JP2007504460A - 固定相及び該固定相を用いた精製プロセス - Google Patents
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Abstract
本発明は、式Iの新規固定相及び、精製の分解能及び/又は生産性を向上させるための、式Iの固定相を含む、選択固定相を用いた液体クロマトグラフィーにおけるペプチド又はリポペプチドを精製するための方法に関する。本クロマトグラフィー法は、分析的又は分取スケールの精製のいずれに対しても使用することができる。
Description
ニューモカンディン(Pneumocandin)B0など、リポペプチドは、発酵プロセスの産物であることが多い。そのような発酵プロセス中に、所望する産物とともに多くの近縁種である類似物が産生される。この未精製発酵産物を精製するために、液体クロマトグラフィー系がよく使用される。液体クロマトグラフィー系は、通常、固定相及び移動相からなる。ペプチド又はリポペプチドの精製用には、固定相はシリカゲル、アルミナ又は他の物質であり得、移動相は、1種類の溶媒又は有機溶媒と水とを含む溶媒の混合液であり得る。
シリカゲルクロマトグラフィー及び他のタイプの液体クロマトグラフィーは、これらの類似物の分離に有用である。しかし、実際には、クロマトグラフィーの分解能が低く、つまり、クロマトグラフィーのピークが重なってしまうことから、所望する産物からのある種の近縁類似物の分離は、満足できるものでないことが多い。妥当な回収率で主要産物の所望する純度を得るためには、1回の実験あたりのカラムに添加する物質の量(フィード又はカラムロードといわれることが多い。)を制限する必要があり、これによりこの操作の生産性が制限される。
ニューモカンディンB0のクロマトグラフィー精製は、クロマトグラフィーの分解能が低いために、従来、困難であった。このクロマトグラフィーでは、シリカゲルカラムにおいて、溶媒の混合液からなる移動相、特に、酢酸エチル(EtOAc)、メタノール(MeOH)及び水、を利用する。以前はニューモカンディンB0からの、ニューモカンディンB5及びE0など主要な混入物の分離は、クロマトグラフィーの分解能が低いために困難であった。ある種の類似物は、分取条件を用いて主要産物のピークから一部しか分離されなかった。この限定的な分離で所望する産物の純度を得るためには、カラムへの添加量を低くしてこの精製段階を遂行する必要があり、そのため、生産性が制限された。
分子量が1065ダルトンである、ニューモカンディンB0は、天然産物であり、カスポファンギン(Caspofungin)アセテート(Cancidas(R))の産生における中間体である。ニューモカンディンB0は、真菌Glarea lozoyensis(グラレア・ロゾエンシス)の発酵による二次代謝産物として産生される。米国特許第5,194,377号及び第5,202,309号を参照のこと。ニューモカンディンB0及び主要な類似混入物の3種類の構造は全て、ミリスチン酸ジメチル側鎖と連結した環状ヘキサペプチドからなり、表1に示す。
シリカゲルクロマトグラフィーでは、精製を達成するために、所望産物のヒドロキシ−リッチな環状ヘキサペプチドコアと、ニューモカンディンB5、C0及びE0を含む類似混入物との結合親和性におけるわずかな変化を利用する。シリカゲルHPLC精製において、ニューモカンディンB5及びE0という、ニューモカンディンB0の発酵において同時に産生される2種類の主要な類似混入物は、ニューモカンディンB0と非常に密接して溶出される。したがって、これら及び同様の類似物に対する精製物質における標的不純物レベルを適合させるために、カラムに添加できる未精製ニューモカンディンB0の量が制限される。その結果、主要な混入物の分解能を向上させるために多大な努力が払われてきた。例えば、3成分、酢酸エチル−メタノール−水の移動相は、ニューモカンディンB0と主要な類似混入物との間の分離能を最適化するために調整されてきた。D.J.Roush,F.D.Antia,K.E.Goklen J.Chromatoguraphy A、827(1998)373-389。さらに、移動相修飾剤の使用により、ニューモカンディンB0と主要な類似混入物との間の分離能及び選択性が向上することが明らかとなっている。J.Nti−Gyabaahら、“Large−scale purification of pneumocandin B0,a precursor for CANCIDAS”,PREP−2003,16th International Symposium,Exhibit and Workshops on Preparative/Process Chromatography,San Francisco,CA,Wednesday,July 2,2003又は米国仮出願番号第60/422,356号(2002年10月30日出願)。
本発明の要約
本発明は、式Iの新規固定相及び、精製の選択性及び/又は生産性を向上させるための、該式Iの固定相を含む、選択固定相と移動相とを有する液体クロマトグラフィー系を用いたペプチド又はリポペプチドの精製のための方法に関する。
本発明は、式Iの新規固定相及び、精製の選択性及び/又は生産性を向上させるための、該式Iの固定相を含む、選択固定相と移動相とを有する液体クロマトグラフィー系を用いたペプチド又はリポペプチドの精製のための方法に関する。
