JPS62259598A - 線維芽細胞発育因子きつ抗物質 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は線維芽細胞発育因子（ＦＧＦ）に関し、より詳
細には、ある種の場合において哺乳動物ＦＧＦの効果を
減少させるために使用できる、合成法によって製造され
たＦＧＦ拮抗物質に関するものである。

従来の技術 脳および下垂体は共に培養細胞に対する細胞分裂促進因
子を含有することが知られているが、１９７４年捷では
これらと古典的な下垂体ホルモン、たとえばＴＳＨ，Ｌ
Ｈ，ＦＳＨ，ＧＨおよびＡＣＴＩＩ　との関係は不明で
あった。１９７４年に塩基性線維芽細胞発育因子（ＦＧ
Ｆ）とよばれるウシの発育因子の精製が報告され、これ
は下垂体ホルモンと異なることが示された（ゴスポダロ
ビイツク（Ｇｏｓｐｏｄａｒｏｗｉｃｚ　、　Ｄ、　）
、Ｎａｔｕｒｅ　、　２４９．１２３−１２７（１９７
４））　　現在ではこの発育因子は１６４１５の分子量
をもち、塩基性であり（ｐ１９．６）、かつ正常な２倍
体線維芽細胞捷たは樹立細胞系に対する有効な細胞分裂
促進物質であることが知られている。別の異なる発育因
子である酸性の脳ＦＧＦの精製は、米国特許第４，４４
４゜７６０号明細書（１９８４年４月２４日付）に記載
されている。この脳の酸性ＦＧＦの完全な性状１３３．
５５４−５ｆｉ２（１９８５））に最近報告された。

その後の研究によってＦＧＦは線維芽細胞の°ほかに各
種の正常な２倍体の中胚葉山来の細胞および神経稜由来
の細胞に対しても細胞分裂促進性であることが確認され
た。これには顆粒膜細胞、副腎皮質細胞、軟骨細胞、筋
芽細胞、角膜および血管の内皮細胞（ウシおよびヒト由
来）、血管平滑筋細胞、および水晶体上皮細胞が含まれ
る。ＦＧＦは血漿補充培地で培養された線維芽細胞の増
殖を支持しうる点で、血小板由来の発育因子の代替とな
りうろことも示された。ＦＧＦはそれがウシおよびヒト
の血管内皮細胞の増殖を刺激しつるのと密接に関連して
、インビボでも毛細管内皮細胞に対しても同様な活性を
もつ。従ってＦＧＦは血管形成因子であると考えられる
。

発明の要約 本発明は合成法によって製造され、かつある種の場合に
おいて哺乳動物ＦＧＦの生物学的効果と実質的に拮抗す
るＦＧＦ拮抗物質を提供する。

本発明はＤＮＡ組換え技術または他の適当な技術、たと
えば古典的な合成法もしくは固相合成法を用いて合成さ
れる、塩基性および酸性線維芽細胞発育因子（ＦＧＦ）
に対する拮抗物質を提供する。

塩基性ＦＧＦは後記の配列をもつアミノ酸残基１４６個
のポリペプチドである。天然のウシＦＧＦ分子において
はシスティン残基はいずれも互いにジスルフィド結合し
ておらず、１個または２個以上のシスティン残基が遊離
システィン分子に結合している可能性がきわめて太きい
と思われる。いずれにしろ本発明はＦＧＦの生物学的な
活性を抑制する生物学的に活性なペプチドを提供する。

それらはＤＮＡ組換え技術またはアミノ酸残基の逐次付
加を伴う標準的な連鎖延長法、たとえば固体樹脂支持体
を使った固相合成法によって合成され５る。

本発明による薬剤組成物には、薬剤学的に許容される液
体または固体キャリヤーに分散したＦＧＦ拮抗物質まだ
はそれらの無毒性塩類が含まれる。

これらの薬剤組成物は臨床医学（ヒトおよび動物の双方
）において、診断または治療の目的で短期間または長期
間投与することにより使用できる。

それらはインビボおよびインビトロ双方において内皮細
胞および関連した他の型の細胞の増殖を調節するのに有
用である。

本発明は簡単に合成できる哺乳動物ＦＧＦ、特に塩基性
ＦＧＦおよび酸性ＦＧＦに対する拮抗物質を提供する。

ペプチドを定義するために用いる命名法はシュレーダー
（５ｃｈｒｏｄｅｒ　）およびリュプケ（Ｌｕｂｋｅ）
により゛ペプチド°゛（アカデミツク・プレス、１９６
５年）に詳述されたものであり、その際一般的な表示法
に従ってＮ末端の遊離α−アミノ基をもつ残基を左側に
示し、Ｃ末端のα−カルボキシル基をもつ残基を右側に
示す。アミノ酸残基が異性体をもつ場合、表示されてい
るのはＬ型のアミノ酸である。ウシの塩基性ＦＧＦは下
記の配列をもつペプチドであることが見出されている。

Ｐｒｏ−Ａｌａ−Ｌｅｗ−Ｐｒｏ−Ｇｌｗ−Ａ、５ｐ−
Ｇ１Ｈｉｓ−Ｐｈｅ−Ｌｙｓ−Ａｓｐ−Ｐｒｏ−Ｌｙｓ
−ＡｒＰｈｅ−Ｌｅｗ−Ａｒｇ−１１ｅ−Ｈｉｓ−Ｐｒ
ｏ−ＡｓＬｖｅ−８ｉｒ−Ａｓｐ−Ｐｒｏ−Ｈｉｓ−１
１−ｅ−ＬａＯ５ Ｇｌｙ−Ｖａｌ−Ｖａｌ−８ｅｒ−１１ｅ−Ｌｙｓ−Ｇ
１Ｍｅ　ｔ−Ｌｙｓ−Ｇｌ　１Ｌ−Ａｓｐ−Ｇｌｙ−Ａ
ｒｇ−ＬａＯ２ Ｇｌｕ−Ｃｙｓ−Ｐｈｅ−Ｐｈｅ−Ｐｈｅ−Ｇｌｗ−Ａ
、ｒＴｙｒ−Ａ、ｒｇ−８ｅｒ−Ａｒｇ−Ｌｙｔｔ−Ｔ
ｙｒ−ＢｅＴｈｒ−Ｇｌ　ｙ−Ｇｌｎ−Ｔｙｒ−Ｌｙｓ
−Ｌｅｕ−Ｇ１Ａ、１ａ−Ｉ　ｌｅ−Ｌｅｕ−Ｐｈｅ−
Ｌｅｕ−Ｐｒｏ−Ｍｅ】０］５ ｙ−Ｇｌｙ−８ｅｒ−Ｇｌｙ−Ａｌａ−Ｐｈｅ−Ｐｒｏ
−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−ｐ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ−Ｖａｌ−Ａｓ
ｐ−Ｇｌｙ−Ｖａｌ−Ａｒｇ−Ｇｌｗ−ｓ−Ｌｅｕ−Ｇ
ｌｎ−Ｌｅｒｂ−Ｇｌｎ−Ａｌａ−Ｇｌｒｂ−Ｇｌｗ−
Ａｒｇ−ｙ−Ｖａｌ−Ｃｙｓ−Ａｌａ−Ａｓｎ−Ａｒｇ
−Ｔｙｒ−ＬｅｌＬ−Ａ、１ａ−ｕ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−
８ｅｒ−Ｌｙｓ−Ｃｙｓ−Ｖａｌ−Ｔｈｒ−Ａｓｐ−ｇ
−Ｌｅｕ−Ｇｌｕ−８ｅｒ−Ａｓｓ−Ａ、５ｎ−Ｔｙｒ
−Ａ、５ｎ−Ｔｈｒ−１１５１２Ｏ ｒ−８６ｒ−Ｔｒｐ−Ｔｙｒ−Ｖａｌ−Ａ、１ａ−Ｌｅ
？ｂ−Ｌｙｓ−Ａｒｇ−１，３０１３５ １−Ｐｒｏ−Ｌｙｓ−Ｔｈｒ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ
−Ｇｉｎ−Ｌｙｓ−（１，１） 天然分子のＣ末端がアミド化されているか否かは確実で
はない。

本発明は天然型ホルモンの中央１析片にそれぞ九基づい
ている２系列のＦＧＦ拮抗物質を提供する。

第１系列の中ノし・領域（ｃｏｒｅ）は３６−３９位に
存在する残基であり、そして第２系列の中心領域に１０
７−１１０位に存在する残基である。換言すれば、第１
系列の４残基な含む比較的短いペプチドは、テトラペプ
チド自身とともに、非刺激条件下（血清単独）で増殖す
る場合およびインビトロの培養細胞にＦＧＦを添加する
ことにより血清を補充する場合にも、内皮細胞の増殖に
何らかの抑制作用を示す。第１系列のＦＧＦ拮抗作用は
、テトラペプチドのＮ末端および／またはＣ末端の延長
を行うことによって極めて実質的に増加することが見出
されている。これらの延長は、天然型ホルモン中のこれ
らの位置に通常見出される残基配列、たとえばＦＧＦ（
３０−５０）を包含してよく、かつ必ずしもではないが
好ましくはＣ末端がアミド化されている。後記に論じる
ように、選択された位置での配列中の置換はなされても
よい。

これらのペプチドが示す拮抗作用の根拠はＦＧＦ受容体
との相互作用である。インビトロの細胞増殖（ＦＧＦ標
的細胞の全部の型を含む）に拮抗作用を示すペプチドは
ＦＧＦがその受容体に結合することも阻止する。さらに
、ペプチドの最小の長さはＦＧＦ（３６−３９）または
ＦＧＦ（１，０７−１１，Ｏ）の中心領域配列のどちら
かを含む。

