CN1845751A - 固定相和利用该固定相的纯化方法 - Google Patents

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CN1845751A CNA2004800255058A CN200480025505A CN1845751A CN 1845751 A CN1845751 A CN 1845751A CN A2004800255058 A CNA2004800255058 A CN A2004800255058A CN 200480025505 A CN200480025505 A CN 200480025505A CN 1845751 A CN1845751 A CN 1845751A
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Abstract

本发明涉及新的式I的固定相和在液体色谱中利用选择固定相，包括式I的固定相，纯化肽或脂肽从而提高纯化的分离度和/或生产率的方法。这种色谱方法可以用于分析或制备规模的纯化。

Description

固定相和利用该固定相的纯化方法
发明背景
脂肽类如肺炎菌素(Pneumocandin)B0是发酵过程中的常见产物。在该发酵过程中，许多密切相关的类似物与所需产物一起产生。液体色谱体系经常用来纯化粗发酵产物。液体色谱体系通常由固定相和流动相组成。为了纯化肽或脂肽，固定相可以是硅胶、氧化铝或其他物质，流动相可以是单一溶剂或溶剂的混和物，其中包括有机溶剂和水。
硅胶色谱和其他类型的液体色谱适用于分离这些类似物。然而，在实践中，与所需产物密切相关的某些类似物的分离经常不令人满意，因为色谱分离不利，即色谱峰重叠。为了以合理收率获得所需纯度的主产物，需要限制每次运行加载在色谱柱上的物质的量(通常是指加入或柱负荷)，它限制了操作的生产率。
肺炎菌素(Pneumocandin)B0的色谱纯化以往由于色谱分离度低而非常困难。所述色谱在硅胶柱上使用由溶剂的混和物组成的流动相，特别是乙酸乙酯(EtOAc)、甲醇(MeOH)和水。过去，关键杂质如肺炎菌素B5和E0由于色谱分离度低难以与肺炎菌素B0分离。一些类似物采用制备条件仅仅部分与主产物峰分开。为了在这种有限的分离度下获得所需产物纯度，需要该提纯步骤以低柱负荷运行，由此限制了生产率。
具有1065道尔顿分子量的肺炎菌素B0是天然产物，并且在乙酸卡波芬净(Caspofungin acetate)(Cancidas)的生产中作为中间体。肺炎菌素B0通过真菌Glarea lozoyensis发酵作为次级代谢产物而产生。参见美国专利5,194,377和5,202,309。肺炎菌素B0和三种关键类似物杂质的结构都属与二甲基肉豆蔻酸酯侧链偶联的环状六肽，如表1所示。
Figure A20048002550500061
表1.肺炎菌素B0和其三种类似物
  化合物   R1   R2   R3   R4   R5   R6
  肺炎菌素B0   OH   OH   Me   OH   H   OH
  肺炎菌素B5   OH   H   Me   OH   H   OH
  肺炎菌素C0   OH   OH   Me   OH   OH   H
  肺炎菌素E0   OH   OH   Me   OH   H   H
硅胶色谱利用所需产物与包括肺炎菌素B5、C0和E0在内的类似物杂质的富羟基环状六肽核的结合亲和性的微细差异来实现分离。在硅胶HPLC纯化中，肺炎菌素B5和E0，这是在肺炎菌素B0的发酵中副产的两种关键类似物杂质，洗脱时非常接近肺炎菌素B0。故为了在这些和相似类似物的纯化原料中达到目标杂质水平，可以加载在色谱柱上的粗肺炎菌素B0的量受到限制。所以，人们极其努力地提高对关键杂质的分离度。譬如，三元乙酸乙酯-甲醇-水流动相已经被平衡来优化肺炎菌素B0和关键类似物杂质之间的分离度。D.J.Roush，F.D.Antia，K.E.Gklen J.Chromatography A，827(1998)373-389。另外，已经证明使用流动相改性剂可以提高肺炎菌素B0和关键类似物杂质之间的分离度和选择性。参见J.Nti-Gyabaah等，″CANCIDAS的一种前体，肺炎菌素B0的大规模纯化″，PREP-2003，16th InternationalSymposium，Exhibit and Workshops on Preparative/ProcessChromatography，San Francisco，CA，Wednesday，July 2，2003或2002年10月30日提交的US临时申请60/422,356。