式I:
式Iの本固定相の実施形態は:
本精製に有用なさらなる固定相は:
Amide−80(Tosoh Biosep LLC.,Japan製造)、
Amide−80(Tosoh Biosep LLC.,Japan製造)、
精製の選択性及び/又は生産性を向上させるための、上記の式Iの固定相、Amide−80、
さらなる固定相は、ある種のペプチド及びリポペプチドの精製に有用であり得、それは、下記:
Rは、
a)H、
b)N−アセチル−D−アスパルギニル、
c)D−グルタミニル、
d)L−プロリニル、
e)イソ−L−グルタミニル、
f)−(CH2)nNH2、
g)−(CH2)nCONH2、
h)−CO(CH2)nCO2H、
i)−CONH2、
j)−CONHR1、
k)−COOR1又は
l)−COR2であり;
nは、1から4であり;
R1は、C1−C6アルキル(置換されていないか、又はCl、F、Br又はIから選択される1、2又は3個の置換基で置換されている。)であり;
R2は、C1−C6アルキル(置換されていないか、又はCl、F、Br又はI、アリール(アリールは、フェニル又はナフチルとして定義され、置換されていないか、又はCl、F、Br、Iもしくはニトロから選択される1、2もしくは3個の置換基で置換されている。)から選択される1、2もしくは3個の置換基で置換されている。)である。)
で定義されるとおりの式Iaの範囲内に含まれる。
この精製プロセスが有用であるリポペプチドの例は、ニューモカンディンB0、カスポファンギン、シロファンギン(Cilofungin)及びミカファンギン(Micafungin)などのエキノカンジン(Echinocandin)誘導体ならびに、アニドゥラファンギン(Anidulafungin)及びダプトマイシン、及び特にカスポファンギン、ミカファンギン、シロファンギン(Cilofungin)、アニドゥラファンギン(Anidulafungin)及びダプトマイシン(Daptomycin)の天然産物前駆体である。カスポファンギンに対する天然産物/発酵産物前駆体は、ニューモカンディンB0である。カスポファンギンアセテート(CANCIDAS(R))は、静脈投与用の抗真菌薬として米国で最近販売されている、半合成リポペプチド エキノカンジンB誘導体である。アニドゥラファンギンは、静脈投与用の抗真菌薬としてEli Lilly/Versicorにより開発中の半合成リポペプチド エキノカンジンB誘導体である。アニドゥラファンギンは、米国特許第5,965,525号及び第6,384,013号(参照により本明細書に組み込む。)で開示されている。シロファンギンは、米国特許第4,293,489号(参照により本明細書に組み込む。)においてEli Lillyにより抗真菌薬としての使用が開示されているエキノカンジン リポペプチドである。ミカファンギン(FUNGARDTM)は、静脈投与用の抗真菌薬としてFujisawaにより開発中のエキノカンジン様のリポペプチドである。ミカファンギンは、米国特許第6,107,458号(参照により本明細書に組み込む。)に開示されている。ダプトマイシン(CIDECINTM)は、抗菌薬としてCubistにより開発中の半合成リポペプチド誘導体である。ダプトマイシンは、Eli Lillyにより、米国特許第4,537,717号(参照により本明細書に組み込む。)で開示されている。
液体クロマトグラフィー系は、移動相及び固定相を有する。この移動相は、1又は複数の溶媒を含有する溶媒系であり、この組成は、精製プロセスを通して一定であるか、又は精製プロセス中に溶媒組成が時間により変化する勾配性のものであるかのいずれかである。この移動相溶媒には、これらに限定されないが、水、メタノール、エタノール、イソプロパノール、ヘキサン、ヘプタン、酢酸エチル、酢酸イソプロピル、アセトニトリル、メチルt−ブチルエーテル(MTBE)及び塩化メチレンが含まれる。この固定相は、式Iの固定相:
本発明は、シリカゲルアミノ又はアミド含有固定相を用いる、ペプチド又はリポペプチドのためのクロマトグラフィー精製方法を提供する。カラム体積(以後、cvと呼ぶ。)は、カラムを通り抜けるのに必要とされる溶媒の体積として定義される。カラムロードは、1回の注入サイクルにおいてカラムに適用する物質(未精製リポペプチド又はペプチド)の量を意味する。カラムロードはまた、カラムフィード(column feed)又はフィードロード(feed load)とも呼ばれる。
本明細書中で提供される例は、本発明のさらなる理解の一助となるものである。特定の物質、使用する種及び条件は、本発明をさらに例示することを意図するものであり、その適切な範囲を限定するものではない。
N−β−アラニンアミドプロピルシリカの調製
Kromasil アミノシリカ(5g、10μ、100Å)を100mL 丸底フラスコに置き、そこに、ジクロロメタン 25mLを添加した。この固定相を完全に湿らせた後、穏やかに撹拌しながら、ジクロロメタン 25mL中の、フリーラジカル阻害剤として25−30ppmの第二銅イオン(14mmol)を含有するアクリルアミド溶液を添加し、室温にてロータリーエバポレーター装置で、真空を適用せずにその混合物を一晩循環させた。翌朝、焼結ガラス漏斗でその混合物を濾過し、ジクロロメタン中の20% メタノール 30mLで3回洗浄し、スラリー中で2−プロパノールを用いて溶解し、評価のために、4.6mm id x25cm長のHPLCカラムに充填した。カラム充填リザーバーから取った残った固定相を高真空下で一晩乾燥させ、次に、燃焼分析に供した(C6.3%;N1.8%)。
