ES2331970T3 - Procedimiento para determinar el efecto antiinflamatorio de un peptido. - Google Patents

Abstract

Procedimiento para determinar los efectos antiinflamatorios de un péptido mediante la medición de la inhibición de la liberación de interleucina-6 (IL-6) a partir de células endoteliales tras una exposición al fragmento E de la fibrina.

Description

Procedimiento para determinar el efecto antiinflamatorio de un péptido.

Antecedentes de la invención

La presente divulgación se refiere a una composición farmacéutica para el tratamiento del choque hemorrágico y sus fenómenos secundarios.

Un choque es una complicación aguda de muchos estados patológicos distintos que se caracteriza por la incapacidad del sistema cardiovascular de mantener una presión sanguínea suficiente. Mejor dicho, en el choque hemorrágico, la pérdida de sangre supera la capacidad del organismo para compensar y proporcionar una saturación de oxígeno y un riego sanguíneo de los tejidos suficientes. Esto se debe con frecuencia a un traumatismo, sin embargo puede provocarse también por una hemorragia espontánea (por ejemplo, hemorragia gastrointestinal, parto), una intervención quirúrgica y otros motivos.

Con la mayor frecuencia, un choque hemorrágico clínico se provoca por un acontecimiento hemorrágico agudo con un proceso desencadenante separado. Con menor frecuencia, se observa un choque hemorrágico en el caso de estados crónicos con pérdida de sangre subaguda. Este estado es la causa de muerte principal en el grupo de edades de 1-44.

Los mecanismos de compensación fisiológicos en el caso de una hemorragia comprenden una vasoconstricción mesentérica y periférica inicial, para desviar sangre hacia la circulación central. Esto se refuerza entonces mediante una taquicardia progresiva. Una monitorización invasiva puede revelar un índice cardiaco elevado, un aporte de oxígeno aumentado (es decir, DO_{2}) y un consumo de oxígeno elevado (es decir VO_{2}) por los tejidos. El nivel de lactato, el estado ácido-base y otras características pueden ser asimismo indicadores útiles para un estado fisiológico. La edad, los tratamientos medicamentosos así como los factores comórbidos pueden influir en la reacción de un paciente a un choque hemorrágico.

Un fallo de los mecanismos de compensación puede conducir a la muerte en el caso de un choque hemorrágico. Sin intervención, en el caso de un choque hemorrágico grave ha de considerarse una distribución trimodal clásica de las muertes. En el plazo de minutos tras una hemorragia aparece un pico de mortalidad inicial debido a un desangrado inmediato. Aparece otro pico debido a la descompensación progresiva después de de 1 a varias horas. Aparece un tercer pico después de días o semanas debido a una septicemia y a un fallo orgánico, que son un fenómeno secundario frecuente de un daño por reperfusión en los órganos.

El tratamiento de un choque provocado por una gran pérdida de sangre es un gran reto, dado que efectos secundarios, que van acompañados de una reacción inflamatoria y alteraciones del sistema de coagulación, posiblemente se volvían independientes y conducen a la muerte del paciente, sin tener en cuenta la cuestión de si era posible una sustitución suficiente de fluido y sangre. Un tratamiento específico de una gran pérdida de sangre como consecuencia de accidentes u otras heridas y de un choque hemorrágico consiste en reanimación de fluidos con cristaloides o coloides para el restablecimiento del riego sanguíneo de los órganos. Además, los procedimientos actuales tienen como meta aliviar los síntomas, lo que incluye una ventilación mecánica, la sustitución de fluido, la aplicación de medicamentos eficaces para el corazón, el control riguroso de la saturación de oxígeno, de la hemoglobina, de la glucosa y de la función renal. El solo control de la reacción inflamatoria, por ejemplo por medio de una administración elevada de esteroides, o la inhibición de la coagulación con antitrombina, no proporciona ninguna mejora de la tasa de supervivencia.

