CN102731625A - 一种纯化特利加压素的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及多肽纯化领域，特别涉及一种纯化特利加压素的方法。该方法通过预处理特利加压素粗品，经纯化、转盐后获得纯度达99.5%以上的特利加压素。本发明提供的纯化特利加压素方法操作简单易行，获得的特利加压素纯度高（可达99.5%以上，且最大单杂小于0.1%）、收率高（纯化收率可达85%以上，总收率可达50%以上），符合产业化要求，一批次可获得1000克以上的精肽。
Description
技术领域
本发明涉及多肽纯化领域，特别涉及一种纯化特利加压素的方法。
背景技术
肝硬化(hepatic cirrhosis)是临床常见的慢性进行性肝病，由一种或多种病因长期或反复作用形成的弥漫性肝损害。在我国大多数为肝炎后肝硬化，少部分为酒精性肝硬化和血吸虫性肝硬化。病理组织学上有广泛的肝细胞坏死、残存肝细胞结节性再生、结缔组织增生与纤维隔形成，导致肝小叶结构破坏和假小叶形成，肝脏逐渐变形、变硬而发展为肝硬化。早期由于肝脏代偿功能较强可无明显症状，后期则以肝功能损害和门脉高压为主要表现，并有多系统受累，晚期常出现上消化道出血、肝性脑病、继发感染、脾功能亢进、腹水、癌变等并发症。
肝硬化的发病机制为进入门脉循环的各充血静脉与体静脉之间可出现血管吻合、门静脉压升高现象。吻合最常出现于奇静脉与食管下端间，即食管静脉曲张。它们扩张后变得粗大，可破裂入食管腔，引起呕血危及生命。
特利加压素（Terli）是一个十二肽，如下所示：
特利加压素能够控制出血，引起内脏血管剧烈收缩从而降低门静脉压，广泛用于肝硬化并发症（食管胃静脉曲张出血、肝肾综合症、腹水）的治疗，同时还适用于泌尿生殖道及其他腹腔脏器出血、感染性休克、烧伤、急性肝功能衰竭、心脏骤停等适应症的治疗。
但是目前制备获得的特利加压素的纯度和收率都较低，不能满足工业化生产的需求，特别是无法大规模纯化特利加压素，制约了特利加压素的应用。因此，提供一种纯化特利加压素的方法具有重要意义。
发明内容
有鉴于此，本发明提供一种纯化特利加压素的方法。该方法通过预处理特利加压素粗品，经纯化、转盐后获得纯度达99.5%以上的特利加压素。本发明提供的纯化特利加压素方法操作简单易行，获得的特利加压素纯度高（可达99.5%以上，且最大单杂小于0.1%）、收率高（纯化收率可达85%以上，总收率可达50%以上），符合产业化要求，一批次可获得1000克以上的精肽。
为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：
本发明提供了一种纯化特利加压素的方法，包括如下步骤：
步骤1：获得特利加压素粗品；
步骤2：取特利加压素粗品预处理后，以十八烷基硅烷键合硅胶为固定相，以浓度为0.1～0.8%的高氯酸和浓度为0.01～0.08%硫酸水溶液制得混合溶液，用碱调节混合溶液的pH值为2.0～3.5后作为A相，以乙腈为B相，按照B相为10%～40%的梯度进行洗脱，制得特利加压素第二粗品；
步骤3：取特利加压素第二粗品，采用离子交换法转盐，即得。
作为优选，特利加压素粗品由液相合成法或固相合成法合成。
作为优选，步骤2中预处理为取有机溶剂溶解所述特利加压素粗品，加入抗氧化剂获得特利加压素粗品溶液。
作为优选，步骤2中有机溶剂的浓度为20～100%。
作为优选，以g/L计，步骤2中特利加压素粗品与有机溶剂的质量体积比为20～100：1。
作为优选，步骤2中特利加压素粗品与抗氧化剂的质量比为100:2～8。
作为优选，步骤2中A相与B相的体积比为10～79:80。
作为优选，步骤2中预处理还包括取特利加压素粗品溶液加水获得特利加压素粗品第二溶液，特利加压素粗品第二溶液中有机溶剂的体积百分数低于20%。
作为优选，步骤2中有机溶剂为乙腈或甲醇。
