CN1260250C - 胸腺五肽的制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种胸腺五肽的制备方法。本发明以Wang树脂做为固相载体与芴甲氧羰基保护的酪氨酸反应，生成酪氨酸树脂，以此做为起始原料，然后依次与芴甲氧羰基(Fmoc)保护的氨基酸缩合反应，生成保护TP-5树脂后，用三氟醋酸裂解的方法将侧链保护基和TP-5同时从树脂上切下来，得到TP-5粗品。本发明的方法条件比较温和，去保护的方法简单易行，缩合过程中没有付产物DCU沉淀产生，便于将树脂洗涤干净，提高缩合产率，减少了杂质混入，以利于产品的纯化；本发明在保质保量得到目的物的基础上，无论从工艺的简化上、工序的节省上、操作的简化上都体现了它的优越性。

Description

胸腺五肽的制备方法

技术领域

本发明涉及多肽类药物的制备方法，具体地说涉及胸腺五肽(Thymopentin)的制备方法。

背景技术

胸腺是一个内分泌器官，胸腺上皮细胞合成和分泌一系列多肽激素，这些激素对T淋巴细胞的分化和成熟起着调控作用。从胸腺激素中已经分离出多种单一的多肽化合物，如由49个氨基酸组成的胸腺生成素II(ThymopoitinII)，其它有胸腺素α₁(Thymsinα₁)、血清胸腺因子(FTS)、胸腺体液因子(TMF)等，其中对胸腺生成素II的研究最多。Goldstein G等报道的分离胸腺生成素(Thymopoitin)是出于他们对重症肌无力这种疾病的兴趣，他们发现有生物活性的多肽在体外也能诱导骨髓细胞分化成为成熟的T细胞，因此推测它是一个具有重要生理作用的制剂。Finginino等已化学合成了胸腺生成素II的整个49肽链，其生物活性与提取的胸腺生成素II相似，此外，胸腺生成素II第32-36氨基酸残基(精—赖—天冬—缬—酪)，已经合成，被命名为胸腺五肽(简称Thymopetnin TP-5，下同)。这段只占其母体分子长度10％的片段仍保留了胸腺生成素的主要活力。TP-5通过促进或抑制的双向调节作用使免疫能力趋于正常，是一种很有发展前景的免疫功能调节药物。而且迄今为止的实验药理学研究和临床药理学研究以及临床应用均未发现TP-5有任何毒付作用。TP-5于1985年在意大利上市，商品名为Timunox，在美国也有数家药厂正在研究开发。上海丽珠制药有限公司也有相同的产品TP-5。

据有关资料报道，传统的胸腺五肽的制备方法采用固相法，该方法利用Merrifield树脂和叔丁氧羰基保护的酪氨酸反应生成酪氨酸树脂，以此为起始原料，依次将保护缬氨酸、保护天冬氨酸、保护赖氨酸、保护精氨酸起缩合反应，生成保护TP-5树脂，再与液态氟化氢反应，使TP-5从树脂上脱下。抽去氟化氢，用稀乙酸抽提，抽提物冷冻干燥后得粗品，再经HPLC法精制后得精品从而得到TP-5原料药。所述方法采用了比较传统和经典的固相合成方法，工艺成熟、稳定。但是存在明显的缺陷：

此方法采用的固相载体是Merrifield树脂，合成保护TP-5树脂后，将肽从树脂上切下来所要求的条件比较苛刻，该方法采用了HF裂解方式，必须拥有一台HF气体发生装置才能实现裂解，对于大量的肽树脂只能分次裂解，生产规模受到限制。另外，HF是一种强腐蚀性的气体，一旦泄漏会对人造成极大的伤害。再者，此合成方法将TP-5从树脂上裂解下来后，抽去HF用稀乙酸抽提，抽提物经冷冻干燥后得粗品TP-5，生产周期长，成本高。

文献：Int.J.Peptide Protein Res.28，1986，22-28介绍了另一种合成胸腺五肽的固相合成方法。Glycolamide ester group as labile linkage in solidphase peptide synthesis use with Fmoc-protected amino acids。文献详细介绍了TP-5的另一种固相合成方法，它的特点如下：1.这种方法采用的固相载体溴乙酰胺树脂是由N-acrylypyrrolidine，ethylene bisacrylamide和N-acrylyl-β-alanine methyl ester在特定条件下形成的共聚物与溴乙酸反应合成的。以这种树脂为载体合成TP-5能防止消旋现象的发生，但这种树脂不是常规树脂，很难获得，价格比较贵，适合用做合成方法的研究用，但对于既考虑成本又要利润的企业大生产来说是不适用的。2.这种方法选择了用芴甲氧羰基(Fmoc)作为α氨基保护基。Fmoc对酸很稳定，但可在碱性条件下很容易地脱去，方法简便易行，省时高效。3.文献介绍的方法中，在保护TP-5树脂合成以后，得到TP-5粗品之前，采用了TFA先去侧链后再用皂化的方法将TP-5从树脂上切落的2个步骤，工艺比较复杂，工艺周期长，这和此方法采用了特定的树脂所决定的。而且皂化后的酸化导致NaCl作为杂质带入粗品中，给粗品的精制带来麻烦。