发明概述
本发明涉及新的式I的固定相以及一种利用液体色谱体系并选择固定相，包括式I的固定相和流动相，纯化肽或脂肽从而提高纯化的选择性和/或生产率的方法。
附图说明
图1：粗肺炎菌素B0的硅胶色谱纯化的色谱图(吸收度278nm相对于时间)。
图2：采用脯氨酸-改性的流动相的粗肺炎菌素B0的硅胶色谱纯化的色谱图(吸收度278nm相对于时间)。
图3：粗肺炎菌素B0的氨基丙基-硅胶色谱纯化的色谱图(吸收度278nm相对于时间)。
图4：粗肺炎菌素B0的酰胺-80-硅胶色谱纯化的色谱图(吸收度278nm相对于时间)。
图5：肺炎菌素B0和有关类似物在硅胶、脯氨酸改性的硅胶、氨基丙基硅胶和酰胺-80-硅胶上的容量因子。
图6：粗肺炎菌素B0的硅胶色谱的色谱图(吸收度278nm相对于柱体积)，其中使用含0.12g/L脯氨酸的脯氨酸改性流动相88∶9∶7乙酸乙酯∶甲醇∶水洗脱剂(预饱和柱)并且在进样时使用含有1.5g/L脯氨酸的75∶17∶8乙酸乙酯∶甲醇∶水作为进样溶剂混和物。
图7：粗肺炎菌素B0的酰胺-80-硅胶色谱的色谱图(吸收度278nm相对于柱体积)，采用相88∶9∶7乙酸乙酯∶甲醇∶水洗脱剂并且用75∶20∶8乙酸乙酯∶甲醇∶水作为进样溶剂混和物。
图8：粗肺炎菌素B0的N-L-脯氨酰基-3-氨基丙基硅胶色谱的色谱图(吸收度278nm相对于柱体积)，利用相88∶9∶7乙酸乙酯∶甲醇∶水洗脱剂并且用75∶20∶8乙酸乙酯∶甲醇∶水作为进样溶剂混和物。
图9：粗肺炎菌素B0的N-甲基氨基甲酰基-3-氨基丙基硅胶色谱的色谱图(吸收度278nm相对于柱体积)，利用88∶9∶7乙酸乙酯∶甲醇∶水洗脱剂并且用75∶20∶8乙酸乙酯∶甲醇∶水作为进样溶剂混和物。
图10：粗肺炎菌素B0的N-β-丙氨酰胺基丙基硅胶色谱的色谱图(吸收度278nm相对于柱体积)，利用88∶9∶7乙酸乙酯∶甲醇∶水洗脱剂并且用75∶20∶8乙酸乙酯∶甲醇∶水作为进样溶剂混和物。
发明详述
式I的固定相：
Figure A20048002550500081
其中
R是：
a)-(CH2)nCONH2，或
b)-COOR1；
n是1-4；和
R1是C1-C2烷基。
式I的固定相的一个实施方式是：
已经用于纯化的其他固定相是：酰胺-80(Tosoh Biosep LLC.制造，日本)，
和
Figure A20048002550500092
由瑞典的Eka Chemicals制造                      公开在美国专利6,342,160
公开一种利用具有固定相和流动相的液体色谱体系纯化肽或脂肽的方法，其中固定相选自上述式I的固定相和酰胺-80，从而提高纯化的选择性和/或生产率。
和
Figure A20048002550500094
其他固定相可以用于纯化某些肽和脂肽，其属于定义如下的式Ia的范围：
Figure A20048002550500095
其中
R是：
a)H，
b)N-乙酰基-D-天门冬酰胺基，
c)D-谷氨酰胺基，
d)L-脯氨酰基(L-Prolinyl)，
e)异-L-谷氨酰胺基，
f)-(CH2)nNH2，
g)-(CH2)nCONH2，
h)-CO(CH2)nCO2H，
i)-CONH2，
j)-CONHR1，
k)-COOR1，或
l)-COR2；
n是1-4；
R1是C1-C6烷基，未取代或被1、2或3个选自Cl、F、Br或I的取代基取代；和
R2是C1-C6烷基，未取代或被1、2或3个选自Cl、F、Br或I的取代基取代；芳基，其中芳基定义为苯基或萘基，未取代或被1、2或3个选自Cl、F、Br、I或硝基的取代基取代。
适用于这种纯化方法的脂肽的实例是棘白菌素衍生物，例如肺炎菌素B0，卡波芬净(Caspofungin)，西洛芬净(Cilofungin)和米卡芬净(Micafungin)以及尼度芬净(Anidulafungin)和达托霉素(Daptomycin)，特别是卡波芬净，米卡芬净，西洛芬净，尼度芬净和达托霉素的天然产物前体。卡波芬净的天然产物/发酵产物前体是肺炎菌素B0。乙酸卡波芬净(CANCIDAS)是半合成脂肽棘白菌素B衍生物，目前在美国作为静脉内给药的抗真菌药销售。尼度芬净是半合成脂肽棘白菌素B衍生物，它是由Eli Lilly/Versicor研发的静脉内给药的抗真菌药物。尼度芬净公开在美国专利5,965,525和6,384,013中，其在此引入作为参考。西洛芬净是Eli Lilly公开在美国专利4,293,489中的作为抗真菌药物使用的棘白菌素脂肽，该专利在此引入作为参考。米卡芬净(FUNGARDTM)是棘白菌素样脂肽，它是由Fujisawa开发的静脉内给药的抗真菌药物。米卡芬净公开在美国专利6,107,458中，该专利在此引入作为参考。达托霉素(CIDECINTM)是半合成脂肽衍生物，它是由Cubist开发的抗细菌药物。达托霉素由Eli Lilly公开在美国专利4,537,717中，该专利在此引入作为参考。