作为优选，步骤2中抗氧化剂为抗坏血酸或抗坏血酸盐中的一种或两者以上的混合物。
作为优选，步骤2中抗坏血酸盐为抗坏血酸钠、抗坏血酸钾。
作为优选，步骤2中碱为氢氧化钠、氢氧化钾或氨水中的一种或两者以上的混合物。
作为优选，步骤3中转盐包括如下步骤：
步骤a：取碱溶液活化树脂，获得活化后的树脂，取特利加压素第二粗品加入到活化后的树脂中混合，过滤收集第一滤液；
步骤b：收集过滤后的树脂用水清洗，过滤后收集清洗液;
步骤c：取清洗液与第一滤液合并，经第一浓缩获得第一浓缩液，取第一浓缩液重复步骤a、步骤b，获得第二滤液；
步骤d：取第二滤液加入冰醋酸，经第二浓缩后获得第二浓缩液、冻干。
作为优选，树脂为强碱型阴离子交换树脂。
作为优选，特利加压素第二粗品与活化后的树脂的质量比为5～15:100。
作为优选，以g/mL计，第二滤液与冰醋酸的质量体积比为1:0.025～0.1。
作为优选，第一浓缩液的浓度为20～100mg/mL。
作为优选，第二浓缩液的浓度为50～200mg/mL。
作为优选，步骤a中碱溶液为氢氧化钠溶液或氢氧化钾溶液。
作为优选，步骤a中碱溶液的浓度为0.2～2mol/L。
作为优选，步骤a中活化树脂的次数为1～2次。
作为优选，步骤b中过滤后的树脂用水冲洗的次数为3～4次。
作为优选，步骤d中冰醋酸的浓度为40～50%。
作为优选，纯化所用色谱柱（柱子直径×长度）规格为5cm×25cm、15cm×25cm、30cm×25cm或45cm×25cm。
本发明提供了一种纯化特利加压素的方法。该方法通过预处理特利加压素粗品，经纯化、转盐后获得纯度达99.5%以上的特利加压素。本发明提供的纯化特利加压素方法操作简单易行，获得的特利加压素纯度高（可达99.5%以上，且最大单杂小于0.1%）、收率高（纯化收率可达85%以上，总收率可达50%以上），符合产业化要求，一批次可获得1000克以上的精肽。
附图说明
图1示实施例1中特利加压素粗品经乙腈水溶液溶解后HPLC谱图；
图2示实施例1中特利加压素粗品经乙腈水溶液、抗坏血酸溶解后HPLC谱图；
图3示实施例1中特利加压素粗品经本发明提供的方法制得的特利加压素HPLC谱图，纯度大于99.5%。
具体实施方式
本发明公开了一种纯化特利加压素的方法，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的方法及应用已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文所述的方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。
本发明提供的一种纯化特利加压素的方法中所用原料及试剂均可由市场购得。
下面结合实施例，进一步阐述本发明：
实施例1
液相合成法获得特利加压素。
样品处理：用体积比25%的乙腈水溶液按照100g/L的浓度溶解粗肽，搅拌使样品完全溶解后用滤膜过滤，收集滤液。按照粗肽重量的5%的比例加入抗坏血酸试剂，用水将粗肽溶液中的乙腈的体积比例稀释到10%备用。
纯化：
纯化条件：色谱柱：以十八烷基硅烷键合硅胶为固定相的色谱柱，柱子直径和长度为：5cm×25cm。流动相：A相：0.4%高氯酸和0.04%硫酸水溶液(v/v)，用50mM的氢氧化钠水溶液调pH值2.8；B相：乙腈，流速：80ml/min，梯度：B%：10%～40%，检测波长：280nm。进样量为1.5g。
纯化过程：将色谱柱用50%以上的乙腈冲洗干净后平衡上样，上样量为1.5g。线性梯度洗脱60min，收集目的峰，将收集的特利加压素溶液于水温30℃的条件下减压旋蒸浓缩至约15mg/mL后备用。