Un choque como consecuencia de una pérdida de sangre y un choque hemorrágico están relacionados con alteraciones evidentes o no evidentes del fibrinógeno en plasma, acompañadas de una formación de fibrina y un aumento de los fragmentos de fibrina. Esta activación de la coagulación y las rutas fibrinolíticas puede conducir a una coagulación intravascular diseminada (DIC) evidente o no evidente, que tiene como consecuencia una obliteración vascular y daños orgánicos finales, y a un consumo de los factores de coagulación, que tiene como consecuencia hemorragias. Es importante que el fibrinógeno, la fibrina y los fragmentos de fibrina no desempeñan un papel sólo en la coagulación sanguínea, sino que presentan varios sitios de unión para proteínas celulares y de la matriz, que les permiten interaccionar con glóbulos blancos, plaquetas, células endoteliales y estructuras de la matriz. Esto conduce a la activación celular, la migración celular, a una liberación de citocinas y finalmente a una reacción inflamatoria. El papel que desempeña el fibrinógeno o la fibrina en la inflamación está documentado por completo (comentado por Altieri Thromb Haemost 82:781-786; Herrick et al. Int J Biochem Cell Biol 31:741-46). La región D de la molécula contiene numerosos sitios de unión para moléculas de la matriz, células endoteliales, plaquetas y células inflamatorias. La región E de la fibrina se une a CD11c (Loike et al. Proc Natl Acad Sci USA 88:1044-48).

Hace poco se describió un nuevo papel para la secuencia Bbeta_{15-42} de la fibrina en la inflamación (documento WO 02/48180). Esta secuencia está localizada asimismo en la región E de la fibrina y sólo es activa cuando se escinde el fibrinopéptido. Los fragmentos de fibrina que contienen esta secuencia en su extremo N-terminal libre de la cadena beta, se unen al endotelio y provocan una inflamación, y un péptido, que coincide con los aminoácidos 15-42 de la cadena Bbeta de la fibrina, bloquea la unión de fragmentos de fibrina a las superficies endoteliales y bloquea in vitro la inflamación (documento WO 02/48180). In vivo, este péptido evita una inflamación miocárdica y reduce la magnitud de un infarto de miocardio en situaciones de isquemia/reperfusión (documento WO 02/48180).

En el documento WO2005/086578 se describe un procedimiento de medición para la determinación del efecto antiinflamatorio de péptidos, en el que se mide una inhibición de la función de las células T.

Los fragmentos de fibrina aparecen en cualquier situación con formación de fibrina afectada y fibrinolisis afectada. Especialmente, en situaciones de choque, esta formación de fibrina alterada y esta fibrinolisis alterada representan un gran problema. En el caso de numerosas enfermedades se documentó una correlación directa entre el resultado y la afectación de la formación de fibrina/fibrinolisis. Por ejemplo, Dengue (van Gorp et al. J Med Virol 2002, 67: 549-54, Mairuhu et al. Lancet Inf Dis 2003; 3:33-41). El síndrome de dificultad respiratoria del adulto (ARDS) es una forma de una afección pulmonar aguda, que se caracteriza por una deposición de fibrina completamente marcada extravascular (Idell Am J Respir Med. 2002; 1:383-91). Asimismo se observaron una trombosis en los vasos pulmonares y una coagulación intravascular diseminada en relación con el ARDS.

Sumario de la invención

La divulgación se refiere al uso de un péptido que comprende la secuencia N-terminal

Gly-His-Arg-Pro-Leu-Asp-Lys-Lys-Arg-Glu-Glu-Ala-Pro-Ser-Leu-Arg-Pro-Ala-Pro-Pro-Pro-Ile-Ser-Gly-Gly-Gly-Tyr-Arg

o cualquier variante alélica o derivado de este péptido, que presenta la propiedad biológica de coincidir con el motivo de unión a cadherina VE inducible en la cadena B\beta (es decir, B\beta_{15-42}) de la fibrina humana, para la preparación de una composición farmacéutica para el tratamiento del choque.

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En una forma de realización preferida este péptido es

Gly-His-Arg-Pro-Leu-Asp-Lys-Lys-Arg-Glu-Glu-Ala-Pro-Ser-Leu-Arg-Pro-Ala-Pro-Pro-Pro-Ile-Ser-Gly-Gly-Gly-Tyr-Arg.