液体色谱体系采用流动相和固定相。流动相是含有一种或多种溶剂的溶剂体系，其组成在整个纯化过程中是恒定不变的，或者是成剃度的，其中该溶剂组合物随着时间在纯化过程中改变。该流动相溶剂包括，但不限于，水、甲醇、乙醇、异丙醇、己烷、庚烷、乙酸乙酯、乙酸异丙酯、乙腈、甲基叔丁基醚(MTBE)和二氯甲烷。该固定相选自：式I的固定相，
Figure A20048002550500111
其中R是-(CH2)nCONH2或-COOR1；n是1-4；R1是C1-C2烷基；以及Tosoh酰胺80。
Figure A20048002550500112
和
Figure A20048002550500113
本发明提供肽或脂肽的色谱纯化方法，它用含氨基-或酰胺-硅胶固定相。柱体积(此后称作cv)定义为穿过柱体所需溶剂的体积。柱负荷是指在一个注射循环中施加到柱内的物质(粗脂肽或肽)的量。柱负荷还可以称作柱进样或进样负荷。
本申请提供的实施例帮助进一步理解本发明。特定材料、所用种类和条件进一步说明本发明而不是限定本发明的合理范围。
实施例1
Figure A20048002550500121
N-β-丙氨酰胺基丙基二氧化硅的制备
将Kromasil氨基二氧化硅(5g，10μ，100)置于100mL圆底烧瓶中，向其中加入25mL的二氯甲烷。当固定相借助于轻微旋转完全湿润后，加入存在于25mL二氯甲烷中的含25-30ppm铜离子的丙烯酰胺溶液作为自由基抑制剂(14毫摩尔)，并且该混和物在旋转蒸发装置上室温下旋转过夜且无需施加真空。次日早晨，该混和物在烧结玻璃漏斗上过滤，用30mL含20％甲醇的二氯甲烷洗涤3次，加入2-丙醇得到浆液，填充到4.6mm内径(id)×25cm长HPLC柱内用于评估。将从柱填充库取出的残留固定相在高真空下干燥过夜，随后进行燃烧分析(C 6.3％；N 1.8％)。
                          实施例2
Figure A20048002550500122
                N-β-丙氨酰胺基丙基二氧化硅的就地制备
商购的氨基二氧化硅柱(Chromegabond Arnine；5μ粒度；60孔径；4.6mm柱内径(i.d.)；25cm柱长)用二氯甲烷以2mL/分钟流速冲洗30分钟。随后丙烯酰胺在乙腈中的10M溶液经过氨基丙基二氧化硅HPLC柱以流速2mL/分钟循环，柱的流出物直接进入到泵入口库以将试剂再循环。试剂溶液的流动持续长达4小时，其中当柱子用首次的二氯甲烷溶液以2mL/分钟洗涤20分钟后，用含20％甲醇的二氯甲烷在2mL/分钟下洗涤20分钟。
                            实施例3
Figure A20048002550500131
N-甲基氨基甲酰基-3氨基丙基二氧化硅的制备
将Kromasil氨基二氧化硅(5g，10μ，100)置于100mL圆底烧瓶，向其中加入25mL的二氯甲烷。当固定相借助于轻微旋转完全湿润后，随后加入氯甲酸甲酯(10mMoles)和三乙胺(10mMoles，1.0eq)在25mL二氯甲烷中的溶液，该混和物在旋转蒸发装置上室温下旋转过夜且无需施加真空。次日清晨，该混和物在烧结玻璃漏斗上过滤，用30mL的含20％甲醇的二氯甲烷洗涤3次，加入2-丙醇制成浆液，并且填充到4.6mm id×25cm长HPLC柱用于评估。从柱填充库取出的残留固定相在高真空下干燥过夜，随后进行燃烧分析(C 6.0％；N1.4％)。
                       实施例4
N-甲基氨基甲酰基-3-氨基丙基二氧化硅的就地制备
商购的氨基二氧化硅柱(Chromegabond Amine；5μ粒度；60孔径；4.6mm柱i.d.；25cm柱长)用二氯甲烷以2mL/分钟的流速冲洗30分钟。氯甲酸甲酯在含1当量三乙胺的二氯甲烷中的1M溶液随后以2mL/分钟的流速通过柱子。该柱随后用2mL/分钟的二氯甲烷冲洗10分钟，随后用含20％甲醇的二氯甲烷以2mL/分钟冲洗20分钟。
                       实施例5
          N-L-脯氨酰基-3-氨基丙基二氧化硅的制备