转盐：用1mol/L氢氧化钠溶液冲洗树脂活化1次，然后按照每克树脂0.1克的样品的比例，将特利加压素样品溶液加入到活化后的树脂中，充分搅拌2分钟，将混合液过滤，将滤除的树脂再用注射用水清洗4次，收集滤出的溶液，将收集到的滤出液浓缩至30mg/ml后，再重复上述过程一次，将再次得到的滤出液按照每克样品0.05ml冰醋酸的比例加入50%（v/v）的冰醋酸水溶液，于水温30℃条件下减压旋蒸浓缩至约50-200mg/mL后转至50ml西林瓶。冷冻干燥后即可得到纯度大于99.5%的特利加压素。
实施例2
固相合成法获得特利加压素。
样品处理：用体积比25%的甲醇水溶液按照100g/L的浓度溶解粗肽，搅拌使样品完全溶解后用滤膜过滤，收集滤液。按照粗肽重量的5%的比例加入抗坏血酸试剂，用水将粗肽溶液中的甲醇的体积比例稀释到10%备用。
纯化：
纯化条件：色谱柱：以十八烷基硅烷键合硅胶为固定相的色谱柱，柱子直径和长度为：15cm×25cm。流动相：A相：0.4%高氯酸和0.04%硫酸水溶液(v/v)，用50mM的氢氧化钠水溶液调pH值2.8；B相：乙腈，流速：500ml/min，梯度：B%：10%～40%，检测波长：280nm。进样量为15-30g。
纯化过程：将色谱柱用50%以上的乙腈冲洗干净后平衡上样，上样量为25g。线性梯度洗脱60min，收集目的峰，将收集的特利加压素溶液于水温不超过30℃的条件下减压旋蒸浓缩至约15mg/ml后备用。
转盐：用1mol/L氢氧化钠溶液冲洗树脂活化1次，然后按照每克树脂0.1克的样品的比例，将特利加压素样品溶液加入到活化后的树脂中，充分搅拌2分钟，将混合溶液过滤，将滤除的树脂再用注射用水清洗4次，收集滤出的溶液，将收集到的滤出液浓缩至25mg/ml后，再重复上述过程一次，将再次得到的滤出液按照每克样品0.05ml冰醋酸的比例加入50%（v/v）的冰醋酸水溶液，于水温30℃条件下减压旋蒸浓缩至约50-200mg/ml后转至50ml西林瓶。冷冻干燥后即可得到纯度大于99.5%的特利加压素。
实施例3
液相合成法获得特利加压素。
样品处理：用体积比25%的甲醇水溶液按照100g/L的浓度溶解粗肽，搅拌使样品完全溶解后用滤膜过滤，收集滤液。按照粗肽重量的5%的比例加入抗坏血酸试剂，用水将粗肽溶液中的甲醇的体积比例稀释到10%备用。
纯化：
纯化条件：色谱柱：以十八烷基硅烷键合硅胶为固定相的色谱柱，柱子直径和长度为：30cm×25cm。流动相：A相：0.4%高氯酸和0.04%硫酸水溶液(v/v)，用50mM的氢氧化钠水溶液调pH值2.8；B相：乙腈，流速：3000ml/min，梯度：B%：10%～40%，检测波长：280nm。进样量为120g。
纯化过程：将色谱柱用50%以上的乙腈冲洗干净后平衡上样，上样量为120g。线性梯度洗脱60min，收集目的峰，将收集的特利加压素溶液于水温不超过30℃的条件下减压旋蒸浓缩至约10-20mg/ml后备用。
转盐：用1mol/L氢氧化钠溶液冲洗树脂活化1次，然后按照每克树脂0.1克的样品的比例，将特利加压素样品溶液加入到活化后的树脂中，充分搅拌2分钟，将混合溶液过滤，将滤除的树脂再用注射用水清洗4次，收集滤出的溶液，将收集到的滤出液浓缩至25mg/ml后，再重复上述过程一次，将再次得到的滤出液按照每克样品0.05ml冰醋酸的比例加入稀释后的冰醋酸水溶液，于水温30℃条件下减压旋蒸浓缩至约50-200mg/ml后转至50ml西林瓶。冷冻干燥后即可得到纯度大于99.5%的特利加压素。
实施例4
固相合成法获得特利加压素。
样品处理：用体积比25%的甲醇水溶液按照100g/L的浓度溶解粗肽，搅拌使样品完全溶解后用滤膜过滤，收集滤液。按照粗肽重量的5%的比例加入抗坏血酸试剂，用水将粗肽溶液中的甲醇的体积比例稀释到10%备用。
纯化：
纯化条件：色谱柱：以十八烷基硅烷键合硅胶为固定相的色谱柱，柱子直径和长度为：45cm×25cm。流动相：A相：0.4%高氯酸水溶液(v/v)，用50mmol的氢氧化钠水溶液调pH值2.8；B相：乙腈，流速：6000ml/min，梯度：B%：10%～40%，检测波长：280nm。进样量为300g。