ＦＧＦの配列（９３−１２０）に関連した第２系列のペ
プチド断片も拮抗作用を示し、かつおのおの異なるヘパ
リン結合部位を含む。すなわちペプチド断片内に含捷れ
る配列は受容体ばかりでなく放射活性のヘパリンと結合
する。ＦＧＦ作用においてヘパリンは重要な要素である
ので、ＦＧＦとヘパリン間の結合をそれによって阻害す
るペプチドは、ＦＧＦの生物学的作用、ＦＧＦとその受
容体との結合、およびＦＧＦとヘパリンとの相互作用を
阻害する重要な能力を説明する。ＦＧＦ（２４−６８）
とＦＧＦ（９３−１，２０）に関連した断片の特異性は
下記 ａ）ＦＧＦ作用の３つの全指標（すなわち細胞増殖１、
バリンとの結合、および受容体との相互作用）に対する
ペプチドの効果、および ｂ）これらのテトラペプチドの１つを含捷ない他のＦＧ
Ｆペプチド断片は同様の活性を示さないという結果 によって最も良く説明される。

本発明により提供されるＦＧＦ拮抗物質ペプチドの第１
系列は、下記の式（ウシＦＧＦの天然に存在する配列に
基づいている）で表現することができる。

Ｔｙｒ−Ｃｙｓ−Ｌｙｓ−ＡｓｔＬ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−
Ｐｈｅ−Ｐｈｅ−Ｌｅｕ−Ａｒｇ−１１ｅ−１１ｉｓ−
Ｐｒｏ−Ａｓｐ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ−Ｖａｌ−Ａｓｐ−Ｒ
４２−Ｖａｌ−Ａｒｇ−Ｇｌｕ−Ｌｙｓ−Ｒ４７−Ａｓ
ｐ−Ｐｒｏ−Ｈｉｓ−１１ｅ−Ｌｙｓ−Ｌｅｕ−Ｇｉｎ
−Ｌｅｑｂ−Ｇｉｎ−Ａｌａ−Ｇｌｕ−Ｇｌｕ−Ａｒｇ
−Ｇｌｙ−Ｖａｌ−Ｖａｌ−８ｅｒ−Ｉｌｅ−Ｌｙｓ−
Ｇｌｙ−Ｖａｌ−Ｙ よく、Ｒ４２はＥａｒ’！たはＡｌａまたはＴｈτであ
ってよい。Ｓａｒはザルコシンの略号である。）この完
全な長さ、すなわち４５残基を有するペプチドはＦＧＦ
拮抗物質として機能し、半アゴニス）　（ｐａｒｔｉａ
ｌ　ａｇｏｎｉｓｔ）　　としては機能しない。

それらは、それら自体として添加ＦＧＦ存在下ばかりで
なく基礎ＦＧＦ（ｂα８αｌ　ＦＧＦ）存在下でも内皮
細胞の増殖を抑制する。拮抗物質の主な機能は活性化を
起こすことなしに単に内皮細胞の受容体を遮断すること
であるので、４５残基がＦＧＦ拮抗物質として機能する
ペプチドの最大限度とは考えられない。結局、これらの
付加残基がα）ペプチドをＦＧＦ半アゴニストに変える
か或いは ｂ）受容体および／またはヘパリンへのペプチドの結合
を減少させ、その結果ＦＧＦ拮抗物質としてのペプチド
の生物学性活性を減少させる、 ことがない限り、片方まだは双方の末端に付加残基をつ
け加えてもよい。

本発明により提供されるＦＧＦ拮抗物質ペプチドの第２
系列は下記の式（ウシＦＧＦの天然に存在する配列に基
づいている）で表現することができる。

Ｐｈｅ−Ｐｈｇ−Ｐｈｅ−Ｇｌｕ−Ａｒｇ−Ｌｅｗ−Ｇ
１１ｔ−８ｅｒ−Ａｓｎ−Ａｓｎ−Ｔｙｒ−Ａｓｎ−Ｔ
ｈｒ−Ｔｙｒ−Ａｒｇ−８ｅｒ−Ａｒｇ−Ｌｙｓ−Ｔｙ
ｒ−８ｅｒ−８ｅｒ−Ｔｒｐ−Ｔｙｒ−Ｖａｌ−Ａｌａ
−Ｌｅｗ−Ｌｅｒｂ−Ａｒｇ−Ｙ（式中、ＹはＯＨまた
はＮＨ２のいずれかである。）上記の完全な２８残基な
有するペプチドはＦＧＦ拮抗物質として機能し、ＦＧＦ
存在下または非存在下で内皮細胞の増殖（および他のＦ
ＧＦ標的細胞の増殖）を抑制する。２８残基より長さの
短いペプチドはＦＧＦに対する拮抗物質として作用する
効力がある。さらに残基を片方寸たは双方の末端につげ
加えてもよい。しかしこうした変化は、ある受容体の活
性化を起こし、これにより部分的に増殖活性のある拮抗
物質へとペプチドを変える可能性がある。

アミノ酸数が約４５またはそれ以上の長さのペプチドを
合成するにはＤＮＡ組換え法を用いるのが好ましいであ
ろう。一方、残基数が約３０寸たはそれ以下の長さのペ
プチドを合成するにはよく知られた鎖長延長技術、たと
えばメリフィールド樹脂などを便５固相合成法を用いる
のが好捷しいであろう。

ＦＧＦペプチドを組換えＤＮＡにより合成するだめには
、意図するアミノ酸配列をコードする二重鎖ＤＮＡを合
成により構成する。遺伝暗号の縮重のため、生成物ポリ
ペプチドをコードするＤＮＡ鎖の形成に多様なコドンの
組合わせを使用することができる。ある型の生物では、
ある特定のコドンがポリペプチドの発現にとってより効
果的であり、コドンの選択は組換えベクターの宿主と］
〜で使われる予定の種類の生物における発現に最も有効
なコドンに従って行うことが好捷しい。しかし適正なコ
ドンの組合せであればいずれも、若干効率が劣るとして
も意図する生成物をコードするであろう。コドンの選択
は考慮されるベクターの構成にも依存するであろう。た
とえば、合成りＮＡ鎖の挿入の後に、制限部位において
切断する制限酵素を用いてベクターを操作したい場合は
、ＤＮＡ鎖内に特定の制限部位を作ることを避ける必要
があろう。またこのＤＮＡ鎖を含む組換えベクターによ
り形質転換される予定の宿主生物がこのＤＮＡ鎖内のあ
る部位で切断する制限酵素を産生ずることが知られてい
る場合にも、ＤＮＡ鎖内にこうした制限部位を置くこと
を避ける必要がある。

合成されるＤＮＡ鎖は、ＦＧＦ拮抗物質をコードする配
列のほかに、考慮されるベクター構成に応じて付加的配
列を含んでもよい。一般にＤＮＡ鎖はその末端にクロー
ニングベクター内の制限部位への挿入を容易にするリン
カ−を含むように合成される。ＤＮＡ鎖は融合ポリペプ
チドの一部として意図する配列をコードすべく構成され
てもよい。この場合、これは一般に蛋白分解プロセシン
グ部位となるアミノ酸残基配列をコードする末端配列を
含み、これにより意図するポリペプチドは融合ポリペプ
チドの残部から蛋白質分解により除去されるであろう。

合成りＮＡ鎖の末端部分には適宜な開始シグナルおよび
終止シグナルが含捷れていてもよい。

意図するＤＮＡ鎖を組立てるために、オリゴヌクレオチ
ドを常法により、たとえばマニアテイススフリング・ハ
ーバ−、ニューヨーク、１９８２年）（以下Ｃ３Ｈ）に
記載された方法により構成する。ヌクレオチド残基７０
１１ｉ！ｉｆｆでの長さのセンス（有意）およびアンチ
センスヌクレオチド鎖を、好ましくは自動合成装置、た
とえばアプライド・バイオシステムズ社、３８０ＡｍＤ
ＮＡ合成装置により合成する。オリゴヌクレオチド鎖は
センスオリゴヌクレオチドとアンチセンスオリゴヌクレ
オチドの部分がオーバーラツプし、相補的塩基対間で互
いに水素結合により会合し、これにより大部分の場合は
連鎖間にギャップをもつ二重銭を形成すべく構成される
。次いで連鎖間のギャップが埋められ、６鎖のオリゴヌ
クレオチドを末端同志で適宜なりＮＡポリメラーゼの存
在下で、および／またはりガーゼによりヌクレオチドト
リホスフェートを用いて結合させる。

天然に存在する分子の一部分であるペプチドが要望され
る場合には、オリゴヌクレオチド合成により合成りＮＡ
鎖を構成する代わりに、意図するＦＧＦ断片に対応する
ｃ　Ｄ　Ｎ　Ａを調製することができる。ｃＤＮＡライ
ブラリー捷たは発現ライブラリーは常法により逆転写酵
素によってＦＧＦ産生細胞系由来のメツセンジャーＲＮ
Ａ（ｍＲＮＡ）から調製される。ＦＧＦ配列を含むクロ
ーンを選択するためには、ＦＧＦ蛋白質の部分に対応す
るハイブリダイゼーションプローブ（好−１＜は遺伝暗
号の縮重に順応するだめの混合プローブ）を調製し、こ
の種の配列を含むクローンの同定に用いる。ＦＧＦ抗体
を用いる発現ライブラリーのスクリーニング法も単独で
、捷たはハイブリダイゼーションプロービング法と組合
せて採用でき、これによりＤＮＡライブラリークローン
中のＦＧＦをコードするＤＮＡ配列の存在を同定捷たは
確認する。この種の方法はたとえば前掲のＣＨ８（／’
Ｃ教示されている。

