发明内容
本发明需要解决的技术问题是公开一种固相多肽合成特利加压素的制备方法,以克服现有技术存在的上述缺陷。
本发明的方法包括如下步骤:
以Rink Amide树脂为起始原料,以Fmoc保护的氨基酸为单体,以TBTU或HBTU/HOBt为缩合剂,依次逐个接上氨基酸,最后一个肽链采用Boc-Gly-OH;
然后加入切肽试剂进行切肽,加入乙醚沉淀,获得还原型粗品;
加入碱性物质,在pH为7.5-10.0的条件下通空气氧化,获得氧化型粗品;
最后采用C18柱进行分离纯化,获得目标产物。
按照本发明优选的方案:
以Rink Amide树脂,包括Rink Amide MBHA树脂或Rink AmideAM树脂为起始原料,以Fmoc保护的氨基酸为单体,以TBTU或HBTU/HOBt为缩合剂,依次逐个接上氨基酸,最后一个肽链采用Boc-Gly-OH的方法包括如下步骤:
(1)Rink Amide树脂的预处理:
将Rink Amide树脂(0.93mmol/g)用DMF浸泡,使树脂充分溶胀,氮气吹干,加入六氢吡啶的DMF溶液,20~30℃反应10~60分钟,氮气吹去六氢吡啶,分别用DMF、甲醇、DMF洗涤,氮气吹干,获得(A);
六氢吡啶的DMF溶液的重量浓度为10~50%;
六氢吡啶的DMF溶液中,Rink Amide树脂的重量浓度为5~20%;
(2)Fmoc-Gly-树脂的制备:
将步骤(1)的(A)加入Fmoc-Gly-OH(MW:297.3)、TBTU或HBTU(MW:321)、HOBT(MW:153.1)、NMM(MW=101.2)和DMF,20~30℃接肽反应0.5~1.5小时,氮气吹干,分别用DMF、甲醇、DMF洗涤,氮气吹干;获得Fmoc-Gly-树脂;
NMM和DMF的体积比为:NMM∶DMF=1∶5~15;
NMM和DMF中,(A)的重量体积浓度为5~15ml/g,Fmoc-Gly-OH的摩尔数为树脂的2~6倍;TBTU或HBTU的摩尔数为树脂的2~6倍;,HOBT的摩尔数为树脂的2~6倍;NMM的摩尔数为树脂的4~12倍;
(3)Fmoc-Lys(Boc)-Gly-树脂的制备:
将步骤(2)的Fmoc-Gly-树脂加入六氢吡啶的DMF溶液,20~30℃脱帽反应10~60分钟,氮气吹干,分别用DMF、甲醇、DMF洗涤,氮气吹干,
加入Fmoc-Lys(Boc)-OH(MW:468.5)、TBTU或HBTU、HOBT、NMM和DMF,20~30℃接肽反应0.5~1.5小时,氮气吹干,分别用DMF、甲醇、DMF洗涤,氮气吹干;获得Fmoc-Lys(Boc)-Gly-树脂;
NMM和DMF的体积比为:NMM∶DMF=1∶5~15;
NMM和DMF中,Fmoc-Lys(Boc)-OH的摩尔数为树脂的2~6倍;TBTU或HBTU的摩尔数为树脂的2~6倍;,HOBT的摩尔数为树脂的2~6倍;NMM的摩尔数为树脂的4~12倍;
六氢吡啶的DMF溶液的重量浓度为15~25%;
六氢吡啶的DMF溶液中,步骤(2)的Fmoc-Gly-树脂的重量体积浓度为5~15ml/g;
(4)Fmoc-Por-Lys(Boc)-Gly-树脂的制备:
将步骤(3)的Fmoc-Lys(Boc)-Gly-树脂加入六氢吡啶的DMF溶液,20~30℃脱帽反应10~60分钟,氮气吹干,分别用DMF、甲醇、DMF洗涤,氮气吹干;
加入Fmoc-Por-OH(MW:337.4)、TBTU或HBTU、HOBT、NMM和DMF,20~30℃接肽反应0.5~1.5小时,氮气吹干,分别用DMF、甲醇、DMF洗涤,氮气吹干;获得Fmoc-Por-Lys(Boc)-Gly-树脂;