纯化过程：将色谱柱用50%以上的乙腈冲洗干净后平衡上样，上样量为300g。线性梯度洗脱60min，收集目的峰，将收集的特利加压素溶液于水温30℃的条件下减压旋蒸浓缩至约20mg/mL后备用。
转盐：用1mol/L氢氧化钠溶液冲洗树脂活化1次，然后按照每克树脂0.1克的样品的比例，将特利加压素样品溶液加入到活化后的树脂中，充分搅拌2分钟，将混合溶液过滤，将滤除的树脂再用注射用水清洗4次，收集滤出的溶液，将收集到的滤出液浓缩至25mg/ml后，再重复上述过程一次，将再次得到的滤出液按照每克样品0.05ml冰醋酸的比例加入稀释后的冰醋酸水溶液，于水温30℃条件下减压旋蒸浓缩至约100mg/mL后转至50ml西林瓶。冷冻干燥后即可得到纯度大于99.5%的特利加压素。
实施例5
液相合成法获得特利加压素。
样品处理：用体积比100%的甲醇（乙腈）水溶液按照20g/L的浓度溶解粗肽，搅拌使样品完全溶解后用滤膜过滤，收集滤液。按照粗肽重量的4%的比例加入抗坏血酸（抗坏血酸钠、抗坏血酸钾），用水将粗肽溶液中的甲醇（乙腈）的体积比例稀释到1%备用。
纯化：
纯化条件：色谱柱：以十八烷基硅烷键合硅胶为固定相的色谱柱，柱子直径和长度为：30cm×25cm。流动相：A相：0.8%高氯酸和0.01%硫酸水溶液(v/v)，用100mM的氢氧化钾水溶液调pH值3.0；B相：乙腈，流速：3000ml/min，梯度：B%：10%～40%，检测波长：280nm。进样量为120g。
纯化过程：将色谱柱用50%以上的乙腈冲洗干净后平衡上样，上样量为120g。线性梯度洗脱60min，收集目的峰，将收集的特利加压素溶液于水温不超过30℃的条件下减压旋蒸浓缩至约10-20mg/ml后备用。
转盐：用2mol/L氢氧化钾溶液冲洗强碱型阴离子交换树脂活化1-2次，然后按照每100克树脂5克的特利加压素的比例，将特利加压素溶液加入到活化后的树脂中，充分搅拌2分钟，将混合溶液过滤，将滤除的树脂再用注射用水清洗3-4次，收集滤出的溶液，将收集到的滤出液浓缩至75mg/ml后，再重复上述过程一次，将再次得到的滤出液按照每克样品0.025ml冰醋酸的比例加入浓度为48%的冰醋酸水溶液，于水温30℃条件下减压旋蒸浓缩至约50mg/ml后转至50ml西林瓶。冷冻干燥后即可得到纯度大于99.6%的特利加压素。
实施例6
固相合成法获得特利加压素。
样品处理：用体积比20%的甲醇（乙腈）水溶液按照100g/L的浓度溶解粗肽，搅拌使样品完全溶解后用滤膜过滤，收集滤液。按照粗肽重量的8%的比例加入抗坏血酸（抗坏血酸钠、抗坏血酸钾），用水将粗肽溶液中的甲醇（乙腈）的体积比例稀释到10%备用。
纯化：
纯化条件：色谱柱：以十八烷基硅烷键合硅胶为固定相的色谱柱，柱子直径和长度为：30cm×25cm。流动相：A相：0.1%高氯酸和0.04%硫酸水溶液(v/v)，用20mM的氨水水溶液调pH值2.5；B相：乙腈，流速：3000ml/min，梯度：B%：10%～40%，检测波长：280nm。进样量为120g。
纯化过程：将色谱柱用50%以上的乙腈冲洗干净后平衡上样，上样量为120g。线性梯度洗脱60min，收集目的峰，将收集的特利加压素溶液于水温不超过30℃的条件下减压旋蒸浓缩至约10-20mg/ml后备用。
转盐：用0.2mol/L氢氧化钾溶液冲洗强碱型阴离子交换树脂活化1-2次，然后按照每100克树脂10克的特利加压素的比例，将特利加压素溶液加入到活化后的树脂中，充分搅拌2分钟，将混合溶液过滤，将滤除的树脂再用注射用水清洗3-4次，收集滤出的溶液，将收集到的滤出液浓缩至40mg/ml后，再重复上述过程一次，将再次得到的滤出液按照每克样品0.1ml冰醋酸的比例加入浓度为45%的冰醋酸水溶液，于水温30℃条件下减压旋蒸浓缩至约200mg/ml后转至50ml西林瓶。冷冻干燥后即可得到纯度大于99.5%的特利加压素。