ＦＧＦをコードする二重鎖Ｄ　Ｎ　Ａ　４Ｊｌは目的と
するペプチドを合成するのに望ましい長さへと適宜に短
かくし、それから必要な場合には適当と考えられる特定
のクローニングベクターに挿入できるよう修飾する。組
換えられてＤＮＡ鎖を取込む予定のクローニングベクタ
ーは宿主である生物または細胞系におけるその生存能お
よび発現性に合わせて選ばれ、Ｄ　Ｎ　Ａ＠挿入法はそ
の宿主に特有の因子に依存する。たとえばＤＮＡ鎖を原
核細胞、たとえば大腸菌（Ｅ、ｃｏｌｉ）　　に用いる
ベクター中へ挿入したい場合は、ＤＮＡ鎖はプロモータ
ー配列、すなわち５′側の非翻訳領域内にあるシャイン
ーダルガルノ配列（またはりボゾーム結合部位）および
ＡＴＧ開始コドンの３′側に挿入されるであろう。ＡＴ
Ｇ開始コドンはシャインーダルガルノ配列から適宜間隔
を置いて配置され、コードする配列はＡＴＧ開始コドン
を含む適正な読み枠内に配置される。クローニングベク
ターは３′側非翻訳領域および翻訳終止部位をも備えて
いる。真核細胞、たとえば酵母細胞捷たは高等動物から
得た細胞系内に挿入するためには、ＦＧＦ断片をコード
するオリゴヌクレオチド配列はキャッピング部位から適
宜間隔を置いて、かつＡＴＧ開始シグナルを含む適正な
読み枠内に配置される。クローニングベクターは３′側
非翻訳領域および翻訳終止部位をも備えている。

対象となるＦＧＦ断片をコードするのに必要でかつコー
ドしたポリペプチドを少なくとも若干は発現することが
実質的に保証できる長さのＤＭＡ鎖を挿入するために、
原核生物形質転換ベクター、たとえばｐＢＲ３２２，ｐ
ＭＢ９．Ｃａｌ　Ｅｌ、ｐｃＲｌ、ＲＰ４およびラムダ
ファージが利用できる。一般にこの種のベクターは、プ
ロモーター、たとえばｌａｃプロモーターに対して適切
な位置にある特異的制限部位をもつべく構成捷たは修飾
されている。

Ｄ　Ｎ　Ａ　４Ｊは、適宜なリンカ−によりこの制限部
位へ挿入され、組換えベクターにより形質転換された原
核細胞系におけるＦＧＦの産生が実質的に保証される。

適正な読み枠を保証するために、種々の長さのリンカ−
をＦＧＦペプチドをコードする配列の末端に備えること
ができる。あるいは、ｌａｃ　Ｚ遺伝子の５′側領域（
オペレーター、プロモーター、転写開始部位、シャイン
ーダルガルノ配列、および翻訳開始シグナルを含む）、
トリプトファン遺伝子からの制御領域（ｔｒｐオペレー
ター、プロモーター、リボゾーム結合部位および翻訳イ
ニシエーター）、およびこれら２プロモーターを含むｔ
ｒｐ−１ａｃもしくは一般にＴａｂプロモーターと呼ば
れる融合遺伝子などの配列を含むカセットを入手し、こ
のカセットを選んだクローニングベクターに挿入する前
に合成りＮＡを好都合に挿入できる。

同様に真核生物形質転換ベクター、たとえばクローン化
つシ乳糖肺ウィルスゲノム、マウスレトロウィルスのク
ローン化ゲノム、および真核生物カセット、たとえばｐ
ＳＶ−２９７）を系（ムリガンおよびベルブ（Ｍｕｌ　
ｌｉｇａｎ　ａｎｔｉ　Ｂｅｒｇ　）により、Ｎａｔｕ
ｒｅ　２７７．１．０８−１１４．１９７９に記載され
ている）、オカヤマーベルグクローニンク系（Ｍｏ１．
　Ｃｅ１１．　Ｂｉｏｌ、　２．１．６１−１．７０．
１９８２）、最近ジエネテイツクス・インステイチュー
）Ｋより報告された発現クローニングベクター（Ｓｃｉ
ｅ−ｎｃｅ２２Ｂ、８１．０−８１．５．１９８５）が
入手でき、これらは形質転換した真核細胞系において少
なくとも若干のＦＧＦペプチド発現を実質的に保証する
。

意図する長さのＦＧＦ断片を調製する別の方法は、その
ポリペプチドをまず遺伝子をコードする融合ポリペプチ
ドのセグメントとして調製することである。この場合、
発現ポリペプチドがＦＧＦ断片配列の側方に酵素プロセ
シング部位をもつべ（ＤＭＡ鎖を構成する。ＦＧＦペプ
チドをコードするＤＭＡ鎖をたとえば大腸菌内への挿入
のためβ−ガラクトシダーゼ遺伝子中へ挿入することが
でき、この場合発現された融点ポリペプチドは次いで適
宜な蛋白質分解酵素により切断され、β−ガラクトシダ
ーゼペプチド配列からＦＧＦ断片が放出される。

ＦＧＦ断片をコードする配列を、切断可能な融合ポリペ
プチドのセグメントとして、たとえばβ一ガラクトシダ
ーゼペプチド配列内に融合したＦＧＦ断片配列として発
現されるべく挿入する利点は、ＦＧＦ断片配列が挿入さ
れる内在性ポリペプチドが一般に非機能性となり、これ
により融合ペプチドをコードするベクターの選択が容易
となる。

本ペプチドは適当な鎖長延長法またはカップリング形式
の方法、たとえば排他的固相法、部分的同相法、フラグ
メント縮合または古典的溶液カップリング法によって合
成することができる。排他的固相法は１固相ペプチド合
成（Ｓｏｌｉｄ−Ｐｈα８ｅＰｅｐｔｉｄｅ　Ｓｙｕｔ
ｈｅｇｉｓ）”、スチュワート（Ｓ　ｔ　ｅｗ−ｃｒｔ
）およびヤング（Ｙｏｕｎｇ）、ピアスケミカル社、ロ
ックフォード、イリノイ（１９８４）に記載されており
、１９７８年８月８日公示の米国特許第４．１０５，６
０３号の開示によって例示されている。

フラグメント縮合の合成法は米国特許第３，９７２゜８
５９（１９７６年８月３日付）に例示されている。その
他の利用可能な合成法は米国特許第３．８４２，０６７
号（１９７４年１０月１５日付）および同第３，８６２
，９２５号（１９７５年１月２８日付）に例示されてい
る。

種々のアぐノ酸成分の不安定な側鎖基を適当な保護基（
その基が最終的に除去される捷で、その部位で化学反応
が起こるを防ぐ）で保護することは、カップリング形式
の合成において一般的である。アミノ酸や断片がカルボ
キシル基の部位で反応する間その物質のα−アミノ基を
保護することは通常一般的であり、その後α−アミン保
護基を選択的に除去してその位置で次の反応を行わせる
。

従って、合成の一段階として、ペプチド鎖中に意図する
配列で位置する各アミノ酸残基を含みかつ適当なアミノ
酸残基に側鎖保護基を結合した中間体化合物が生成する
ことは普通のことである。

第１系列のこうした中間体は下記の式で表わすことがで
きる： Ｘ’−Ｔｙｒ（Ｘ２）−Ｃｙｓ　（Ｘ４）−Ｌｙｓ　（
Ｘ７）−Ａｓｎ（Ｘ８）　−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｐｈｅ−
Ｐｈｅ−Ｌａｗ−Ａｒｇ（Ｘ６）−１１ｅ−Ｈｉｓ　（
Ｘ’）−Ｐｒｏ−Ａｓｐ（Ｘ３）−Ｇｌｙ−Ａｒｇ（Ｘ
６）−Ｖａｔ−Ａｓｐ（Ｘ”）　−Ｒ４２−Ｖａｌ＋Ａ
＠１）（Ｘ’）−Ｇｌｖ、（Ｘ”）　−Ｌｙｓ（Ｘ７）
−Ｒ４）（Ｘ５）−Ａｓｐ（Ｘ”）−Ｐｒｏ−Ｈｉｓ（
、Ｙ”）−ＩＩｅ−Ｌｙ　ｓ　（Ｘ７）−Ｌｅｒｂ−Ｇ
ｌ　％　（Ｘ’　）−Ｌｅｒｂ−Ｇｌ　ｎ　（１”　）
−Ａｌａ−Ｇｌｕ（Ｘ３）−Ｇｌｕ（Ｘｌ）−Ａｒｇ（
Ｘ６）−Ｇｌｙ−Ｖａｌ−Ｖａｌ−８ｅｒ（Ｘ５）−１
１ｅ−Ｌｙｓ（Ｘ７）−Ｇｌｙ−Ｖａｌ−Ｘ１０第２系
列のこうした中間体は下記の式で表わすことができる： Ｘ’−Ｐｈｉ−Ｐｈｅ−Ｐｈｅ−Ｇｔｗ（ＸＪ−Ａｒｇ
（Ｘ’）−ＬｅｌＬ−Ｇｌｕ（Ｘ”）−８ｅｒ（Ｘ５）
−Ａｓｎ（Ｘ８）−Ａｓｎ（Ｘ８）−Ｔｙｒ（Ｘ２）−
Ａｓ７Ｌ（Ｘ８）−Ｔｈｒ（Ｘ”）−Ｔｙｒ（Ｘ２）−
Ａｒｇ（Ｘ”）−８ｅｒ（Ｘ５）−Ａｒｇ（Ｘ６）−Ｌ
ｙｓ（Ｘ７）−Ｔｙｒ−（Ｘ”）−８ｅｔ（Ｘ５）−８
ｅｒ（Ｘ”）−Ｔｒｐ−Ｔｙｒ（Ｘ２）−Ｖａｌ−Ａｌ
ａ−Ｌｅ　ｕ−Ｌｙ　ｓ　（、Ｙ７）−Ａｒ　ｇ　（、
￥ｆｉ）　−Ｘ　”これらの式中、Ｘｌは水素またはα
−アミン保護基のいずれかである。Ｘｌに包含されるα
−アミン保護基は、ポリペプチドの逐次合成の分野にお
いて有用であると知られているものである。Ｘｌとして
使用しうるα−アミン保護基の種類には（１）アシル型
保護基、例えばホルミル、トリフルオロアセチル、フタ
リル、トルエンスルホニル（Ｔａｇ）、ベンゼンスルホ
ニル、ニトロフェニルスルフェニル、トリチルスルフェ
ニル、Ｏ−ニトロフェノキシアセチル、クロロアセチル
、アセチル、およびγ−クロロブチリル；（２）芳香族
ウレタン型保護基、例工ばベンジルオキシカルボニル（
Ｚ）およびｐ−クロロベンジルオキシカルボニル、ｐ−
ニトロベンジルオキシカルボニル、ｐ−ブロモベンジル
オキシカルボニル、ｐ−メトキシベンジルオキシカルボ
ニルのような置換Ｚ；（３）脂肪族ウレタン保護基、例
えばｔ−ブチルオキシカルボニル（Ｂ□Ｃ）、ジイソプ
ロピルメチルオキシカルボニル、イソプロピルオキシカ
ルボニル、エトキシカルボニル、アリルオキシカルボニ
ル；　（４１シクロアルキルウレタン型保護基、例えば
シクロペンチルオキシカルボニル、アダマンチルオキシ
カルボニル、およびシクロヘキシルオキシカルボニル；
（５１−１−オウレタン型保護基、例えばフェニルチオ
カル曵ニル；（６）アルキル型保護基、例えばトリフェ
ニルメチル（）　ＩＪチル）、ベンジル；　（７＋　）
リアルキルシラン基、例えばトリメチルシラン；が含ま
れる。好ましいα−アミノ保護基はＢＯＣである。

