, (0,20 kgf/cm2), por ejemplo, de 29,5 kPa, (0,30 kgf/cm2) o menos, mas especificamente de 9,8 kPa a 29,5 kPa (0,10 kgf/cirr a 0,30 kgf/cm2), mas especificamente de 14,7 kPa a 24,5 kPa (0,15 kgf/cm2 a 0,25 kgf/cm2).

(Ejemplo 3: Filtracion a traves de una membrana de eliminacion de virus de tamano de poro pequeno que comprende la etapa de lavado posterior)

Se preparo cada solucion proteinica (solucion de anticuerpos policlonales), que tenia una combinacion de pH y fuerza ionica salina indicada en cualquiera de los ejemplos experimentales 32 a 34 en la tabla 3, mediante el procedimiento descrito anteriormente en (i). A continuacion, se anadio parvovirus porcino (PPV) a una concentracion del 0,5% en volumen a cada solucion, y la mezcla se agito bien para obtener una solucion proteinica que contenia virus.

Cada solucion obtenida de este modo se sometio a filtracion en linea a traves de una membrana de eliminacion de virus de tamano de poro pequeno (Planova (marca registrada) 20N) que tenia un area de membrana de 0,001 m2 a una presion de filtracion de 0,80 kgf/cm2 (7,8 x 10 kPa) hasta que la cantidad de la solucion filtrada alcanzo 100 l/m2 (el filtrado resultante se denomina fraccion de filtracion de virus). La presion de filtracion se midio utilizando un manometro colocado en el lado del recipiente de la solucion de alimentacion.

Despues de alcanzar la cantidad predeterminada de la solucion filtrada, se cerro la linea de salida del recipiente de la solucion de alimentacion. A continuacion, se alivio la presion sobre el lado de la solucion de alimentacion (externo), en primer lugar, a 0,0 kPa. Posteriormente, se abrio la linea de salida en el lado primario (lado de la solucion de alimentacion a traves de la membrana) de la membrana de filtracion, de manera que la presion interna de la membrana de filtracion se alivio tambien a 0,0 kPa. A continuacion, la membrana de filtracion se dejo durante 3 horas.

A continuacion, se preparo cada solucion de lavado (con bajo nivel virico) con cualquiera de los valores de pH y fuerzas ionicas salinas de los ejemplos experimentales 32 a 34, mostrados en la tabla 3, de la misma manera que el procedimiento de (i), excepto por que no se utilizaron los anticuerpos policlonales. El recipiente de la solucion de alimentacion se cambio a uno que contenia la solucion de lavado y se aplico presion hasta 7,8 x 10 kPa (0,80 kgf/cm2) con la linea de salida del recipiente de la solucion de alimentacion cerrada. A continuacion, se abrio la linea de salida del recipiente de la solucion de alimentacion, de manera que se filtraron 5 l/m2 de la solucion de lavado a una presion de 0,80 kgf/cm2 (7,8 x 10 kPa) a traves de la membrana de eliminacion de virus de tamano de poro pequeno dejada de este modo (el filtrado resultante se denomina fraccion de lavado posterior).

El LRV de la fraccion de filtracion de virus se calculo mediante el procedimiento descrito anteriormente en (ii). Los resultados se muestran en la tabla 3. Ademas, se calculo el LRV' solo de la fraccion de lavado posterior segun la siguiente ecuacion 7:

LRV' = log10 (C0/Cw) (Ecuacion 7)

en la que C0 representa la concentracion virica de la solucion proteinica que contiene virus antes de la filtracion, y Cw representa la concentracion virica del filtrado de la solucion de lavado despues de filtrar solamente la solucion de lavado. Los resultados se muestran en la tabla 3.

En el ejemplo experimental 34, la fraccion de lavado posterior tenia un LRV' bajo, aunque la fraccion de filtracion de virus tenia un LRV elevado. Este resultado demostro que los virus se fugaron a la fraccion de lavado posterior obtenida por la etapa de filtracion a una presion de filtracion baja (presion de filtracion: 0,0 kPa). Por el contrario, en los ejemplos experimentales 32 y 33, incluso la etapa que comprendia esta filtracion a una presion de filtracion baja produjo una tasa elevada de eliminacion de virus.