NMM和DMF的体积比为:NMM∶DMF=1∶5~15;
NMM和DMF中,步骤(3)的Fmoc-Lys(Boc)-Gly-树脂的重量体积浓度为5~15ml/g,Fmoc-Por-OH的摩尔数为树脂的2~6倍;TBTU或HBTU的摩尔数为树脂的2~6倍;,HOBT的摩尔数为树脂的2~6倍;NMM的摩尔数为树脂的4~12倍;
六氢吡啶的DMF溶液的重量浓度为15~25%;
六氢吡啶的DMF溶液中,Fmoc-Lys(Boc)-Gly-树脂的重量体积浓度为5~15ml/g;
(5)Fmoc-Cys(Trt)-Por-Lys(Boc)-Gly-树脂的制备:
将步骤(4)的Fmoc-Por-Lys(Boc)-Gly-树脂加入六氢吡啶的DMF溶液,20~30℃脱帽反应10~60分钟,氮气吹干,分别用DMF、甲醇、DMF洗涤,氮气吹干;
加入Fmoc-Cys(Trt)-OH(MW:585.7)、TBTU或HBTU、HOBT、NMM和DMF,20~30℃接肽反应0.5~1.5小时,氮气吹干,分别用DMF、甲醇、DMF洗涤,氮气吹干;获得Fmoc-Cys(Trt)-Por-Lys(Boc)-Gly-树脂;
NMM和DMF的体积比为:NMM∶DMF=1∶5~15;
NMM和DMF中,步骤(4)的Fmoc-Por-Lys(Boc)-Gly-树脂的重量体积浓度为5~15ml/g,Fmoc-Cys(Trt)-OH的摩尔数为树脂的2~6倍;TBTU或HBTU的摩尔数为树脂的2~6倍;,HOBT的摩尔数为树脂的2~6倍;NMM的摩尔数为树脂的4~12倍;
六氢吡啶的DMF溶液的重量浓度为15~25%;
六氢吡啶的DMF溶液中,Fmoc-Por-Lys(Boc)-Gly-树脂的重量体积浓度为5~15ml/g;
(6)Fmoc-Asn(Trt)-Cys(Trt)-Por-Lys(Boc)-Gly-树脂的制备:
将步骤(5)的Fmoc-Cys(Trt)-Por-Lys(Boc)-Gly-树脂加入六氢吡啶的DMF溶液,20~30℃脱帽反应10~60分钟,氮气吹干,分别用DMF、甲醇、DMF洗涤,氮气吹干,
加入Fmoc-Asn(Trt)-OH(MW:596.7)、TBTU或HBTU、HOBT、NMM和DMF,20~30℃接肽反应0.5~1.5小时,氮气吹干,分别用DMF、甲醇、DMF洗涤,氮气吹干;获得Fmoc-Asn(Trt)-Cys(Trt)-Por-Lys(Boc)-Gly-树脂;
NMM和DMF的体积比为:NMM∶DMF=1∶5~15;
NMM和DMF中,步骤(5)的树脂的重量体积浓度为5~15ml/g,Fmoc-Asn(Trt)-OH的摩尔数为树脂的2~6倍;TBTU或HBTU的摩尔数为树脂的2~6倍;,HOBT的摩尔数为树脂的2~6倍;NMM的摩尔数为树脂的4~12倍;
六氢吡啶的DMF溶液的重量浓度为15~25%;
六氢吡啶的DMF溶液中,Fmoc-Cys(Trt)-Por-Lys(Boc)-Gly-树脂的重量体积浓度为5~15ml/g;
(7)Fmoc-Gln(Trt)-Asn(Trt)-Cys(Trt)-Por-Lys(Boc)-Gly-树脂的制备:
将步骤(6)的Fmoc-Asn(Trt)-Cys(Trt)-Por-Lys(Boc)-Gly-树脂加入六氢吡啶的DMF溶液,20~30℃脱帽反应10~60分钟,氮气吹干,分别用DMF、甲醇、DMF洗涤,氮气吹干。