Kromasil アミノシリカ(5g、10μ、100Å)を100mL 丸底フラスコに置き、そこに、ジクロロメタン 25mLを添加した。この固定相を完全に湿らせた後、穏やかに撹拌しながら、ジクロロメタン 25mL中の、フリーラジカル阻害剤として25−30ppmの第二銅イオン(14mmol)を含有するアクリルアミド溶液を添加し、室温にてロータリーエバポレーター装置で、真空を適用せずにその混合物を一晩循環させた。翌朝、焼結ガラス漏斗でその混合物を濾過し、ジクロロメタン中の20% メタノール 30mLで3回洗浄し、スラリー中で2−プロパノールを用いて溶解し、評価のために、4.6mm id x25cm長のHPLCカラムに充填した。カラム充填リザーバーから取った残った固定相を高真空下で一晩乾燥させ、次に、燃焼分析に供した(C6.3%;N1.8%)。
N−β−アラニンアミドプロピルシリカのインシトゥ調製
市販のアミノシリカカラム(Chromegabond Amine;5μ粒子サイズ;60Åポアサイズ;4.6mm カラム i.d.;25cm カラム長)に、流速2mL/minで、30分間、ジクロロメタンを流した。次に、アセトニトリル中のアクリルアミドの10M溶液を、アミノプロピルシリカHPLCカラムを介して流速2mL/minで循環させ、そのカラムからの流出物をポンプインレットリザーバーに誘導し、試薬が再循環できるようにした。その試薬液を4時間にわたって流し続け、そのカラムを、最初に2mL/minで20分間、ジクロロメタンの溶液で洗浄し、次に、2mL/minで20分間、ジクロロメタン中の20% メタノールで洗浄した。
市販のアミノシリカカラム(Chromegabond Amine;5μ粒子サイズ;60Åポアサイズ;4.6mm カラム i.d.;25cm カラム長)に、流速2mL/minで、30分間、ジクロロメタンを流した。次に、アセトニトリル中のアクリルアミドの10M溶液を、アミノプロピルシリカHPLCカラムを介して流速2mL/minで循環させ、そのカラムからの流出物をポンプインレットリザーバーに誘導し、試薬が再循環できるようにした。その試薬液を4時間にわたって流し続け、そのカラムを、最初に2mL/minで20分間、ジクロロメタンの溶液で洗浄し、次に、2mL/minで20分間、ジクロロメタン中の20% メタノールで洗浄した。
N−メチルカルバモイル−3−アミノプロピルシリカの調製
Kromasilアミノシリカ(5g、10μ、100Å)を100mL 丸底フラスコに置き、そこにジクロロメタン25mLを添加した。その固定相を完全に湿らせた後、穏やかに撹拌しながら、次に、ジクロロメタン 25mL中のクロロギ酸メチルの溶液(10mmol)及びトリエチルアミン(10mmol、1.0eq)を添加し、ロータリーエバポレーター装置で室温にて、真空を適用せずにその混合物を一晩循環させた。翌朝、焼結ガラス漏斗でその混合物を濾過し、ジクロロメタン中の20% メタノール 30mLで3回洗浄し、スラリー中で2−プロパノールを用いて溶解し、評価のために、4.6mm id x25cm長のHPLCカラムに充填した。カラム充填リザーバーから取った残った固定相を高真空下で一晩乾燥させ、次に、燃焼分析に供した(C6.0%;N1.4%)。
Kromasilアミノシリカ(5g、10μ、100Å)を100mL 丸底フラスコに置き、そこにジクロロメタン25mLを添加した。その固定相を完全に湿らせた後、穏やかに撹拌しながら、次に、ジクロロメタン 25mL中のクロロギ酸メチルの溶液(10mmol)及びトリエチルアミン(10mmol、1.0eq)を添加し、ロータリーエバポレーター装置で室温にて、真空を適用せずにその混合物を一晩循環させた。翌朝、焼結ガラス漏斗でその混合物を濾過し、ジクロロメタン中の20% メタノール 30mLで3回洗浄し、スラリー中で2−プロパノールを用いて溶解し、評価のために、4.6mm id x25cm長のHPLCカラムに充填した。カラム充填リザーバーから取った残った固定相を高真空下で一晩乾燥させ、次に、燃焼分析に供した(C6.0%;N1.4%)。
N−メチルカルバモイル−3−アミノプロピルシリカのインシトゥ調製
市販のアミノシリカカラム(Chromegabond Amine;5μ粒子サイズ;60Åポアサイズ;4.6mm カラム i.d.;25cm カラム長)に、流速2mL/minで、30分間、ジクロロメタンを流した。次に、トリエチルアミン1等量を含有するジクロロメタン中のクロロギ酸メチルの1M溶液を流速2mL/minでカラムに通した。次にそのカラムに2mL/minで10分間、ジクロロメタンを流し、続いて、2mL/minで20分間、ジクロロメタン中の20% メタノールを流した。
市販のアミノシリカカラム(Chromegabond Amine;5μ粒子サイズ;60Åポアサイズ;4.6mm カラム i.d.;25cm カラム長)に、流速2mL/minで、30分間、ジクロロメタンを流した。次に、トリエチルアミン1等量を含有するジクロロメタン中のクロロギ酸メチルの1M溶液を流速2mL/minでカラムに通した。次にそのカラムに2mL/minで10分間、ジクロロメタンを流し、続いて、2mL/minで20分間、ジクロロメタン中の20% メタノールを流した。