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[Tabla 3]

pH Fuerza ionica salina (mM) LRV de la fraccion de filtracion de virus LRV' de la fraccion de lavado posterior

Ejemplo experimental 32

4/0 0 >5,69 >5,65

Ejemplo experimental 33

7,0 100 >5,83 >5,83

Ejemplo experimental 34

4,0 100 >6,17 3,33

(Ejemplo 4: Filtracion a traves de una membrana de eliminacion de virus de tamano de poro pequeno que incluye etapa de parada e inicio)

Se preparo cada solucion proteinica (solucion de anticuerpos policlonales) con cualquiera de los valores de pH y fuerzas ionicas salinas de los ejemplos experimentales 35 a 37, mostrados en la tabla 3, mediante el procedimiento descrito anteriormente en (i). A continuacion, se anadio parvovirus porcino (PPV) a una concentracion del 0,5% en volumen a cada solucion, y la mezcla se agito bien para obtener una solucion proteinica que contenia virus.

Cada disolucion obtenida de este modo se sometio a filtracion en linea a traves de una membrana de eliminacion de virus de tamano de poro pequeno (Planova (marca registrada) 20N) que tenia un area de membrana de 0,001 m2 a una presion de 0,80 kgf/cm2 (7,8 x 10 kPa) hasta que la cantidad de la solucion filtrada alcanzo 100 l/m2 (se denomina al filtrado resultante fraccion de filtracion de virus). La presion de filtracion se midio utilizando un manometro colocado en el lado del recipiente de la solucion de alimentacion.

Despues de alcanzar la cantidad predeterminada de la solucion filtrada, se cerro la linea de salida del recipiente de la solucion de alimentacion. A continuacion, se alivio en primer lugar la presion sobre el lado de la solucion de alimentacion (externa) a 0,0 kPa. Posteriormente, se abrio la linea de salida en el lado primario (lado de la solucion de alimentacion a traves de la membrana) de la membrana de filtracion, de manera que se alivio tambien la presion interna de la membrana de filtracion a 0,0 kPa. A continuacion, la membrana de filtracion se dejo durante 3 horas.

A continuacion, se aplico presion el recipiente de la solucion de alimentacion a 7,8 x 10 kPa (0,80 kgf/cm2) con la linea de salida del recipiente de la solucion de alimentacion cerrada. A continuacion, se abrio la linea de salida del recipiente de la solucion de alimentacion, de manera que se filtraron de nuevo 10 l/m2 de la solucion proteinica que contenia virus a una presion de 0,80 kgf/cm2 (7,8 x 10 kPa) a traves de la membrana de eliminacion de virus de tamano de poro pequeno dejada de este modo (se denomino al filtrado resultante fraccion de parada e inicio).

Se calcularon el LRV de la fraccion de filtracion de virus y el LRV de la fraccion de parada e inicio mediante el procedimiento descrito anteriormente en (ii). Los resultados se muestran en la tabla 4. En el ejemplo experimental 37, la fraccion de parada e inicio tenia un LRV bajo, aunque la fraccion de filtracion de virus tenia un LRV elevado. Este resultado demostro que los virus se fugaron a la fraccion de parada e inicio obtenida mediante la etapa que comprendia la filtracion a presion de filtracion baja (presion de filtracion: 0,0 kPa). Por el contrario, en los ejemplos experimentales 35 y 36, incluso la etapa que comprendia esta filtracion a una presion de filtracion baja produjo una tasa elevada de eliminacion de virus.

[Tabla 4]

pH Fuerza ionica salina (mM) LRV de la fraccion de filtracion de virus LRV de la fraccion de parada e inicio

Ejemplo experimental 35

4,0 0 >5,12 >5,12

Ejemplo experimental 36

7,0 100 >5,74 >5,74

Ejemplo experimental 37

4,0 100 6,42 3,59

Como resultado de estos ejemplos 1 a 4, se encontraron los intervalos de pH y fuerza ionica salina de la solucion antes de la filtracion que pueden satisfacer una tasa elevada de eliminacion de virus (LRV de PPV: 4 o mas) incluso si la filtracion de la solucion proteinica que contiene virus a traves de la membrana de eliminacion de virus de tamano de poro pequeno comprende la filtracion a presion de filtracion baja.

Aplicabilidad Industrial

La presente invencion puede proporcionar un farmaco proteinico que tiene una tasa elevada de eliminacion de virus, mediante la produccion de un farmaco proteinico con bajo nivel virico utilizando una membrana de eliminacion de 5 virus de tamano de poro pequeno, que comprende una etapa de filtracion a presion de filtracion baja. De este modo, la presente invencion puede proporcionar un farmaco proteinico que tiene una tasa elevada de eliminacion de virus, por ejemplo, incluso mediante la filtracion de una solucion proteinica a una presion de filtracion fijada a una presion baja, una filtracion que comprende una etapa de lavado posterior o una filtracion que comprende una etapa de parada e inicio. De este modo, la presente invencion tiene aplicabilidad industrial.

