CN111875600A - 一种山莨菪中莨菪烷类生物碱的制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种山莨菪中莨菪烷类生物碱的制备方法，它包括如下步骤：取山莨菪，粉碎，加乙酸甲醇溶液提取，提取液经陶瓷膜过滤除杂，再经有机膜分离除去杂质，透过有机膜的水溶液干燥，即得。本发明制备方法，提取效率高，操作方便，利于工业化生产推广应用。

Description

一种山莨菪中莨菪烷类生物碱的制备方法
技术领域
本发明具体涉及一种山莨菪中莨菪烷类生物碱的制备方法。
背景技术
山莨菪[Anisodus tanguticus(Maxim.)Pascher]为茄科山莨菪属多年生草本植物。山莨菪野生分布于青海、西藏、四川、甘肃地区，生长于海拔2200-4200m的高山地区山坡、路边。藏医常以山莨菪种子和根入药，其根的藏药名为“唐冲那保”，具有麻醉镇痛、杀虫、镇静、解毒作用，主要用于治疗病毒恶疮、虫病、皮肤炭疽病及癫狂等症。山莨菪中主要有效成分是莨菪烷类生物碱，如阿托品、东莨菪碱、山莨菪碱、樟柳碱等，这些化合物具有阻断乙酰胆碱受体的作用，能扩张微血管，改善微循环以及抗休克等作用。
目前，从植物中提取莨菪烷类生物碱的技术报道较少，王环等人在测定山莨菪中东莨菪碱、山莨菪碱的含量实验中，采用弱碱性试剂氨水和氯仿进行浸提，该方法提取效率低下，而且氯仿的毒性较强，因此，需要建立一种新的、高效、低毒的莨菪烷类生物碱的提取方法。
发明内容
为解决上述问题，本发明提供了一种山莨菪中莨菪烷类生物碱的制备方法，它包括如下步骤：
取山莨菪，粉碎，加乙酸甲醇溶液提取，提取液经陶瓷膜过滤，取滤液干燥，即得。
进一步地，所述山莨菪是茄科、山莨菪属多年生宿根草本Anisodus tanguticus(Maxim.)Pascher.的根和/或地上部分。
进一步地，所述山莨菪与乙酸甲醇溶液的质量体积比为1g：5～20ml，优选为1g：10ml。
更进一步地，所述乙酸甲醇溶液中乙酸浓度为3～5％，优选4％。
进一步地，所述提取为超声提取或回流提取；所述超声提取时间5～60min，功率500-2500w，优选时间30min，功率2500w；所述热回流提取时间1.5-3h，温度为65-85℃，优选时间2.5h，温度75℃。
进一步地，所述陶瓷膜的孔径为0.2μm或0.1μm。
进一步地，所述干燥为冷冻干燥，冷冻干燥的参数为冷肼温度-65～-40℃，干燥时间15～40小时。
本发明还提供了一种前述方法制备的莨菪烷类生物碱，所述莨菪烷类生物碱总含量大于50％。
进一步地，所述莨菪烷类生物碱中含有樟柳碱、东莨菪碱、山莨菪碱和阿托品。
本发明最后提供了一种前述莨菪烷类生物碱在制备抗乙酰胆碱受体的药物中的用途。
本发明山莨菪中莨菪烷类生物碱的制备方法，提取效率高，操作方便，利于工业化生产推广应用，通过本发明方法制备得到的莨菪烷类生物碱含量高，活性强，经试验证明，其对于平滑肌收缩具有明显的抑制作用，在用于抗乙酰胆碱受体的药物中的前景广阔。
显然，根据本发明的上述内容，按照本领域的普通技术知识和惯用手段，在不脱离本发明上述基本技术思想前提下，还可以做出其它多种形式的修改、替换或变更。