将Kromasil氨基二氧化硅(5g，10μ，100)置于100mL圆底烧瓶，向其中加入25mL的二氯甲烷。当固定相借助于轻微旋转完全湿润后，加入Boc-L-Pro(4.7mMoles)和1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐(EDC，4.7mMoles，1.0eq)在25mL二氯甲烷中的溶液，该混和物在旋转蒸发装置上室温下旋转过夜且无需施加真空。次日清晨，该混和物在烧结玻璃漏斗上过滤，用30mL的含20％甲醇的二氯甲烷洗涤3次，并且在高真空下干燥。干燥后，加入45mL的三氟乙酸(TFA)在二氯甲烷中的35％溶液，并且所得浆液在室温下震荡45分钟。将该浆液过滤并且回收的固定相用30mL含20％甲醇的二氯甲烷洗涤3次，随后用30mL的10％Hunig氏碱在二氯甲烷中的溶液洗涤，加入2-丙醇制成浆液，并且填充到4.6mm id×25cm长HPLC柱用于评估。从柱填充库取出的残留固定相在高真空下干燥过夜，随后进行燃烧分析(C 7.5％；N 2.0％)。
                        实施例6
      N-L-脯氨酰基-3-氨基丙基二氧化硅的就地制备
商购的氨基二氧化硅柱(Chromegabond胺；5μ粒度；60孔径；4.6mm柱i.d.；25cm柱长)用二氯甲烷以2mL/分钟的流速冲洗30分钟。令Boc-L-Pro在含1当量l-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐的乙腈中的1M溶液以2mL/分钟的流速通过柱子50分钟。该柱用二氯甲烷以2mL/分钟冲洗10分钟，随后用含20％甲醇的二氯甲烷以2mL/分钟冲洗20分钟。Boc保护基的脱除就地进行，这是通过首先用二氯甲烷以5mL/分钟冲洗柱子10分钟，此后用含4％三氟乙酸的二氯甲烷的溶液以5mL/分钟冲洗40分钟，随后用二氯甲烷以5mL/分钟冲洗20分钟。此后，将含0.5％三乙胺的二氯甲烷溶液以5mL/分钟泵入通过该柱子40分钟，随后二氯甲烷以5mL/分钟通过20分钟。
                      实施例7
肺炎菌素B0在不同固定相上以低负荷进行的HPLC的比较
采用250mm长×4.6mm内径的分析级HPLC柱，来比较采用肺炎菌素B0及其类似物的分析负荷时通过不同固定相得到的保留和选择特性。不同的固定相包括：(1)标准二氧化硅，和(2)氨基丙基二氧化硅(得自Eka Chemicals(Bohus，瑞典))，和(3)酰胺-80(酰胺部分与二氧化硅键合，得自Tosoh Biosep LLC.(日本))。所有这些填充具有10μm粒度和120孔径。标准二氧化硅作为单纯液体色谱体系运行，并且使用用L-脯氨酸改性的流动相，达到二氧化硅被脯氨酸饱和。参见J.Nti-Gyabaah等″CANCIDAS的一种前体，肺炎菌素B0的大规模纯化″，PREP-2003，16th International Symposium，Exhibitand Workshops on Preparative/Process Chromatography，SanFrancisco，CA，Wednesday，July 2，2003或2002年10月30日提交的US临时申请60/422,356。
三元流动相和进样稀释剂(84/9/7v/v/v乙酸乙酯，甲醇和水)用得自Fisher Scientific(Pittsburg，PA，USA)的HPLC级溶剂制成。用于脯氨酸洗脱二氧化硅运行的L-脯氨酸得自Ajinomoto(日本)。将L-脯氨酸溶解在三元流动相内至0.12g/L。进样通过将纯的Pn B0(已经通过标准硅胶法纯化的粗Pn B0)与等份的含Pn B5、Pn C0和Pn E0的溶液混和制成，由此这些类似物各自以Pn B0浓度的约10％存在，PnB0的浓度为约1g/L。富集Pn C0的溶液通过选择得自采用标准硅胶法时在硅胶上注射粗Pn B0的截尾馏分来获得。通过选择得自采用脯氨酸洗脱法时在硅胶上注射Pn B0的前截馏分，并且随后进一步通过类似于分析型Pn B0分析(本实施例的下文作描述)但采用较高进样负荷的反相法纯化这些截馏分从而获得富集Pn B5和Pn E0的溶液。具有二极管排列检测器的Agilent HP-1100 HPLC体系(Waldbronn，Germany)用于HPLC运行，并且用于馏分分析，检测采用278nm的波长。
对于各种注射，注射10μL的1g/L进样溶液。流动相的流速为1.1mL/分钟。为了用脯氨酸改性的流动相和标准二氧化硅运行，将L-脯氨酸溶解在流动相达到～0.12g/L，并且随后将～480mL的该溶液泵入通过二氧化硅柱(就地用脯氨酸涂覆二氧化硅)。该含L-脯氨酸的溶液用作此次运行的洗脱剂。得到的色谱图如图1、2、3和4所示。
