CN102850343A - 一种山莨菪中生物碱的前处理方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种山莨菪中生物碱的前处理方法，该方法适用于山莨菪中生物碱的分离制备及定性定量工作中的样品前处理。方法内容主要有是将山莨菪药材粉碎后加乙醇溶液提取，然后收集提取液，浓缩得浸膏，取浸膏用硅胶基质的强阳离子交换（SCX）固相萃取（SPE）材料对粗碱中的生物碱进行选择性富集，以得到生物碱富集片段，用于山莨菪中生物碱的分离分析及分离制备。本发明选择性好、所得馏分生物碱含量高，且能大大提高山莨菪中生物碱的分离分析及分离制备效率。前处理方法运行过程重复性高和可操作性好，易于实现标准化和产业化，对高效选择性获取山莨菪中生物富集碱馏分具有一定的指导意义。

Description

一种山莨菪中生物碱的前处理方法

技术领域

本发明涉及天然药物的前处理，具体的说是山莨菪中生物碱的前处理方法，主要涉及山莨菪中生物碱的提取和SPE过程。

技术背景

藏药山莨菪为茄科东莨菪属植物山莨菪Scopolia tangutica Maxim.的根.具有解痉、镇痛、催眠作用的功效(郭鹏举等，青海地道地产药材.西安：陕西科学技术出版社，1996)。主产于甘肃、青海、西藏、四川、云南等省区。其中，以东莨菪碱、莨菪碱和樟柳碱等为代表的托品烷类生物碱是山莨菪的主要活性成分(周云龙，植物生物学，2004)。药理研究表明，山莨菪中的托品烷类生物碱具有解痉、镇痛等功效，(许璟瑛等，分析试验室，2009，12)。由于托品烷类生物碱的多种药理学活性，山莨菪中托品烷类生物碱的研究一直是人们的研究热点。但生物碱在天然产物中往往含量较低，如果不利用有效的前处理方法对生物碱进行富集，很难实现天然产物中生物碱的分离分析和分离制备。所以，天然产物中生物碱的前处理方法一直都是研究者关注的热点。

在已有的报道中，生物碱类化合物的前处理方法研究颇受青睐。在这些前处理方法中，液液萃取由于具有处理样品量大等优点而被广泛应用(J.Zhang等，Journal of Separation Science，2009，32，1401)，但液液萃取也存在有机溶剂消耗大，容易乳化，选择性低等缺点。因此除液液萃取外，其它的前处理方法也受到很大程度的重视，如固相萃取。固相萃取有效的克服了液液萃取有机溶剂消耗大，容易乳化等缺点，为生物碱的前处理开辟了新的有力途径。同时，材料的多样性也是固相萃取的一大优势。多样的固相萃取材料可供研究者选择，以应对不同样品处理的需要，为快速、有效的处理样品提供了有力保证。在众多的固相萃取材料中，C18是广泛使用的一种材料(L.Kursinszki等，Journal of Chromatography A，2005，32，1091)。在利用C18处理生物碱的过程中，可以采用不同的洗脱剂，根据分析物极性的差异，将提取物分成若干片段。相比传统的液液萃取，利用C18的固相萃取方法在选择性上已经有很大的改进，而且具有溶剂消耗少，可避免乳化现象等优点，但C18固相萃取材料所提供的选择性仍然不能满足生物碱高选择性富集的需要。为了进一步提高生物碱选择性富集的效果，研究者们提出将阳离子交换材料用于生物碱的前处理(T.Mroczek等，Journal of Chromatography A，2002，29，949)。生物碱在酸性甚至中性及弱碱性条件下以阳离子形式存在，而非生物碱以不带电荷或者阴离子形式存在，当用阳离子交换材料处理提取物时，仅生物碱被离子交换作用保留下来，而非生物碱被除去。传统的固相萃取方法通常在水溶液下进行，而生物碱中往往存在一些疏水性较强的生物碱化合物，这些化合物很难在水溶液中溶解，所以传统的固相萃取方法较难实现这类生物碱的选择性富集。疏水性较强的生物碱在有机溶剂中较容易溶解，发展有机溶剂下进行的固相萃取方法以富集这类生物碱，对这类生物碱的药物开发及分离分析工作十分重要。