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Sorprendentemente se comprobó que estos péptidos, en el caso de la protección de animales de sangre caliente frente a las consecuencias y complicaciones de una reperfusión tras mayores acontecimientos de hemorragia y de un choque hemorrágico, presentan un efecto excepcionalmente favorable. Pudo mostrarse que pueden evitar los daños orgánicos y el fallo orgánico que se deben a reacciones inflamatorias agudas provocadas por choque hemorrágico y reperfusión. Los péptidos pueden evitar enfermedades tales como el síndrome de respuesta inflamatoria sistémica (SIRS), el síndrome de dificultad respiratoria aguda (ARDS), insuficiencia renal, insuficiencia hepática y fallo multiorgánico.

Descripción detallada de la invención Péptidos y proteínas

Se prepararon péptidos mediante una síntesis de péptidos en fase sólida y se purificaron por medio de una HPLC en fase inversa, usándose columnas Nucleosil 100-10 C18 (PiChem, Graz, Austria). Debería observarse que la región beta 15-42 es similar al 100% entre especies, cuando se permiten sustituciones de aminoácidos conservativas. El nudo de disulfuro N-terminal compuesto por los aminoácidos A\alpha1-51, B\beta1-118 y \gamma1-78 del fibrinógeno (NDSK) se preparó tal como se describió anteriormente (documento WO 02/48180). El nudo de disulfuro N-terminal compuesto por los aminoácidos A\alpha17-51, B\beta15-118 y \gamma1-78 de la fibrina (NDSK-II, al que le faltan los fibrinopéptidos A y B) se preparó tratando NDSK a 37ºC durante 3 horas con trombina (20 U / 1 mg de NDSK). La trombina restante se neutralizó a 37ºC durante 2 horas con fluorofosfato de diisopropilo 10 mM (Fluka, Milwaukee, WI). Todos los productos se dializaron a continuación en una solución salina tamponada con fosfato (PBS).

ELISA El péptido B\beta_{15-42} se une a cadherina VE

La interacción de la cadena Bbeta (Bbeta_{15-42}) de la fibrina con células endoteliales provoca alteraciones morfológicas (Bunce et al. J Clin Invest 89:842-50; Bach et al. Exp Cell Res 238:324-34; Chalupowicz et al. J Cell Biol 130:207-15; Hamaguchi et al. Blood 81:2348-56; Francis et al. Blood cells 19:291-306), una proliferación (Sporn et al. Blood 86:1802-10), la liberación del factor de von Willebrand (Ribes et al. J Clin Invest 79:117-23, Ribes et al. J Clin Invest 84: 435-42; Erban y Wagner, J Biol Chem 267, 2451-58) y posiblemente IL-8 (Qi et al. Blood 90: 3593-3602) y una expresión en la membrana de CD54 (Harley et al. Art Thromb Vasc Biol 20:652-658). Se identificó la cadherina VE como ligando de unión de la secuencia Bbeta_{15-42} y se desarrollaron ensayos ELISA para determinar esta interacción de las células endoteliales y/o la cadherina VE con la fibrina o los fragmentos de fibrina. Martinez et al. usaron anticuerpos anti-pan-cadherina para atrapar cadherinas de células endoteliales, seguido de una incubación con fibrina (Martinez et al. Ann NY Acad Sci 936:386-405), se recubrieron monocapas de HUVEC (que expresan cadherina VE) con fragmentos de fibrina radiomarcados o péptido Bbeta_{15-42} (Bach et al. J Biol Chem 273:30719-28; Harley et al. Art Thromb Vasc Biol 20:652-658), y se usó cadherina VE recombinante de Gorlatov y Medved (Biochemistry 41:4107-16). Otros utilizaron un ELISA para la detección de fragmentos de fibrina en la sangre, usando principalmente anticuerpos frente a distintas secuencias dentro de la molécula de fibrinógeno, incluidos anticuerpos frente al motivo Bbeta_{15-42} (comentado en Fareed et al. Clin Chem 8:1845-53).