加入Fmoc-Gln(Trt)-OH(MW:610.7)、TBTU或HBTU、HOBT、NMM和DMF,20~30℃接肽反应0.5~1.5小时,氮气吹干,分别用DMF、甲醇、DMF洗涤,氮气吹干;获得Fmoc-Gln(Trt)-Asn(Trt)-Cys(Trt)-Por-Lys(Boc)-Gly-树脂;
NMM和DMF的体积比为:NMM∶DMF=1∶5~15;
NMM和DMF中,步骤(6)的树脂的重量体积浓度为5~15ml/g,Fmoc-Gln(Trt)-OH的摩尔数为树脂的2~6倍;TBTU或HBTU的摩尔数为树脂的2~6倍;,HOBT的摩尔数为树脂的2~6倍;NMM的摩尔数为树脂的4~12倍;
六氢吡啶的DMF溶液的重量浓度为15~25%;
六氢吡啶的DMF溶液中Fmoc-Asn(Trt)-Cys(Trt)-Por-Lys(Boc)-Gly-树脂的重量体积浓度为5~15ml/g;
(8)Fmoc-Phe-Gln(Trt)-Asn(Trt)-Cys(Trt)-Por-Lys(Boc)-Gly-树脂的制备:
将步骤(7)的Fmoc-Gln(Trt)-Asn(Trt)-Cys(Trt)-Por-Lys(Boc)-Gly-树脂加入六氢吡啶的DMF溶液,20~30℃脱帽反应10~60分钟,氮气吹干,分别用DMF、甲醇、DMF洗涤,氮气吹干。
加入Fmoc-Phe-OH(FW:387.4)、TBTU或HBTU、HOBT、NMM和DMF,20~30℃接肽反应0.5~1.5小时,氮气吹干,分别用DMF、甲醇、DMF洗涤,氮气吹干;获得Fmoc-Phe-Gln(Trt)-Asn(Trt)-Cys(Trt)-Por-Lys(Boc)-Gly-树脂;
NMM和DMF的体积比为:NMM∶DMF=1∶5~15;
NMM和DMF中,步骤(7)的树脂的重量体积浓度为5~15ml/g,Fmoc-Phe-OH的摩尔数为树脂的2~6倍;TBTU或HBTU的摩尔数为树脂的2~6倍;,HOBT的摩尔数为树脂的2~6倍;NMM的摩尔数为树脂的4~12倍;
六氢吡啶的DMF溶液的重量浓度为15~25%;
六氢吡啶的DMF溶液中Fmoc-Gln(Trt)-Asn(Trt)-Cys(Trt)-Por-Lys(Boc)-Gly-树脂的重量体积浓度为5~15ml/g;
(9)Fmoc-Tyr(tBu)-Phe-Gln(Trt)-Asn(Trt)-Cys(Trt)-Por-Lys(Boc)-Gly-树脂的制备:
将步骤(8)的Fmoc-Phe-Gln(Trt)-Asn(Trt)-Cys(Trt)-Por-Lys(Boc)-Gly-树脂加入六氢吡啶的DMF溶液,20~30℃脱帽反应10~60分钟,氮气吹干,分别用DMF、甲醇、DMF洗涤,氮气吹干。
加入Fmoc-Tyr(tBu)-OH(MW:403.4)、TBTU或HBTU、HOBT、NMM和DMF,20~30℃接肽反应0.5~1.5小时,氮气吹干,分别用DMF、甲醇、DMF洗涤,氮气吹干;获得Fmoc-Tyr(tBu)-Phe-Gln(Trt)-Asn(Trt)-Cys(Trt)-Por-Lys(Boc)-Gly-树脂;
NMM和DMF的体积比为:NMM∶DMF=1∶5~15;
NMM和DMF中,步骤(8)的树脂的重量体积浓度为5~15ml/g,Fmoc-Tyr(tBu)-OH的摩尔数为树脂的2~6倍;TBTU或HBTU的摩尔数为树脂的2~6倍;,HOBT的摩尔数为树脂的2~6倍;NMM的摩尔数为树脂的4~12倍;
六氢吡啶的DMF溶液的重量浓度为15~25%;
六氢吡啶的DMF溶液中Fmoc-Phe-Gln(Trt)-Asn(Trt)-Cys(Trt)-Por-Lys(Boc)-Gly-树脂的重量体积浓度为5~15ml/g;