N−L−プロリル−3−アミノプロピルシリカの調製
Kromasilアミノシリカ(5g、10μ、100Å)を100mL 丸底フラスコに置き、そこにジクロロメタン25mLを添加した。固定相を完全に湿らせた後、穏やかに撹拌しながら、次に、ジクロロメタン 25mL中のBoc−L−Pro(4.7mmol)及び1−エチル−3−(3−ジメチルアミノプロピル)カルボジイミド塩酸塩(EDC、4.7mmol、1.0eq)を添加し、室温にてロータリーエバポレーター装置で、真空を適用せずにその混合物を一晩循環させた。翌朝、焼結ガラス漏斗でその混合物を濾過し、ジクロロメタン中の20% メタノール 30mLで3回洗浄し、高真空下で乾燥させた。乾燥後、ジクロロメタン中のトリフルオロ酢酸(TFA)の35%溶液 45mLを添加し、得られたスラリーを室温にて45分間、振盪した。次にそのスラリーを濾過し、回収した固定相をジクロロメタン中の20% メタノール 30mLで3回洗浄し、次に、ジクロロメタン中の10% Hunig’s baseの溶液 30mLで洗浄し、スラリー中で2−プロパノールを用いて溶解し、評価のために、4.6mm idx25cm長のHPLCカラムに充填した。カラム充填リザーバーから取った残った固定相を高真空下で一晩乾燥させ、次に、燃焼分析に供した(C7.5%;N2.0%)。
Kromasilアミノシリカ(5g、10μ、100Å)を100mL 丸底フラスコに置き、そこにジクロロメタン25mLを添加した。固定相を完全に湿らせた後、穏やかに撹拌しながら、次に、ジクロロメタン 25mL中のBoc−L−Pro(4.7mmol)及び1−エチル−3−(3−ジメチルアミノプロピル)カルボジイミド塩酸塩(EDC、4.7mmol、1.0eq)を添加し、室温にてロータリーエバポレーター装置で、真空を適用せずにその混合物を一晩循環させた。翌朝、焼結ガラス漏斗でその混合物を濾過し、ジクロロメタン中の20% メタノール 30mLで3回洗浄し、高真空下で乾燥させた。乾燥後、ジクロロメタン中のトリフルオロ酢酸(TFA)の35%溶液 45mLを添加し、得られたスラリーを室温にて45分間、振盪した。次にそのスラリーを濾過し、回収した固定相をジクロロメタン中の20% メタノール 30mLで3回洗浄し、次に、ジクロロメタン中の10% Hunig’s baseの溶液 30mLで洗浄し、スラリー中で2−プロパノールを用いて溶解し、評価のために、4.6mm idx25cm長のHPLCカラムに充填した。カラム充填リザーバーから取った残った固定相を高真空下で一晩乾燥させ、次に、燃焼分析に供した(C7.5%;N2.0%)。
N−L−プロリル−3−アミノプロピルシリカのインシトゥ調製
市販のアミノシリカカラム(Chromegabond Amine;5μ粒子サイズ;60Åポアサイズ;4.6mm カラム i.d.;25cm カラム長)に、流速2mL/minで、30分間、ジクロロメタンを流した。次に、1−エチル−3−(3−ジメチルアミノプロピル)カルボジイミド塩酸塩 1等量を含有するアセトニトリル中のBoc−L−Proの1M溶液を流速2mL/minで50分間、カラムに通した。次にそのカラムに2mL/minで10分間、ジクロロメタンを流し、続いて、2mL/minで20分間、ジクロロメタン中の20% メタノールを流した。最初にカラムにジクロロメタンを5mL/minで10分間流し、続いて、ジクロロメタン中の4% トリフルオロ酢酸溶液を5mL/minで40分間流すことにより、インシトゥでBoc保護基の除去を行い、次に、5mL/minで20分間、ジクロロメタンで洗い流した。次に、ジクロロメタン中の0.5%トリエチルアミンの溶液をカラムを介して5mL/minで40分間押し出し、続いて、ジクロロメタンを5mL/minで20分間押し出した。
市販のアミノシリカカラム(Chromegabond Amine;5μ粒子サイズ;60Åポアサイズ;4.6mm カラム i.d.;25cm カラム長)に、流速2mL/minで、30分間、ジクロロメタンを流した。次に、1−エチル−3−(3−ジメチルアミノプロピル)カルボジイミド塩酸塩 1等量を含有するアセトニトリル中のBoc−L−Proの1M溶液を流速2mL/minで50分間、カラムに通した。次にそのカラムに2mL/minで10分間、ジクロロメタンを流し、続いて、2mL/minで20分間、ジクロロメタン中の20% メタノールを流した。最初にカラムにジクロロメタンを5mL/minで10分間流し、続いて、ジクロロメタン中の4% トリフルオロ酢酸溶液を5mL/minで40分間流すことにより、インシトゥでBoc保護基の除去を行い、次に、5mL/minで20分間、ジクロロメタンで洗い流した。次に、ジクロロメタン中の0.5%トリエチルアミンの溶液をカラムを介して5mL/minで40分間押し出し、続いて、ジクロロメタンを5mL/minで20分間押し出した。
低ロード量での様々な固定相におけるニューモカンディンB0のHPLCの比較。