Se desarrolló un ELISA modificado, que trabajaba con los mismos principios descritos por otros, sin embargo, el objetivo del ELISA descrito en este caso no consiste en determinar cuantitativamente los productos de la degradación de la fibrina, sino buscar proteínas, péptidos o compuestos que alteren la unión de la secuencia Bbeta_{15-42} y de la cadherina VE. El principio consiste en que la cadherina VE puede interaccionar o bien como proteína acortada, o bien como proteína completa o bien acoplada con otras proteínas, que no alteran el sitio de unión de Bbeta_{15-42}, con la secuencia Bbeta_{15-42} de la fibrina. Puede agregarse cualquier otra sustancia adicional a este sistema y medirse si la sustancia inhibe la unión de cadherina VE/Bbeta_{15-42}.

En detalle, se recubrieron placas de inmovilización de proteínas de 96 pocillos (Exiqon, Vedbaek, DK) con proteína de fusión cadherina VE-FC humana recombinante (8 nM/ml; R&D Systems, Minneapolis) en PBS y se dejó reposar durante la noche a 4ºC. Después se lavaron las placas y se incubaron con péptido B\beta_{15-42} (GHRPLDKK
REEAPSLRPAPPPISGGGYR), que estaba marcado en el extremo C-terminal del péptido con una secuencia FLAG (DYKDDDDK), o con un péptido al azar marcado con FLAG (DRGAPAHRPPRGPISGRSTPEKEKLLPG) y, concretamente, en una concentración de 0-80 \mumoles/ml. Tras el lavado se detectó mediante incubación con un anticuerpo anti-FLAG marcado con peroxidasa (Sigma, St. Louis, EE.UU.) y un sustrato cromógeno el péptido marcado con FLAG unido. La densidad óptica se determinó mediante un lector de placas para ELISA ajustado a una longitud de onda de 450 nm. Los datos representan el valor medio de tres ensayos independientes, realizándose cada uno por triplicado. La tabla a continuación muestra que el péptido B\beta_{15-42} se unía a la cadherina VE de manera dependiente de la concentración. En contraposición con esto, el péptido al azar mostró sólo una unión insig
nificante.

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Unión dependiente de la dosis del péptido Bbeta_{15-42} a cadherina VE

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El péptido B\beta_{15-42} y los fragmentos de fibrina compiten con respecto a la unión a cadherina VE.

En una etapa siguiente se analiza si este ELISA puede usarse para examinar otros péptidos/compuestos, que compiten por la unión de la secuencia B\beta_{15-42} a cadherina VE. Según lo esperado, el péptido B\beta_{15-42} inhibía completamente la unión del péptido B\beta_{15-42} marcado con flag y se usó como control positivo, y el péptido al azar o el disolvente no tenían ningún efecto y se usaron como controles negativos. Péptidos más cortos inhibían parcialmente la unión de B\beta_{15-42} a cadherina VE. NDSK-II inhibía la unión de B\beta_{15-42} de manera dependiente de la concentración. Se consiguió un equilibrio entre B\beta_{15-42} y NDSK-II (inhibición del 50%) en el caso de una razón en moles de 24:1. NDSK tenía poco o nada de efecto.

Se recubrió la superficie de plástico con cadherina VE en una concentración de 8 nM/ml. Después se añadieron los péptidos indicados en concentraciones de 200 \muM/ml, se añadió NDSK o NDSK-II en las concentraciones indicadas. La detección de la unión de Bbeta_{15-42} marcado con FLAG (12 \muM/ml) se realizó tal como se describió anteriormente.

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Además se identificó un análisis específico para determinar la actividad afirmada de los péptidos, que consiste en una medición de la inhibición de la liberación de interleucina-6 a partir de células endoteliales. La interleucina-6 resultó ser un fuerte agente para la predicción del desenlace y de la mortalidad en la situación de un choque y por tanto es un parámetro valioso para la determinación de los efectos favorables de los péptidos.

Por tanto, la invención se refiere a un procedimiento para determinar el efecto antiinflamatorio de un péptido mediante la medición de la inhibición de la liberación de interleucina-6 (IL-6) a partir de células endoteliales tras una exposición al fragmento E de la fibrina.