（２日） Ｘ２はＴｙｒのフェノール性水酸基のための保護基であ
り、テトラヒドロピラニル、ｔ−ブチル、トリチル、Ｂ
ｚｌ、ＣＢＺ、’　　４Ｂｒ−ＣＢＺ、および２．６−
ジクロルベンジルといった基から選択される。好捷しい
保護基は２，６−ジクロルベンジルである。Ｘ２は水素
であってもよく、この場合は水酸基に保護基が存在しな
いことを意味する。

Ｘ３は水素もしくはＡｓｐまたはＧｌｕＯカルボキシル
基のだめのエステル形成保護基であって、Ｂｚｔ、シク
ロヘキシル、シクロヘキシル、２１６−ジクロルベンジ
ル、メチルおよびエチルといった基から選択される。

Ｘ４は、ｐ−メトキシベンジル（ＭｅＯＢｚｔ）、ｐ−
メチルベンジル、アセトアミドメチル、トリチル、およ
びＢｚｔといった基から選択されるＣｙｓのための保護
基である。最も好捷しい保護基はｐ−メトキシベンジル
である。Ｘ４は水素であってもよく、このことはスルフ
ヒドリル基に保護基が存在しないことを意味する。

Ｘ５はＴｈｒおよびＳａｒの水酸基のための保護基であ
り、アセチル、ベンゾイル、ｔ−ブチル、トリチル、テ
トラヒドロピラニル、Ｂｚｔ、　　２　、６−ジクロル
ベンジルおよびＣＢＺといった基から選択される。好ま
しい保護基はＢｚｌである。Ｘ５は水素であってもよく
、このことは水酸基に保護基が存在しないことを意味す
る。

Ｘｏは、ニトロ、Ｔｏｓ、ＣＢＺ、アダマンチルオキシ
カルボニルといった基から選択されるＡ、ｒσのグアニ
ジノ基のだめの保護基であるか、もしくは水素である。

Ｘ７は水累捷たはＬｙｓの側鎖アミノ置換基のための保
護基である。適当な側鎖アミノ保護基の例＋１２−　ク
ロルベンジルオキシカルボニル（２−ＣＬ−Ｚ）、Ｔｏ
ｓ、ＣＢＺ、ｔ−アミルオキシカルボニルおよびＢＯＣ
である。

側鎖アミン保護基の選択は、合成中のα−アミン基の保
護基除去の間に除去されないものでなければならないと
いうことを除いては限定的ではない。従って、α−アミ
ン保護基と側鎖アミン保護基は同じではありえない。

Ｘ８はＧｌｎおよび／またはＡｇｎの側鎖アミド基のた
めの保護基であり、キサンチル（Ｘｒｔｎ）が好捷しい
。Ｘ８は任意には水素でありうる。

Ｘ９は、ＴｏｓｉたはジニトロフェニルのよりなＨｉｓ
のイミダゾール窒素のための保護基であるか、または水
素でありうる。

Ｘ１０は、ＯＨ，ＯＣＨ３、エステル類、アミド類、ヒ
ドラジド類、−０−ＣＨ２−樹脂支持体および−ＮＨ−
樹脂支持体といった種類から選択され、この場合ＯＨと
アミド類以外の基は広い意味での保護基とみなされる。

中間体の式中、Ｘ′、Ｘ２１．Ｘ３１．ｙ４、Ｘ５、Ｘ
６１．￥７、Ｘ８、Ｘ９およびＸ１０のうち少なくとも
１つは保護基である。

ペプチド合成において使用する個々の側鎖保護基を選択
する場合、下記の法則に従５：すなわち（ｃｌ保獲基は
、試薬に対して、および合成の各段階でα−アミン基の
除去のために選ばれた反応条件下で安定であるべきであ
る；（ｂ）保護基はカップリング条件下でその保護特性
を保持して切断されない；および（ｃｌ側鎖保護基は、
意図するアミノ酸配列を含む合成の完了時点に、ペプチ
ド釧を変性させない反応条件下で除去できなければなら
ない。

本ペプチドは、メリーフィールド（Ｍｅｒｒｉｆｉ−ｇ
ｌｄ）のＪ、　Ａｍ、　Ｃｈｅｍ、　Ｓｏｃ　、　、　
８５、ｐ２１４９（１９６３）に記載されたような固相
合成法を用いて製造されることが好ましい。しかし、先
に述べたように当分野で知られた他の同様な化学合成法
も使用し５る。固相合成法は保護したα−アミノ酸を適
当な樹脂にカップリングすることによりペプチドのＣ末
端から開始される。このような出発物質はα−アミノ保
護Ｖａｌを、クロルメチル（ＩＪＩ脂またはヒドロキシ
メチル樹脂へエステル結合によって結合するか、あるい
はＢＨＡ樹脂捷たはＭＢＨＡ樹脂にアミド結合で結合す
ることによって製造し５る。ヒドロキシメチル樹脂の製
法はボダンスキー（ＢｏｄｔＬｎｓｋｙ　）らのＣｈｅ
ｍ、　Ｉ？Ｌｄ、　（ｏンドン）３８．１５９７−９８
（１９６６）に記載されている。クロルメチル化樹脂は
カリフォルニア州すッチモンドのバイオラッド研究所（
Ｂｉｏ　ＲａｄＬａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）およびラブ
システムズ社（Ｌａｂ、　Ｓｙｓｔｅｍｓ、　Ｉｎｃ、
）　　から市販されている。

この種の樹脂の製法はスチュワー）　（Ｓｔｅｗａｒｔ
）らの゛固相ペプチド合成（Ｓｏｌｉｄ　Ｐｈａｓｅ　
Ｐｅｐｔ−ｉｄｅ　５ｙｎｔｈｅｓｉｓ　）”（フリー
マン・アンド・カンパニー、サンフランシスコ、ｌ　９
６９　）１％１章１〜６頁に記載されている。ＢＨＡお
よびＭＢＨＡ樹脂支持体は市販されているが、一般に合
成を意図しているポリペプチドがＣ末端にα−カルボキ
サミドをもつ時にのみ使用される。

例えば第１系列のペプチドをＣ末端を遊離した状態で合
成したい場合には、モナハン（Ｍｏｎａｈａｎ）および
ギロン（Ｇｉｌｏｎ）のＢｉｏｐｏｌｙｍｅｒ　１２、
ｐｐ２５１３−１９．１９７３の方法に従って、ＢＯＣ
で保護したＶａｌをクロルメチル化樹脂へカップリング
して製造することができる。ＥＯＣ−Ｖａｔのカップリ
ング後に、塩化メチレン中のトリフルオロ酢酸（ＴＦＡ
　）、ＴＦＡ単独またはジオキサン中のＨＣＩを用いて
α−アミン保護基を除去する。保護基の除去は０℃から
室温までの温度で行なわれる。

他の標準的な切断試薬、および特定のα−アミン保護基
の除去条件は、シュレーダー（Ｓｃｈｒｏｄｅｒ）およ
びリュプケ（Ｌｕｂｋｅ）の°ザ・ペプチド（Ｔｈｅ　
Ｐｅｐｔｉｄｅｓ　）”１、ｐｐｑ２−７５（アカデミ
ツクプレス、１９６５　）に記載されているように使用
しうる。

Ｖａｌのα−アミノ保護基の除去後、残りのα−アミノ
−および側鎖−保護アミノ酸を意図する順序で段階的に
カップリングさせて、先に定義した中間体を得る。ある
いは各アミノ酸を別個に反応器へ加える代わりに、若干
のアミノ酸を互いにカップリングさせてから同相反応器
へ添加してもよい。適当なカップリング試薬の選択は当
分野の技術の範囲内である。カップリング試薬として特
に適しているものはＮ　、　Ｎ’−ジシクロへキシルカ
ルボジイミド（ＤＣＣＩ）である。

ペプチドの固相合成に用いられる活性化試薬はペプチド
合成の分野においてよく知られている。

適当な活性化試薬は下記に例示される：（］）カルボジ
イミド類、例えばＮ　、　Ｎ’−ジイソプロピルカルボ
ジイミド、＃、＃’−ジシクロへキシルカルボジイミド
（ＤＣＣＩ　）　；　（２１シアナミド類たとえばＮ。

Ｎ′−ジベンジルシアナミド；（３）ケチイミン類；（
４）インキサゾリウム塩類；（５）環に１〜４．　（ｆ
ｉｌの窒素を含む芳香族性を有するモノサイクリック窒
素含有複素環式アミド類、例えばイミダゾリド類、ピラ
ゾリド類、および１　、２　、４．−　）リアゾリド類
。