(10)Fmoc-Cys(Trt)-Tyr(tBu)-Phe-Gln(Trt)-Asn(Trt)-Cys(Trt)-Por-Lys(Boc)-Gly-树脂的制备:
将步骤(9)的Fmoc-Tyr(tBu)-Phe-Gln(Trt)-Asn(Trt)-Cys(Trt)-Por-Lys(Boc)-Gly-树脂加入六氢吡啶的DMF溶液,20~30℃脱帽反应10~60分钟,氮气吹干,分别用DMF、甲醇、DMF洗涤,氮气吹干。
加入Fmoc-Cys(Trt)-OH(FW:585.7)、TBTU或HBTU、HOBT、NMM和DMF,20~30℃接肽反应0.5~1.5小时,氮气吹干,分别用DMF、甲醇、DMF洗涤,氮气吹干;获得Fmoc-Tyr(tBu)-Phe-Gln(Trt)-Asn(Trt)-Cys(Trt)-Por-Lys(Boc)-Gly-树脂;
NMM和DMF的体积比为:NMM∶DMF=1∶5~15;
NMM和DMF中,步骤(9)的树脂重量体积浓度为5~15ml/g,Fmoc-Cys(Trt)-OH摩尔数为树脂的2~6倍;TBTU或HBTU的摩尔数为树脂的2~6倍;,HOBT的摩尔数为树脂的2~6倍;NMM的摩尔数为树脂的4~12倍;
六氢吡啶的DMF溶液的重量浓度为15~25%;
六氢吡啶的DMF溶液中Fmoc-Tyr(tBu)-Phe-Gln(Trt)-Asn(Trt)-Cys(Trt)-Por-Lys(Boc)-Gly-树脂的重量体积浓度为5~15ml/g;
(11)Fmoc-Gly-Cys(Trt)-Tyr(tBu)-Phe-Gln(Trt)-Asn(Trt)-Cys(Trt)-Por-Lys(Boc)-Gly-树脂的制备:
将步骤(10)的Fmoc-Cys(Trt)-Tyr(tBu)-Phe-Gln(Trt)-Asn(Trt)-Cys(Trt)-Por-Lys(Boc)-Gly-树脂加入六氢吡啶的DMF溶液,20~30℃脱帽反应10~60分钟,氮气吹干,分别用DMF、甲醇、DMF洗涤,氮气吹干。
加入Fmoc-Gly-OH(FW:297.3)、TBTU或HBTU、HOBT、NMM和DMF,20~30℃接肽反应0.5~1.5小时,氮气吹干,分别用DMF、甲醇、DMF洗涤,氮气吹干;获得Fmoc-Gly-Cys(Trt)-Tyr(tBu)-Phe-Gln(Trt)-Asn(Trt)-Cys(Trt)-Por-Lys(Boc)-Gly-树脂;
NMM和DMF的体积比为:NMM∶DMF=1∶5~15;
NMM和DMF中,步骤(10)的树脂的重量体积浓度为5~15ml/g,Fmoc-Gly-OH的摩尔数为树脂的2~6倍;TBTU或HBTU的摩尔数为树脂的2~6倍;,HOBT的摩尔数为树脂的2~6倍;NMM的摩尔数为树脂的4~12倍;
六氢吡啶的DMF溶液的重量浓度为15~25%;
六氢吡啶的DMF溶液中Fmoc-Tyr(tBu)-Phe-Gln(Trt)-Asn(Trt)-Cys(Trt)-Por-Lys(Boc)-Gly-树脂的重量体积浓度为5~15ml/g;
(12)Fmoc-Gly-Gly-Cys(Trt)-Tyr(tBu)-Phe-Gln(Trt)-Asn(Trt)-Cys(Trt)-Por-Lys(Boc)-Gly-树脂的制备:
将步骤(11)的Fmoc-Gly-Cys(Trt)-Tyr(tBu)-Phe-Gln(Trt)-Asn(Trt)-Cys(Trt)-Por-Lys(Boc)-Gly-树脂加入六氢吡啶的DMF溶液,20~30℃脱帽反应10~60分钟,氮气吹干,分别用DMF、甲醇、DMF洗涤,氮气吹干。
