CN102816207A - 卡泊芬净前体pneumocandinB0组分的纯化方法 - Google Patents

Abstract

一种卡泊芬净前体pneumocandinB₀组分的纯化方法，包括以下步骤：将PB₀组分粗品进行反相柱层析，收集并减压浓缩，得到半纯品；将步骤1中所得PB₀半纯品上正相柱层析，得高纯度PB₀组分，正反相液相分析，色谱纯度均大于95%。与现有技术相比，本发明的有益效果是：使用正、反相柱子，对PB₀组分进行纯化，不仅纯化步骤简单，纯化效果好，而且对设备要求低，可实现规模化生产，生产可行性高；特别是此发明方法分离PB₀组分收率高，而成本却较低。

Description

卡泊芬净前体pneumocandinB0组分的纯化方法

技术领域

本发明涉及卡泊芬净的合成、纯化，具体涉及卡泊芬净前体的纯化方法。 

  

背景技术

卡泊芬净（caspofungin）是第一个获准上市的棘白菌素类新型抗真菌药物，是一种半合成环状脂质化合物，相对分子量为1213.42。其前体化合物pneumocandinB₀（PB₀）是从Glarea lozoyensis中提取得到。卡泊芬净的作用靶点是真菌细胞壁的葡聚糖合酶，不同于传统的作用于真菌浆膜中麦角固醇的抗真菌药。与目前3类系统性抗真菌药物：多烯类（两性霉素B）、吡咯类(如酮康唑、氟康唑、伊曲康唑)、氟嘧啶类相比，表现出更为广泛的抗菌谱：对多数念珠菌属及其他抗真菌药耐药的真菌均有效，且抗菌活性强，耐受性好。卡泊芬净通过非竞争性抑制1.3-β-D肽聚糖合成酶而阻止真菌细胞壁的合成，从而迅速杀灭真菌，大大降低耐药菌的出现。因此，卡泊芬净是一类高效、低毒、广谱的抗真菌药物。且因其良好的药代动力学特性而可每日1次给药，故具有较好的临床应用前景。 

从pneumocandinB₀组分出发，需经数步化学反应，最终得到卡泊芬净。若PB₀纯度过低，直接会影响后面每步化学反应产物的收率，且对最终产物卡泊芬净的精制纯化带来相当大的困难，因此制备高纯度PB₀组分是卡泊芬净合成、纯化的关键。由于PB₀组分是通过微生物发酵获得，而微生物发酵产物成分较多，再加上PB₀组分结构复杂，对热、碱均不稳定，所以给制备高纯度的PB₀组分增加了难度。 

目前，已有对pneumocandinB₀组分纯化的报道，但是存在或纯化的效果不理想，或操作极其复杂，导致产品收率降低，很难实现规模化生产。 

 PneumocandinB₀组分的结构式如下： 

发明内容

本发明的目的是为了提供一种卡泊芬净前体pneumocandinB₀（PB₀）组分的纯化方法，该方法纯化效果好、操作步骤简单，可作为规模化生产高纯度PB₀组分的有效手段。 

本发明采用以下技术方案： 

一种卡泊芬净前体pneumocandinB₀组分的纯化方法，上述的纯化方法包括以下步骤：

步骤1，将PB₀组分粗品进行反相柱层析，收集并减压浓缩，得到半纯品；

步骤2，将步骤1中所得PB₀半纯品上正相柱层析，得高纯度PB₀组分，正反相液相分析，色谱纯度均大于95%。

上述的步骤1中所使用的反相层析柱为C8或C18, 反相层析柱的柱料的粒径为20～50um。 

步骤2中上述的正相柱柱料是普通正相硅胶上键合有氰基（CN），其粒径为200～300目。 

步骤1中上述的将PB₀组分粗品进行反相柱层析具体包括以下步骤： 

步骤1-1，用体积百分比为95%的乙醇装柱，再用体积百分比为45%的乙醇，该溶液同时含有体积百分比为1‰的甲酸，平衡柱子；

步骤1-2，上样；

步骤1-3，用体积百分比为50%的乙醇，该溶液同时含有体积百分比为1‰的甲酸，冲洗柱子，之后再用此溶液进行解析；

步骤1-4，分段收集，将所需收集液减压浓缩，得到半纯品。

在进行步骤1-2上样之前，需要用体积百分比为45%的乙醇溶液溶解PB₀组分粗品，溶解后样品浓度为5～10g/L，再用甲酸调pH值为3.0—4.0，然后再上样。 

上述的步骤1中反相柱层析的解析剂是体积百分比为55%—58%的乙醇，同时该溶液中含体积百分比为1‰的甲酸。 

步骤2中上述的正相柱层析采用干法上样，具体方法为：将步骤1中所得半成品与正相氰基硅胶以重量比为1:5的比例进行混合，均匀后倒入层析柱中。 

上述的步骤2中进行正相柱层析时，在上样前，先用体积比为乙酸乙酯：甲醇：水=82: 10:8的溶液平衡柱子，上样后，继续用此溶液作为解析剂进行解析。 

上述的水中含有体积比为1‰～2‰的氯化钠。 

步骤1中上述的减压浓缩温度为45～60℃。 

与现有技术相比，本发明的有益效果是：使用正、反相柱子，对PB₀组分进行纯化，不仅纯化步骤简单，纯化效果好，而且对设备要求低，可实现规模化生产，生产可行性高；特别是此发明方法分离PB₀组分收率高，而成本却较低。 