有用な特異的複素環式アミドはＮ　、　Ｎ’−カルボニ
ルジイミダゾール、Ｎ、Ｎ’−カルボニル−ジー１．２
．４−）リアゾールを含む；（６）アルコキシル化アセ
チレン、例えばエトキシアセチレン；（７）アミノ酸の
カルボキシル部分と混合無水物を形成する試薬、例えば
エチルクロルフォルメートおよびイソブチルクロルフォ
ルメート、および（８）アミノ酸のカルボキシル部分と
活性エステルを形成する試薬、例えばＮ−ヒドロキシフ
タルイミド、Ｎ−ヒドロキシフタルイミドおよび１−ヒ
ドロキシベンゾトリアゾール（ＨＯＥＴ）のような環窒
素に水酸基を有する窒素含有複素環式化合物。その他の
活性化試薬なちびにペプチドカップリングにおけるそれ
らの使用は、シュレーダー、Ｈ＋）ユプケの上記文献第
■章訃よびカプール（Ｋａｐｏｏｒ）のＪ、　Ｐｈｃｔ
ｒ、　Ｓｃｉ、、　５９、ｐ１〜２７（１９７０）に記
載されている。

それぞれの保護アミノ酸捷たはアミノ酸配列は大体２倍
捷たけそれ以上の過剰量で同相反応器へ導入され、カッ
プリング反応はジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）　　：
　ＣＨ２Ｃｌ、　（１：　］　）の混合媒体中あるいは
ＤＭＦ捷たはＣＩＩ、、Ｃ／！、単独中で行ってもよい
。不完全なカップリングが起こった場合は、α−アミン
保護基を除去する前にそのカップリング反応を繰り返し
、その後次のアミノ酸をカップリングさせる。合成の各
段階でのカップリング反応の成就は、もしその合成が手
動で行なわれるな３４．５９５　（１，９７０）に記載
されているように、ニンヒドリン反応で監視する。

意図するアミノ酸配列が完了した後、液状フッ化水素の
ような試薬で処理して中間体ペプチドを樹脂支持体から
切り離す。その際液状フッ化水素はペプチドを樹脂から
切り離すばかりでなく、残っているすべての側鎖保護基
Ｘ２、ｚ　３１．ｙ　４　、ｚ　５、Ｘ６、Ｘ７、Ｘ８
およびＸ９ならびにα−アミノ保護基、Ｙｌ　をも切断
してペプチドをもたらす。

中間体ペプチドは、代わりの経路としてアルコーリシス
により樹脂支持体から脱離してもよく、その後回収した
Ｃ末端アルキルエステルは加水分解により酸に変換する
。側鎖保護基はその後上記に記載した方法あるいは接触
還元（たとえばＢ　ａ　Ｓ　Ｏ４上のＰｄ　）のような
他の既知の方法によって切断できる。フッ化水素を切断
に使用するときは、スカベンジャーとしてアニソールと
メチルエチルスルフィドを反応容器中に加える。

下記の実施例は固相法によってＦＧＦ拮抗物質を合成す
る好捷しい方法を示している。対応するより短いペプチ
ド断片は、単にペプチド鎖のいずれかの末端で必要数の
アミノ酸を除去するととにより同じ方法で合成し得るこ
とがもちろん認められるであろう。

実施例Ｉ 下記の式： Ｈ−Ｔｙｒ−Ｃｙｓ−Ｌｙｓ−ＡｓｔＬ−Ｇｌ　ｙ−Ｇ
ｌ　ｙ−Ｐｈｅ−Ｐｈｅ−Ｌａｗ−Ａｒｇ−１１ｅ−Ｈ
ｉｓ−Ｐｒｏ−Ａｓｐ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ　−Ｖａｌ−Ａ
ｓｐ−Ｇｌｙ−Ｖａｌ−Ａｒｇ−Ｇｌｒｂ−Ｌｙｓ−８
ｅｒ　−Ａｓｐ−Ｐｒｏ−Ｈｉｓ−１１ｅ−Ｌｙｓ−Ｌ
ｅｗ−Ｇｌｎ−Ｌｅｂｂ−０１％−Ａｌａ−Ｇｌｓ−Ｇ
ｌｒｂ−Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ｖａｌ−Ｖａｌ　−８ｅｒ−
ＩＩ　ｅ−Ｌｙｓ−Ｇｌｙ−Ｖａｌ　−ＮＨ２を有する
Ｆ　Ｇ　Ｆ　（２４−６８）−アミドの合成は、ベック
マン９９０ペプチド合成機とＭＢＨＡ樹脂を用いて逐次
方式で実施する。ＢＯＣ−Ｖａｌの樹脂へのカップリン
グは米国特許第４，２９２，３１３号に記載される一般
方法により実施し、この結果、使用したＭＨＢＡ樹脂の
置換に応じて樹脂１７当たｆ）Ｖａｌ約０．２−０．６
　ミＩＪモルの置換を得る。

保護基を除去して中和した後、ペプチド鎖を樹脂上に一
個ずつ付加していく。保護基の除去、中和および谷アミ
ノ酸の付加はギレミン（ＧｌＬｉｌｌｅ−ｍｉｎ）らの
米国特許第３，９０４，５９４号に詳述された方法に一
般的に従って行なった。カップリングは特に下記のスケ
ジュールに詳述されるように行なった。

４ＣＨ２Ｃ７１，２洗浄（３回）０５ ５　　　ＣＨ３０Ｈ洗浄（２回）０５ ７　　　ＣＨ３０Ｈ洗浄（２回）０．５９　　　ＣＨ３
ＯＨ洗浄（２回）０．５１０　　ＣＨ２Ｃｔ２洗浄（２
回）０．５ミ　ド（ＤＣＣ） １２　　ＣＨ２Ｃｌ、洗浄（１回）０．５１５　　ＣＨ
３０Ｈ洗浄（２回）０５ １．６　　ＣＨ２Ｃｔ２洗浄（２回）０．５１．８　　
ＣＨ２Ｃｌ、洗浄（２回）０５１９　　ＣＨ３０Ｈ洗浄
（２回）０５ 簀ＡｓｎおよびＧｌｎのカップリングのためには、この
段階で１．１３６モル過剰の１−ヒドロキシベンゾ）　
ＩＪアゾール（ＩｉＯＢｔ）を加えた。

カップリング反応を簡単に述べれば、塩化メチレン中の
ＢＯＣ−保護アミノ酸１ミリモルを樹脂１１当たりに使
用し、塩化メチレン中の０．５モルＤＣＣＩ　　１等量
捷たは塩化メチレン中の３０％ＤＭＦを加えて２時間実
施する。Ａｒｇをカップリングさせる時は１０％ＤＭＦ
と塩化メチレンの混合物を使用する。ＳｅｒとＴｈγの
水酸基側鎖保護基としてＢｚｌを使用する。Ｌｙｓ側鎖
の保護基としてハ２−　クロル−ベンジルオキシカルボ
ニル（２Ｃ１−Ｚ）を使用する。ＴｏｓはＡｒｇのグア
ニジノ基を保護するのに使用し、Ｇｌｕ　ｉたはＡｓｐ
のカルボキシル基はＢｚｔエステルとして保護される。

Ｔｙｒのフェノール性水酸基は２，６−ジクロルベンジ
ルで保護する。ＡｓｎおよびＧｉ？Ｌは保護しないｉｔ
にする。合成の終りに、下記の組成の中間体が得られる
： （Ｘ’）Ｔｙｒ（Ｘ２）−Ｃｙｓ（Ｘ’）−Ｌｙｓ（Ｘ
７）−Ａ、ｓｎ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｐｈｅ−Ｐｈｅ−Ｚ
ｇ＋ｕ−Ａｒｇ（Ｘ６）−１１ｅ−Ｈｉｓ（Ｘ”）−Ｐ
ｒｏ−Ａ、ｓｐ（Ｘ３）−Ｇｌｙ−Ａｒｇ（Ｘ”）−Ｖ
ａｌ−Ａｓｐ（Ｘ３）−Ｇｌｙ−Ｖａｌ−Ａｒｇ（Ｘ６
）−Ｇｌｕ（Ｘ３）−Ｌｙｓ（Ｘ７）−８ｅｒ（Ｘ５）
−Ａｓｐ（Ｘ３）−Ｐｒｏ−Ｈｉｓ（１”）−１１ｅ−
Ｌｙｓ（Ｚ７）−Ｌａｗ−Ｇｉｎ−Ｌｅｒｂ−Ｇｌｎ−
Ａｌａ−Ｇｌｕ（Ｘ”）−Ｇｌｕ（Ｘ”）−Ａ、ｒｇ（
Ｘ６）−Ｇｌｙ−Ｖａｌ−Ｖａｔ−８ｅｒ（Ｘ５）　−
１ｒｅ−Ｌｙｓ（Ｘ’）−Ｇｌｙ−Ｖａｌ−Ｘ”。

（式中、ＸｌはＢＯＣ，Ｘ２は２，６−ジクロルベンジ
ル　、ｙ３ｉｊベンジルエステル、Ｘ４はＭｅＯＢｚＬ
、　Ｘ５はＥｚＬ、Ｘ６はＴｏｓ、Ｘ７　は２Ｃ１−Ｚ
、　Ｘ９はＴｏｓ、そしてＸ１０は−ＮＨ−ＭＢＨＡ樹
脂支持体である） 最終のＴｙｒ残基を樹脂にカップリングした後、ＢＯＣ
基をＣ１１２ＣＬ２中の４５％ＴＦＡで除去する。

残っている保護ペプチド−樹脂を切り離して保護基を除
去するために、ペプチド−樹脂］、　ｆｉ’当たりアニ
ソール１゜５−、メチルエチルスルフィド０．２５ｍｌ
およびフッ化水素（ＨＦ　）　１０　ｍ７！を用いて一
２０℃で３０分および０℃で３０分処理する。ＩＩＦを
高真空下で除去した後、樹脂−ペプチド残留物を乾燥ジ
エチルエーテルおよびクロロホルムで交互に洗い、次い
でペプチドをガス抜きした２Ｎ水性酢酸で抽出する。酢
酸抽出物を凍結乾燥して白い綿毛状物質を得る。