以下通过实施例形式的具体实施方式，对本发明的上述内容再作进一步的详细说明。但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下的实例。凡基于本发明上述内容所实现的技术均属于本发明的范围。
附图说明
图1山莨菪中莨菪烷类生物碱的总离子流图
具体实施方式
实施例1、山莨菪中莨菪烷类生物碱的制备
取山莨菪根500g，粉碎，加入5000ml含有4％的乙酸甲醇溶液，在功率2500w条件下，超声提取30min，提取液经0.2μm陶瓷膜过滤除杂，滤液冷冻干燥(冷冻干燥条件为冷肼温度为-65℃，干燥时间为15小时)，即得莨菪烷类生物碱。
实施例2、山莨菪中莨菪烷类生物碱的制备
取山莨菪根2kg，粉碎，加入30L含有4％的乙酸甲醇溶液，在功率1000w条件下，超声提取20min，提取液经0.1μm陶瓷膜过滤除杂，滤液冷冻干燥(冷冻干燥条件冷肼温度为-55℃，干燥时间为25小时)，即得莨菪烷类生物碱。
实施例3、山莨菪中莨菪烷类生物碱的制备
取山莨菪根4kg，粉碎，加入60L含有4％的乙酸甲醇溶液，在提取温度为65℃条件下，回流提取时间1.5h，提取液经0.1μm陶瓷膜过滤除杂，滤液冷冻干燥(冷冻干燥条件冷肼温度为-52℃，干燥时间为30小时),即得莨菪烷类生物碱。
实施例4、山莨菪中莨菪烷类生物碱的制备
取山莨菪根2kg，粉碎，加入40L含有4％的乙酸甲醇溶液，在提取温度为55℃条件下，回流提取时间2h，提取液经0.1μm陶瓷膜过滤除杂，滤液冷冻干燥(冷冻干燥条件冷肼温度为-50℃，干燥时间为25小时),即得莨菪烷类生物碱。
以下通过试验例来说明本发明的有益效果。
试验例1山莨菪中莨菪烷类生物碱制备工艺
称取山莨菪根500g，粉碎，加入2500ml含有4％的乙酸甲醇溶液，分别用浸提、超声提取、回流提取三种方式提取，提取液经0.2μm陶瓷膜过滤除杂，滤液在冷肼温度为-65℃条件下，冷冻干燥15小时，再用液相色谱法检测干燥后提取物中的莨菪烷类生物碱含量，具体提取条件和提取物检测结果见表1。
其中，液相色谱检测方法为：①称取制备得到的提取物，加甲醇超声溶解，提取液离心，取上清液用于测试；②分别精密称取樟柳碱、山莨菪碱、东莨菪碱、阿托品对照品，加甲醇溶解，得对照品溶液；③通过如下色谱条件检测样品溶液和对照品溶液：色谱柱为安捷伦(150mm×4.6mm i.d.,4μm)；以0.1％甲酸溶液为流动相A，以0.1％甲酸乙腈为流动相B，线性梯度洗脱，0min 10％B；20min 10％B；流速为1ml/min；柱温为30℃；检测波长为210nm；进样量：10μl；④用外标法计算各生物碱含量，莨菪烷类生物碱含量为各生物碱含量之和。
表1不同提取方法得到的提取物中莨菪烷类生物碱含量
提取方法 过滤方法 莨菪烷类生物碱含量
5％氨水氯仿浸提24h 陶瓷膜除杂 20％
4％乙酸甲醇浸提24h 陶瓷膜除杂 23％
4％乙酸甲醇超声提取0.5h 陶瓷膜除杂 58％
4％乙酸甲醇回流提取2h 陶瓷膜除杂 56％
从表1可见，浸提需要时间长，得到的提取物中莨菪烷类生物碱含量低，而超声提取和回流提取不仅耗时短，得到的莨菪烷类生物碱含量均大于50％，因此，山莨菪根中莨菪烷类生物碱提取采用超声或回流提取。
2、提取溶剂的选择