具体实施方式

下面结合实施例对本发明进行更进一步详细说明，但不是对本发明的限定。另外需说明，实验操作是在室温20～30℃条件下进行。 

实施例1

将5g PB₀组分粗品溶解于500ml 45%乙醇（V/V），其中另含1‰甲酸（V/V）的溶液中，再用甲酸调pH值为3.0，过滤得500ml滤液，对该滤液进行反相HPLC分析，主峰（含PB₀、PC₀组分，二者在反相色谱中表现为同一色谱峰）组分的含量为3.62g，正相HPLC分析（PB₀、PC₀组分可分开），PB₀组分的含量为2.43g，将上述滤液上反相柱。

C18反相柱柱料（日本富士公司）规格：Lot.No.HU00200，Pro. No.SMB100，Size:20/45um。 

称量C18反相柱料300g，用95%乙醇（V/V）溶液装柱，然后用45%乙醇，含1‰甲酸（（V/V）溶液平衡柱子。上样完毕，用50%乙醇（V/V），含1‰甲酸（V/V）溶液冲洗柱子2000ml，用55%乙醇（V/V）（其中同时含1‰甲酸（V/V））溶液解析，洗脱2500ml后开始收集，总计收集2500ml后停止收集，合并收集液，在温度为45～60℃减压浓缩，得浓缩样品（PB₀组分半纯品）2.48g，反相HPLC分析主峰（含PB₀、PC₀组分，二者在反相色谱中表现为同一色谱峰）纯度为91.5%，正相HPLC分析PB₀纯度为75.6%。 

将上述PB₀组分半纯品2.48g与12.4g正相氰基硅胶混合，均匀后倒入正相层析柱中，上正相柱。 

正相柱柱料：上述的正相氰基硅胶，是指普通正相硅胶上键合有氰基（CN），粒径为200～300目。 

称量上述正相氰基硅胶250g，用甲醇装柱，然后用乙酸乙酯：甲醇：水（水中含有1‰的氯化钠）=82:10:8溶液平衡柱子。上样完毕，继续用乙酸乙酯：甲醇：水（水中含有1‰的氯化钠）=82:10:8溶液解析，洗脱2500ml后开始收集，总计收集2000ml后停止收集，合并收集液，50～55℃减压浓缩，得PB₀组分高纯品1.32g，反相HPLC分析主峰（含PB₀、PC₀组分，二者在反相色谱中表现为同一色谱峰）纯度为95.9%，正相HPLC分析PB₀纯度为95.1%，异构体PC₀纯度为0.8%。 

  

实施例2

将5g PB₀组分粗品溶解于500ml 45%乙醇（V/V）的溶液中，再用甲酸调pH4.0，过滤得500ml滤液，对该滤液进行反相HPLC分析，主峰（含PB₀、PC₀组分，二者在反相色谱中表现为同一色谱峰）组分的含量为3.62g，正相HPLC分析（PB₀、PC₀组分可分开），PB₀组分的含量为2.43g，将上述滤液上反相柱。

C18反相柱柱料（日本富士公司）规格：Lot.No.HU00200，Pro. No.SMB100，Size:20/45um。 

称量C18反相柱料300g，用95%乙醇溶液装柱，然后用45%乙醇，含1‰甲酸（（V/V）溶液平衡柱子。上样完毕，用50%乙醇（V/V）（其中，同时含1‰甲酸（V/V））的溶液冲洗柱子2000ml，用58%乙醇（V/V）（其中，同时含1‰甲酸（V/V））溶液解析，洗脱2000ml后开始收集，总计收集1800ml后停止收集，合并收集液，55～60℃减压浓缩，得浓缩样品2.38g，反相HPLC分析主峰（含PB₀、PC₀组分，二者在反相色谱中表现为同一色谱峰）纯度为90.7%，正相HPLC分析PB₀纯度为74.9%。 

