CN1810829A - 醋酸奥曲肽的制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种醋酸奥曲肽的制备方法，该方法，包括以下步骤：1)用固相合成法合成具有D－Phe－Cys－Phe－D－Trp－Lys－Thr－Cys－Thr氨基酸残基序列的直链八肽；2)氧化直链八肽，得到氧化型奥曲肽；3)将氧化型奥曲肽在醋酸盐溶液中经转盐和纯化后，得到醋酸奥曲肽。本发明的醋酸奥曲肽的制备方法中，全部采用DMF，HOBT/HBTU和DIEA进行接肽反应，具有操作简便，副反应少的优点，用此方法可达到最小保护策略，并可进行大量的合成。本发明具有成本低，收率高的优点，在醋酸奥曲肽的工业化生产中将具有广阔的应用前景。
Description
技术领域
本发明涉及化合物的制备方法，特别是涉及醋酸奥曲肽的一种制备方法。
背景技术
醋酸奥曲肽(Octreotide acetate)是一个含有7个氨基酸残基和1个苏氨醇的多肽，现已被广泛应用于临床，能够治疗的疾病主要有：上消化道出血(包括肝硬变食管静脉曲张出血、消化性溃疡出血、应激性溃疡出血等)、胰腺疾病(包括重型急性胰腺炎、胰损伤或手术后胰瘘、预防胰手术后并发症等)、胃肠道瘘管、消化系统内分泌肿瘤、肢端肥大症、突眼性甲亢症及艾滋病相关性腹泻等。
目前，与醋酸奥曲肽及其类似物的合成相关的专利有两篇，其中一篇为“Novelpolypeptides，processes for their production，pharmaceutical compositionscomprising said polypeptides and their use.”，于1983年获美国专利保护，专利号：4395403；另一篇为“醋酸奥曲肽的液相合成方法”，于2002年获得中国专利保护，公开号：CN1355173。
上述两篇专利文献中，均采用液相片段缩合法合成醋酸奥曲肽及其类似物。在专利4395403中，将合成片段分为N-端二肽和C-端六肽两个片段，采用BOC(叔丁氧羰基)/Bzl(苄基)保护策略，其中D-Trp-OH用BOC保护α-氨基，Thr-OH、Thr-ol的羟基没有保护，接肽方法主要采用叠氮法，化合物的转盐过程采用凝胶层析法。该制备方法中存在的不足主要表现为：1、在用酸脱BOC保护时，D-Trp易发生氧化、烷基化等副反应；2、叠氮化法接肽，反应条件苛刻，易发生爆炸；3、用凝胶层析法转盐，时间长，耗溶剂，收率低。公开号为CN 1355173的专利在对醋酸奥曲肽的合成研究中，将合成片段分为N-端三肽和C-端五肽两个片段，采用BOC(叔丁氧羰基)、Bzl(苄基)、Fmoc保护策略，其中二肽的D-Phe用BOC保护，五肽的D-Trp用Fmoc保护，采用DCC-HOBt法进行接肽反应，化合物的转盐过程采用非极性柱转盐。该专利在合成方法上针对国外方法中的不足的确作出很大改进，但是由于液相合成方法自身具有一些不可避免的缺陷，使得：1、后处理过程复杂；2、需要在两个容器中进行反应，无法避免反应中间体转移的手续和损失；3、难于实现自动化；4、转盐和纯化分步进行，终产物收率始终不理想。因此迫切需要研究开发出一种更好的醋酸奥曲肽合成方法。
发明内容
本发明的目的是提供一种成本较低、纯化较容易的醋酸奥曲肽的制备方法。
本发明所提供的醋酸奥曲肽的制备方法，包括以下步骤：
1)用固相合成法合成具有D(D型)-Phe-Cys-Phe-D-Trp-Lys-Thr-Cys-Thr氨基酸残基序列的直链八肽；
2)氧化直链八肽，得到氧化型奥曲肽；
3)将氧化型奥曲肽在醋酸盐溶液中经转盐和纯化后，得到醋酸奥曲肽。
如图1所示(R1代表Trt(三苯甲基)；R2代表Boc(叔丁氧羰基)；R3＝But(叔丁基)，R4＝Fmoc(芴甲氧羰基)；I＝二甲基甲酰胺(DMF)，HOBT(1-羟基苯并三氮唑)/HBTU(苯并三唑四甲基脲六氟磷酸酯，“/”是和的含义)，二异丙基乙基胺(DIEA)；II＝DMF，20％六氢吡啶(Pipe)；III＝三氟乙酸(TFA)，1，2-乙二硫醇(EDT)，D.I.H2O)，所述固态合成法合成直链八肽包括以下步骤：
1)R4-Cys(R1)-OH与H-Thr-OL-2-Cl-R1-Resin(树脂)在DMF，HOBT/HBTU和DIEA中反应，得到R4-Cys(R1)-Thr-OL-2-Cl-R1-Resin；