称取山莨菪根500g，粉碎，加入2500ml含有不同浓度的酸性溶液，再分别在功率2000w下超声提取1h和在温度70℃下回流提取2h，提取液经0.2μm陶瓷膜过滤除杂，滤液在冷肼温度为-65℃的条件下，冷冻干燥15小时，再用“1”项下的检测方法测定干燥后提取物中的莨菪烷类生物碱含量，具体提取溶剂和提取物检测结果见表2。
表2不同提取溶剂得到的提取物中莨菪烷类生物碱含量
Figure BDA0002625951120000041
从表2可见，在回流提取和超声提取两种提取方式下，提取溶剂均为3％，4％，5％乙酸甲醇溶液时，莨菪烷类生物碱的含量大于50％，当提取溶剂为4％的乙酸甲醇时，莨菪烷类生物碱的含量最大。
3、料液比选择
称取多份山莨菪根，粉碎，加入不同体积的4％乙酸甲醇溶液，再分别在功率2000w下超声提取1h和在温度70℃下回流提取2h，提取液经0.2μm陶瓷膜过滤除杂，滤液在冷肼温度为-65℃的条件下，冷冻干燥15小时，再用“1”项下的检测方法测定干燥后提取物中的莨菪烷类生物碱含量，具体料液比和提取物检测结果见表3。
表3不同料液比提取得到的提取物中莨菪烷类生物碱含量
提取溶剂 纯化方法 莨菪烷类生物碱含量
4％乙酸甲醇超声提取1h(料液比1:5) 陶瓷膜除杂 52％
4％乙酸甲醇超声提取1h(料液1:10) 陶瓷膜除杂 56％
4％乙酸甲醇超声提取1h(料液1:15) 陶瓷膜除杂 54％
4％乙酸甲醇超声提取1h(料液1:20) 陶瓷膜除杂 52％
4％乙酸甲醇超声提取1h(料液1:25) 陶瓷膜除杂 46％
4％乙酸甲醇超声提取1h(料液1:30) 陶瓷膜除杂 42％
4％乙酸甲醇回流提取2h(料液1:5) 陶瓷膜除杂 52％
4％乙酸甲醇回流提取2h(料液1:10) 陶瓷膜除杂 58％
4％乙酸甲醇回流提取2h(料液1:15) 陶瓷膜除杂 57％
4％乙酸甲醇回流提取2h(料液1:20) 陶瓷膜除杂 54％
4％乙酸甲醇回流提取2h(料液1:25) 陶瓷膜除杂 43％
4％乙酸甲醇回流提取2h(料液1:30) 陶瓷膜除杂 42％
从表3可见，在回流提取和超声提取两种提取方式下，当料液比为1:5～1:20时，莨菪烷类生物碱的含量大于50％，当料液比为1:10时，莨菪烷类生物碱含量最大。
4、提取时间选择
称取多份山莨菪根500g，粉碎，加入5000ml4％乙酸甲醇溶液，再分别在功率2000w下超声提取和在温度70℃下回流提取，提取液经0.2μm陶瓷膜过滤除杂，滤液在冷肼温度为-65℃的条件下，冷冻干燥15小时，再用“1”项下的检测方法测定干燥后提取物中的莨菪烷类生物碱含量，具体提取时间和提取物检测结果见表4。
表4不同提取时间得到的提取物中莨菪烷类生物碱含量
提取时间 纯化方法 莨菪烷类生物碱含量
4％乙酸甲醇超声提取10min 陶瓷膜除杂 <10％
4％乙酸甲醇超声提取20min 陶瓷膜除杂 52％
4％乙酸甲醇超声提取30min 陶瓷膜除杂 58％
4％乙酸甲醇超声提取40min 陶瓷膜除杂 56％
4％乙酸甲醇超声提取50min 陶瓷膜除杂 55％
4％乙酸甲醇超声提取60min 陶瓷膜除杂 54％
4％乙酸甲醇超声提取90min 陶瓷膜除杂 36％
4％乙酸甲醇超声提取120min 陶瓷膜除杂 34％
4％乙酸甲醇回流提取0.5h 陶瓷膜除杂 29％
4％乙酸甲醇回流提取1h 陶瓷膜除杂 32％