加入Fmoc-Gly-OH(FW:297.3)、TBTU或HBTU、HOBT、NMM和DMF,20~30℃接肽反应0.5~1.5小时,氮气吹干,分别用DMF、甲醇、DMF洗涤,氮气吹干;获得Fmoc-Gly-Gly-Cys(Trt)-Tyr(tBu)-Phe-Gln(Trt)-Asn(Trt)-Cys(Trt)-Por-Lys(Boc)-Gly-树脂;
NMM和DMF的体积比为:NMM∶DMF=1∶5~15;
NMM和DMF中,步骤(11)的树脂的重量体积浓度为5~15ml/g,Fmoc-Gly-OH的摩尔数为树脂的2~6倍;TBTU或HBTU的摩尔数为树脂的2~6倍;,HOBT的摩尔数为树脂的2~6倍;NMM的摩尔数为树脂的4~12倍;
六氢吡啶的DMF溶液的重量浓度为15~25%;
六氢吡啶的DMF溶液中,Fmoc-Gly-Cys(Trt)-Tyr(tBu)-Phe-Gln(Trt)-Asn(Trt)-Cys(Trt)-Por-Lys(Boc)-Gly-树脂的重量体积浓度为5~20ml/g;
(13)Boc-Gly-Gly-Gly-Cys(Trt)-Tyr(tBu)-Phe-Gln(Trt)-Asn(Trt)-Cys(Trt)-Por-Lys(Boc)-Gly-树脂的制备:
在步骤(12)获得的树脂中,加入六氢吡啶的DMF溶液,20~30℃脱帽反应10~60分钟,氮气吹干,分别用DMF、甲醇、DMF洗涤,氮气吹干。
加入Boc-Gly-OH(FW:175.2)、TBTU或HBTU、HOBT、NMM和DMF,将混合物20~30℃接肽反应0.5~1.5小时,氮气吹干,分别用DMF、甲醇、DMF洗涤,氮气吹干,再用甲醇洗涤,干燥,得保护12肽树脂;
NMM和DMF的体积比为:NMM∶DMF=1∶5~15;
NMM和DMF中,步骤(12)的树脂的重量体积浓度为5~15ml/g,Boc-Gly-OH的摩尔数为树脂的2~6倍;TBTU或HBTU的摩尔数为树脂的2~6倍;HOBT的摩尔数为树脂的2~6倍;NMM的摩尔数为树脂的4~12倍;
按照本发明优选的方案,加入切肽试剂进行切肽包括如下步骤:
将上述保护的12肽树脂加入切肽试剂:(TFA/TIS/EDT/H2O=900ml/40ml/25ml/10ml),20~35℃反应1.5~2.5小时,过滤,滤液加乙醚沉淀,获得还原型粗品;
保护的12肽树脂在切肽试剂中的重量体积比为5~20ml/g;
按照本发明优选的方案,还原型粗品氧化(二硫键的形成)的方法包括如下步骤:
将还原型粗品溶于水中,在搅拌下缓慢加入0.5~1.5mol/L的氨水,调节pH至7.5-10.0,过滤,收集滤液;
按照本发明优选的方案,纯化包括如下步骤:
滤液经C18柱纯化,流动相:0.1MNH4Ac∶乙腈(9∶1);流速为:100-650ml/min;检测波长为:280nm;用HPLC跟踪收集所需要的流出液,然后采用常规的方法冻干,获得目标产物。总收率约为:21%。
由上述公开的技术方案可见,本发明的方法,采用Rink Amide树脂(包括Rink AmideMBHA树脂、Rink AmideAM树脂)为起始原料,步接肽收率≥99%,最后一个肽链采用Boc-Gly-OH,简化了工艺,降低了生产成本,采用切肽试剂(TFA/EDT/H2O/TIS)进行切肽,加入乙醚沉淀粗品的方法,避免使用剧毒的氟化氢,三废污染少,切肽收率高达92%,采用弱碱性氧化(pH7.5-10.0)的方法,氧化收率高,反应时间短,采用C18(或C8)柱进行分离纯化,避免使用三氟乙酸,减少三废,纯化收率高达25%,每步接肽收率均在99%以上;切肽后收率为:92%,分离纯化收率为:25%,总收率约为:21%。由此可见,本发明的方法生产成本低,工艺简单,收率高,便于工业化实施。