2)将R4-Cys(R1)-Thr-OL-2-Cl-R1-Resin在DMF和20％Pipe中反应，得到H2N-Cys(R1)-Thr-OL-2-Cl-R1-Resin，再将R4-Thr(R3)-OH与R4-Cys(R1)-Thr-OL-2-Cl-R1-Resin在DMF，HOBT/HBTU和DIEA中反应，得到R4-Thr(R3)-Cys(R1)-Thr-OL-2-Cl-R1-Resin；
3)将R4-Thr(R3)-Cys(R1)-Thr-OL-2-Cl-R1-Resin在DMF和20％Pipe中反应，得到H2N-Thr(R3)-Cys(R1)-Thr-OL-2-Cl-R1-Resin，再将R4-Lys(R2)-OH与H2N-Thr(R3)-Cys(R1)-Thr-OL-2-Cl-R1-Resin在DMF，HOBT/HBTU和DIEA中反应，得到R4-Lys(R2)-Thr(R3)-Cys(R1)-Thr-OL-2-Cl-R1-Resin；
4)将R4-Lys(R2)-Thr(R3)-Cys(R1)-Thr-OL-2-Cl-R1-Resin在DMF和20％Pipe中反应，得到H2N-Lys(R2)-Thr(R3)-Cys-(R1)-Thr-OL-2-Cl-R1-Resin，再将R4-D-Trp(R2)-OH与H2N-Lys(R2)-Thr(R3)-Cys-(R1)-Thr-OL-2-Cl-R1-Resin在DMF，HOBT/HBTU和DIEA中反应，得到R4-D-Trp(R2)-Lys(R2)-Thr(R3)-Cys-(R1)-Thr-OL-2-Cl-R1-Resin；
5)将R4-D-Trp(R2)-Lys(R2)-Thr(R3)-Cys-(R1)-Thr-OL-2-Cl-R1-Resin在DMF和20％Pipe中反应，得到H2N-D-Trp(R2)-Lys(R2)-Thr(R3)-Cys-(R1)-Thr-OL-2-Cl-R1-Resin，再将R4-Phe-OH与H2N-D-Trp(R2)-Lys(R2)-Thr(R3)-Cys(R1)-Thr-OL-2-Cl-R1-Resin在DMF，HOBT/HBTU和DIEA中反应，得到
R4-Phe-D-Trp(R2)-Lys(R2)-Thr(R3)-Cys(R1)-Thr-OL-2-Cl-R1-Resin；
6)将R4-Phe-D-Trp(R2)-Lys(R2)-Thr(R3)-Cys(R1)-Thr-OL-2-Cl-R1-Resin在DMF和20％Pipe中反应，得到H2N-Phe-D-Trp(R2)-Lys(R2)-Thr(R3)-Cys(R1)-Thr-OL-2-Cl-R1-Resin，再将R4-Cys(R1)-OH与H2N-Phe-D-Trp(R2)-Lys(R2)-Thr(R3)-Cys(R1)-Thr-OL-2-Cl-R1-Resin在DMF，HOBT/HBTU和DIEA中反应，得到
R4-Cys(R1)-Phe-D-Trp(R2)-Lys(R2)-Thr(R3)-Cys(R1)-Thr-OL-2-Cl-R1-Resin；
7)将R4-Cys(R1)-Phe-D-Trp(R2)-Lys(R2)-Thr(R3)-Cys(R1)-Thr-OL-2-Cl-R1-Resin在DMF和20％Pipe中反应，得到
H2N-Cys(R1)-Phe-D-Trp(R2)-Lys(R2)-Thr(R3)-Cys(R1)-Thr-OL-2-Cl-R1-Resin，再将R4-D-Phe-OH与H2N-Cys(R1)-Phe-D-Trp(R2)-Lys(R2)-Thr(R3)-Cys(R1)-Thr-OL-2-Cl-R1-Resin在DMF，HOBT/HBTU和DIEA中反应，得到
R4-D-Phe-Cys(R1)-Phe-D-Trp(R2)-Lys(R2)-Thr(R3)-Cys(R1)-Thr-OL-2-Cl-R1-Resin；
8)将R4-D-Phe-Cys(R1)-Phe-D-Trp(R2)-Lys(R2)-Thr(R3)-Cys(R1)-Thr-OL-2-Cl-R1-Resin在DMF和20％Pipe中反应，得到
H2N-D-Phe-Cys(R1)-Phe-D-Trp(R2)-Lys(R2)-Thr(R3)-Cys(R1)-Thr-OL-2-Cl-R1-Resin，再将H2N-D-Phe-Cys(R1)-Phe-D-Trp(R2)-Lys(R2)-Thr(R3)-Cys(R1)-Thr-OL-2-Cl-R1-Resin在TFA，EDT和D.I.H2O中，-20℃至室温下5反应，得到直链八肽H2N-D-Phe-Cys-Phe-D-Trp-Lys-Thr-Cys-Thr-COOH。