实施例7
液相合成法获得特利加压素。
样品处理：用体积比40%的甲醇（乙腈）水溶液按照60g/L的浓度溶解粗肽，搅拌使样品完全溶解后用滤膜过滤，收集滤液。按照粗肽重量的2%的比例加入抗坏血酸（抗坏血酸钠、抗坏血酸钾），用水将粗肽溶液中的甲醇（乙腈）的体积比例稀释到20%备用。
纯化：
纯化条件：色谱柱：以十八烷基硅烷键合硅胶为固定相的色谱柱，柱子直径和长度为：30cm×25cm。流动相：A相：0.3%高氯酸和0.08%硫酸水溶液(v/v)，用200mM的氢氧化钠水溶液调pH值2.0；B相：乙腈，流速：3000ml/min，梯度：B%：10%～40%，检测波长：280nm。进样量为120g。
纯化过程：将色谱柱用50%以上的乙腈冲洗干净后平衡上样，上样量为120g。线性梯度洗脱60min，收集目的峰，将收集的特利加压素溶液于水温不超过30℃的条件下减压旋蒸浓缩至约10-20mg/ml后备用。
转盐：用1.5mol/L氢氧化钠溶液冲洗强碱型阴离子交换树脂活化1-2次，然后按照每100克树脂15克的特利加压素的比例，将特利加压素溶液加入到活化后的树脂中，充分搅拌2分钟，将混合溶液过滤，将滤除的树脂再用注射用水清洗3-4次，收集滤出的溶液，将收集到的滤出液浓缩至100mg/ml后，再重复上述过程一次，将再次得到的滤出液按照每克样品0.05ml冰醋酸的比例加入浓度为40%的冰醋酸水溶液，于水温30℃条件下减压旋蒸浓缩至约100mg/ml后转至50ml西林瓶。冷冻干燥后即可得到纯度大于99.7%的特利加压素。
实施例8
固相合成法获得特利加压素。
样品处理：用体积比70%的甲醇（乙腈）水溶液按照30g/L的浓度溶解粗肽，搅拌使样品完全溶解后用滤膜过滤，收集滤液。按照粗肽重量的6%的比例加入抗坏血酸（抗坏血酸钠、抗坏血酸钾），用水将粗肽溶液中的甲醇（乙腈）的体积比例稀释到5%备用。
纯化：
纯化条件：色谱柱：以十八烷基硅烷键合硅胶为固定相的色谱柱，柱子直径和长度为：30cm×25cm。流动相：A相：0.5%高氯酸和0.05%硫酸水溶液(v/v)，用100mM的氢氧化钾水溶液调pH值3.5；B相：乙腈，流速：3000ml/min，梯度：B%：10%～40%，检测波长：280nm。进样量为120g。
纯化过程：将色谱柱用50%以上的乙腈冲洗干净后平衡上样，上样量为120g。线性梯度洗脱60min，收集目的峰，将收集的特利加压素溶液于水温不超过30℃的条件下减压旋蒸浓缩至约10-20mg/ml后备用。
转盐：用0.8mol/L氢氧化钾溶液冲洗强碱型阴离子交换树脂活化1-2次，然后按照每100克树脂12克的特利加压素的比例，将特利加压素溶液加入到活化后的树脂中，充分搅拌2分钟，将混合溶液过滤，将滤除的树脂再用注射用水清洗3-4次，收集滤出的溶液，将收集到的滤出液浓缩至20mg/ml后，再重复上述过程一次，将再次得到的滤出液按照每克样品0.75ml冰醋酸的比例加入浓度为50%的冰醋酸水溶液，于水温30℃条件下减压旋蒸浓缩至约150mg/ml后转至50ml西林瓶。冷冻干燥后即可得到纯度大于99.8%的特利加压素。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
Claims (17)
1.一种纯化特利加压素的方法，其特征在于，包括如下步骤：
步骤1：获得特利加压素粗品；
步骤2：取所述特利加压素粗品预处理后，以十八烷基硅烷键合硅胶为固定相，以浓度为0.1～0.8%的高氯酸和浓度为0.01～0.08%硫酸水溶液制得混合溶液，用碱调节所述混合溶液的pH值为2.0～3.5后作为A相，以乙腈为B相，按照B相为10%～40%的梯度进行洗脱，制得特利加压素第二粗品；