发明内容

本发明的目的是提供一种山莨菪中生物碱的前处理方法，主要涉及生物碱的提取以及固相萃取选择性富集生物碱过程。

其利用硅胶基质的强阳离子交换高效地从山莨菪提取物选择性的富集生物碱，该方法可广泛用于山莨菪中生物碱的分离分析和分离制备。

为实现上述目的，本发明采用的技术方案为：

一种山莨菪中生物碱的前处理方法，

1)提取：称取山莨菪原药材，加入其重量8-12倍的重量浓度70％-95％乙醇于70-100摄氏度提取，过滤，并于滤渣中加入乙醇溶液重复上述提取、过滤过程0-3次，每次提取1-3小时，合并提取液并浓缩至相对密度为1.0-1.2的浸膏，得到山莨菪醇提物组分；

2)固相萃取SPE过程：

a.将山莨菪醇提物溶解到纯甲醇中，配成粗碱溶液；

b.取硅胶基质的强阳离子交换(SCX)SPE柱，用纯甲醇活化、平衡，取粗碱溶液上样；

c.用3-10倍柱体积甲醇清洗SPE柱以除去粗碱中的非生物碱；

d.最后用3-10柱体积高氯酸铵-甲醇溶液洗脱获得生物碱；其中高氯酸铵于甲醇溶液浓度为150-250mM。

所述浸膏至生物碱富集片段的获得过程是指于浸膏中加入甲醇，使其于甲醇体积浓度达到20-80％(最好为20-50％)上SPE柱；或，使其于甲醇体积浓度达到20-80％(最好为20-50％)，如果加入浸膏后甲醇液混浊时，需室温静置1-3小时，过滤，取滤液上SPE柱；

取硅胶基质的强阳离子交换(SCX)SPE柱，用纯甲醇活化、平衡，取粗碱溶液上样；用3-10倍柱体积甲醇清洗SPE柱以除去粗碱中的非生物碱；最后用3-10柱体积高氯酸铵-甲醇溶液洗脱获得生物碱，以得到生物碱富集片段，用于山莨菪中生物碱的分离分析和分离制备。

所获得生物碱的定量分析过程：以粒径3-5微米的C18硅胶键合固定相为色谱填料，以乙腈(A)和水(B)和离液盐系统(C)为流动相，将山莨菪生物碱富集片段于色谱上进行梯度洗脱；洗脱梯度(V/V)为：0-20分钟，10％-30％A，20％C；20-30分钟，30-50％A，20％C；

其中离液盐系统由以下成分组成，50-150毫摩尔每升高氯酸钠、30-100毫摩尔每升磷酸二氢钠和1-3毫升高氯酸，通过液相色谱分析对生物碱中的成份进行定量。

本发明的优点：

1、对生物碱的选择性富集效果好。本发明采用了先进的固相萃取填料和处理方法。利用硅胶基质强阳离子交换固相萃取柱提供的对生物碱的高选择性，可以保证几乎所有非生物碱的除去以及生物碱的富集。

2、强大的疏水性生物碱的富集能力。本发明中采用的硅胶基质的强阳离子交换固相萃取材料相对于聚合物基质的强阳离子交换材料，具有在有机溶剂中高稳定性的特点。所以，硅胶基质强阳离子交换SPE材料可用于本发明中，发展非水SPE方法，用于疏水性生物碱的富集，疏水性粗碱的处理，以及醇提生物粗碱的无稀释SPE处理。此外，硅胶基质的SCX也可以用在传统的固相萃取方法中，用于极性生物碱的富集。

3.重现性好。本发明利用硅胶基质的强阳离子交换固相萃取材料稳定的性能，以及该材料良好的批次重现性，可以保证样品前处理方法的重现性和稳定性。

4.能极大的方便了山莨菪中生物碱的分离分析和分离制备。本发明对生物碱所具备的高选择性，可有效的去除山莨菪粗碱中的非生物碱，极大的方便了山莨菪中生物碱的分离分析及分离制备。