所述将直链八肽经氧化使自N端第2位的Cys与自N端第7位的Cys之间形成双硫键，得到氧化型奥曲肽的方法为：将直链八肽直接溶于水经稀释得到浓度为0.1-1.0mg/mL的稀溶液，优选为1.0mg/mL，并调节pH值至8-9，优选的pH值为8.5，在室温下反应至用HPLC监测无直链多肽存在即可，然后冻干后可进行下一步的纯化。氧化过程中，浓度越低的溶液氧化反应效率较高，产物纯度较好，但随着溶液浓度的降低，溶液体积也会相应增加，不利于后续的冻干，因此在生产过程中一般采用浓度相对较高的溶液进行氧化。
所述将氧化型奥曲肽在醋酸盐溶液中进行转盐和纯化的方法为：将氧化型奥曲肽溶于水经稀释得到浓度为10-100mg/mL的溶液，然后用醋酸盐溶液作为纯化缓冲液用HPLC法进行梯度洗脱，同时使溶液中的氧化型奥曲肽与醋酸根结合得到醋酸奥曲肽，将收集的组分液合并，冻干后得到醋酸奥曲肽干粉。所述醋酸盐缓冲液的浓度为10-50mM；所述醋酸盐为醋酸铵。
本发明醋酸奥曲肽的制备方法中，全部采用DMF，HOBT/HBTU和DIEA进行接肽反应，具有操作简便，副反应少的优点，用此方法可达到最小保护策略，并可进行大量的合成。现有技术中制备醋酸盐多肽样品一般包括用TFA缓冲液纯化样品和用离子交换柱进行换盐处理两个步骤。在该制备方法中，采用离子交换柱换盐将会有较大量的损失。本发明在奥曲肽的转盐过程中将醋酸盐的制备以及样品的纯化同时进行，大大减少了由于多步纯化造成的溶剂浪费。本发明具有成本低，收率高的优点，在醋酸奥曲肽的工业化生产中将具有广阔的应用前景。
附图说明
图1为用固相合成法合成直链八肽的流程图
图2A为0.1mg/mL奥曲肽粗品的S-S环化反应时间为0小时的HPLC检测色谱图
图2B为0.1mg/mL奥曲肽粗品的S-S环化反应时间为48小时的HPLC检测色谱图
图3A为0.2mg/mL奥曲肽粗品的S-S环化反应时间为0小时的HPLC检测色谱图
图3B为0.2mg/mL奥曲肽粗品的S-S环化反应时间为60小时的HPLC检测色谱图
图4A为0.4mg/mL奥曲肽粗品的S-S环化反应时间为0小时的HPLC检测色谱图
图4B为0.4mg/mL奥曲肽粗品的S-S环化反应时间为72小时的HPLC检测色谱图
图5A为1.0mg/mL奥曲肽粗品的S-S环化反应时间为0小时的HPLC检测色谱图
图5B为1.0mg/mL奥曲肽粗品的S-S环化反应时间为96小时的HPLC检测色谱图
图6为醋酸奥曲肽的HPLC纯化图谱
图7为醋酸奥曲肽的HPLC纯化图谱
图8为醋酸奥曲肽的HPLC纯化图谱
具体实施方式
下述实施例中所用方法如无特别说明均为常规方法。
实施例1、醋酸奥曲肽的制备
具体的制备过程，包括以下步骤：
一、用固相合成法合成直链八肽
1、Fmoc-Cys(Trt)-Thr-OL-2-Cl-Trt-Resin的制备
将Fmoc-Cys(Trt)-OH 10.54克、HBTU 9.10克和HOBT 3.24克混合后，溶于DMF100毫升，加入DIEA 19毫升，将上述混合溶液倒入ACT90合成反应器中，室温条件下反应。反应1小时后，抽滤以除去溶剂，然后用DMF 100毫升、CH3OH 100毫升及二氯甲烷100毫升(DCM)各洗树脂3次，经抽滤除去溶剂，得到
Fmoc-Cys(Trt)-Thr-OL-2-Cl-Trt-Resin。
2、Fmoc-Thr(But)-Cys(Trt)-Thr-OL-2-Cl-Trt-Resin的制备
1)H2N-Cys(Trt)-Thr-OL-2-Cl-Trt-Resin的制备
向ACT90合成反应器中加入20％Pipe 100毫升，反应20分钟后经抽滤除去溶剂，然后用DMF 100毫升、CH3OH 100毫升及DCM 100毫升各洗树脂3次，再经抽滤后除去溶剂，得到H2N-Cys(Trt)-Thr-OL-2-Cl-Trt-Resin。
2)Fmoc-Thr(But)-Cys(Trt)-Thr-OL-2-Cl-Trt-Resin的制备
将Fmoc-Thr(But)-OH 7.15克、HBTU 9.10克和HOBT 3.24克溶于DMF 100毫升，加入DIEA 19毫升，将上述混合溶液倒入ACT90合成反应器中，室温条件下反应。反应1.5小时后，抽滤以除去溶剂，然后用DMF 100毫升、CH3OH 100毫升及DCM 100毫升各洗树脂3次，经抽滤除去溶剂，得到
Fmoc-Thr(But)-Cys(Trt)-Thr-OL-2-Cl-Trt-Resin。