发明内容

本发明需要解决的技术问题是提供一种胸腺五肽的制备方法，以克服现有技术存在的上述缺陷。

本发明的技术构思是这样的：

本发明以4-羟基甲基苯氧甲基聚苯乙烯树脂(简称Wang树脂，下同)做为固相载体与芴甲氧羰基保护的酪氨酸反应，生成酪氨酸树脂，以此做为起始原料，然后依次与芴甲氧羰基(Fmoc)保护的缬氨酸、天门冬氨酸、赖氨酸、叔丁氧羰基精氨酸起缩合反应，生成保护TP-5树脂后，用三氟醋酸裂解的方法将侧链保护基和TP-5同时从树脂上切下来，酸解液用无水乙醚处理将TP-5沉淀出来从而得到TP-5粗品，经高效液相色谱(HPLC)精制得到TP-5精品。

本发明的方法包括如下步骤：

(1)芴甲氧羰基酪氨酸(叔丁基)树脂(Fmoc-Tyr(tBu)-Wang resin)的制备：

将芴甲氧羰基酪氨酸(叔丁基)(Fmoc-Tyr(tBu)-OH)、N，N二甲基甲酰胺(DMF)、1-羟基苯骈三唑(HOBT)和4-二甲氨基吡啶(DMAP)的混合溶液，加入到Wang树脂中，然后将二异丙基碳二亚胺/N，N二甲基甲酰胺(DIC/DMF)溶液加到树脂中，用碱性物质调pH为5-7，在10℃～40℃的条件下反应6-48小时，用二氯甲烷、乙醇或DMFD类有机溶剂进行洗涤，即获得Fmoc-Tyr(tBu)-Wang resin；

所述及的Wang树脂的化学结构为：

可采用市售产品，如可采用天津南开和成科技公司生产的规格为：Subst.1.1mmol/g，DV：1％～2％，Mesh：100～200的Wang树脂。

所述及的碱性物质是吡啶；

按照本发明优选的技术方案，所说的混合溶液中Fmoc-Tyr(tBu)-OH与DMF、HOBT和DMAP的摩尔比为：

Fmoc-Tyr(tBu)-OH∶HOBT∶DMAP＝7～3∶7～3∶1，优选的为5∶5∶1；

Wang树脂∶Fmoc-Tyr(tBu)-OH∶HOBT∶DMAP

＝1∶7～3∶7～3∶1，摩尔比；优选的为1∶5∶5∶1

DIC/DMF与Wang树脂的摩尔比为：7～3∶1，优选的为5∶1；

(2)固相接肽：

以步骤(1)的Fmoc-Tyr(tBu)-Wang resin为起始原料，用保护氨基酸依次接二肽、三肽、四肽和五肽，保护氨基酸的用量为起始原料1～5倍。

按照本发明的优选的技术方案，接二肽、三肽、四肽和五肽的方法包括如下步骤：

接二肽：用重量浓度为5～60％(v/v)的六氢吡啶/DMF与Fmoc-Tyr(tBu)-Wang resin在5-40℃的条件下反应5-60分钟，去除Fmoc保护基，用二氯甲烷、乙醇或DMF类有机溶剂洗涤至中性，获得去除了Fmoc保护基的树脂；

将Fmoc-Val-OH、HOBT用DMF溶解后加入到上述的去除了Fmoc保护基的树脂中，再加入DIC/DMF，25-30℃反应6-24小时，收集反应产物，即为接二肽后的产物；

Fmoc-Val-OH∶HOBT＝1∶1；

DIC/DMF的浓度为1Mm/M1，与去除了Fmoc保护的摩尔数之比为7～3∶1，优选的为5∶1；

采用上述相同的方法依次接三肽、四肽和五肽，获得保护五肽树脂，即TP-5树脂。

(3)酸解：

采用常规的方法进行酸解，如可将干燥保护的TP-5树脂称重，将三氟醋酸(TFA)和苯酚依次加入树脂中在10-40℃的条件下酸解1-5小时，这样将侧链脱去的同时TP-5也从树脂上切落下来；收集酸解液中的反应产物，即为TP-5粗品。

TFA∶苯酚＝25～15∶1，体积比；

本发明的有益效果：

本发明用Wang树脂为固相载体，所述树脂是酸不稳定树脂，所以将肽从树脂上切落的条件比较温和，用TFA就可以达到即脱去侧链又将TP-5从树脂上切落的目的，起到了事半功倍的作用；

合成多肽所用的氨基酸的氨基采用了Fmoc保护，去保护的方法简单易行；

采用的缩合剂二异丙基碳二亚胺(DIC)在缩合过程中没有付产物N-N’-二环己基尿(DCU)沉淀产生，这样便于将树脂洗涤干净，提高缩合产率，减少了杂质混入，以利于产品的纯化；