将实施例2中的PB₀组分半纯品2.38g与11.9g正相氰基硅胶混合，均匀后倒入正相层析柱中，上正相柱。 

正相柱柱料：上述的正相氰基硅胶，是指普通正相硅胶上键合有氰基（CN），粒径为200～300目。 

称量正相氰基硅胶250g，用甲醇装柱，然后用乙酸乙酯：甲醇：水（水中含有2‰的醋酸钠）=82:10:8溶液平衡柱子。上样完毕，继续用乙酸乙酯：甲醇：水（水中含有2‰的氯化钠）=82:10:8溶液解析，洗脱3500ml后开始收集，总计收集2500ml后停止收集，合并收集液，50～55℃减压浓缩，得PB₀组分高纯品1.42g，反相HPLC分析主峰（含PB₀、PC₀组分，二者在反相色谱中表现为同一色谱峰）纯度为96.1%，正相HPLC分析PB₀纯度为95.5%，异构体PC₀纯度为0.5 %。 

本说明书中各个实施例采用递进的方式描述，每个实施例重点说明的都是与其它实施例的不同之处，各个实施例之间相同相似部分相互参见即可。

在本说明书中所谈到的“实施例1”、“实施例2”、 等，指的是结合该实施例描述的具体特征、结构或者特点包括在本申请概括性描述的至少一个实施例中。在说明书中多个地方出现同种表述不是一定指的是同一个实施例。进一步来说，结合任一实施例描述一个具体特征、结构或者特点时，所要主张的是结合其他实施例来实现这种特征、结构或者特点也落在本发明的范围内。 

尽管这里参照本发明的多个解释性实施例对本发明进行了描述，但是，应该理解，本领域技术人员可以设计出很多其他的修改和实施方式，这些修改和实施方式将落在本申请公开的原则范围和精神之内。更具体地说，在本申请公开、附图和权利要求的范围内，可以对主题组合布局的组成步骤和/或布局进行多种变型和改进。除了对组成步骤和/或布局进行的变型和改进外，对于本领域技术人员来说，其他的用途也将是明显的。 

Claims (10)

1.一种卡泊芬净前体pneumocandinB₀组分的纯化方法，其特征在于：所述的纯化方法包括以下步骤：

步骤1，将PB₀组分粗品进行反相柱层析，收集并减压浓缩，得到半纯品；

步骤2，将步骤1中所得PB₀半纯品上正相柱层析，得高纯度PB₀组分，正反相液相分析，色谱纯度均大于95%。

2.根据权利要求1所述的卡泊芬净前体pneumocandinB₀组分的纯化方法，其特征在于：所述的步骤1中所使用的反相层析柱为C8或C18, 反相层析柱的柱料的粒径为20～50um。

3.根据权利要求1所述的卡泊芬净前体pneumocandinB₀组分的纯化方法，其特征在于：步骤2中所述的正相柱柱料是普通正相硅胶上键合有氰基（CN），其粒径为200～300目。

4.根据权利要求1所述的卡泊芬净前体pneumocandinB₀组分的纯化方法，其特征在于：步骤1中所述的将PB₀组分粗品进行反相柱层析具体包括以下步骤：

步骤1-1，用体积百分比为95%的乙醇装柱，再用体积百分比为45%的乙醇，该溶液同时含有体积百分比为1‰的甲酸，平衡柱子；

步骤1-2，上样；

步骤1-3，用体积百分比为50%的乙醇，该溶液同时含有体积百分比为1‰的甲酸，冲洗柱子，之后再用此溶液进行解析；

步骤1-4，分段收集，将所需收集液减压浓缩，得到半纯品。

5.根据权利要求3所述的卡泊芬净前体pneumocandinB₀组分的纯化方法，其特征在于：在进行步骤1-2上样之前，需要用体积百分比为45%的乙醇溶液溶解PB₀组分粗品，溶解后样品浓度为5～10g/L，再用甲酸调pH值为3.0—4.0，然后再上样。

6.根据权利要求1所述的卡泊芬净前体pneumocandinB₀组分的纯化方法，其特征在于：所述的步骤1中反相柱层析的解析剂是体积百分比为55%—58%的乙醇，同时该溶液中含体积百分比为1‰的甲酸。

7.根据权利要求1所述的卡泊芬净前体pneumocandinB₀组分的纯化方法，其特征在于：步骤2中所述的正相柱层析采用干法上样，具体方法为：将步骤1中所得半成品与正相氰基硅胶以重量比为1:5的比例进行混合，搅拌均匀后倒入层析柱中。

8.根据权利要求1所述的卡泊芬净前体pneumocandinB₀组分的纯化方法，其特征在于：所述的步骤2中进行正相柱层析时，在上样前，先用体积比为乙酸乙酯：甲醇：水=82: 10:8的溶液平衡柱子，上样后，继续用此溶液作为解析剂进行解析。

9.根据权利要求8所述的卡泊芬净前体pneumocandinB₀组分的纯化方法，其特征在于：所述的水中含有体积比为1‰～2‰的氯化钠。

10.根据权利要求1所述的卡泊芬净前体pneumocandinB₀组分的纯化方法，其特征在于：步骤1中所述的减压浓缩温度为45～60℃。