3、Fmoc-Lys(Boc)-Thr(But)-Cys(Trt)-Thr-OL-2-Cl-Trt-Resin的制备
1)H2N-Thr(But)-Cys(Trt)-Thr-OL-2-Cl-Trt-Resin的制备
向ACT90合成反应器中加入20％Pipe 100毫升，反应20分钟后抽滤以除去溶剂，然后用DMF 100毫升、CH3OH 100毫升及DCM 100毫升各洗树脂3次，经抽滤除去溶剂，得到H2N-Thr(But)-Cys(Trt)-Thr-OL-2-Cl-Trt-Resin。
2)Fmoc-Lys(Boc)-Thr(But)-Cys(Trt)-Thr-OL-2-Cl-Trt-Resin的制备
将Fmoc-Lys(Boc)-OH 8.43克、HBTU 9.10克和HOBT 3.24克溶于DMF 100毫升，加入DIEA 19毫升，将上述混合溶液倒入ACT90合成反应器中，室温条件下反应2小时后，抽滤以除去溶剂，然后用DMF 100毫升、CH3OH 100毫升及DCM 100毫升各洗树脂3次，经抽滤除去溶剂，得到Fmoc-Lys(Boc)-Thr(But)-Cys(Trt)-Thr-OL-2-Cl-Trt-Resin。
4、Fmoc-D-Trp(Boc)-Lys(Boc)-Thr(But)-Cys(Trt)-Thr-OL-2-Cl-Trt-Resin的制备
1)H2N-Lys(Boc)-Thr(But)-Cys(Trt)-Thr-OL-2-Cl-Trt-Resin的制备
向ACT90合成反应器中加入20％Pipe 100毫升，反应20分钟后抽滤以除去溶剂，然后用DMF 100毫升、CH3OH 100毫升及DCM 100毫升各洗树脂3次，经抽滤除去溶剂，得到H2N-Lys(Boc)-Thr(But)-Cys(Trt)-Thr-OL-2-Cl-Trt-Resin。
2)Fmoc-D-Trp(Boc)-Lys(Boc)-Thr(But)-Cys(Trt)-Thr-OL-2-Cl-Trt-Resin的制备
将Fmoc-D-Trp(Boc)-OH 9.48克、HBTU 9.10克和HOBT 3.24克溶于DMF 100毫升，加入DIEA 19毫升，将上述混合溶液倒入ACT90合成反应器中，室温条件下反应3小时后，抽滤以除去溶剂，然后用DMF 100毫升、CH3OH 100毫升及DCM 100毫升各洗树脂3次，经抽滤除去溶剂，得到Fmoc-D-Trp(Boc)-Lys(Boc)-Thr(But)-Cys(Trt)-Thr-OL-2-Cl-Trt-Resin。
5、Fmoc-Phe-D-Trp(Boc)-Lys(Boc)-Thr(But)-Cys(Trt)-Thr-OL-2-Cl-Trt-Resin的制备
1)H2N-D-Trp(Boc)-Lys(Boc)-Thr(But)-Cys(Trt)-Thr-OL-2-Cl-Trt-Resin的制备
向ACT90合成反应器中加入20％Pipe 100毫升，反应20分钟后抽滤除去溶剂，然后用DMF 100毫升、CH3OH 100毫升及DCM 100毫升各洗树脂3次，经抽滤除去溶剂，得到H2N-D-Trp(Boc)-Lys(Boc)-Thr(But)-Cys(Trt)-Thr-OL-2-Cl-Trt-Resin。
2)Fmoc-Phe-D-Trp(Boc)-Lys(Boc)-Thr(But)-Cys(Trt)-Thr-OL-2-Cl-Trt-Resin的制备
将Fmoc-Phe-OH 6.97克、HBTU 9.10克和HOBT 3.24克溶于DMF 100毫升，加入DIEA 19毫升，将上述混合溶液倒入ACT90合成反应器中，室温条件下反应2小时后，抽滤以除去溶剂，然后用DMF 100毫升、CH3OH 100毫升及DCM 100毫升各洗树脂3次，经抽滤除去溶剂，得到Fmoc-Phe-D-Trp(Boc)-Lys(Boc)-
Thr(But)-Cys(Trt)-Thr-OL-2-Cl-Trt-Resin。
6、Fmoc-Cys(Trt)-Phe-D-Trp(Boc)-Lys(Boc)-Thr(But)-Cys(Trt)-Thr-OL-2-Cl-Trt-Resin的制备
1)H2N-Phe-D-Trp(Boc)-Lys(Boc)-Thr(But)-Cys(Trt)-Thr-OL-2-Cl-Trt-Resin的制备