切断し保護基を除去したペプチドはその後３０％酢酸に
溶解し、セファデックスＧ−５０微細ゲル瀘過にかける
。

ペプチドはさらに、０．４　Ｍ　ＮＨ４０Ａａ　（ｐＨ
６，５）１ｔを０．０１　Ａ／　ＮＨ４０Ａｃ、（ｐＨ
４，５）　４００　ｍ１２を含む混合フラスコに滴下す
ることによって生成する凹型勾配を用いて、ＣＭ−３２
カルボキシメチルセルロース（ワットマン）陽イオン交
換クロマトグラフィー（１゜８　Ｘ　１８ｃｍＩｎ、、
　Ｖｂｅｄ＝５０ｍｌ）で精製する。最終精製は０１％
ＴＦＡおよびアセトニトリル溶媒系を用いてヴアイダツ
ク（ＶｙｄａＣ）０４カラムの調製用ＨＰＬＣを使用し
て行なう。精製の詳細は一般にリング（Ｌｉｎｇ）らの
Ｂｉｏｃｈｅｔｎ。

Ｂｉｏｐｈｙｓ、　Ｅｅｓ、　Ｃｏｍｒｎｒｂｎ、　９
５．９４５（１９８０）に示されている。クロマトグラ
フ画分は注意してＴＬＣで監視し、実質的純度を示す両
分のみを集めた。

Ｖａｌをクロルメチル化樹脂に結合させるというＢｉｏ
ｐｏｌｙｍｅｒｓ、　１２．２５１．３−１９　（１９
７３）に記載されている方法に一般的に従って、Ｃ末端
に遊離酸を有する同じペプチドを製造する合成をクロル
メチル化樹脂を用いて繰り返す。

実施例■ ＦＧＦ断片ペプチドの内皮細胞増殖を阻害する効率を求
めるため、基礎細胞増殖とＦＧＦ刺激細胞増殖の両者を
調節するペプチドの能力を測定する条件下でペプチドを
試験する。ゴスポダロヴイツク（Ｇｏｓｐｏｄａｒｏｗ
ｉｃｚ　）らのＪ、　Ｃｅ１ｌ　Ｂｓｏ、１．。

１２２．３２３−３３３（１，９８５）に詳述されてい
る型のバイオアッセイを使用した。

各試験用に、１ウエル当たり細胞約０．３−０．５×１
０４個の間の初期細胞密度を２４−ミニウェルプレート
に樹立した。各ウェル中の細胞は６−８時間後に、合成
ＦＧＦ拮抗物質の非存在下または種々の濃度での存在下
においてチャレンジ投与量のＦＧＦで処理した。４８時
間後に同様の処理を繰り返した。細胞は５日めにトリプ
シンで消化して、各ウェル中の細胞総数をクールター粒
子計測器（Ｃｏｕｌｔｅｒ　ｐａｒｔｉｃｌｅ　ｃｏｕ
？Ｌｔｅｒ）を用いて辿１定した。ペプチドＦＧＦ（２
４−６８）−ＮＨ２の試験では、内皮細胞の基礎増殖と
ＦＧＦ−刺激増殖の両者に対して完全な拮抗活性を有す
ることが示され、約１００μｆ／ｍｅの濃度で細胞数は
それぞれ約８４％および約９２％減少する。同様の結果
がＦＧＦ（２４−６８）−ＯＲの試験からも得られ、両
ペプチドのＩＤ、。は約５マイクロモルであることが示
されている。

次いで、ＦＧＦ標的細胞の受容体との相互作用を調べる
ために、１１２５ＦＧＦのＢＨＫ細胞への結合に及ぼす
ＦＧＦ断片の効果を測定する試験を実施し、かつ該断片
の〔３Ｈ〕−ヘパリンへの結合を損１１定する試験も実
施する。１００μ９／ｍｌの濃度のＦＧＦ（２４，−６
８）−ＮＨ２は、細胞に結合する放射活性なＦＧＦの量
を約５４％減少させ、かつヘパリンに結合する強い親和
性を示す。

実施例■ 下記の式： ％式％ 成ハ、ベックマン９９０ペプチド合成機とＭＢＨＡ樹脂
を用いて、実施例■に記載された方法により逐次方式で
実施する。ペプチドが実質的に純粋であることはＴＬＣ
およびＩＩ　Ｐ　Ｌ　Ｃを用いて判定する。実施例Ｈに
示された方法による試験の結果、内皮細胞の基礎増殖と
ＦＧＦ−刺激増殖の両者（Ｃ対してこのペプチドが完全
な拮抗活性を有することが示され、細胞数はそれぞれ約
１９％および約１６％減少する。

下記の式： ％式％ を有するＦ　Ｇ　Ｆ　（３０−４９）　−ＮＩＩ２　　
の合成は、ベックマン９９０ペプチド合成機とＭＢＨＡ
樹脂を用いて、ＡｓｐおよびＧｔｌｂの保護にＢｚｔの
代わりにシクロヘキシルを用いる以外は実施例Ｉに記載
された方法により逐次方式で実施する。ペプチドが実質
的に純粋であることはＴＬＣおよびＩＩ’ＰＬＣを用い
て判定する。実施例１に示された方法による試験の結果
、内皮細胞の基礎増殖とＦＧＦ−刺激増殖の両者に対し
てこのペプチドが完全な拮抗活性を有することが示され
る。

下記の式： ％式％ 成は、ベックマン９９０ペプチド合成機とＭＢＨＡ樹脂
を用いて、実施例Ｉに記載された方法により逐次方式で
実施する。ペプチドが実質的に純粋であることはＴＬＣ
およびＨＰＬＣを用いて判定する。実施例■に示された
方法による試験の結果、内皮細胞の基礎増殖とＦＧＦ−
刺激増殖の両者に対してこのペプチドが完全な拮抗活性
を有することが示され、細胞数はそれぞれ約８６％およ
び約９５％減少する。そしてこのペプチドはＢＨＫ細胞
とヘパリンに対して非常に強力な結合親和性を有するこ
とが示される。

実施例■ 下記の式： ％式％ 成ハ、ベックマン９９０ペプチド合成機とクロルメチル
化樹脂を用いて、先に記載された方法により逐次方式で
実施する。ペプチドが実質的に純粋であることはＴＬＣ
およびＨＰＬＣを用いて判定する。実施例■に示された
方法による試験の結果、内皮細胞の基礎増殖とＦＧＦ−
刺激増殖の両者に対してこのペプチドが完全な拮抗活性
を有することが示される。

下記の式： ％式％ を有するＦＧＦ（３１−５３）−ＮＨ２の合成は、ベッ
クマン９９０ペプチド合成機とＭＥＨＡ樹脂を用いて、
実施例１に記載された方法により逐次方式で実施する。

ペプチドが実質的に純粋であることはＴＬＣおよびＨＰ
ＬＣを用いて判定する。実施例Ｈに示された方法による
試験の結果、内皮細胞の基礎増殖とＦＧＦ−刺激増殖の
両者に対してこのペプチドが完全な拮抗活性を有するこ
とが示される。

実施例■ 下記の式： ％式％ を有するＦＧＦ（３２−３９）−ＮＨ２の合成は、ベッ
クマン９９０ペプチド合成機とＭＢＨＡ樹脂を用いて、
実施例Ｉに記載された方法により逐次方式で実施する。

ペプチドが実質的に純粋であることはＴＬＣおよびＩＩ
　Ｐ　Ｌ　Ｃを用いて判定する。実施例Ｈに示された方
法による試験の結果、内皮細胞の基調増殖とＦＧＦ−刺
激増殖の両者に対してこのペプチドが完全な拮抗活性を
有することが示され、細胞数はそれぞれ約３７％および
約１１％減少する。

実施例Ｖ 下記の式： ％式％ を有する。Ｆ　Ｇ　Ｆ　（２４６３）　ＮＨｔの合成は
、ベックマン９９０ペプチド合成機とＭＢＨＡ樹脂を用
いて、実施例■に記載された方法により逐次方式で実施
する。ペプチドが実質的に純粋であることはＴＬＣおよ
びＨＰＬＣを用いて判定する。実施例■に示された方法
による試験の結果、内皮細胞の基礎増殖とＦＧＦ−刺激
増殖の両者に対してこのペプチドが完全な拮抗活性を有
することが示される。

実施例Ｘ 下記の式： ％式％ を有する〔Ａｌａ４７〕ＦＧＦ（２４６３）−ＮＦ２の
合成は、ベックマン９９０ペプチド合成機とＭＢＨＡ樹
脂を用いて、実施例Ｉに記載された方法により逐次方式
で実施する。ペプチドが実質的に純粋であることはＴＬ
ＣおよびＨＰＬＣを用いて判定する。実施例■に示され
た方法による試験の結果、内皮細胞の基礎増殖とＦＧＦ
−刺激増殖の両者に対してこのペプチドが完全な拮抗活
性を有することが示される。

実施例ＸＩ 下記の式； ％式％ 合或は、ベックマン９９０ペプチド合成機とＭＢＨＡ樹
脂を用いて、実施例Ｉに記載された方法により逐次方式
で実施する。ペプチドが実質的に純粋であることはＴＬ
ＣおよびＩＩ　Ｐ　Ｌ　Ｃを用いて判定する。実施例■
に示された方法による試験の結果、内皮細胞の基礎増殖
とＦＧＦ−刺激増殖の両者に対してこのペプチドが完全
な拮抗活性を有することが示される。

下記の式： ％式％ 成ハ、ベックマン９９０ペプチド合成機とＭＢＨＡ樹脂
を用いて、実施例Ｉに記載された方法により逐次方式で
実施する。ペプチドが実質的に純粋であることはＴＬＣ
およびＨＰＬＣを用いて判定する。実施例■に示された
方法による試験の結果、内皮細胞の基礎増殖とＦＧＦ−
刺激増殖の両者に対してこのペプチドが完全な拮抗活性
を有するととが示される。

下記の式： ％式％ を有するＦＧＦ（３５−５０）−ＮＦ２の合成は、ベッ
クマン９９０ペプチド合成機とＭＥＨＡ樹脂を用いて、
実施例Ｉに記載された方法により逐次方式で実施する。