本方案采用无水乙醚将TP-5从酸解液中沉淀出来，简便快捷地得到TP-5粗品粉末；

综上所述，本方案在保质保量得到目的物的基础上，无论从工艺的简化上、工序的节省上、操作的简化上都体现了它的优越性。

                         实施例1

以10Mm Wang树脂为原料。

Fmoc-Tyr(tBu)-Wang resin制备：

取一干燥的250ml茄形瓶将树脂加入其中，树脂用CH₂Cl₂浸泡半小时后，用CH₂Cl₂洗3次，抽干；

称取22.98g的Fmoc-Tyr(tBu)-OH，用DMF溶解后加入7.65gHOBT，待全溶后再入1.22g DMAAP，溶解后全部加入到树脂中；

向树脂中加入50ml DIC/DMF(1mM/ml)后，用吡啶调pH＝6.5，密封后30℃反应24小时；

反应结束后用CH₂Cl₂、EtOH、DMF洗涤树脂，各洗3次；

固相接肽：

接二肽：Fmoc-Val-Tyr(tBu)-Wang resin；

称取10mMFmoc-Tyr(tBu)-P置250ml茄形瓶中，浸泡、以CH₂Cl₂洗3次，抽干；

去保护：将25％六氢吡啶/DMF80ml加入树脂中，30℃20分钟。

洗涤：CH₂Cl₂ DMF CH₂Cl₂各3次至中性、抽干。

接肽：Fmoc-Val-OH        10.18g

      HOBT               4.59g

      DIC/DMF(1Mm/ml)    30ml

用40mlDMF将Fmoc-Val-OH、HOBT溶解后加入树脂中后，将DIC/DMF加入树脂中，30℃反应过夜。次日，抽干溶剂，洗涤，CH₂Cl₂EtOH DMF CH₂Cl₂ DMF各3次。检测游离氨基，呈阴性后方可进入下一步；

接三肽：Fmoc-Asp(otBu)-Val-Tyr(tBu)-Wang resin

去保护、洗涤方法同接二肽；

接肽：Fmoc-Asp(otBu)-OH    12.33g

      HOBT                 4.95g

      DIC/DMF              30ml

方法同接二肽；

接四肽：Fmoc-Lys(Boc)-Asp(otBu)-Val-Tyr(tBu)-Wang resin

去保护、洗涤方法同接二肽；

接肽：Fmoc-Lys(Boc)-OH    14.06g

      HOBT                4.95g

      DIC/DMF             30ml

方法同接二肽；

接五肽：Boc-Arg-HCl-Lys(Boc)-Asp(otBu)-Val-Tyr(tBu)-Wang resin

去保护、洗涤方法同接二肽；

接肽：Boc-Arg-OH-HCl    9.87g

      HOBT              4.95g

      DIC/DMF           30ml

方法同接二肽

将保护TP-5树脂按常规洗涤后，用乙醇、甲醇各洗两次抽干。P₂O₅干燥器干燥。

酸解：

在称重的上述树脂中加入一定量的TFA和苯酚、30℃条件下反应3小时。TFA和苯酚的总体积数是保护TP-5树脂重量的10倍，其中，TFA为95％、苯酚为5％，得到TP-5粗品；

将酸解液滤出，树脂用CH₂Cl₂洗3次，洗涤液与酸解液合并后浓缩，在浓缩液中加入无水乙醚，TP-5立即沉淀，用无水乙醚洗沉淀2次，抽干得白色粉末即为TP-5粗品。

Claims (7)

1.一种胸腺五肽的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：

(1)将Fmoc-Tyr(tBu)-OH、DMF、HOBT和DMAP的混合溶液，加入到Wang树脂中，然后将DI/DMF溶液加到树脂中，用碱性物质调pH为5-7，反应，获得Fmoc-Tyr(tBu)-Wang resin；

(2)固相接肽：

以步骤(1)的Fmoc-Tyr(tBu)-Wang resin为起始原料，用保护氨基酸依次接二肽、三肽、四肽和五肽；

(3)采用常规的方法进行酸解，收集酸解液中的反应产物，即为TP-5粗品。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(1)在10℃～40℃的条件下反应时间6-48小时。

3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述及的碱性物质是吡啶。

4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述及的DIC/DMF溶液的浓度为1mM/ml。

5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所说的混合溶液中Fmoc-Tyr(tBu)-OH与HOBT和DMAP的摩尔比为：

Fmoc-Tyr(tBu)-OH∶HOBT∶DMAP＝7～3∶7～3∶1；

Wang树脂∶Fmoc-Tyr(tBu)-OH∶HOBT∶DMAP

＝1∶7～3∶7～3∶1，摩尔比。

6.根据权利要求1～5任一项所述的方法，其特征在于，接二肽、三肽、四肽和五肽的方法包括如下步骤：

接二肽：用六氢吡啶/DMF溶液与Fmoc-Tyr(tBu)-Wang resin反应，洗涤至中性，获得去除了Fmoc保护基的树脂；

将Fmoc-Val-OH、HOBT用DMF溶解后加入到上述的去除了Fmoc保护基的树脂中，再加入DIC/DMF反应，收集反应产物，即为接二肽后的产物；

采用上述相同的方法依次接三肽、四肽和五肽，获得保护的TP-5树脂。

7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于保护氨基酸的用量为起始原料1-5倍。