向ACT90合成反应器中加入20％Pipe 100毫升，反应20分钟后抽滤以除去溶剂，然后用DMF 100毫升、CH3OH 100毫升及DCM 100毫升各洗树脂3次，抽滤除去溶剂，得到H2N-Phe-D-Trp(Boc)-Lys(Boc)-Thr(But)-Cys(Trt)-Thr-OL-2-Cl-Trt-Resin。
2)Fmoc-Cys(Trt)-Phe-D-Trp(Boc)-Lys(Boc)-Thr(But)-Cys(Trt)-Thr-OL-2-Cl-Trt-Resin的制备
将Fmoc-Cys(Trt)-OH 10.54克、HBTU 9.10克和HOBT 3.24克溶于DMF 100毫升，加入DIEA 19毫升，将上述混合溶液倒入ACT90合成反应器中，室温条件下反应5小时后，抽滤以除去溶剂，然后用DMF 100毫升、CH3OH 100毫升及DCM 100毫升各洗树脂3次，经抽滤除去溶剂，得到Fmoc-Cys(Trt)-Phe-D-
Trp(Boc)-Lys(Boc)-Thr(But)-Cys(Trt)-Thr-OL-2-Cl-Trt-Resin。
7、Fmoc-D-Phe-Cys(Trt)-Phe-D-Trp(Boc)-Lys(Boc)-Thr(But)-Cys(Trt)-Thr-OL-2-Cl-Trt-Resin的制备
1)H2N-Cys(Trt)-Phe-D-Trp(Boc)-Lys(Boc)-Thr(But)-Cys(Trt)-Thr-OL-2-Cl-Trt-Resin的制备
向ACT90合成反应器中加入20％Pipe 100毫升，反应20分钟后抽滤以除去溶剂，然后用DMF 100毫升、CH3OH 100毫升及DCM 100毫升各洗树脂3次，经抽滤除去溶剂，得到H2N-Cys(Trt)-Phe-D-Trp(Boc)-Lys(Boc)-Thr(But)-Cys(Trt)-Thr-OL-2-Cl-Trt-Resin。
2)Fmoc-D-Phe-Cys(Trt)-Phe-D-Trp(Boc)-Lys(Boc)-Thr(But)-Cys(Trt)-Thr-OL-2-Cl-Trt-Resin的制备
将Fmoc-D-Phe-OH 6.97克、HBTU 9.10克和HOBT 3.24克溶于DMF 100毫升，加入DIEA 19毫升，将上述混合溶液倒入ACT90合成反应器中，室温条件下反应2.5小时后，抽滤以除去溶剂，然后用DMF 100毫升、CH3OH 100毫升及DCM 100毫升各洗树脂3次，经抽滤除去溶剂，得到Fmoc-D-Phe-Cys(Trt)-Phe-D-Trp(Boc)-Lys(Boc)-Thr(But)-Cys(Trt)-Thr-OL-2-Cl-Trt-Resin。
8、H2N-D-Phe-Cys(Trt)-Phe-D-Trp(Boc)-Lys(Boc)-Thr(But)-Cys(Trt)-Thr-OL-2-Cl-Trt-Resin的制备
向ACT90合成反应器中加入20％Pipe 100毫升，反应20分钟后抽滤以除去溶剂，然后用DMF 100毫升、CH3OH 100毫升及DCM 100毫升各洗树脂3次，经抽滤除去溶剂，得到H2N-D-Phe-Cys(Trt)-Phe-D-Trp(Boc)-Lys(Boc)-Thr(But)-Cys(Trt)-Thr-OL-2-Cl-Trt-Resin。
9、直链八肽H2N-D-Phe-Cys-Phe-D-Trp-Lys-Thr-Cys-Thr-OL的获得
将盛有步骤8获得的H2N-D-Phe-Cys(Trt)-Phe-D-Trp(Boc)-Lys(Boc)-Thr(But)-Cys(Trt)-Thr-OL-2-Cl-Trt-Resin 27.494克的500毫升圆底烧瓶(放有一合适的磁子)中加入100毫升TFA/EDT/D.I.H2O混合液(混合比例为38∶1∶1)，调节磁子搅拌速度，在缓慢搅拌条件下反应5小时后，将切割混合物倒入抽滤瓶内抽干，然后用35毫升50％TFA/DCM清洗树脂2次，抽干；将抽滤液倒入预先冷冻好的2.5L冰冻乙醚中，置于-20℃冰箱放置30分钟后，从冰箱中取出沉淀乙醚液，离心(转速为3500rpm)弃上清液，再用200毫升冰冻乙醚将沉淀洗涤4次，分别离心(转速3500rpm)，最后用150毫升5％HAc溶解沉淀，冷冻抽干，得到粗肽10.8克。
二、奥曲肽的制备