4％乙酸甲醇回流提取1.5h 陶瓷膜除杂 52％
4％乙酸甲醇回流提取2h 陶瓷膜除杂 54％
4％乙酸甲醇回流提取2.5h 陶瓷膜除杂 59％
4％乙酸甲醇回流提取3h 陶瓷膜除杂 53％
4％乙酸甲醇回流提取3.5h 陶瓷膜除杂 46％
4％乙酸甲醇回流提取4h 陶瓷膜除杂 42％
4％乙酸甲醇回流提取4.5h 陶瓷膜除杂 38％
4％乙酸甲醇回流提取5h 陶瓷膜除杂 36％
从表4可见，超声提取时间为20-60min时，莨菪烷类生物碱的含量大于50％，当超声提取时间为30min，莨菪烷类生物碱含量最大；当回流提取时间1.5h-3h，莨菪烷类生物碱的含量大于50％，当回流提取时间为2.5h，莨菪烷类生物碱含量最大。
5超声功率优化
称取多份山莨菪根500g，粉碎，加入5000ml4％乙酸甲醇溶液，再分别在不同功率下超声提取30min，提取液经0.2μm陶瓷膜过滤除杂，滤液在冷肼温度为-65℃的条件下，冷冻干燥15小时，再用“1”项下的检测方法测定干燥后提取物中的莨菪烷类生物碱含量，具体提取时间和提取物检测结果见表5。
表5不同超声功率提取得到的提取物中莨菪烷类生物碱含量
提取功率 纯化方法 莨菪烷类生物碱含量
4％乙酸甲醇超声(功率500w) 陶瓷膜除杂 53％
4％乙酸甲醇超声(功率1000w) 陶瓷膜除杂 56％
4％乙酸甲醇超声(功率1500w) 陶瓷膜除杂 58％
4％乙酸甲醇超声(功率2000w) 陶瓷膜除杂 63％
4％乙酸甲醇超声(功率2500w) 陶瓷膜除杂 65％
从表5可见，超声功率为500-2500w时，莨菪烷类生物碱的含量大于50％，当超声功率为2500w时，莨菪烷类生物碱含量最大。
6回流提取时提取温度优化
称取多份山莨菪根500g，粉碎，加入5000ml4％乙酸甲醇溶液，不同温度下回流提取2.5h，提取液经0.2μm陶瓷膜过滤除杂，滤液在冷肼温度为-65℃的条件下，冷冻干燥15小时，再用“1”项下的检测方法测定干燥后提取物中的莨菪烷类生物碱含量，具体提取时间和提取物检测结果见表6。
表6不同提取温度提取得到的提取物中莨菪烷类生物碱含量
提取功率 纯化方法 莨菪烷类生物碱含量
4％乙酸甲醇60℃回流提取 陶瓷膜除杂 53％
4％乙酸甲醇65℃回流提取 陶瓷膜除杂 58％
4％乙酸甲醇70℃回流提取 陶瓷膜除杂 62％
4％乙酸甲醇75℃回流提取 陶瓷膜除杂 66％
4％乙酸甲醇80℃回流提取 陶瓷膜除杂 64％
4％乙酸甲醇85℃回流提取 陶瓷膜除杂 57％
4％乙酸甲醇90℃回流提取 陶瓷膜除杂 48％
从表6可见，回流提取温度为60-85℃时，莨菪烷类生物碱的含量大于50％，当提取温度为75℃时，莨菪烷类生物碱含量最大。
7不同陶瓷膜纯化的比较
称取多份山莨菪根500g，粉碎，加入5000ml4％乙酸甲醇溶液，提取温度为75℃下提取2.5h，经不同陶瓷膜过滤除杂，滤液在冷肼温度为-65℃的条件下，冷冻干燥15小时，再用“1”项下的检测方法测定干燥后提取物中的莨菪烷类生物碱含量，具体提取时间和提取物检测结果见表7。
表7不同陶瓷膜纯化后得到的提取物中莨菪烷类生物碱含量
纯化方法 莨菪烷类生物碱含量
0.1μm陶瓷膜除杂 63％
0.2μm陶瓷膜除杂 65％
0.5μm陶瓷膜除杂 22％