附图说明

图1本发明实施例1和2用于东莨菪碱和莨菪碱的选择性富集色谱图(λ＝204nm)；

图2本发明实施例1用于山莨菪中生物碱的选择性富集质谱图；

图3本发明实施例1用莨菪碱和东莨菪碱做SPE方法验证(λ＝204nm)；

图4本发明中实施例2所涉及山莨菪中东莨菪碱和莨菪碱的定量分析(λ＝204nm)。

具体实施方式

实施例1：山莨菪中生物碱的选择性富集

以托品烷类生物碱为代表的生物碱在山莨菪中广泛存在，并因其高的活性受到普遍关注。但山莨菪的提取物中存在大量的非生物碱，对生物碱的分离分析和分离制备存在极大的干扰。尤其是需要在低波长下检测的托品烷类生物碱，非生物碱的干扰非常严重。为了除去提取物中非生物碱并对生物碱，尤其是一些低丰度的生物碱进行富集，生物碱的前处理方法尤为重要。

为了验证该前处理方法的可行性，选取具有代表性的托品烷类生物碱--东莨菪碱和莨菪碱标准品进行了方法验证。分别取10毫克莨菪碱和东莨菪碱溶于甲醇，配成1毫克每毫升的莨菪碱-甲醇溶液和东莨菪碱-甲醇溶液。取100mg硅胶基质的强阳离子交换(SCX)SPE柱，用纯甲醇活化、平衡，取1毫升莨菪碱-甲醇溶液和1毫升东莨菪碱-甲醇溶液上样。用3毫升甲醇清洗SPE柱。最后用3毫升250毫摩尔每升的高氯酸铵-甲醇溶液洗脱生物碱。经过液相分析发现(图1)，生物碱富集在了高氯酸铵-甲醇洗脱液中，由此可知，该方法能用于生物碱的有效富集。从理论分析可知，非生物碱由于缺乏阳离子交换作用的保留，在甲醇洗脱部分即可被除去，从图1可以看出，生物碱并未在上样和甲醇洗脱部分出现，由此可以推测，该方法能够实现生物碱和非生物碱的分离。

验证了前处理方法对生物碱的富集的有效性之后，将该方法应用到山莨菪提取物的前处理中。首先，称取山莨菪原药材95克，加入1升95％乙醇80摄氏度回流提取、过滤，滤渣重复上述提取过程1次，每次提取3小时，将提取液合并浓缩，得浸膏1.65毫升(相对密度1.05)；然后，将上述发展的SPE方法用于山莨菪浸膏的简化。将1毫升山莨菪醇浸膏溶解到纯甲醇中，配成5毫升粗碱溶液。取硅胶基质的强阳离子交换(SCX)SPE柱(100毫克，3毫升)，用3毫升纯甲醇活化、平衡，取0.2毫升粗碱溶液上样。用3毫升甲醇清洗SPE柱以除去粗碱中的非生物碱。最后用3毫升250毫摩尔每升的高氯酸铵-甲醇溶液洗脱生物碱。最后，我们得到了山莨菪的生物碱富集片段，该片段所含的非生物碱极少，极大的简化了山莨菪中生物碱的分离分析和分离制备工作。

以粒径5微米的C18硅胶键合固定相为色谱填料，以含0.08％TFA的乙腈(A)和0.1％TFA(B)为流动相，将山莨菪生物碱富集片段和SPE处理前的样品进行分析比较。洗脱梯度(V/V)为：0-20min，5％-50％A；20-30min，50-90％A。

为了检验该前处理方法对生物碱选择性富集的有效选那个，对SPE过程中得到的生物碱富集片段进行了质谱分析。采用电喷雾离子(ESI)源：正离子扫描，电喷雾电压为3200伏，扫描范围m/z100-1000，雾化气压力雾化温度：350摄氏度，加热毛细管温度：120摄氏度。从图3分析可知，该片段中化合物的[M+H]+几乎都是偶数。根据氮规则可知，从SPE洗脱下来的生物碱富集片段几乎都是含氮化合物。主要化合物的[M+H]+列于表1。由此可知，本发明对山莨菪中的生物碱具有很好的选择性富集效果。

