CN108250272A - 卡泊芬净高效分离纯化方法 - Google Patents

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周永正
张亚辉
张雁
王科然
吴元华
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    • C07K—PEPTIDES
    • C07K7/00—Peptides having 5 to 20 amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof
    • C07K7/50—Cyclic peptides containing at least one abnormal peptide link
    • C07K7/54—Cyclic peptides containing at least one abnormal peptide link with at least one abnormal peptide link in the ring
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Abstract

本发明的目的在于提供一种分离纯化卡泊芬净的方法。其特征在于：采用表面修饰了极性基团的硅胶亲水材料，将卡泊芬净粗品用一定比例的有机溶剂‑缓冲盐溶液溶解，上样后按照一定比例的有机溶剂‑缓冲盐进行洗脱，纯化后脱盐得到色谱纯度大于99％，关键杂质A0小于0.1％的卡泊芬净，该方法实现了对卡泊芬净的高效分离纯化与制备，具有稳定性好、上样量大、操作简便、可控等特点，适用于生产化的分离和纯化。

Description

卡泊芬净高效分离纯化方法
技术领域
本发明属于卡泊芬净的分离纯化与精制技术领域，特别提供一种卡泊芬净的高效分离纯化方法。
背景技术
卡泊芬净(Caspofungin)来自棘白菌素家族的大环脂肽，能抑制许多丝状真菌和酵母菌细胞壁β-(1，3)-D-葡聚糖合成，破坏细胞壁完整性，而产生杀真菌作用。卡泊芬净结构式如下：
卡泊芬净是肺念菌素B0(纽莫康定B0)的半合成衍生物，由Glarea Lozoyensis发酵产物合成而来。所合成的卡泊芬净，必须经过分离纯化后，方可达到药用标准的纯度。
由于药物中的杂质一般没有治疗作用，有的还具有一定的毒性，是影响药品安全性的主要因素。美国食品药品监督管理局(FDA)要求过程杂质控制在规定界限以下。对于原料药，FDA要求尽可能无杂质，使其在临床应用时尽可能安全，因此提高卡泊芬净纯度至关重要。
美国专利US5552521中公开了以制备型HPLC纯化卡泊芬净的方法，以C18柱为固定相，以乙腈/水/醋酸为洗脱剂。该方法仅能获得纯度为78％的产物，产品纯度较低。中国专利CN104250290公开了采用C18反相色谱填料为固定相分离纯化卡泊芬净的方法，该方法得到的卡泊芬净的纯度在97％左右，但未涉及卡泊芬净关键杂质A的控制。中国专利CN102076707(WO2009158034)公开了采用反相色谱填料(C8或C18)为分离介质，可控制杂质A较低的含量，但需要经过至少2次的反相色谱柱分离纯化。
现有技术在制备过程中大多工艺效率低，上样量低、纯化后产品纯度不高且能耗高。因此提高工艺效率，提高产品纯度对卡泊芬净的工业化生产有着很重要的意义。
发明内容
本发明提供了一种卡泊芬净的高效分离纯化方法，该方法的原理是依靠固定相表面吸附作用，混合物中的组分在固定相中、随着流动相移动的迁移速度不同，从而按一定次序由固定相中流出，依次接取目标馏分，根据馏分分析结果合并馏分即可得到目标组分。
本发明技术方案如下：
一种卡泊芬净的高效分离纯化方法，其特征在于：采用液相色谱法分离纯化卡泊芬净，采用表面修饰了极性基团的硅胶作为亲水分离填料，采用有机溶剂和缓冲盐混合液为洗脱剂。
其中，所述亲水分离填料中极性基团为羟基，羧基，氨基，酰氨基，氰基中的一种或多种。