10

Claims (26)

1. 5

   10

   15

   20

   25

   30

   35

   40

   45

   50

   55

   60

   65

   REIVINDICACIONES

   1. Procedimiento para fabricar un farmaco proteinico con bajo nivel virico, que comprende la siguiente etapa (a):

   (a) una etapa de filtracion para filtrar una solucion proteinica que contiene virus a traves de una membrana de eliminacion de virus de tamano de poro pequeno, en la que la membrana de eliminacion de virus de tamano de poro pequeno tiene un tamano de poro que no permite la permeacion de virus, pero permite la permeacion de moleculas de proteina,

   - comprendiendo la etapa de filtracion (a) la siguiente etapa (p) realizada antes de la etapa de filtracion a presion baja (q):

   (p) una etapa de filtracion a presion elevada para filtrar la solucion proteinica que contiene virus a traves de la membrana de eliminacion de virus de tamano de poro pequeno a una presion superior a 29,54 kPa (0,30 kgf/cm2), y

   - comprendiendo la etapa de filtracion (a) la siguiente etapa (q):

   (q) aliviar la presion de filtracion despues de la etapa (p), y una etapa de filtracion a presion baja para filtrar una solucion de lavado o la solucion proteinica que contiene virus a traves de una membrana de eliminacion de virus de tamano de poro pequeno a una presion de filtracion de 29,4 kPa (0,30 kgf/cm2) o inferior,

   en la que la solucion de lavado o la solucion proteinica que contiene virus antes de la filtracion en la etapa de filtracion a presion baja (q) tiene un pH X y una fuerza ionica salina Y que satisfacen las siguientes ecuaciones 1 y 5:

   0 < Y mM < 150X - 590 (Ecuacion 1)
2. 3.5 < X < 8,0 (Ecuacion 5)

   o las siguientes ecuaciones 4 y 5:

   Y = 0 mM (Ecuacion 4)
3. 3.5 < X < 8,0 (Ecuacion 5).
4. 2. Procedimiento, segun la reivindicacion 1, en el que la solucion proteinica que contiene virus se filtra en la etapa

   (q), y

   en la que el 50% o mas de la solucion proteinica completa que contiene virus a filtrar en la etapa de filtracion (a) se filtra en la etapa de filtracion a presion baja (q).
5. 3. Procedimiento, segun la reivindicacion 1, en el que la etapa de filtracion (a) es una etapa para filtrar la solucion proteinica que contiene virus a traves de la membrana de eliminacion de virus de tamano de poro pequeno a una presion de filtracion de 29,4 KPa (0,30 kgf/cm2) o inferior, en la que la solucion proteinica que contiene virus antes de la filtracion en la etapa de filtracion (a) tiene un pH X y una fuerza ionica salina Y que satisfacen las siguientes ecuaciones 1 y 5:

   0 < Y mM < 150X - 590 (Ecuacion 1)
6. 3.5 < X < 8,0 (Ecuacion 5)

   o las siguientes ecuaciones 4 y 5:

   Y = 0 mM (Ecuacion 4)
7. 3.5 < X < 8,0 (Ecuacion 5).
8. 4. Procedimiento, segun la reivindicacion 1, en el que la solucion de lavado en la etapa (q) de filtracion a presion baja es una solucion tampon para lavado.
9. 5. Procedimiento, segun las reivindicaciones 1 o 4, en el que la etapa (q) de filtracion a presion baja es una etapa de lavado posterior o una etapa de parada e inicio.
10. 6. Procedimiento, segun cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en el que la solucion de filtracion en la etapa (q) de filtracion a presion baja tiene un pH X y una fuerza ionica salina Y que satisfacen las siguientes ecuaciones 2 y 5:

    0 < Y mM < 50X - 200 (Ecuacion 2)
11. 3.5 < X < 8,0 (Ecuacion 5)

    o las siguientes ecuaciones 4 y 5:

    5

    10

    15

    20

    25

    30

    35

    40

    45

    50

    55

    60

    65

    Y = 0 mM (Ecuacion 4)
12. 3.5 < X < 8,0 (Ecuacion 5).
13. 7. Procedimiento, segun cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en el que la solucion de lavado o la solucion proteinica que contiene virus antes de la filtracion en la etapa (q) de filtracion a presion baja tiene un pH X y una fuerza ionica salina Y que satisfacen las siguientes ecuaciones 3 y 5:

    0 < Y mM < 50X - 250 (Ecuacion 3)
14. 3.5 < X < 8,0 (Ecuacion 5)

    o las siguientes ecuaciones 4 y 5:

    Y = 0 mM (Ecuacion 4)
15. 3.5 < X < 8,0 (Ecuacion 5).
16. 8. Procedimiento, segun cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, en el que la etapa (q) de filtracion a presion baja es una etapa para filtrar la solucion de lavado o la solucion proteinica que contiene virus a traves de la membrana de eliminacion de virus de tamano de poro pequeno a una presion de filtracion de 19,6 kPa (0,20 kgf/cm2) o inferior.
17. 9. Procedimiento, segun cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en el que un valor de reduccion logaritmica (LRV), calculado segun la siguiente ecuacion 6, es 4 o superior:

    LRV = log10 (Cq/Cf) (Ecuacion 6)

    en la que Cq representa la concentracion virica de la solucion proteinica que contiene virus antes de la etapa de filtracion (a), y Cf representa la concentracion virica de la solucion proteinica con bajo nivel virico despues de la filtracion.
18. 10. Procedimiento, segun la reivindicacion 4 o 5, en el que un valor de reduccion logaritmica (LRV), calculado segun la siguiente ecuacion 6, es 4 o superior:

    LRV = log10 (Cq/Cf) (Ecuacion 6)

    en la que Cq representa la concentracion virica de la solucion proteinica que contiene virus antes de la etapa de filtracion (a) y Cf representa la concentracion virica de la solucion proteinica con bajo nivel virico despues de la filtracion y

    el LRV’ calculado segun la siguiente ecuacion 7 es 4 o superior:

    LRV = log10 (Cq/Cw) (Ecuacion 7)

    en la que Cq representa la concentracion virica de la solucion proteinica que contiene virus antes de la etapa de filtracion (a), y Cw representa la concentracion virica del filtrado de la solucion tampon para el lavado despues de la etapa de filtracion (a).
19. 11. Procedimiento, segun cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10, en el que el material de la membrana de eliminacion de virus de tamano de poro pequeno es celulosa o un polimero sintetico hidrofilizado.
20. 12. Procedimiento, segun cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11, en el que el material de la membrana de eliminacion de virus de tamano de poro pequeno es un polimero sintetico hidrofilizado, y en el que el polimero sintetico se selecciona entre el grupo que comprende fluoruro de polivinilideno, polieter sulfona, polisulfona y polietileno.
21. 13. Procedimiento, segun cualquiera de las reivindicaciones 1 a 12, en el que la forma de la membrana de eliminacion de virus de tamano de poro pequeno es una membrana plana o una membrana de fibras huecas.
22. 14. Procedimiento, segun cualquiera de las reivindicaciones 1 a 13, en el que la solucion proteinica que contiene virus tiene una concentracion proteinica de 1 mg/ml a 100 mg/ml.
23. 15. Procedimiento, segun cualquiera de las reivindicaciones 1 a 14, en el que la solucion proteinica que contiene virus comprende una o mas proteinas seleccionadas entre el grupo que comprende anticuerpos monoclonales, factor de coagulacion sanguinea recombinante, interferon, hormonas, enzimas, inmunoglobulina, albumina, factor VIII de coagulacion sanguinea, factor IX de coagulacion sanguinea, fibrinogeno y antitrombina III.
24. 16. Procedimiento, segun cualquiera de las reivindicaciones 1 a 14, en el que la solucion proteinica que contiene virus comprende un anticuerpo como proteina.
25. 17. Procedimiento, segun cualquiera de las reivindicaciones 1 a 14, en el que la solucion proteinica que contiene virus comprende factor VIII de coagulacion sanguinea o fibrinogeno como proteina.

    5 18. Procedimiento, segun cualquiera de las reivindicaciones 1 a 17, en el que la solucion proteinica que contiene

    virus comprende uno o mas virus seleccionados entre el grupo que comprende parvovirus humano B19 (B19), virus diminuto del raton (MVM), parvovirus porcino (PPV), parvovirus bovino (BPV), parvovirus canino (CPV), poliovirus (Polio), circovirus, virus de la hepatitis A (HAV) y virus de la hepatitis E (HEV).

    10 19. Procedimiento, segun cualquiera de las reivindicaciones 1 a 18, en el que la solucion proteinica que contiene

    virus comprende un virus de 32 nm o menor en diametro que no tiene envoltura.
26. 20. Procedimiento, segun cualquiera de las reivindicaciones 1 a 19, en el que la solucion proteinica que contiene virus comprende uno o mas componentes seleccionados entre el grupo que comprende una sal inorganica, un 15 componente de solucion tampon, un surfactante y un sacarido.