综合图1，图2及表1可看出，经过SPE之后的样品得到极大的简化，为山莨菪中生物碱尤其是托品烷类生物碱的分离分析及分离制备提供了极大的方便。

表1SPE洗脱下来的生物碱富集片段中主要化合物的[M+H]+

实施例2：山莨菪中东莨菪碱和莨菪碱的定量分析

东莨菪碱和莨菪碱是山莨菪中常见的两种生物碱，由于具有高的活性和药用价值，受到普遍的关注。因此，山莨菪药材中东莨菪碱和莨菪碱的定量分析对山莨菪药材的质量控制具有重要的意义。本实施案例中，将我们开发的生物碱前处理方法，用于山莨菪中这两种生物碱的定量分析，为它们的定量分析开发一种简单可行的新方法。

为了验证该前处理方法处理东莨菪碱和莨菪碱的可行性，在处理实际样品之前，先用东莨菪碱和莨菪碱标准品进行了验证。首先，分别取10毫克莨菪碱和东莨菪碱溶于甲醇，配成1毫克每毫升的莨菪碱-甲醇溶液和东莨菪碱-甲醇溶液。取100mg硅胶基质的强阳离子交换(SCX)固相萃取柱，用纯甲醇活化、平衡，取1毫升莨菪碱-甲醇溶液和1毫升东莨菪碱-甲醇溶液上样。用3毫升甲醇清洗SPE柱。最后用3毫升250毫摩尔每升的高氯酸铵-甲醇溶液洗脱SPE柱上富集的生物碱。收集上述SPE洗脱片段，并进行了色谱分析(如图1)。色谱分析方法如下：以粒径5微米的C18硅胶键合固定相为色谱填料，以含0.08％TFA的乙腈(A)和0.1％TFA(B)为流动相，将山莨菪生物碱富集片段和SPE处理前的样品进行分析比较。洗脱梯度(V/V)为：0-20min，5％-50％A；结果发现，只在盐甲醇洗脱片段有东莨菪碱和莨菪碱存在。此结果说明，该前处理方法能对东莨菪碱和莨菪碱进行很好的保留、富集。

该前处理方法在处理标准品得到较好的效果之后，我们将它应用到山莨菪提取物得处理当中。首先，称取山莨菪原药材95克，加入1升95％乙醇80摄氏度回流提取3小时，过滤，并对药渣重复上述提取过程1次，合并提取液并浓缩，得浸膏1.65毫升(相对密度1.0-1.2)；然后，用上述开发的SPE方法处理所的浸膏。

将1毫升山莨菪醇浸膏溶解到纯甲醇中，配成5毫升粗碱溶液。取硅胶基质的强阳离子交换(SCX)SPE柱(100毫克，3毫升)，用3毫升纯甲醇活化、平衡，取0.2毫升粗碱溶液上样。用3毫升甲醇清洗SPE柱以除去粗碱中的非生物碱。最后用3毫升250毫摩尔每升的高氯酸铵-甲醇溶液洗脱生物碱。最后，我们得到了山莨菪的生物碱富集片段，该片段所含的非生物碱极少，极大的简化了山莨菪中生物碱的定量分析过程并提高了定量的准确度。

虽然山莨菪的提取物在前处理过程中已经得到了很好的简化，但现有的分离分析方法仍然无法将待分析物及其干扰峰分离。因此，在已有的分离分析方法基础上我们发展了新的液相分析方法。以粒径5微米的C18硅胶键合固定相为色谱填料，以乙腈(A)和水(B)和离液盐系统(C)为流动相，将山莨菪生物碱富集片段进行梯度洗脱。其中离液盐系统由以下成分组成，100毫摩尔每升高氯酸钠、50毫摩尔每升磷酸二氢钠和2毫升高氯酸。洗脱梯度(V/V)为：0-20分钟，10％-30％A，20％C；20-30分钟，30-50％A，20％C。有效地前处理方法结合适当的色谱分离方法，原本在提取物中很难确定的东莨菪碱和莨菪碱色谱峰被明显的显现了出来，如图4所示，在该方法中，实现了东莨菪碱和莨菪碱与它们干扰峰的基线分离，为山莨菪中这两种生物碱的定量分析提出了一种简单而有效的新方法。