从表7可见，陶瓷膜为0.1μm、0.2μm时，莨菪烷类生物碱的含量大于50％。
试验例2本发明山莨菪中莨菪烷类生物碱质谱表征
一、样品实验前处理方法
称取实施例1制备得到的莨菪烷类生物碱1g，加15ml甲醇，超声15min，12000转/分钟离心20min，取上清液用于测试。
二、仪器设备
UPLC-Triple-TOF/MS系统：AcquityTM ultra型高效液相色谱仪(美国Waters公司)，Triple TOF 5600+型飞行时间质谱，配有电喷雾离子源(美国AB SCIEX公司)；Eppendorf minispan离心机(德国Eppendorf公司)
三、测试条件
色谱条件色谱柱为沃特世ACQUITY UPLC HSS T3(150mm×2.1mm i.d.,1.8μm)；以0.1％甲酸溶液为流动相A，以0.1％甲酸乙腈为流动相B，线性梯度洗脱，0min 0％B；2min0％B；25min 30％B；35min 95％B；37min 95％B；流速为0.3ml/min；柱温为50C；检测波长为254nm；进样量：2μl。
质谱条件UPLC-Triple-TOF 5600+飞行时间液质联用仪：负离子扫描模式；扫描范围：m/z 100-1500；雾化气(GS1)：55psi；雾化气(GS2)：55psi；气帘气(CUR)：35psi；离子源温度(TEM)：600℃(正)；离子源电压(IS)：5500V(正)；一级扫描：去簇电压(DP)：100V；聚焦电压(CE)：10V；二级扫描：使用TOF MS～Product Ion～IDA模式采集质谱数据，CID能量为-20、-40和-60V，进样前，用CDS泵做质量轴校正,使质量轴误差小于2ppm。
四、检测结果及数据分析
山莨菪中莨菪烷类生物碱的总离子流图见图1。经分析鉴定，山莨菪的莨菪烷类生物碱中含有樟柳碱、东莨菪碱、山莨菪碱、阿托品、去甲阿托品。表8为莨菪烷类生物碱的二级质谱数据。
表8山莨菪中莨菪烷类生物碱的二级质谱数据
Figure BDA0002625951120000091
试验例3本发明山莨菪中莨菪烷类生物碱含量测定
一、样品实验前处理方法
称取实施例1制备得到的莨菪烷类生物碱0.5g，加15ml甲醇，超声15min，12000转/分钟离心20min，取上清液用于测试。
二、仪器设备
安捷伦1260高效液相色谱。
三、对照品溶液的制备
分别精密称取樟柳碱、山莨菪碱、东莨菪碱、阿托品对照品3.0mg、2.0mg、2.0mg、4.0mg置于10mL容量瓶中，加甲醇溶解，摇匀，定容至刻度，得到浓度为0.3mg/mL、0.2mg/mL、0.2mg/mL、0.4mg/mL的樟柳碱、山莨菪碱、东莨菪碱、阿托品对照品溶液。
四、测试条件
色谱条件色谱柱为安捷伦(150mm×4.6mm i.d.,4μm)；以0.1％甲酸溶液为流动相A，以0.1％甲酸乙腈为流动相B，线性梯度洗脱，0min 10％B；20min 10％B；流速为1ml/min；柱温为30℃；检测波长为210nm；进样量：10μl。
五、检测结果
见表9
表9实施例1制备得到的莨菪烷类生物碱含量
Figure BDA0002625951120000101
试验例4本发明山莨菪莨菪烷类生物碱抗胆碱活性
1.大鼠气管平滑肌标本的制备