根据双硫键在空气中氧化的通用方法，取0.102g、0.202g、0.409g、1.009g步骤一制备的粗肽干粉(直链八肽)分别溶解于1000mL水中(容器选用2000mL烧杯)，并用1M氨水调节pH值至8.5，得到浓度分别为0.1mg/mL(其摩尔浓度约为1×10-4M)、0.2mg/mL(其摩尔浓度约为2×10-4M)、0.4mg/mL(其摩尔浓度约为4×10-4M)、1.0mg/mL(其摩尔浓度约为1×10-3M)的粗肽溶液，室温下(约25℃)敞口放置，缓慢搅拌，用HPLC监测二硫键的形成，其中浓度为0.1mg/mL(其摩尔浓度约为1×10-4M)粗肽溶液的反应监测图谱如图2A-图2B所示，反应进行48小时后直链八肽的主峰面积占总峰面积的7.65％，-70℃冷冻停止反应，冷冻干燥后得到氧化型奥曲肽粗品干粉85mg，多肽的氧化率为92.4％，在该浓度下步骤反应产率为83.0％；浓度为0.2mg/mL(其摩尔浓度约为2×10-4M)粗肽溶液的反应监测图谱如图3A-图3B所示，反应进行60小时后直链八肽的主峰面积占总峰面积的3.1％，-70℃冷冻停止反应，冷冻干燥后得到氧化型奥曲肽粗品干粉0.176g，多肽的氧化率为96.9％，该步骤反应的产率为87.0％；浓度为0.4mg/mL(其摩尔浓度约为4×10-4M)粗肽溶液的反应监测图谱如图4A-图4B所示，反应进行72小时后直链八肽基本完全被氧化，-70℃冷冻停止反应，冷冻干燥后得到氧化型奥曲肽粗品干粉0.343g，多肽的氧化率为100％，该步骤反应的产率为84.0％；浓度为1.0mg/mL(其摩尔浓度约为1×10-3M)粗肽溶液的反应监测图谱如图5A-图5B所示，反应进行96小时后直链八肽基本完全被氧化，-70℃冷冻停止反应，冷冻干燥后得到氧化型的奥曲肽粗品干粉0.862g，多肽的氧化率为100％，该步骤反应的产率为86.2％。
对于浓度较小的直链八肽溶液，形成双硫键的时间相对于浓度较高的溶液要要快得多。虽然高浓度的样品在氧化过程中所需要的时间相对较长，但在随后的冷冻干燥过程中，获得相同的量的氧化八肽的时间要短的多，甚至可以不进行冷冻干燥直接进行纯化过程。
三、醋酸奥曲肽的获得
采用下述三种方法对步骤二制备的氧化型奥曲肽粗品进行盐化及纯化，得到醋酸奥曲肽：
1、称取步骤二制备的氧化型奥曲肽粗品200mg溶于水得到浓度约为20mg/mL的氧化型奥曲肽粗肽溶液，采用HPLC进行纯化，纯化条件为：
色谱柱：Varian(21.4×250mm)C18柱
流动相A：5mM NH4Ac in 10％乙腈(AcN)，pH4.5
流动相B：5mM NH4Ac in 90％AcN，pH4.5
洗脱程序：20mL/min，线性梯度
| 时间(min) | A％ | B％ | 备注 |
| 0-0.5 | 90 | 10 | 等待进样 |
| 0.5-30.5 | 90-75 | 10-25 | 线性梯度 |
| 30.5-31 | 75-2 | 25-98 | 线性梯度 |
| 31-40 | 2 | 98 | 等梯度清洗柱子 |
| 40-40.5 | 2-90 | 98-10 | 线性梯度 |
| 40.5-55 | 90 | 10 | 等梯度平衡柱子 |
全部过程采用紫外检测仪(275nm)监测，纯化图谱如图6所示，保留时间约为17分钟。
将HPLC纯化过程中收集得到的含主峰的流动相冻干，得到所需要的醋酸奥曲肽52mg，采用该方法进行纯化的收率为26.0％，该工艺可进行放大操作。
2、称取步骤二制备的氧化型奥曲肽粗品200mg溶于水得到浓度约为20mg/mL的氧化型奥曲肽粗肽溶液，采用HPLC进行纯化，纯化条件为：
色谱柱：Varian(21.4×250mm)C18柱
流动相A：20mM NH4Ac in 5％AcN，pH4.5
流动相B：20mM NH4Ac in 90％AcN，pH4.5
洗脱程序：20mL/min，线性梯度
| 时间(min) | A％ | B％ | 备注 |
| 0-0.5 | 80 | 20 | 等待进样 |
| 0.5-30.5 | 80-50 | 20-50 | 线性梯度 |
| 30.5-31 | 50-2 | 50-98 | 线性梯度 |
| 31-40 | 2 | 98 | 等梯度清洗柱子 |
| 40-40.5 | 2-80 | 98-20 | 线性梯度 |
| 40.5-55 | 80 | 20 | 等梯度平衡柱子 |
全部过程采用紫外检测仪(275nm)监测，纯化图谱如图7所示，保留时间为14分钟左右。
将HPLC纯化过程中收集得到的含主峰的流动相冻干，得到所需要的醋酸奥曲肽47mg，采用该方法进行纯化的收率为23.5％，该工艺可进行放大操作。