具体实施方式
实施例和前述过程中所采用的原料列表如下:
No |
品名 |
生产厂商 |
1 |
Fmoc-Gly-OH |
四川三高生化股份有限公司 |
2 |
Fmoc-Cys(Trt)-OH |
四川三高生化股份有限公司 |
3 |
Fmoc-Tyr(tBu)-OH |
四川三高生化股份有限公司 |
4 | Fmoc-Phe-OH | 四川三高生化股份有限公司 |
5 |
Fmoc-Gln(Trt)-OH |
四川三高生化股份有限公司 |
6 |
Fmoc-Asn(Trt)-OH |
四川三高生化股份有限公司 |
7 |
Fmoc-Cys(Trt)-OH |
四川三高生化股份有限公司 |
8 |
Fmoc-Pro-OH |
四川三高生化股份有限公司 |
9 |
Fmoc-Lys(Boc)-OH |
四川三高生化股份有限公司 |
10 |
Rink Amide树脂 |
天津和成科技有限公司 |
11 |
1-羟基苯并三氮唑(HOBt) |
四川三高生化股份有限公司 |
12 |
TBTU |
四川三高生化股份有限公司 |
13 |
三氟乙酸(TFA) |
Merck公司 |
14 |
三异丙基硅烷(TIS) |
Merck公司 |
15 |
乙二硫醇(EDT) |
Merck公司 |
16 |
N-甲基吗啡啉(NMM) |
上海科帆公司 |
17 |
二甲基甲酰胺(DMF) |
上海化学试剂公司 |
18 |
无水甲醇(MeOH) |
上海振兴化工一厂 |
19 |
六氢吡啶(PIP) |
上海化学试剂公司 |
实施例1
肽链制备:
溶胀和脱帽:
称取Rink Amide树脂50克(200目,0.93mmol/g,46.5mmol),用800mlDMF浸泡,使树脂充分溶胀,氮气吹干。加入800毫升20%六氢吡啶的DMF溶液,25℃振摇30分钟。氮气吹滤去六氢吡啶,分别用DMF、无水甲醇、DMF各洗涤三次,氮气吹干。
Fmoc-Gly-树脂的制备:
加Fmoc-Gly-OH(MW:297.3,186mmol)55.3g,TBTU或HBTU(MW:321,186mmol)59.7g,HOBT(MW:153.1,186mmol)32.7g,NMM 41.4ml(MW=101.2),400mlDMF,将混合物25℃振摇1小时。氮气吹干,DMF、无水甲醇、DMF各洗涤三次,氮气吹干。
Fmoc-Lys(Boc)-Gly-树脂的制备:
加入500毫升20%六氢吡啶的DMF溶液,25℃振摇30分钟。氮气吹干,分别用DMF、无水甲醇、DMF各洗涤三次,氮气吹干。
加Fmoc-Lys(Boc)-OH(MW:468.5,186mmol)87.1g,TBTU或HBTU(MW:321,186mmol)59.7g,HOBt(MW:153.1,186mmol)32.7g,NMM 41.4ml(MW=101.2),400mlDMF,将混合物25℃振摇1小时。氮气吹干,DMF、无水甲醇、DMF各洗涤三次,氮气吹干。
Fmoc-Por-Lys(Boc)-Gly树脂的制备:
加入500毫升20%六氢吡啶的DMF溶液,25℃振摇30分钟。氮气吹干,分别用DMF、无水甲醇、DMF各洗涤三次,氮气吹干。
加Fmoc-Por-OH(MW:337.4,186mmol)62.8g,TBTU或HBTU(MW:321,186mmol)59.7g,HOBT(MW:153.1,186mmol)32.7g,NMM 41.4ml(MW=101.2),400mlDMF,将混合物25℃振摇1小时。氮气吹干,DMF、无水甲醇、DMF各洗涤三次,氮气吹干。