每次运行时，收集馏分且通过正相和反相HPLC、采用2002年10月30日提交的美国临时专利申请60/422,356(引入作为参考)或J.Nti-Gyabaah等″CANCIDAS的一种前体，肺炎菌素B0的大规模纯化″，PREP-2003，16th International Symposium，Exhibit and Workshopson Preparative/Process Chromatography，San Francisco，CA，Wednesday，July 2，2003所述的方法分析它们，由此来鉴定峰。肺炎菌素B0、E0、B5和C0的保留时间随后用来计算容量因子，根据它们得到Pn B0和三种类似物之间的选择性。结果如图1-5和表2所示。
表2：肺炎菌素B0和类似物之间的选择性
  选择性(相对于PnB0)
  Pn E0   Pn B5   Pn C0   图
  单纯二氧化硅   1.03   1.05   1.27   1
  ″脯氨酸化″二氧化硅*   1.22   1.25   1.26   2
  氨基丙基-二氧化硅   1.67   1.66   1.06   3
  酰胺-80二氧化硅   1.46   1.42   1.25   4
*利用脯氨酸改性的流动相的硅胶色谱
                      实施例8
使用酰胺-80二氧化硅作为固定相的肺炎菌素B0的纯化
作为250mm长×4.6mm内径柱(10μm粒度，8nm孔径，球形)，酰胺-80结合的相得自Tosoh Biosep LLC的。作为对照进行采用与单纯二氧化硅柱相同的进样物质且该柱子用脯氨酸改性流动相平衡的分离，使用Princeton Chromatography提供的W.R.Grace/Davison硅胶Grade-631柱(250mm长×4.6mm id，16-20Tm粒度，60孔径，不规则)。进行两种运行的流动相组合物是88/9/7v/v/v乙酸乙酯/甲醇/水(e/m/w)；脯氨酸改性流动相也含有0.12g/L的L-脯氨酸。所有溶剂是得自Fisher Scientific的HPLC级。脯氨酸得自Ajinomoto(日本)。
用纯度为61.9％的肺炎菌素B0(Pn B0粗品)的部分提纯制剂制备柱进样。制备Pn B0粗品的方法公开在美国专利5,202,309、5,194,377和6,610,822中。对于酰胺-80的运行，通过将Pn B0粗品溶解在75/20/8v/v/v乙酸乙酯、甲醇和水的混和物中制备进样溶液；肺炎菌素B0在进样溶液中的浓度为～45g/L。对于对照运行，使用75/17/8v/v/v乙酸乙酯/甲醇/水进样溶剂混和物，并且采用1.5g/L脯氨酸和～45g/L PnB0。
使用之前，柱子用10个柱体积(cv)的甲醇冲洗，并且用10个cv的流动相平衡。在每次注射时，注射1.2mL的进样溶液(代表～15g/L床)。该流动相的流速为～0.5mL/分钟。在每次运行时，收集馏分并分析以便评价分离的质量。重复各种注射以确保洗脱情况一致。对于使用脯氨酸改性流动相的运行，在首次注射之前将～480mL的含脯氨酸流动相泵入通过单纯二氧化硅柱。
分析方法：
对于各自运行，收集馏分且通过反相和正相HPLC进行分析。样本在Agilent HP-1100分析型HPLC体系上进行分析。采用反相HPLC定量分析大多数种类，除了在反相方法中与Pn B0共洗脱的Pn C0之外。正相HPLC分析用于测定Pn C0。
Pn C0的测定
Pn C0的量通过正相Pn B0分析进行测定，这是一种等强度HPLC(isocratic HPLC)法，它采用YMC二氧化硅柱(SL12S05-2546WT)，其具有5μm的粒度和120的孔径。该柱子为250×4.6mm i.d.且保持在25℃下。洗脱是采用84/9/7乙酸乙酯/甲醇/水洗脱剂的等度洗脱。流速为1.2mL/分钟，通过UV检测278nm的吸收度。产物样本在注射之前无需特别制备。
Pn B0和其他物种的测定
反相HPLC分析用于测定Pn B0/Pn C0和其他物种，包括Pn E0和PnB5。反相分析采用使用YMCJ′球柱(JM08SO4-2546WT)的梯度HPLC法，粒度为4μm和孔径为80。柱子为250×4.6mm i.d.并且保持在30℃。采用的两种流动相是0.1％磷酸(A)和乙腈(B)。洗脱梯度是从60％A和40％B开始并且在45分钟内以1.5mL/分钟变化为1％A和99％B，并且在220nm下UV检测。分析之前，在氮气下将样本吹干并且再次溶解在甲醇中这达到起始浓度。