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Inhibición de la liberación de interleucina-6 a partir de células endoteliales

Se recubrieron placas de cultivo celular de 96 pocillos con gelatina al 1%. En cada pocillo se pipetearon aproximadamente 23.000 células endoteliales de cordón umbilical humanas (HUVEC) en 200 \mul de medio. Las HUVEC se tomaron del pase 4 de un conjunto de cuatro donadores distintos. El medio usado para la dilución fue un medio convencional con FCS al 10%, ECGS en medio Dulbecco modificado por Iscove (Iscove's modified Dulbecco medium) (Petzelbauer et al., J Immunol. 151: 5062-5072, 1993). En el plazo de aproximadamente 18 horas se formó a 37ºC en una incubadora una monocapa de células confluente. Se eliminó el sobrenadante y se sustituyó por un medio que contenía o bien NDSK-II solo o bien NDSK-II más péptido B\beta_{15-42} (GHRPLDKKREEAPSLRPAPPPISGGGYR).

El volumen total definitivo ascendió a 200 \mul. Tras una incubación de 4 horas a 37ºC bajo CO_{2} al 5% se eliminó de nuevo el sobrenadante del cultivo celular y se centrifugó durante 10 minutos a 4ºC con 3000 U/min. La concentración de interleucina-6 (IL-6) se midió con la aplicación de un análisis habitual en el comercio (IL-6 Quantikine Immunoassay (R&D Sytems; n.º de catálogo: D6050; lote: 231361). La calibración se realizó según el protocolo convencional proporcionado por el fabricante del análisis con diferentes diluciones de IL-6 recombinante y medio. Las lecturas de la densidad óptica tuvieron lugar a una longitud de onda de 450 nm con una longitud de onda de referencia
de 550 nm.

Resultados

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Choque hemorrágico en cerdos domésticos

Se alimentaron cerdos domésticos Landrace macho con un peso de 20-35 kg con alimento convencional y recibieron agua a voluntad. Todos los procesos se realizaron de acuerdo con las directrices de la AAALAC y según el Handbuch für die Pflege von Labortieren (Manual para el mantenimiento de animales de laboratorio) (Departamento de salud y asuntos sociales, Instituto nacional de la salud, publicación n.º 86-23). Se trataron previamente de manera medicamentosa los cerdos con azaperona (4 mg/kg). Se introdujo una cánula en la vena de la oreja, y se administró el anestésico propofol. Se instrumentaron completamente los animales durante 1 hora y se equilibraron para obtener una línea de base estable. A continuación se extrajo sangre de los animales (n=16), hasta que se consiguió una tensión arterial media de 40 mm Hg. Se mantuvieron durante 1 hora a ese nivel, que representaba un choque hemorrágico. Tras este periodo de tiempo se sustituyó el volumen de la sangre perdida por la sangre derramada y soluciones salinas (cristaloides). Además, los animales recibieron una dosificación en bolo del péptido B\beta15-42 (n=8) o un péptido con secuencia al azar (n=8) en una dosificación de 2,4 mg/kg, y, concretamente, en cada caso como inyección en bolo intravenosa individual. Durante el periodo de reperfusión posterior de 5 horas de duración se determinaron el índice de Horrowitz (medición de la saturación de oxígeno de la sangre), la PEEP (presión espiratoria final positiva en mm Hg) y el volumen de gasto cardiaco en distintos tiempos. En las tablas siguientes se usaron los
siguientes tiempos:

Tiempo 1:

1 hora antes del choque hemorrágico

Tiempo 2:

durante el choque hemorrágico

Tiempo 3:

1 hora tras el inicio de la reperfusión

Tiempo 4:

3 horas tras el inicio de la reperfusión

Tiempo 5:

5 horas tras el inicio de la reperfusión.

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Índice de Horrowitz

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Claims (1)

1. Procedimiento para determinar los efectos antiinflamatorios de un péptido mediante la medición de la inhibición de la liberación de interleucina-6 (IL-6) a partir de células endoteliales tras una exposición al fragmento E de la fibrina.