ニューモカンディンB0及びその類似物の分析的ロードを使用した際の様々な固定相により得られる保持力及び選択特性を比較するために、分析スケールのHPLCカラム、250mm長x4.6mm idを使用した。この様々な固定相には、(1)標準的シリカ、及び(2)アミノプロピルシリカ(Eka Chemicals(Bohus,Sweden)より入手。)及び(3)Amide−80(シリカに結合したアミド部分、Tosoh Biosep LLC(Japan)より入手。)が含まれた。これらの充填物は全て、10μm 粒子サイズ及び120Åポア直径であった。この標準的シリカは、単純な液体クロマトグラフィー系としての実験であり、L−プロリンで修飾した移動相を用い、その結果、そのシリカはプロリンで飽和された。J.Nti−Gyabaahら、“Large−scale purification of pneumocandin B0,a precursor for CNACIDAS”,PREP−2003,16th International Symposium,Exhibit and Workshops on Preparative/Process Chromatography,San Francisco,CA,Wednesday,July 2,2003又は米国仮出願番号第60/422,356号(2002年10月30日出願)を参照のこと。
Fisher Scientific(Pittsburg,PA,USA)からのHPLCグレードの溶媒を用いて、3種類からなる移動相及びフィード希釈液(84/9/7 v/v/v 酢酸エチル、メタノール及び水)を調製した。プロリン溶出シリカ実験に対して使用したL−プロリンは、Ajinomoto(Japan)から入手した。L−プロリンは、3種類からなる移動相で、0.12g/Lになるように溶解した。フィードは、PnB5、PnC0及びPnE0を含有する溶液のアリコートと純粋なPnB0(標準的シリカゲル法により精製された未精製PnB0)を混合することにより、これらの類似物が、およそ1g/Lで存在するPnB0の、およそ10%濃度でそれぞれ存在するように調製した。PnC0に富む溶液は、標準的なシリカゲル法を用いたシリカゲルにおいて未精製PnB0の注入からテールカット(tailcut)分画を選択することにより得た。PnB5及びPnE0に富む溶液は、プロリン溶出法を用いてシリカゲルにおいてPnB0の注入からフォアカット(Forecut)分画を選択し、次に、PnB0の分析的分析(この実施例で後に述べる。)のために使用したものと同様であるがフィードローディング量が大きい逆相法により、それらの部分をさらに精製することにより得た。HPLC実験ならびに分画分析には、ダイオードアレイ検出器を備えたAgilent HP−1100HPLCシステム(Waldbronn、Germany)を使用し、検出のために278nmの波長を用いた。
各注入に対して、1g/L フィード溶液 10μLを注入した。移動相の流速は、1.1mL/minであった。プロリン修飾移動相及び標準的シリカを用いた実験のために、L−プロリンを〜0.12g/Lになるようにこの移動相に溶解し、次にその溶液の〜480mLを、シリカカラムを介して押し出した(そのシリカをプロリンでインシトゥ被覆するために)。この実験のために、溶出液としてL−プロリン含有溶液を使用した。この実験から得られたクロマトグラムを図1、2、3及び4で示す。
各実験に対して、分画を回収し、米国仮出願番号第60/422,356号(2002年10月30日出願)(参照により本明細書に組み込む。)又はJ.Nti−Gyabaahら、“Large−scale purification of pneumocandin B0,a precursor for CANCIDAS”,PREP−2003,16th International Symposium,Exhibit and Workshops on Preparative/Process Chromatography,San Francisco,CA,Wednesday,July 2,2003に記載の方法を用いて順相及び逆相HPLCでそれらを分析することによりピークを確認した。次に、ニューモカンディンB0、E0、B5及びC0の保持時間を用いて、容量比を計算し、そこから、PnB0と3種類の類似物との間の選択性を得た。その結果を図1から5及び表2に示す。
固定相としてAmide−80を用いたニューモカンディンB0の精製
Tosoh Biosep LLCから、250mm長x4.6mm idカラム(10μm粒子サイズ、8nm ポアサイズ、球状)としてAmide−80結合相を得た。対照として、Princeton Chromatographyから販売されているW.R.Grace/Davison シリカゲルGrade−631カラム(250mm長x4.6mm id,16−20Tm粒子サイズ、60Åポアサイズ、不均一)を用いて、プロリン修飾移動相で平衡化した非修飾シリカカラムにおいて同じフィード物質を用いた分離を行った。両実験に対する移動相組成は、88/9/7 v/v/v 酢酸エチル/メタノール/水(e/m/w)であり;プロリン修飾移動相はまた、L−プロリン 0.12g/Lを含有していた。溶媒は全て、Fisher ScientificからのHPLCグレード試薬であった。プロリンは、Ajinomoto(Japan)から得た。