结果
用脯氨酸改性流动相在单纯硅胶上得到的典型色谱图如图6所示。洗脱出大量富集截留的Pn B0，如图所示，并且与Pn E0和Pn B5非常好地分离，它们是在前峰洗脱出来。
在酰胺-80柱上运行得到的色谱图如图7所示。此次运行流动相或进样溶剂没有使用脯氨酸或其他改性剂。进样溶剂混和物采用比对照情形略高水平的甲醇。Pn B0在这种固相上的保留作用类似于采用脯氨酸改性流动相运行的对照试验(如图6所示)。事实上，除了Pn B0主峰更加宽之外，洗脱特性似乎非常类似于对照体系。
从～6至14个柱体积(cv)收集到许多馏分，并且这些馏分用正相和反相HPLC进行分析。这样的分析证实类似物例如Pn E0和Pn B5很好地与Pn B0分开；这些类似物含在图7所示的～6至8.5cv代表的馏分中。正相分析的结果表明大多数的Pn C0被分离进入到图7中13至14cv代表的馏分中。所以，图7中～8.5至13cv代表的馏分可以合并，得到纯的富集截留物，收率＞90％。
                        实施例9
用N-L-脯氨酰基-3-氨基丙基二氧化硅作为固定相的肺炎菌素B0的纯化
制备含有N-L-脯氨酰基-3-氨基丙基二氧化硅固定相的柱子；制备这种固定相的方法如实施例5和6所述。所用的柱子是250mm长×4.6mm内径，并且含有与球形二氧化硅键合的脯氨酸-酰胺部分，该二氧化硅得自ES Industries，粒度为5μm且孔径为60。试验与实施例8所述的相同，并且结果还可以相对于图6所示实施例中的对照进行评估。
在N-L-脯氨酰基-3-氨基丙基二氧化硅键合相上运行获得的色谱图如图8所示。作为举例，尽管进样中甲醇的水平增高并且体系不采用脯氨酸，但是Pn B0在该相上的保留类似于使用脯氨酸改性流动相在单纯二氧化硅上得到的保留(如图6所示)。然而，其中存在某些关键差异。首先，通常在对照体系中可观察到的大溶剂前峰似乎变小了。另一差别在于，在主Pn B0峰的引导边缘洗脱出来的杂质似乎很好地彼此分开。最后，Pn B0峰更加托尾(与图6相比)。
从～10至21个柱体积(cv)收集到许多馏分，并且这些馏分用正相和反相HPLC进行分析。分析结果表明，关键的先洗脱杂质例如Pn B5和Pn E0非常好地与Pn B0分离。这些杂质大多数含在图8所示的10-13cv范围代表的馏分中。正相分析的结果表明，大多数的Pn C0被分离进入到图8中13至14个cv范围所示的馏分中。所以，～13至19个cv(图8所示)可以合并，得到纯的富集截留物，收率＞90％。
                      实施例10
用N-甲基氨基甲酰基-3-氨基丙基二氧化硅作为固定相的肺炎菌素B0的
                        纯化
制备含有N-甲基氨基甲酰基-3-氨基丙基二氧化硅固定相的柱子；制备这种固定相的方法如实施例3和4所述。该实施例中的柱子是250mm长×4.6mm内径，并且含有与球形二氧化硅键合的N-甲基氨基甲酰基-3-氨基丙基二氧化硅部分，该二氧化硅得自ES Industries，粒度为5μm且孔径为60。试验与实施例8所述的相同，并且结果还可以相对于图6所示实施例中的对照进行评估。
在N-甲基氨基甲酰基-3-氨基丙基二氧化硅键合相上运行得到的色谱图如图9所示。尽管进样中甲醇的水平增高并且体系不采用脯氨酸，但是Pn B0在该相上的保留非常优良(与图6对比)。从～21至40柱体积(cv)收集到许多馏分。这些馏分用正相和反相HPLC进行分析。馏分分析表明，先洗脱类似物例如Pn E0和Pn B5很好地与Pn B0分开，并且含在图9所示的～21至25cv代表的馏分中。正相分析的结果表明，Pn B0与后洗脱类似物例如Pn C0的分离相当于对照过程。开环降解物的水平占此次运行的富集截留中的小百分比，这些降解物在所有上述实施例中均只以痕量水平存在。除了这些降解物，在后的馏分非常纯。
                           实施例11
用N-β-丙氨酰胺基丙基二氧化硅作为固定相的肺炎菌素B0的纯化
制备含有N-β-丙氨酰胺基丙基二氧化硅固定相的柱子；制备这种固定相的方法如实施例1和2所述。所用的柱子是250mm长×4.6mm内径，并且含有一个与球形二氧化硅键合的氨基丙基部分键合的丙基酰胺部分，该二氧化硅得自ES Industries，粒度为5μm且孔径为60。试验与实施例8所述的相类似，但固定相比大多数被评估的其他固定相明显更具保留性，所以需要较强的流动相(75/17/8乙酸乙酯/甲醇/水)来完全洗脱下柱子上的Pn B0。结果仍然可以相对于图6所示的对照进行评估。