步骤3：取所述特利加压素第二粗品，采用离子交换法转盐，即得。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述特利加压素粗品由液相合成法或固相合成法合成。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤2中所述预处理为取有机溶剂溶解所述特利加压素粗品，加入抗氧化剂获得特利加压素粗品溶液。
4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，步骤2中所述有机溶剂的浓度为20～100%。
5.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，以g/L计，步骤2中所述特利加压素粗品与所述有机溶剂的质量体积比为20～100：1。
6.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，步骤2中所述特利加压素粗品与所述抗氧化剂的质量比为100:2～8。
7.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，步骤2中所述A相与所述B相的体积比为10～79:80。
8.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，步骤2中所述预处理还包括取所述特利加压素粗品溶液加水获得特利加压素粗品第二溶液，所述特利加压素粗品第二溶液中所述有机溶剂的体积百分数低于20%。
9.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，步骤2中所述有机溶剂为乙腈或甲醇。
10.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，步骤2中所述抗氧化剂为抗坏血酸或抗坏血酸盐中的一种或两者以上的混合物。
11.根据权利要求10所述的方法，其特征在于，步骤2中所述抗坏血酸盐为抗坏血酸钠、抗坏血酸钾。
12.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤3中所述转盐包括如下步骤：
步骤a：取碱溶液活化树脂，获得活化后的树脂，取所述特利加压素第二粗品加入到所述活化后的树脂中混合，过滤收集第一滤液；
步骤b：收集过滤后的树脂用水清洗，过滤后收集清洗液;
步骤c：取所述清洗液与所述第一滤液合并，经第一浓缩获得第一浓缩液，取所述第一浓缩液重复步骤a、步骤b，获得第二滤液；
步骤d：取所述第二滤液加入冰醋酸，经第二浓缩后获得第二浓缩液、冻干。
13.根据权利要求12所述的方法，其特征在于，所述树脂为强碱型阴离子交换树脂。
14.根据权利要求12所述的方法，其特征在于，所述特利加压素第二粗品与所述活化后的树脂的质量比为5～15:100。
15.根据权利要求12所述的方法，其特征在于，以g/mL计，所述第二滤液与所述冰醋酸的质量体积比为1:0.025～0.1。
16.根据权利要求12所述的方法，其特征在于，所述第一浓缩液的浓度为20～100mg/mL。
17.根据权利要求12所述的方法，其特征在于，所述第二浓缩液的浓度为50～200mg/mL。
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Date of cancellation: 20220513 Granted publication date: 20141015 Pledgee: Shenzhen hi tech investment small loan Co.,Ltd. Pledgor: HYBIO PHARMACEUTICAL Co.,Ltd. Registration number: Y2020980000692 |