Tosoh Biosep LLCから、250mm長x4.6mm idカラム(10μm粒子サイズ、8nm ポアサイズ、球状)としてAmide−80結合相を得た。対照として、Princeton Chromatographyから販売されているW.R.Grace/Davison シリカゲルGrade−631カラム(250mm長x4.6mm id,16−20Tm粒子サイズ、60Åポアサイズ、不均一)を用いて、プロリン修飾移動相で平衡化した非修飾シリカカラムにおいて同じフィード物質を用いた分離を行った。両実験に対する移動相組成は、88/9/7 v/v/v 酢酸エチル/メタノール/水(e/m/w)であり;プロリン修飾移動相はまた、L−プロリン 0.12g/Lを含有していた。溶媒は全て、Fisher ScientificからのHPLCグレード試薬であった。プロリンは、Ajinomoto(Japan)から得た。
61.9%の純度を有するニューモカンディンB0(PnB0 未精製)の部分精製調製物を、カラムフィードを調製するために使用した。PnB0未精製物を調製するための方法は、米国特許第5,202,309号、第5,194,377号及び第6,610,822号で与えられる。Amide−80の実験に対して、75/20/8 v/v/v 酢酸エチル、メタノール及び水の混合液に、フィード溶液中のニューモカンディンB0濃度が〜45g/Lになるように、PnB0未精製物を溶解することによりフィード溶液を調製した。対照実験のために、75/17/8 v/v/v 酢酸エチル/メタノール/水のフィード溶媒混合液を用い、1.5g/L プロリン及び〜45g/L PnB0とした。
使用前に、カラムにメタノール 10カラム体積(cv)を流し、移動相 10cvで平衡化した。各注入に対して、フィード溶液 1.2mLを注入(〜15g/Lベッドに相当)した。移動相流速は、〜0.5mL/minであった。各実験に対して、分画を回収し、分離の特性を評価するために分析した。一貫した溶出プロファイルであることを確実にするために、各注入を繰り返した。プロリン修飾移動相を用いた実験に対して、最初の注入前に、プロリン含有移動相の〜480mLを、非修飾シリカカラムを介して押し出した。
分析方法:
各実験に対して、分画を回収し、逆相及び順相HPLCにより分析した。その試料をAgilent HP−1100分析的HPLC系で分析した。逆相法においてPnB0とともに溶出される、PnC0を除く殆どの種を定量するために、逆相HPLCを使用した。PnC0を測定するために、順相HPLCアッセイを使用した。
各実験に対して、分画を回収し、逆相及び順相HPLCにより分析した。その試料をAgilent HP−1100分析的HPLC系で分析した。逆相法においてPnB0とともに溶出される、PnC0を除く殆どの種を定量するために、逆相HPLCを使用した。PnC0を測定するために、順相HPLCアッセイを使用した。
PnC0の測定
順相PnB0アッセイ、5μmの粒子サイズ及び120ÅのポアサイズであるYMCシリカカラム(SL12S05−2546WT)を用いた定組成HPLC法により、PnC0の量を測定した。カラムは、250x4.6mm i.d.であり、25℃で維持した。溶出は、84/9/7 酢酸エチル/メタノール/水 溶出液の定組成であった。流速は、1.2mL/minであり、検出は、278nmのUV吸収により行った。産物試料は、注入前に特別な調製を必要としなかった。
順相PnB0アッセイ、5μmの粒子サイズ及び120ÅのポアサイズであるYMCシリカカラム(SL12S05−2546WT)を用いた定組成HPLC法により、PnC0の量を測定した。カラムは、250x4.6mm i.d.であり、25℃で維持した。溶出は、84/9/7 酢酸エチル/メタノール/水 溶出液の定組成であった。流速は、1.2mL/minであり、検出は、278nmのUV吸収により行った。産物試料は、注入前に特別な調製を必要としなかった。
PnB0及び他の種の測定
PnB0/PnC0及び、PnE0及びPnB5を含む他の種を測定するために、逆相HPLCアッセイを使用する。この逆相アッセイにおいて、4μm粒子サイズ、80ÅポアサイズのYMC J’Sphereカラム(JM08S04−2546WT)を用いて、勾配HPLC法を使用する。カラムは、250x4.6mm i.d.であり、30℃で維持した。使用した2種類の移動相は、0.1% リン酸(A)及びアセトニトリル(B)であった。溶出勾配は、60%A及び40%Bから開始して、1%A及び99%Bまで、1.5mL/minで45分間にわたり変化させ、220nmでUV検出を行った。分析前に、窒素下で試料を吹き込み乾燥し、元の濃度になるようにメタノールに再溶解した。
PnB0/PnC0及び、PnE0及びPnB5を含む他の種を測定するために、逆相HPLCアッセイを使用する。この逆相アッセイにおいて、4μm粒子サイズ、80ÅポアサイズのYMC J’Sphereカラム(JM08S04−2546WT)を用いて、勾配HPLC法を使用する。カラムは、250x4.6mm i.d.であり、30℃で維持した。使用した2種類の移動相は、0.1% リン酸(A)及びアセトニトリル(B)であった。溶出勾配は、60%A及び40%Bから開始して、1%A及び99%Bまで、1.5mL/minで45分間にわたり変化させ、220nmでUV検出を行った。分析前に、窒素下で試料を吹き込み乾燥し、元の濃度になるようにメタノールに再溶解した。
結果
非修飾シリカゲルにおいてプロリン修飾移動相を用いて得られる典型的なクロマトグラムを図6に示す。図に示されるように、PnB0が、大きな高濃度の分画として溶出され、PnE0及びPnB5(先行するピークで溶出)から良く分離されている。