在N-β-丙氨酰胺基丙基二氧化硅键合相上运行获得的色谱图如图10所示。需着重点指出，正常下在脯氨酸洗脱方法体系中观察到的大溶剂前峰似乎变小。另一差别在于，在主Pn B0峰的引导边缘洗脱出来的关键杂质很好地分开。
从～6至13cv收集到数种馏分。该馏分通过正相和反相HPLC进行分析。分析结果表明，先洗脱的类似物例如Pn E0和Pn B5与Pn B0明显分开。这些杂质大部分含在～6至8cv代表的馏分中。正相分析的结果表明，大部分的Pn C0分离到11-13cv的馏分中。～8至11cv代表的馏分(如图10所示)可以合并，得到纯的富集截留物，并且收率＞90％。在富集截留馏分中可以检测到低水平的开环降解物。其可能是优良的固定相，因为其保留性允许使用在溶剂强度上与进样溶剂混合物非常类似的洗脱用流动相，由此得到非常稳定的色谱性能。

Claims (14)

1.式I的固定相：
其中
R是：
c)-(CH2)nCONH2，或
d)-COOR1；
n是1-4；和
R1是C1-C2烷基。
2.权利要求1所述的式I的固定相，选自：
Figure A2004800255050002C2
3.一种利用具有固定相和流动相的液体色谱体系纯化肽或脂肽的方法，其中该固定相选自权利要求1所述的式I的固定相，Tosoh酰胺80，
和
Figure A2004800255050002C4
从而改进纯化的选择性和/或生产率。
4.权利要求3的方法，其中该流动相是含有一种或多种溶剂的溶剂体系。
5.权利要求4的方法，其中溶剂体系中的溶剂选自：水，甲醇，乙醇，异丙醇，己烷，庚烷，乙酸乙酯，乙酸异丙酯，乙腈，甲基叔丁基醚(MTBE)和二氯甲烷。
6.权利要求4的方法，其中该液体色谱体系用于纯化肽。
7.权利要求4的方法，其中该液体色谱体系用于纯化脂肽。
8.权利要求7的方法，其中该脂肽是卡波芬净、米卡芬净、西洛芬净、尼度酚净和达托霉素的发酵产物前体。
9.权利要求8的方法，其中该脂肽是卡波芬净的前体，肺炎菌素B0。
10.权利要求9的方法，其中该流动相是含有水、甲醇和乙酸乙酯的溶剂体系。
11.权利要求6的方法，其中该肽是缩宫素或缓激肽。
12.一种用包含固定相和流动相的液体色谱体系纯化肺炎菌素B0的方法，该固定相选自：Tosoh酰胺80，
从而提高纯化的选择性和/或生产率。
13.权利要求12的方法，其中该流动相含有溶剂体系，其中该溶剂体系中的溶剂选自：水，甲醇，乙醇，异丙醇，己烷，庚烷，乙酸乙酯，乙酸异丙酯，乙腈，甲基叔丁基醚(MTBE)和二氯甲烷。
14.权利要求13的方法，其中该溶剂体系是乙酸乙酯、甲醇和水的混和物。
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Cited By (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN102481336A (zh) * 2009-08-14 2012-05-30 克塞里尔制药公司 从棘白菌素c0中分离和/或提纯棘白菌素b0
CN102816207A (zh) * 2012-09-06 2012-12-12 成都雅途生物技术有限公司 卡泊芬净前体pneumocandinB0组分的纯化方法
CN105362293A (zh) * 2015-11-16 2016-03-02 南京新百药业有限公司 一种垂体后叶注射液的生产工艺
CN108047314A (zh) * 2018-01-05 2018-05-18 宁波人健药业集团股份有限公司 一种缩宫素的纯化方法
CN108250272A (zh) * 2016-12-28 2018-07-06 浙江华谱新创科技有限公司 卡泊芬净高效分离纯化方法
CN116693629A (zh) * 2023-08-07 2023-09-05 杭州湃肽生化科技有限公司 替尔泊肽的纯化方法

Families Citing this family (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US8017016B2 (en) * 2006-07-07 2011-09-13 Sims Carl W Method and apparatus for pervaporation control in chromatographic systems