利用东莨菪碱和莨菪碱标准品对山莨菪药材中的东莨菪碱和莨菪碱进行定量分析。实验过程中，所得的相关参数如下：

表2线性范围

n为线性曲线的取点数

表3方法的重现性

另外，在该实验过程中还对该方法的回收率、LOD、LOQ进行了测试：东莨菪碱和莨菪碱的回收率分别是105.6％和107.2％；东莨菪碱的LOD和LOQ分别为0.25微克每毫升和0.5微克每毫升；莨菪碱的LOD和LOQ分别为4微克每毫升和5微克每毫升。同时，还对实际样品的回收率进行了测试：东莨菪碱和莨菪碱的回收率分别是98.51％和91.12％。

最后，结合出色的液相分析方法，对山莨菪中东莨菪碱和莨菪碱进行定量分析，结果如下：东莨菪碱的含量为4.049mg/g，莨菪碱的含量为10.18mg/g。

本发明适用于山莨菪中生物碱的分离制备及定性定量工作中的样品前处理本发明选择性好、所得馏分生物碱含量高，且能大大提高山莨菪中生物碱的分离分析及分离制备效率。前处理方法运行过程重复性高和可操作性好，易于实现标准化和产业化，对高效选择性获取山莨菪中生物富集碱馏分具有一定的指导意义。

Claims (4)

1.一种山莨菪中生物碱的前处理方法，其特征在于：

1）提取：称取山莨菪原药材，加入其重量8-12倍的重量浓度70%—95%乙醇于70-100摄氏度提取，过滤，并于滤渣中加入乙醇溶液重复上述提取、过滤过程0-3次，每次提取1-3小时，合并提取液并浓缩至相对密度为1.0-1.2的浸膏，得到山莨菪醇提物组分；

2）SPE过程：

a.将山莨菪醇提物溶解到纯甲醇中，配成粗碱溶液；

b.取硅胶基质的强阳离子交换（SCX）SPE柱,用纯甲醇活化、平衡，取粗碱溶液上样；

c.用3-10倍柱体积甲醇清洗SPE柱以除去粗碱中的非生物碱；

d.最后用3-10柱体积高氯酸铵-甲醇溶液洗脱获得生物碱；其中高氯酸铵于甲醇溶液浓度为150-250mM。

2.按照权利要求1所述的方法，其特征在于：所述浸膏至生物碱富集片段的获得过程是指于浸膏中加入甲醇，使其于甲醇体积浓度达到20-80%上SPE柱；或，使其于甲醇体积浓度达到20-80%，如果加入浸膏后甲醇液混浊时，需室温静置1-3小时，过滤，取滤液上SPE柱；

取硅胶基质的强阳离子交换（SCX）SPE柱,用纯甲醇活化、平衡，取粗碱溶液上样；用3-10倍柱体积甲醇清洗SPE柱以除去粗碱中的非生物碱；最后用3-10柱体积高氯酸铵-甲醇溶液洗脱获得生物碱，以得到生物碱富集片段，用于山莨菪中生物碱的分离分析和分离制备。

3.按照权利要求2所述的方法，其特征在于：

所述浸膏至生物碱富集片段的获得过程是指于浸膏中加入甲醇，使其于甲醇体积浓度达到20-50%上SPE柱；或，使其于甲醇体积浓度达到20-50%，如果加入浸膏后甲醇液混浊时，需室温静置1-3小时，过滤，取滤液上SPE柱。

4.按照权利要求1或2所述的方法，其特征在于：

所获得生物碱的定量分析过程：以粒径3-5微米的C18硅胶键合固定相为色谱填料，以乙腈（A）和水(B)和离液盐系统(C)为流动相，将山莨菪生物碱富集片段于色谱上进行梯度洗脱；洗脱梯度（V/V）为：0-20分钟，10%-30%A，20%C；20-30分钟，30-50%A，20%C；

其中离液盐系统由以下成分组成，50-150毫摩尔每升高氯酸钠、30-100毫摩尔每升磷酸二氢钠和1-3毫升高氯酸，通过液相色谱分析对生物碱中的成份进行定量。

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