非修飾シリカゲルにおいてプロリン修飾移動相を用いて得られる典型的なクロマトグラムを図6に示す。図に示されるように、PnB0が、大きな高濃度の分画として溶出され、PnE0及びPnB5(先行するピークで溶出)から良く分離されている。
Amide−80カラムにおける実験から得られたクロマトグラムを図7に示す。この実験では、移動相又はフィード溶媒のいずれにもプロリン又は他の修飾剤を用いなかった。対照の場合よりもメタノール濃度がわずかに高いフィード溶媒混合液を使用する。この固相におけるPnB0の保持力は、プロリン修飾移動相を用いた対照実験に対して得られたもの(図6で示す。)と同様であった。実際に、溶出プロファイルは、対照システムと、主要なPnB0ピークがより平らで広がっていることを除き、非常に似ている。
〜6から14カラム体積(cv)から多くの分画を回収し、その分画を順相及び逆相HPLC両方で分析した。この分析により、PnE0及びPnB5などの類似物がPnB0から良く分離され、これらの類似物が、図7において〜6から8.5cvに相当する分画に含有されたことが確かめられた。順相分析の結果から、殆どのPnC0が、図7において13から14cvに相当する分画に分離されたことが示された。したがって、図7において示される〜8.5から13cvに相当する分画は、回収率が>90%の純粋で高濃度の部分を得るために合わせることができる。
固定相としてN−L−プロリル−3−アミノプロピルシリカを用いたニューモカンディンB0の精製
N−L−プロリル−3−アミノプロピルシリカ固定相を含有してカラムを調製した。この固定相の調製方法は、実施例5及び6で示した。利用したカラムは、250mm長x4.6mm i.d.であり、5μmの粒子サイズ及び60Åのポアサイズである、ES Industriesの球状シリカに結合したプロリン−アミド部分を含有していた。この実験は、他の部分は、実施例8で述べたものと同じであり、その結果はまた、図6で説明されるその実施例における対照に対して評価し得る。
N−L−プロリル−3−アミノプロピルシリカ固定相を含有してカラムを調製した。この固定相の調製方法は、実施例5及び6で示した。利用したカラムは、250mm長x4.6mm i.d.であり、5μmの粒子サイズ及び60Åのポアサイズである、ES Industriesの球状シリカに結合したプロリン−アミド部分を含有していた。この実験は、他の部分は、実施例8で述べたものと同じであり、その結果はまた、図6で説明されるその実施例における対照に対して評価し得る。
N−L−プロリル−3−アミノプロピルシリカ結合相における実験から得たクロマトグラムを図8に示す。示されるように、フィードにおけるメタノール濃度が高くなっており、この系からプロリンが除外されているにもかかわらず、この相におけるPnB0の保持力は、プロリン修飾移動相を用いて非修飾シリカにおいて得られたもの(図6で示す。)と同様であった。しかし、重要な違いがいくつかある。第一に、対照のシステムにおいて通常観察される大きな溶媒の最前部のピークが小さくなっているように見えることである。その他の違いは、主要なPnB0ピークの開始部分において溶出される混入物が互いに良く分離されているように見えることである。最後に、PnB0ピークのテール部分が長くなっていることである(図6と比較)。
〜10から21cvから多くの分画を回収し、順相及び逆相HPLCの両方によりこの分画を分析した。分析結果から、PnB5及びPnE0などの主要な初期に溶出される混入物がPnB0からはっきりと分離されたことが示された。これらの混入物は、図8における10−13cvの範囲に相当する分画に殆ど含有される。順相分析の結果から、PnC0の殆どが図8における13から14cvの範囲に相当する分画に分離されたことが示された。したがって、〜13から19cv(図8で示される。)は、回収率が>90%の純粋で高濃度の部分を得るために合わせることができる。
固定相としてN−メチルカルバモイル−3−アミノプロピルシリカを用いたニューモカンディンB0の精製
N−メチルカルバモイル−3−アミノプロピルシリカ固定相を含有してカラムを調製した。この固定相の調製方法は、実施例3及び4で示した。この実施例におけるカラムは、250mm長x4.6mm idであり、5μmの粒子サイズ及び60Åのポアサイズである、ES Industriesの球状シリカに結合したN−メチルカルバモイル−3−アミノプロピルシリカ部分を含有していた。この実験は、他の部分は、実施例8で述べたものと同じであり、その結果はまた、図6で説明されるその実施例における対照に対して評価し得る。
N−メチルカルバモイル−3−アミノプロピルシリカ固定相を含有してカラムを調製した。この固定相の調製方法は、実施例3及び4で示した。この実施例におけるカラムは、250mm長x4.6mm idであり、5μmの粒子サイズ及び60Åのポアサイズである、ES Industriesの球状シリカに結合したN−メチルカルバモイル−3−アミノプロピルシリカ部分を含有していた。この実験は、他の部分は、実施例8で述べたものと同じであり、その結果はまた、図6で説明されるその実施例における対照に対して評価し得る。