ペプチドが実質的に純粋であることはＴＬＣおよびＨｐ
　ｒ、　ｃを用いて判定する。実施例■に示された方法
による試験の結果、内皮細胞の基礎増殖とＦＧＦ−刺激
増殖の両者に対してこのペプチドが完全な拮抗活性を有
することが示される。

下記の式： Ｈ−Ｈｉ　５−Ｐｒ　ｏ−Ａｓ　ｐ−Ｇｌ　ｙ−Ａｒｇ
−Ｖａ　ｌ　−Ａｓ　ｐ−ＡＸ　ａ−Ｖａｌ−Ａｒｇ−
Ｇｌｒｂ−Ｌｙｓ−Ｔｈｒ−Ａｓｐ−Ｐｒｏ−Ｈ４ｓ　
−ＮＨ２ を有するＣＡＩ　ａ４２．　Ｔｈｒ”〕Ｆ　ＧＦ　（３
５５０）　−ＮＨｔの合成は、ベックマン９９０ペプチ
ド合成機とＭＢＨＡ樹脂を用いて、実施例■に記載され
た方法により逐次方式で実施する。ペプチドが実質的に
純粋であることはＴＬＣおよびＨＰＬＣを用いて判定す
る。実施例Ｈに示された方法による試験の結果、内皮細
胞の基礎増殖とＦＧＦ−刺激増殖の両者に対してこのペ
プチドが完全な拮抗活性を有することが示される。

下記の式： ％式％ を有するＦＧＦ（３６−３９）−ＮＨ２の合成は、ベッ
クマン９９０ペプチド合成機とＭ　Ｅ　ＩＩ　Ａ　＄１
脂を用いて、実施例Ｉに記載された方法により逐次方式
で実施する。ペプチドが実質的に純粋であることはＴＬ
ＣおよびＨＰＬＣを用いて判定する。実施例Ｈに示され
た方法による試験の結果、内皮細胞の基礎増殖とＦＧＦ
−刺激増殖の両者に対してこのペプチドが完全な拮抗活
性を有することが示され、細胞数はそれぞれ約３７％お
よび約５４％減少する。本ペプチドの生物学的有効性は
ＦＧＦ（２１−６８）より劣り、ＩＤ、。は約３０から
５０マイクロモルの間を示す。

下記の式： ％式％ を有するＦＧＦ（９３−１２０）−ＮＨ，、の合成は、
ベックマン９９０ペプチド合成機とＭＥＨＡ樹脂を用い
て、実施例Ｉに記載された方法により逐次方式で実施す
る。ペプチドが実質的に純粋であることはＴＬＣおよび
ＨＰＬＣを用いて判定する。実施例Ｈに示された方法に
よる試験の結果、内皮細胞の基礎増殖とＦＧＦ−刺激増
殖の両者に対してこのペプチドが完全な拮抗活性を有し
、かつＢＨＫ細胞とヘパリンに非常に強く結合すること
が示される。

下記の式： ％式％ を有するＦＧＦ（１，０７−１１０）−ＮＨ２の合成は
、ベックマン９９０ペプチド合成機とＭＢＨＡ樹脂を用
いて、実施例Ｉに記載された方法により逐次方式で実施
する。ペプチドが実質的に純粋であることはＴＬＣおよ
びＩＩ　Ｐ　Ｌ　Ｃを用いて判定する。実施例■に示さ
れた方法による試験の結果、内皮細胞の基礎増殖とＦＧ
Ｆ−刺激増殖の両者に対してこのペプチドが完全な拮抗
活性を有することが示される。

下記の式： ％式％ を有するＦＧＦ（１０６−１−１５）−ＮＨ２の合成は
、ベックマン９９０ペプチド合成機とＭ　Ｂ　ＩＩ　Ａ
樹脂を用いて、実施例Ｉに記載された方法により逐次方
式で実施する。ペプチドが実質的に純粋であることはＴ
ＬＣおよびＨＰＬＣを用いて判定する。実施例Ｈに示さ
れた方法による試験の結果、内皮細胞の基礎増殖とＦＧ
Ｆ−刺激増殖の両者に対してこのペプチドが完全な拮抗
活性を有し、かつＢＨＫ細胞とヘパリンに非常に強く結
合することが示される。

実施例罵 Ｃ３Ｈ（前掲）に記載された常法により、下記の式： ト ド 図 図 ｎｃｎ （５日） を有する合成ＦＧＦ−断片遺伝子を構成する。

こうしたＦＧＦ−断片をコードするＤＮＡ鎖は、オーバ
ーラツプした相補的配列をもつオリゴヌクレオチドをア
プライドバイオシステムズ自動合成装置で合成すること
により行なわれる。

オーバーラツプしたオリゴヌクレオチドを融合させて二
重鎖ＤＮＡを形成させ、ギャップをＤＮＡポリメラーゼ
およびＴ４リガーゼにより埋める。

センス（有意）鎖のＦＧＦ−断片をコードする配列の５
′側に隣接してＡＴＧ開始シグナルが備んられ、これに
より発現されたポリペプチドのＮ末端に外来メチオニン
が付加される。ＦＧＦ−断片をコードする配列の３′側
に隣接して停止シグナルがある。５′末端にはＥｃｏＲ
Ｔオーバーハングがあり、３′末端には下色（■オーバ
ーハングがあって、これにより合成りＮＡ鎖は、ビエイ
ラ（Ｖｉｅｉｒａ）らのＧ１１％１１１４、２５’Ｊ−
２６８（１９８２）に記載されているように、プラスミ
ドｐＵＣ８のＩＣ−（ｌ　Ｒｌおよびｐａ、Ｌ　Ｉ部位
に直接挿入可能である。ＤＮＡ鎖はｐＵｃ８プラスミド
内ヘアニールされる。ここではこれはＡＴＧ開始シグナ
ルおよびシャイン・ダルガルノ配列がそれらとプロモー
ターとの天然の配向および会合を保った状態で、β−ガ
ラクトシダーゼプロモーターの制御下に置かれる。

組換えベクター（ＦＧＦ（２４−６８）を指令）を塩化
カルシウム法によシ大腸菌のＤＨ−１株に形質転換する
（前記９亙！参照）。

形質転換した大腸菌をＬプロス中で培養しアンピシリン
耐性株を選択する。ＤＮＡ鎖はそのＤＮＡ鎖の蛋白質生
成物を発現すると予期できる配向でプラスミド中に挿入
されたので、アンピシリン耐性コロニーはＦＧＦに対し
て得られた抗血清との反応性でスクリーニングされる。

これらのコロニーはへルフマン（ＨｅαげｗａｆＬ）ら
（Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ。

Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　ＵＳ　Ａ　　８０．３ｌ−３５
（１９８３））の免疫学的方法によりスクリーニングさ
れ、ＦＧＦ抗体と陽性の反応を示すコロニーの特性をさ
らに調べる。細胞は、その培地から分離後、細胞溶解し
てその上清を得る。形質転換した細胞からの上清がＦＧ
Ｆに対して産生された抗体と反応することがＲＩＡによ
り判定される。

１００づの細胞上清を得て、これから上述したように意
図するＦＧＦ（２４−６８）断片を精製する。

総蛋白質に対して９８重量％捷で精製されたＦＧＦ約０
．０１ｒｎ９が得られる。

外来Ｎ末端メチオニン残基な含む合成ＦＧＦ断片の生物
活性を、Ｊ、　Ｃｅ１ｌ　Ｅｉｏｌ、　９７．１６７７
−１６８５（１９８３）に記載されているものと同様の
アッセイを用い、培養した成牛大動脈弓内皮細胞の増殖
を阻害する能力に関した生物活性について試験する。要
約すると細胞（３−１０継代）を２Ｘ１０３個／皿の密
度でプラスチック培養皿に接種し、１０％子牛血清を補
充したダルベツコの改良イーグル培地（ＤＭＥＭ）で培
養する。被験試料を１０−１〜１０−３の希釈度で０日
目および２日目に皿に添加する。４日目に各３枚の皿を
トリプシン処理し、クールター計数器で計数する。バッ
クグラウンド水準は通常は細胞１０５個／皿であるが、
特定の種々の濃度のＦＧＦ拮抗物質を与えられたものは
細胞１０４個／皿程度である。効力検定のために対数応
答曲線を作成する。この目的のために、０５％ウシ血清
アルブミン（ＢＳＡ）／ＤＭＥＭ中に希釈した原液希釈
液（１０１〜１０５）の１０μｔアリコートを添加した
（３重試験）。

余分なＮ末端残基は臭化シアンまたはイソチオシアン酸
フェニルで部分消化したのち無水の強酸（例えばトリフ
ルオロ酢酸）で処理することにより除去できる。とうし
た臭化シアン処理を実施した後においても引き続いて、
ＦＧＦ断片は皿あたりの細胞総数を実質的に減少させる
。

実施例ＸＸ 実施例Ｘ■のＦＧＦ断片産生大腸菌クローンの１種にお
いて増幅されたプラスミドを単離し、ｐｃ−。

ＲＩおよびＳａｌ　Ｉによって切断する。この消化され
たプラスミドをアガロースゲル上で電気泳動し、増幅さ
れたＦＧＦ断片挿入体を分離および回収する。この挿入
体をプラスミドｐＹＥｐに挿入する。

これは大腸菌およびビール酵母菌（Ｓａｃｃｈａｒｏｍ
−ｙｃｇｓ　ｃｅｒｅｖｉｓｉａｇ　）の両者を形質転
換するために使用できるシャトルベクターである。合成
りＮＡ鎖をここに挿入することによりＡＴＧシグナルか
らの適正な読み枠内において、キャップ部位に対し適正
な間隔を保った状態でこのＤＮＡ配列が確実にプロモー
ターの制御下に置かれる。このシャトルベクターを用い
てＵＲＡ３を形質転換する。