3、称取步骤二制备的氧化型奥曲肽粗品200mg溶于水得到浓度约为20mg/mL的氧化型奥曲肽粗肽溶液，采用HPLC进行纯化，纯化条件为：
色谱柱：Varian(21.4×250mm)C18柱
流动相A：20mM NH4Ac in 5％AcN，pH6.0
流动相B：20mM NH4Ac in 90％AcN，pH6.0
洗脱程序：20mL/min，线性梯度
| 时间(min) | A％ | B％ | 备注 |
| 0-0.5 | 80 | 20 | 等待进样 |
| 0.5-30.5 | 80-50 | 20-50 | 线性梯度 |
| 30.5-31 | 50-2 | 50-98 | 线性梯度 |
| 31-40 | 2 | 98 | 等梯度清洗柱子 |
| 40-40.5 | 2-80 | 98-20 | 线性梯度 |
| 40.5-55 | 80 | 20 | 等梯度平衡柱子 |
全部过程采用紫外检测仪(275nm)监测，纯化图谱如图8所示，保留时间为17分钟左右。
将HPLC纯化过程中收集得到的含主峰的流动相冻干，得到所需要的醋酸奥曲肽59mg，采用该方法进行纯化的收率为29.5％，该工艺可进行放大操作。
采用不同浓度，不同pH的醋酸胺溶液作为纯化的缓冲液，均可得到色谱纯度大于95.0％且其它各项都能符合质量标准要求的药用醋酸奥曲肽，经鉴定用本发明所述方法制备的醋酸奥曲肽HPLC纯度可达99.05％，Maldi-TOF MS为：1019.62(理论分子量为1019.3)，比旋度为：-61.2°(标准[α]D 20-57°～-63°(c 0.2，100％CH3COOH))，乙酸含量：9.3％(标准5.0-12％)。
Claims (6)
1、一种醋酸奥曲肽的制备方法，包括以下步骤：
1)用固相合成法合成具有D-Phe-Cys-Phe-D-Trp-Lys-Thr-Cys-Thr氨基酸残基序列的直链八肽；
2)氧化直链八肽，得到氧化型奥曲肽；
3)将氧化型奥曲肽在醋酸盐溶液中经转盐和纯化后，得到醋酸奥曲肽。
2、根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于：所述步骤1)中用固相合成法合成直链八肽包括以下步骤：
1)R4-Cys(R1)-OH与H-Thr-OL-2-Cl-R1-Resin在DMF，HOBT/HBTU和DIEA中反应，得到R4-Cys(R1)-Thr-OL-2-Cl-R1-Resin；
2)将R4-Cys(R1)-Thr-OL-2-Cl-R1-Resin在DMF和20％Pipe中反应，得到H2N-Cys(R1)-Thr-OL-2-Cl-R1-Resin，再将R4-Thr(R3)-OH与R4-Cys(R1)-Thr-OL-2-Cl-R1-Resin在DMF，HOBT/HBTU和DIEA中反应，得到R4-Thr(R3)-Cys(R1)-Thr-OL-2-Cl-R1-Resin；
3)将R4-Thr(R3)-Cys(R1)-Thr-OL-2-Cl-R1-Resin在DMF和20％Pipe中反应，得到H2N-Thr(R3)-Cys(R1)-Thr-OL-2-Cl-R1-Resin，再将R4-Lys(R2)-OH与H2N-Thr(R3)-Cys(R1)-Thr-OL-2-Cl-R1-Resin在DMF，HOBT/HBTU和DIEA中反应，得到R4-Lys(R2)-Thr(R3)-Cys(R1)-Thr-OL-2-Cl-R1-Resin；
4)将R4-Lys(R2)-Thr(R3)-Cys(R1)-Thr-OL-2-Cl-R1-Resin在DMF和20％Pipe中反应，得到H2N-Lys(R2)-Thr(R3)-Cys-(R1)-Thr-OL-2-Cl-R1-Resin，再将R4-D-Trp(R2)-OH与H2N-Lys(R2)-Thr(R3)-Cys-(R1)-Thr-OL-2-Cl-R1-Resin在DMF，HOBT/HBTU和DIEA中反应，得到R4-D-Trp(R2)-Lys(R2)-Thr(R3)-Cys-(R1)-Thr-OL-2-Cl-R1-Resin；
5)将R4-D-Trp(R2)-Lys(R2)-Thr(R3)-Cys-(R1)-Thr-OL-2-Cl-R1-Resin在DMF和20％Pipe中反应，得到H2N-D-Trp(R2)-Lys(R2)-Thr(R3)-Cys-(R1)-Thr-OL-2-Cl-R1-Resin，再将R4-Phe-OH与H2N-D-Trp(R2)-Lys(R2)-Thr(R3)-Cys(R1)-Thr-OL-2-Cl-R1-Resin在DMF，HOBT/HBTU和DIEA中反应，得到