N−メチルカルバモイル−3−アミノプロピルシリカ結合相における実験から得たクロマトグラムを図9に示す。フィードにおけるメタノール濃度が高くなっており、この系からプロリンが除外されているにもかかわらず、この相におけるPnB0の保持力は優れていた(図6と比較。)。〜21から40cvから多くの分画を回収した。その分画を順相及び逆相HPLCにより分析した。分画分析から、PnE0及びPnB5などの初期に溶出される類似物がPnB0から良く分離され、図9に示される、〜21から25cvに相当する分画に含有されていたことが示された。順相分析の結果から、PnC0などの遅れて溶出される類似物からのPnB0の分離が対照のプロセスに相当するものであることが示された。この実験の高濃度部分において数%レベルで、先行する実施例においては存在したとしても痕跡レベルでしか見られなかった開環分解が存在した。この分解以外、この遅れて溶出される分画は非常に純粋であった。
固定相としてN−β−アラニンアミドプロピルシリカを用いたニューモカンディンB0の精製
N−β−アラニンアミドプロピルシリカ固定相を含有してカラムを調製した。この固定相の調製方法は、実施例1及び2で示した。使用したカラムは、250mm長x4.6mm i.d.であり、5μmの粒子サイズ及び60Åのポアサイズである、ES Industriesの球状シリカに結合したアミノプロピル部分に結合した1個のプロピルアミド部分を含有していた。この実験は、他の部分は、実施例8で述べたものと同じであったが、固定相は、評価した他の殆どのものよりも保持力が著しく強く、このカラムからPnB0を完全に溶出するためには、より強力な移動相(75/17/8 酢酸エチル/メタノール/水)が必要であった。この結果は、なお、図6で示される対照に対して評価し得る。
N−β−アラニンアミドプロピルシリカ固定相を含有してカラムを調製した。この固定相の調製方法は、実施例1及び2で示した。使用したカラムは、250mm長x4.6mm i.d.であり、5μmの粒子サイズ及び60Åのポアサイズである、ES Industriesの球状シリカに結合したアミノプロピル部分に結合した1個のプロピルアミド部分を含有していた。この実験は、他の部分は、実施例8で述べたものと同じであったが、固定相は、評価した他の殆どのものよりも保持力が著しく強く、このカラムからPnB0を完全に溶出するためには、より強力な移動相(75/17/8 酢酸エチル/メタノール/水)が必要であった。この結果は、なお、図6で示される対照に対して評価し得る。
N−β−アラニンアミドプロピルシリカ結合相における実験から得られたクロマトグラムを図10に示す。プロリン溶出法の系で通常観察される大きな溶媒の最前部のピークが、小さくなっているように見えることを指摘することは重要である。他の違いは、主要なPnB0ピークの開始部で溶出される主要な混入物が良く分離されていることである。
〜6から13cvから、いくつかの分画を回収した。この分画を順相及び逆相HPLCの両方で分析した。この分析結果から、PnE0及びPnB5などの初期に溶出される類似物がPnB0からはっきりと分離されていることが示された。これらの混入物は、殆ど、〜6から8cvに相当する分画に含有されていた。順相分析の結果から、PnC0の殆どが11から13cvに相当する分画に分離されたことが分かった。〜8から11cvに相当する分画(図10で示される。)は、回収率が>90%の純粋で高濃度の部分を得るために合わせることができる。低いレベルの開環分解が高濃度部分において検出された。この保持力により、溶媒の強度においてフィード溶媒混合液と非常に近い溶出のための移動相を使用することができ、その結果、非常に安定したクロマトグラフィー性能が得られるので、これは、より優れた固定相である可能性がある。
Claims (14)
- 前記移動相が1又は複数の溶媒を含む溶媒系である、請求項3に記載の方法。
- 前記溶媒系中の溶媒が、水、メタノール、エタノール、イソプロパノール、ヘキサン、ヘプタン、酢酸エチル、酢酸イソプロピル、アセトニトリル、メチルt−ブチルエーテル(MTBE)及び塩化メチレンからなる群から選択される、請求項4に記載の方法。
- 前記液体クロマトグラフィー系が、ペプチドの精製用である、請求項4に記載の方法。
- 前記液体クロマトグラフィー系が、リポペプチドの精製用である、請求項4に記載の方法。
- 前記リポペプチドが、カスポファンギン(caspofungin)、ミカファンギン(micafungin)、シロファンギン(cilofungin)、アンデュリファンギン(andulifungin)及びダプトマイシン(daptomycin)の発酵産物前駆体である、請求項7に記載の方法。
- 前記リポペプチドが、カスポファンギンの前駆体、ニューモカンディン(pneumocandin)B0である、請求項8に記載の方法。
- 前記移動相が、水、メタノール及び酢酸エチルを含む溶媒系である、請求項9に記載の方法。
- 前記ペプチドが、オキシトシン(oxytocin)又はブラジキニン(bradykinin)である、請求項6に記載の方法。
- 前記移動相が、溶媒系を含み、該溶媒系中の溶媒が、水、メタノール、エタノール、イソプロパノール、ヘキサン、ヘプタン、酢酸エチル、酢酸イソプロピル、アセトニトリル、メチルt−ブチルエーテル(MTBE)及び塩化メチレンからなる群から選択される、請求項12に記載の方法。
- 前記溶媒系が、酢酸エチル、メタノール及び水の混合液である、請求項13に記載の方法。
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