DK2070536T3 (da) * 2006-10-06 2012-04-10 Toyama Chemical Co Ltd Farmaceutisk sammensætning med et phenylamidin-derivat og fremgangsmåde til anvendelse af den farmaceutiske sammensætning i kombination med et antifungalt middel
TW200826957A (en) * 2006-10-16 2008-07-01 Teva Gyogyszergyar Zartkoruen Mukodo Reszvenytarsasag Purification processes for echinocandin-type compounds
US20090222322A1 (en) * 2008-03-02 2009-09-03 Microsoft Corporation Monetizing a social network platform
CA2794688C (en) 2010-03-29 2018-07-03 Biocon Limited A process for purification of pneumocandin
CN102335596A (zh) * 2010-07-19 2012-02-01 上海天伟生物制药有限公司 一种固定相和利用该固定相纯化脂肽的方法
WO2012041801A1 (en) * 2010-09-28 2012-04-05 Dsm Sinochem Pharmaceuticals Netherlands B.V. Method for isolating a cyclohexapeptide
CN103936837B (zh) * 2014-02-14 2016-05-25 博瑞生物医药泰兴市有限公司 一种提纯纽莫康定b0的方法

Family Cites Families (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US3033815A (en) * 1959-08-28 1962-05-08 Union Carbide Corp Organosilicon compounds and process for producing same
US4874520A (en) * 1986-04-23 1989-10-17 Battelle Development Corporation Chromatographic process
US6107458A (en) * 1994-10-07 2000-08-22 Fujisawa Pharmaceutical Co., Ltd. Cyclic hexapeptides having antibiotic activity

Cited By (9)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN102481336A (zh) * 2009-08-14 2012-05-30 克塞里尔制药公司 从棘白菌素c0中分离和/或提纯棘白菌素b0
CN102481336B (zh) * 2009-08-14 2015-11-25 克塞里尔制药公司 从棘白菌素c0中分离和/或提纯棘白菌素b0
CN102816207A (zh) * 2012-09-06 2012-12-12 成都雅途生物技术有限公司 卡泊芬净前体pneumocandinB0组分的纯化方法
CN102816207B (zh) * 2012-09-06 2014-08-27 成都雅途生物技术有限公司 卡泊芬净前体pneumocandinB0组分的纯化方法
CN105362293A (zh) * 2015-11-16 2016-03-02 南京新百药业有限公司 一种垂体后叶注射液的生产工艺
CN108250272A (zh) * 2016-12-28 2018-07-06 浙江华谱新创科技有限公司 卡泊芬净高效分离纯化方法
CN108047314A (zh) * 2018-01-05 2018-05-18 宁波人健药业集团股份有限公司 一种缩宫素的纯化方法
CN116693629A (zh) * 2023-08-07 2023-09-05 杭州湃肽生化科技有限公司 替尔泊肽的纯化方法
CN116693629B (zh) * 2023-08-07 2023-10-31 杭州湃肽生化科技有限公司 替尔泊肽的纯化方法

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