R4-Phe-D-Trp(R2)-Lys(R2)-Thr(R3)-Cys(R1)-Thr-OL-2-Cl-R1-Resin；
6)将R4-Phe-D-Trp(R2)-Lys(R2)-Thr(R3)-Cys(R1)-Thr-OL-2-Cl-R1-Resin在DMF和20％Pipe中反应，得到H2N-Phe-D-Trp(R2)-Lys(R2)-Thr(R3)-Cys(R1)-Thr-OL-2-Cl-R1-Resin，再将R4-Cys(R1)-OH与H2N-Phe-D-Trp(R2)-Lys(R2)-Thr(R3)-Cys(R1)-Thr-OL-2-Cl-R1-Resin在DMF，HOBT/HBTU和DIEA中反应，得到
R4-Cys(R1)-Phe-D-Trp(R2)-Lys(R2)-Thr(R3)-Cys(R1)-Thr-OL-2-Cl-R1-Resin；
7)将R4-Cys(R1)-Phe-D-Trp(R2)-Lys(R2)-Thr(R3)-Cys(R1)-Thr-OL-2-Cl-R1-Resin在DMF和20％Pipe中反应，得到
H2N-Cys(R1)-Phe-D-Trp(R2)-Lys(R2)-Thr(R3)-Cys(R1)-Thr-OL-2-Cl-R1-Resin，再将
R4-D-Phe-OH与H2N-Cys(R1)-Phe-D-Trp(R2)-Lys(R2)-Thr(R3)-Cys(R1)
-Thr-OL-2-Cl-R1-Resin在DMF，HOBT/HBTU和DIEA中反应，得到
R4-D-Phe-Cys(R1)-Phe-D-Trp(R2)-Lys(R2)-Thr(R3)-Cys(R1)-Thr-OL-2-Cl-R1-Resin；
8)将R4-D-Phe-Cys(R1)-Phe-D-Trp(R2)-Lys(R2)-Thr(R3)-Cys(R1)-Thr-OL-2-Cl-R1-Resin在DMF和20％Pipe中反应，得到
H2N-D-Phe-Cys(R1)-Phe-D-Trp(R2)-Lys(R2)-Thr(R3)-Cys(R1)-Thr-OL-2-Cl-R1-Resin，再将
H2N-D-Phe-Cys(R1)-Phe-D-Trp(R2)-Lys(R2)-Thr(R3)-Cys(R1)-Thr-OL-2-Cl-R1-Resin在TFA，EDT和D.I.H2O中，-20℃至室温下反应，得到直链八肽H2N-D-Phe-Cys-Phe-D-Trp-Lys-Thr-Cys-Thr-COOH。
3、根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于：所述步骤2)中将直链八肽氧化的方法为：将直链八肽直接溶于水得到浓度为0.1-1.0mg/mL的溶液，并调节溶液pH值至8-9，在室温下进行氧化反应，得到氧化型奥曲肽。
4、根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于：所述溶液浓度为1.0mg/mL；所述溶液pH值为8.5。
5、根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于：所述步骤3)中将氧化型奥曲肽在醋酸盐溶液中进行转盐和纯化的方法为：将氧化型奥曲肽溶于水得到浓度为10-100mg/mL的溶液，然后用醋酸盐溶液作为纯化缓冲液用HPLC法进行梯度洗脱，将收集的组分液合并，冻干后得到醋酸奥曲肽干粉。
6、根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于：所述醋酸盐缓冲液的浓度为10-50mM；所述醋酸盐为醋酸铵。
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| CN109187804A (zh) * | 2018-10-18 | 2019-01-11 | 成都天台山制药有限公司 | 制备醋酸奥曲肽的方法 |
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- 2005-01-27 CN CN 200510002874 patent/CN1810829A/zh active Pending
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