所述填料表面极性基团键合相粒径5～100μm，孔径
所述有机溶剂为异丙醇，甲醇，乙醇，乙腈，丙酮，正丁醇中的一种或多种。
所述缓冲盐水溶液采用Na+、K+、H+、NH4 +之一种或多种为阳离子，Cl-、HCOO-、CH3COO-、F-、PO4 3-、ClO4 -、HCO3 -之一种或多种为阴离子。
作为优选的技术方案，有机溶剂/缓冲盐体积比为5/95～95/5；洗脱液流速为0.1倍柱体积/min～0.8倍柱体积/min；分离纯化制备的馏分收集方式为从卡泊芬净流出开始接到卡泊芬净流完；上样量为0.1％～5％。
本发明所述卡泊芬净的高效分离纯化方法，其特征在于，具体步骤如下：
1)、称取适量卡泊芬净粗品，用洗脱液配制成浓度为10mg/mL-1000mg/mL的上样液；
2)、采用色谱柱内径3～1000mm；分离纯化体系采用表面修饰了极性基团的亲水硅胶填料，填料中极性基团为羟基，羧基，氨基，酰氨基，氰基中的一种或多种；填料表面极性基团键合相粒径5～100μm，孔径 采用有机溶剂和缓冲盐混合液为洗脱剂；有机溶剂为异丙醇，甲醇，乙醇，乙腈，丙酮，正丁醇中的一种或多种；缓冲盐水溶液采用Na+、K+、H+、NH4 +之一种或多种为阳离子，Cl-、HCOO-、CH3COO-、F-、PO4 3-、ClO4 -、HCO3 -之一种或多种为阴离子；有机溶剂/缓冲盐的体积比为5/95～95/5；洗脱液流速为0.1倍柱体积/min～0.8倍柱体积/min；上样量为0.1％～5％，从卡泊芬净流出开始接馏分到卡泊芬净流完停止，纯化后脱盐可以得到卡泊芬净纯度99％以上，关键杂质A0小于0.1％的产品。
本发明具有如下优点：
1.高选择性：针对当前卡泊芬净纯化遇到的问题，本发明提出采用表面修饰了极性基团的硅胶填料作为分离材料。卡泊芬净混合组分在亲水色谱柱上得到较好的分离，很好解决了卡泊芬净化合物在纯硅胶填料上载样量不高，纯化后纯度不高的问题。
2.分离速度快：该方法纯化速度快，消耗溶剂量少，解决了大孔树脂在实验过程中，纯化速度较慢，产生废液较多，污染较大的问题，拥有很好的市场前景。
3.重复性好，操作简单可控，易实现自动化，过程稳定。
附图说明
图1卡泊芬净制备图。
图2纯化后卡泊芬净产品分析图。
具体实施方式
现结合实例，对本发明做进一步说明。实例仅限于说明本发明，而非对本发明的限定。
实施例1
卡泊芬净粗品1g，溶于10mL乙醇-高氯酸铵溶液中，进样量10mL，上样量0.33％；使用键合了羧基的亲水硅胶柱(柱规格50×250mm，粒径10μm，孔径填料质量300g)，流速100mL/min；上样结束后立即用77％(V/V)乙醇-10mM高氯酸铵溶液等度洗脱；紫外检测器，检测波长220nm，从目标峰出峰开始接馏分到峰回到基线停止，脱盐后可以得到卡泊芬净纯度99.1％以上，杂质A0小于0.1％的产品。
实施例2
其它条件与实施例1相同，不同之处在于填料孔径是纯化后脱盐可以得到卡泊芬净纯度99.5％以上，杂质A0小于0.1％的产品。
实施例3
其它条件与实施例1相同，不同之处在于使用羧基亲水硅胶柱(柱规格50×1000mm，粒径30μm，孔径填料质量1.2kg)，纯化后脱盐可以得到卡泊芬净纯度99.5％以上，杂质A0小于0.1％的产品。
实施例4
其它条件与实施例1相同，不同之处在于使用羟基亲水硅胶柱(柱规格600×250mm，粒径15μm，孔径填料质量300g)，上样后用79％(V/V)甲醇-30mM乙酸铵溶解等度洗脱，纯化后脱盐可以得到卡泊芬净纯度99.5％以上，杂质A0小于0.1％的产品。
实施例5
卡泊芬净粗品300g，溶于2.2L甲醇-60mM甲酸铵中，进样量2.2L，上样量1.0％。使用羟基亲水硅胶柱(柱规格500×250mm，粒径10μm，孔径填料质量30kg)，流速8L/min。上样后用78％(V/V)甲醇-60mM甲酸铵等度洗脱；紫外检测器，检测波长210nm，从目标峰出峰开始接馏分到峰回到基线停止，纯化后脱盐可以得到卡泊芬净纯度99.4％以上，杂质C0小于0.1％的产品。