对大鼠经腹腔注射10％水合氯醛1000mg/kg进行麻醉，剪开胸腔和颈，迅速游离气管，置于Krebs-Henseleit(K-H)溶液中漂洗。小心剪除气管周围的脂肪,将气管剪成1cm左右的气管环备用。
2.大鼠气管平滑肌张力测定
将大鼠离体气管平滑肌标本悬挂于盛有20mLK-H液的浴槽内，通过张力换能器连接PowerLab数据采集和分析系统，调节张力至2.0g左右，在37℃下平衡1h，期间每15min换营养液1次。用1×10-5mol/L的卡巴胆碱刺激气管收缩，待气管收缩幅度达到最大时，以累积剂量法每隔5min加药(即实施例1制备得到的莨菪烷类生物碱)，使营养液中的莨菪烷类生物碱浓度分别达1×10-6、1×10-5、2×10-5、1×10-4mol/L，空白组加入等体积的超纯水作为对照，以加药后的气管张力幅度与卡巴胆碱诱发最大收缩幅度之间的比值反映气管张力的变化。
3结果
山莨菪中莨菪烷类的抑制结果见表10。与空白对照组相比，山莨菪中莨菪烷类对卡巴胆碱诱导的大鼠气管平滑肌收缩具有抑制作用。
表10山莨菪中莨菪烷类抗胆碱活性
Figure BDA0002625951120000102
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综上，本发明山莨菪中莨菪烷类生物碱的制备方法，提取效率高，操作方便，利于工业化生产推广应用。经试验证明，通过本发明方法制备得到的莨菪烷类生物碱含量高，活性强，其对于平滑肌收缩具有明显的抑制作用，在抗乙酰胆碱受体的药物中的应用前景广阔。

Claims (10)

1.一种山莨菪中莨菪烷类生物碱的制备方法，其特征在于：它包括如下步骤：
取山莨菪，粉碎，加乙酸甲醇溶液提取，提取液经陶瓷膜过滤，取滤液干燥，即得。
2.根据权利要求1所述制备方法，其特征在于：所述山莨菪是茄科、山莨菪属多年生宿根草本Anisodus tanguticus(Maxim.)Pascher.的根和/或地上部分。
3.根据权利要求1所述制备方法，其特征在于：所述山莨菪与乙酸甲醇溶液的质量体积比为1g：5～20ml，优选为1g：10ml。
4.根据权利要求1或3所述制备方法，其特征在于：所述乙酸甲醇溶液中乙酸浓度为3～5％，优选4％。
5.根据权利要求1所述制备方法，其特征在于：所述提取为超声提取或回流提取；所述超声提取时间5～60min，功率500-2500w，优选时间30min，功率2500w；所述热回流提取时间1.5-3h，温度为65-85℃，优选时间2.5h，温度75℃。
6.根据权利要求1所述制备方法，其特征在于：所述陶瓷膜的孔径为0.2μm或0.1μm。
7.根据权利要求1所述制备方法，其特征在于：所述干燥为冷冻干燥，冷冻干燥的参数为冷肼温度-65～-40℃，干燥时间15～40小时。
8.一种按照权利要求1～7任意一项所述方法制备的莨菪烷类生物碱，其特征在于，所述莨菪烷类生物碱总含量大于50％。
9.根据权利要求8所述莨菪烷类生物碱，其特征在于，所述莨菪烷类生物碱中含有樟柳碱、东莨菪碱、山莨菪碱和阿托品。
10.权利要求8或9所述莨菪烷类生物碱在制备抗乙酰胆碱受体的药物中的用途。
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