Fmoc-Cys(Trt)-Por-Lys(Boc)-Gly-树脂的制备:
加入500毫升20%六氢吡啶的DMF溶液,25℃振摇30分钟。氮气吹干,分别用DMF、无水甲醇、DMF各洗涤三次,氮气吹干。
加108.9g(585.7,186mmol)Fmoc-Cys(Trt)-OH、TBTU或HBTU(MW:321,186mmol)59.7g,HOBT(MW:153,186mmol)32.7g,NMM 41.4ml(MW=101.2),400mlDMF,将混合物25℃振摇1小时。氮气吹干,DMF、无水甲醇、DMF各洗涤三次,氮气吹干。
Fmoc-Asn(Trt)-Cys(Trt)-Por-Lys(Boc)-Gly-树脂的制备:
加入500毫升20%六氢吡啶的DMF溶液,25℃振摇30分钟。氮气吹干,分别用DMF、无水甲醇、DMF各洗涤三次,氮气吹干。
加111.0g(596.7,186mmol)Fmoc-Asn(Trt)-OH、TBTU或HBTU(MW:321,186mmol)59.7g,HOBT(MW:153,186mmol)32.7g,NMM 41.4ml(MW=101.2),400mlDMF,将混合物25℃振摇1小时。氮气吹干,DMF、无水甲醇、DMF各洗涤三次,氮气吹干。
Fmoc-Gln(Trt)-Asn(Trt)-Cys(Trt)-Por-Lys(Boc)-Gly-树脂的制备:
加入500毫升20%六氢吡啶的DMF溶液,25℃振摇30分钟。氮气吹干,分别用DMF、无水甲醇、DMF各洗涤三次,氮气吹干。
加113.6g(610.7,186mmol)Fmoc-Gln(Trt)-OH、TBTU或HBTU(MW:321,186mmol)59.7g,HOBT(MW:153,186mmol)32.7g,NMM 41.4ml(MW=101.2),400mlDMF,将混合物25℃振摇1小时。氮气吹干,DMF、无水甲醇、DMF各洗涤三次,氮气吹干。
Fmoc-Phe-Gln(Trt)-Asn(Trt)-Cys(Trt)-Por-Lys(Boc)-Gly-树脂的制备:
加入500毫升20%六氢吡啶的DMF溶液,25℃振摇30分钟。氮气吹干,分别用DMF、无水甲醇、DMF各洗涤三次,氮气吹干。
加72.1g(FW:387.4,186mmol)Fmoc-Phe-OH,TBTU或HBTU(MW:321,186mmol)59.7g,HOBT(MW:153,186mmol)32.7g,NMM 41.4ml(MW=101.2),400mlDMF,将混合物25℃振摇1小时。氮气吹干,DMF、无水甲醇、DMF各洗涤三次,氮气吹干。
Fmoc-Tyr(tBu)-Phe-Gln(Trt)-Asn(Trt)-Cys(Trt)-Por-Lys(Boc)-Gly-树脂的制备:
加入500毫升20%六氢吡啶的DMF溶液,25℃振摇30分钟。氮气吹干,分别用DMF、无水甲醇、DMF各洗涤三次,氮气吹干。
加75.0g(403.4,186mmol)Fmoc-Tyr(tBu)-OH、TBTU或HBTU(MW:321,186mmol)59.7g,HOBT(MW:153,186mmol)32.7g,NMM 41.4ml(MW=101.2),400mlDMF,将混合物25℃振摇1小时。氮气吹干,DMF、无水甲醇、DMF各洗涤三次,氮气吹干。
Fmoc-Cys(Trt)-Tyr(tBu)-Phe-Gln(Trt)-Asn(Trt)-Cys(Trt)-Por-Lys(Boc)-Gly-树脂的制备:
加入500毫升20%六氢吡啶的DMF溶液,25℃振摇30分钟。氮气吹干,分别用DMF、无水甲醇DMF各洗涤三次,氮气吹干。
加108.9g(FW:585.7,186mmol)Fmoc-Cys(Trt)-OH,TBTU或HBTU(MW:321,186mmol)59.7g,HOBT(MW:153,186mmol)32.7g,NMM 41.4ml(MW=101.2),400mlDMF,将混合物25℃振摇1小时。氮气吹干,DMF、无水甲醇、DMF各洗涤三次,氮气吹干。
Fmoc-Gly-Cys(Trt)-Tyr(tBu)-Phe-Gln(Trt)-Asn(Trt)-Cys(Trt)-Por-Lys(Boc)-Gly-树脂的制备:
加入500毫升20%六氢吡啶的DMF溶液,25℃振摇30分钟。氮气吹干,分别用DMF、无水甲醇DMF各洗涤三次,氮气吹干。
加55.3g(FW:297.3,186mmol)Fmoc-Gly-OH,TBTU或HBTU(MW:321,186mmol)59.7g,HOBT(MW:153,186mmol)32.7g,NMM 41.4ml(MW=101.2),400mlDMF,将混合物25℃振摇1小时。氮气吹干,DMF、无水甲醇、DMF各洗涤三次,氮气吹干。
Fmoc-Gly-Gly-Cys(Trt)-Tyr(tBu)-Phe-Gln(Trt)-Asn(Trt)-Cys(Trt)-Por-Lys(Boc)-Gly-树脂的制备:
加入500毫升20%六氢吡啶的DMF溶液,25℃振摇30分钟。氮气吹干,分别用DMF、无水甲醇DMF各洗涤三次,氮气吹干。
加55.3g(FW:297.3,186mmol)Fmoc-Gly-OH,TBTU或HBTU(MW:321,186mmol)59.7g,HOBT(MW:153,186mmol)32.7g,NMM 41.4ml(MW=101.2),400mlDMF,将混合物25℃振摇1小时。氮气吹干,DMF、无水甲醇、DMF各洗涤三次,氮气吹干。
Boc-Gly-Gly-Gly-Cys(Trt)-Tyr(tBu)-Phe-Gln(Trt)-Asn(Trt)-Cys(Trt)-Por-Lys(Boc)-Gly-树脂的制备:
加入500毫升20%六氢吡啶的DMF溶液,25℃振摇30分钟。氮气吹干,分别用DMF、无水甲醇DMF各洗涤三次,氮气吹干。
加32.6g(FW:175.2,186mmol)Boc-Gly-OH,TBTU或HBTU(MW:321,186mmol)59.7g,HOBT(MW:153,186mmol)32.7g,NMM 41.4ml(MW=101.2),400mlDMF,将混合物25℃振摇1小时。氮气吹干,DMF、无水甲醇、DMF各洗涤三次,氮气吹干。
再用无水甲醇洗涤三次。抽干后,放入真空干燥器中干燥,称重,得保护12肽树脂。
切肽:
保护的12肽树脂转移到切肽瓶中,冷却下,边搅拌边加入切肽试剂:(TFA/TIS/EDT/H2O=900ml/40ml/25ml/10ml),25℃搅拌2小时。过滤,抽干,滤液加无水乙醚沉淀。
氧化(二硫键的形成):
将还原型特利加压素粗品溶于纯化水中,在搅拌下缓慢加入1mol/L氨水,调节PH至7.5-10.0,搅拌过夜(HPLC跟踪反应进程),过滤。
纯化:
滤液经C18柱(10×30cm)纯化,流动相:0.1MNH4Ac∶乙腈(9∶1);流速为:300ml/min;检测波长为:280nm;用HPLC跟踪收集所需要的流出液,然后冻干,获得目标产物,总收率约为:21%。