实施例6
其它条件与实施例5相同，不同之处在于卡泊芬净粗品380g，溶于10L乙醇-水中，进样量10L，上样量0.5％。使用羟基亲水硅胶柱(柱规格800×250mm，粒径60μm，孔径填料质量76kg)，流速18L/min。纯化后脱盐可以得到卡泊芬净纯度99.1％以上，杂质A0小于0.1％的产品。
实施例7
其它条件与实施例5相同，不同之处在于硅胶柱粒径30μm，纯化后脱盐可以得到卡泊芬净纯度99％以上，杂质A0小于0.1％的产品。
实施例8
其它条件与实施例5相同，不同之处在于流速为6L/min，纯化后脱盐可以得到卡泊芬净纯度99.1％以上，杂质A0小于0.1％的产品。
实施例9
其它条件与实施例5相同，不同之处在于称取卡泊芬净粗品3.6g，溶于40mL甲醇-水中，进样量40mL，上样量2％；羟基亲水硅胶柱(柱规格50×150mm，粒径15μm，孔径填料质量180g)，流速80mL/min；纯化后脱盐可以得到卡泊芬净色谱纯度99.3％以上，杂质A0小于0.1％的产品。
上述实施例只为说明本发明的技术构思及特点，其目的在于让熟悉此项技术的人士能够了解本发明的内容并据以实施，并不能以此限制本发明的保护范围。凡根据本发明精神实质所作的等效变化或修饰，都应涵盖在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种卡泊芬净的高效分离纯化方法，其特征在于：采用液相色谱法分离纯化卡泊芬净，采用表面修饰了极性基团的硅胶作为亲水分离填料，采用有机溶剂和缓冲盐混合液为洗脱剂。
2.按照权利要求1所述卡泊芬净的高效分离纯化方法，其特征在于：所述亲水分离填料中极性基团为羟基，羧基，氨基，酰氨基，氰基中的一种或多种。
3.按照权利要求1所述卡泊芬净的高效分离纯化方法，其特征在于：所述填料粒径5～100μm，孔径
4.按照权利要求1所述卡泊芬净的高效分离纯化方法，其特征在于：所述有机溶剂为异丙醇，甲醇，乙醇，乙腈，丙酮，正丁醇中的一种或多种。
5.按照权利要求1所述卡泊芬净的高效分离纯化方法，其特征在于：所述缓冲盐水溶液采用Na+、K+、H+、NH4 +之一种或多种为阳离子，Cl-、HCOO-、CH3COO-、F-、PO4 3-、ClO4 -、HCO3 -之一种或多种为阴离子。
6.按照权利要求1所述卡泊芬净的高效分离纯化方法，其特征在于：有机溶剂/缓冲盐体积比为5/95～95/5。
7.按照权利要求1所述卡泊芬净的高效分离纯化方法，其特征在于：洗脱液流速为0.1倍柱体积/min～0.8倍柱体积/min。
8.按照权利要求1所述卡泊芬净的高效分离纯化方法，其特征在于：分离纯化制备的馏分收集方式为从卡泊芬净流出开始接到卡泊芬净流完。
9.按照权利要求1所述卡泊芬净的高效分离纯化方法，其特征在于：上样量为0.1％～5％。
10.按照权利要求1所述卡泊芬净的高效分离纯化方法，其特征在于，具体步骤如下：
1)、称取适量卡泊芬净粗品，用洗脱液配制成浓度为10mg/mL-1000mg/mL的上样液；
2)、采用色谱柱内径3～1000mm；分离纯化体系采用表面修饰了极性基团的亲水硅胶填料，填料中极性基团为羟基，羧基，氨基，酰氨基，氰基中的一种或多种；填料表面极性基团键合相粒径5～100μm，孔径 采用有机溶剂和缓冲盐混合液为洗脱剂；有机溶剂为异丙醇，甲醇，乙醇，乙腈，丙酮，正丁醇中的一种或多种；缓冲盐水溶液采用Na+、K+、H+、NH4 +之一种或多种为阳离子，Cl-、HCOO-、CH3COO-、F-、PO4 3-、ClO4 -、HCO3 -之一种或多种为阴离子；有机溶剂/缓冲盐的体积比为5/95～95/5；洗脱液流速为0.1倍柱体积/min～0.8倍柱体积/min；上样量为0.1％～5％，从卡泊芬净流出开始接馏分到卡泊芬净流完停止。
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