Ｕ　ＲＡ、　３はオラテートモノホスフエートデ力ルポ
キシラーゼ遺伝子が欠失したビール酵母菌の一菌株であ
る。

この形質転換した酵母を培地中で増殖させ対数増殖に到
達させる。酵母をその培地から分離し、細胞溶解物を調
製する。プールした細胞溶解物は、ＦＧＦに対して産生
された抗体と反応することがＲＩＡにより判定された。

これはＦＧＦペプチドセグメントを含むペプチドが酵母
細胞内に発現されたことを証明する。

本発明は塩基性ＦＧＦと酸性ＦＧＦの両者に対して（両
者ともに同一受容体に作用することが示されているので
）生物活性のある拮抗物質となるポリペプチドを提供し
、生物学的用途および治療用として利用できるものであ
る。長いＦＧＦ断片の調製は原核細胞系および真核細胞
系の双方において行うことができる。こうした合成は細
菌捷たは酵母のいずれかの細胞系を用いて容易に証明さ
れるが、合成遺伝子は高等動物の細胞、たとえば哺乳動
物腫瘍細胞において発現させるために挿入可能でなけれ
ばたちない。この種の哺乳動物細胞は、例えば宿主動物
における腹腔内腫瘍として増殖させ、ＦＧＦ断片を腹腔
内液から採取することができる。短いＦＧＦ断片は、固
相合成または他のカップリング形式の合成によって簡便
に作ることができる。

上記の各実施例はＦＧＦ断片をＤＮＡ組換え法により合
成できることを証明しているが、これらの例は最高の産
生を示すことを意味するものではない。今後、より有効
なりローニングベクターおよび宿主細胞系を選択するこ
とによってＦＧＦの収率が高まると期待される。真核細
胞および原核細胞の双方について既知の遺伝子増幅法を
採用して産生な高めることができる。宿主細胞系から培
地中への遺伝子をコードするポリペプチドの分泌も、合
成ＦＧＦ断片を大量に得る際に重要な１つの要素である
と考えられる。

脳および下垂体由来の塩基性ＦＧＦ製剤は、前に述べた
ように、−次および二次間充織ならびに神経外胚葉に由
来する組織から得た多種類の正常２倍体培養細胞に対し
て細胞増殖促進作用を示す。

これらにはウサギ軟骨細胞、ウシ顆粒膜細胞および副腎
皮質細胞、ウシ角膜内皮細胞、ウシ副腎皮質細胞由来の
毛細管内皮細胞およびヒ目贋帯内皮細胞が含捷れる。

ＦＧＦ拮抗物質は、培養細胞系のインビトロの増殖を調
節するのに有用な生物学的材料であり、かつ局所的に投
与した場合インビボでも同様に機能すると予想される。

従ってＦＧＦ拮抗物質は、糖尿病性網膜症のような目の
血管増殖性疾患、糸球体腎炎のような腎臓の増殖性疾患
、軟骨肉腫のようなある種の腫瘍、および副腎血管新生
の治療のために有効に適用しうる。

合成ＦＧＦ拮抗物質捷たはその無毒性塩類は、薬剤組成
物を形成する薬剤学的に許容されるキャリヤーとあわせ
てヒトを含む哺乳動物に静脈内、皮下、筋肉内または経
口的に投与できる。必要量は治療すべき個々の症状、そ
の症状の程度、および意図する治療期間に応じて異なる
であろう。

この種のペプチドはしばしば、薬剤学的に許容される無
毒性塩類、たとえば酸付加塩または亜鉛、鉄などとの金
属錯体（これらはこの適用目的のためには塩類であると
みなされる）の形で投与される。この種の酸付加塩の具
体例は、塩酸塩、臭化水素酸塩、硫酸塩、リン酸塩、マ
レイン酸塩、酢酸塩、クエン酸塩、安息香酸塩、コハク
酸塩、リンゴ酸塩、アスコルビン酸塩、酒石酸塩などで
ある。有効成分を錠剤の形で投与したい場合、錠剤は結
合剤、例えばトラガカント、コーンスターチまたはゼラ
チン；崩壊剤、例えばアルギニン酸；ならびに滑沢剤、
例えばステアリン酸マグネシウムを含有しつる。液状で
の投与が望捷しい場合は、甘味剤および／または香味剤
を使用することができ、等張の食塩液中、リン酸塩緩衝
液中などにおいて静脈内投与することができる。

これらのペプチドは医師の指導のもとに投与すべきであ
り、薬剤組成物は通常一般の薬剤学的に許容されるキャ
リヤーと組合わせてこれらのペプチドを含有するであろ
う。

本発明は、現在本発明者らが知る最良の形態をなす好ま
しい実施態様について記述してきだが、肖分野で通常の
知識を有する者に明らかな種々の変更および修飾が特許
請求の範囲に記載する本発明の範囲から逸脱することな
くされうろことを理解すべきである。ＦＧＦ拮抗物質ペ
プチドをＦＧＦ半アゴニストに変えることのない延長は
、延長がＦＧＦ拮抗物質としてのペプチドの生物活性を
著しく減少させない限り、片方才たは双方の末端に付加
でき、かつとの種のポリペプチドは開示されたものと等
しいと見なされる。例えば、Ｔｙｒ残基は個々の拮抗物
質の生物活性に実質的に影響することなく、合成ＦＧＦ
拮抗物質のどちらの末端にも付加できる。とれらのペプ
チドの機能は第一に結合であるので、最も重要なものは
配列であり、Ｃ末端は遊離酸、アミドまたは何らかの同
等な部分であυ得る。

本発明の特徴は先の特許請求の範囲に力説されるもので
ある。

（６日）

Claims (20)

【特許請求の範囲】
1. （１）ＦＧＦ拮抗物質として機能するか、ヘパリンと結
   合するか或いはＦＧＦ受容体と結合する下記の式： （ I ）【アミノ酸配列があります】 （式中、ＹはＯＨまたはＮＨ＿２であり、Ｒ＿４＿２は
   Ｇｌｙ、ＡｌａまたはＳａｒであり、そしてＲ＿４＿７
   はＳｅｒ、ＡｌａまたはＴｈｒである）または（II）【
   アミノ酸配列があります】 を有するペプチド、または上記いずれかのペプチドの生
   物学的に活性な断片。
2. （２）下記の式： 【アミノ酸配列があります】 （式中、ＹはＯＨまたはＮＨ＿２であり、Ｒ＿４＿２は
   Ｇｌｙ、ＡｌａまたはＳａｒであり、そしてＲ＿４＿７
   はＳｅｒ、ＡｌａまたはＴｈｒである） を有する特許請求の範囲第１項記載のペプチド。
3. （３）Ｎ末端から数えて１個〜１２個の残基が欠損する
   特許請求の範囲第２項記載のペプチド。
4. （４）Ｃ末端から数えて１個〜２９個の残基が欠損する
   特許請求の範囲第２項記載のペプチド。
5. （５）Ｃ末端から数えて１個〜２９個の残基が欠損する
   特許請求の範囲第３項記載のペプチド。
6. （６）Ｒ＿４＿２がＧｌｙである特許請求の範囲第２項
   記載のペプチド。
7. （７）Ｒ＿４＿７がＳｅｒである特許請求の範囲第６項
   記載のペプチド。
8. （８）Ｃ末端から数えて１９残基が欠損しており、Ｒ＿
   ４＿２がＧｌｙであり、そしてＲ＿４＿７がＳｅｒであ
   る特許請求の範囲第５項記載のペプチド。
9. （９）Ｎ末端から数えて１個〜１２個の残基が欠損し、
   かつＲ＿４＿２がＡｌａである特許請求の範囲第２項記
   載のペプチド。
10. （１０）Ｃ末端から数えて１個〜２９個の残基が欠損し
    、かつＲ＿４＿２がＡｌａである特許請求の範囲第２項
    記載のペプチド。
11. （１１）Ｃ末端から数えて１個〜２９個の残基が欠損し
    、かつＲ＿４＿７がＴｈｒである特許請求の範囲第９項
    記載のペプチド。
12. （１２）Ｒ＿４＿２がＳａｒである特許請求の範囲第２
    項記載のペプチド。
13. （１３）Ｒ＿４＿７がＡｌａである特許請求の範囲第１
    ２項記載のペプチド。
14. （１４）下記の式： 【アミノ酸配列があります】 を有する特許請求の範囲第１項記載のペプチド。
15. （１５）下記の式： Ｔｙｒ−Ａｒｇ−Ｓｅｒ−Ａｒｇ−Ｌｙｓ−Ｔｙｒ−Ｓ
    ｅｒ−Ｓｅｒ−Ｔｒｐ−Ｔｙｒ−ＮＨ＿２ を有する特許請求の範囲第１項記載のペプチド。
16. （１６）ＦＧＦ拮抗物質として機能するか、ヘパリンと
    結合するか或いはＦＧＦ受容体と結合する下記の式： （ I ）【アミノ酸配列があります】 （式中、Ｒ＿４＿２はＧｌｙ、ＡｌａまたはＳａｒであ
    り、Ｒ＿４＿７はＳｅｒ、ＡｌａまたはＴｈｒである）
    または（II）【アミノ酸配列があります】 を含むポリペプチド、または上記いずれかのペプチドの
    生物学的に活性な断片をコードするＤＮＡ鎖を得て、 このＤＮＡ鎖を、上記のコードされたポリペプチドの発
    現を促進するＤＮＡ配列に対し適正な関係となるように
    クローニングベクターに挿入し、生物または細胞系を上
    記のＤＮＡ鎖が挿入されたクローニングベクターで形質
    転換し、 形質転換された生物または細胞系を培養し、そして これにより産生されるＦＧＦポリペプチドを得ることよ
    りなる、ＦＧＦ拮抗物質の製法。
17. （１７）生物が原核生物である、特許請求の範囲第１６
    項記載の方法。
18. （１８）生物または細胞系が真核生物である、特許請求
    の範囲第１６項記載の方法。
19. （１９）生物が大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）の菌株である、
    特許請求の範囲第１６項記載の方法。
20. （２０）生物がビール酵母（Ｓ．Ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ
    ）の菌株である、特許請求の範囲第１６項記載の方法。