CN105250391A

CN105250391A - 一种秃疮花生物碱有效部位的制备方法

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Publication number: CN105250391A
Application number: CN201410340246.3A
Authority: CN
Inventors: 柳军玺; 邸多隆; 钟梅; 陈亚丽
Original assignee: Lanzhou Institute of Chemical Physics LICP of CAS
Current assignee: Lanzhou Institute of Chemical Physics LICP of CAS
Priority date: 2014-07-17
Filing date: 2014-07-17
Publication date: 2016-01-20
Anticipated expiration: 2034-07-17
Also published as: CN105250391B

Abstract

本发明公开了一种秃疮花生物碱有效部位的制备方法。通过化学步骤得到秃疮花生物碱有效部位为棕黑色粉末状固体，由阿扑菲类、吗啡烷类、普鲁托品类和原小檗碱类异喹啉类生物碱构成。本发明的方法可以有效提高活性化合物的浓度，降低药物服用剂量，显著提高秃疮花生物碱的药理活性。

Description

一种秃疮花生物碱有效部位的制备方法

技术领域

本发明涉及一种天然产物提取物，属天然产物化学领域。具体地讲，本发明涉及一种从罂粟科植物秃疮花中提取纯化生物碱有效部位的制备方法。

背景技术

秃疮花，植物拉丁名为Dicranostigmaleptopodum(Maxim)Fedde，又名红茂草、秃子花、勒马回（陕西），为罂粟科秃疮花属植物。秃疮花为二年生或多年生草本，高25-80厘米；秃疮花分布于亚洲温带，海拔400-1300米的丘陵、山坡、路边、农田、草地、墙上等处，耐旱、耐瘠薄；我国全产，主要分布在甘肃、陕西的秦岭南北、渭河流域；该植物春、夏两季均可采挖带根全草，阴干或鲜用。《全国中草药汇编》载：“苦、涩、凉，有毒”；《陕西中草药》载：“味苦、涩，性凉”；全草有清热解毒、消肿止痛、杀虫等功效；治扁桃体炎、牙痛、咽喉痛、淋巴结核；外用于秃疮、疥癣、痈疽、瘘管、顽固性口炎、化脓性中耳炎、胃溃疡、外伤、带状疱疹、阴囊癣、阴户肿痛、霉菌性阴道炎等疾病。

现代药理研究表明：秃疮花提取物对卡介苗(BCG)和脂多糖(LPS)诱导的小鼠免疫性肝损伤具有一定的保护作用（毛爱红，等，秃疮花提取物对CCl₄诱导的小鼠急性肝损伤的影响.兰州大学学报，医学版，2008，34(2)：18-20）；秃疮花可显著降低因CCl₄而引起的血清谷丙转氨酶（ALT）、碱性磷酸酶（ALP）、谷草转氨酶（AST）、乳酸脱氢酶（LDH）和肝脏丙二醛（MDA）水平的升高,并能维持血清超氧化物歧化酶（SOD）水平，使肝组织病理变化得以改善（张昱，等，秃疮花有效成分对小鼠CCl₄肝损伤的保护作用，青海医学院学报，2004，25(1)：7-10）；秃疮花提取物在体内外可分别抑制由H₂O₂和乙酰苯肼引发的鼠红细胞氧化性溶血（赵祁，等，秃疮花提取物对红细胞氧化性溶血的抑制机制，兰州大学学报(医学版)，2006，32(3)：40-45）。从秃疮花中提取的单体化合物异紫堇碱（isocorydine，音译名异可利定，又名异紫堇啡碱，统一名称为异紫堇碱），为阿朴啡类生物碱，具有较好的药理学活性，如抗心律失常，舒张血管，抗缺氧作用，具有靶向肿瘤干细胞的抗癌活性等，2010年，国家药监局批准异紫堇碱盐酸盐（盐酸异可利定片）作为处方药（批准文号：国药准字H53021977）用于胃、肠、胆、胰、子宫、血管痉挛所致的疼痛，属解痉镇痛药。

申请人前期系统开展了秃疮花化学成分的研究（刘大护等，秃疮花生物碱类化学成分研究，中草药，2011，8(42)：1505-1508；YanDang,etal.，AlkaloidfromDicranostigmaleptopodum(Maxim)Fedde，ChinChemLett，2009，20，1218-1220.；MeiZhong，etal.，AnewquaternaryprotoberberinealkaloidisolatedfromDicranostigmaleptopodum(Maxim)Fedde，NatProdRes，2014，28（9）：507-510；YanjuanLiu，etal.Structuralandmechanisticbasesoftheanticanceractivityofnaturalaporphinoidalkaloids，CurrTopMedChem，2013，13(24)：2116-2126.），从中分离得到25个生物碱类化合物，其中4个新化合物，通过前期的药理活性筛选研究，发现秃疮花中的微量成分异紫堇二酮具有显著地抗肿瘤活性，建立了异紫堇二酮的提取分离制备工艺（YunLiu，etal.，Evaluationofpolydopaminesupportednano-polytetrafluoroethylenasnovelmaterialforsolidphaseextraction，NewJ.Chem.，2012，36（11）：2376-2382.；中国专利申请号201110085388.6）和半合成化学转化制备工艺（张天才等，天然产物异紫堇二酮的半合成转化研究药学学报，2011，46（12）：1471-1475；中国专利申请号201110085389.0），并对异紫堇二酮的体内外抗癌作用进行了初步的评价，证明该化合物具有一定的抗癌作用（卜令娜等，异紫堇二酮体内外抗肿瘤活性研究，中国药理学通报，2013，29(6):814-81）。

天然产物化学成分研究表明秃疮花中主要含有萘并菲啶类、阿扑菲类、吗啡烷类、普鲁托品类、原小檗碱类等异喹啉类生物碱（畅行若,王宏新,周光治.秃疮花化学成分及组织形态研究.药物分析杂志,1982,2(5):273-277；RuiqiSun,etal.Evidence-basedcomplementaryandalternativemedicine，2014，），该类生物碱大都具有镇痛，镇静及肾上腺能受体样作用，部分化合物具有显著的抗癌活性。

有关的秃疮花生物碱的有关专利：红茂草生物碱的提取方法及由该方法获得的提取物（CN102000158B）公开了一种红茂草生物碱的提取方法及其制备的提取物，其所述的方法是通过水提取红茂草全草，并经乙醇沉淀，浓缩并经过冻干处理获得红茂草生物碱；红茂草醇提取物在制备抗黑色素瘤转移药物中的应用（CN102357123B）公开了一种红茂草醇提物在抗肿瘤药物中的新用途，该提取物具有抗肿瘤转移作用，具体表现为抑制黑色素瘤自发性肿瘤转移和实验性肿瘤转移，可用于制备抗黑色素肿瘤转移药物。以上专利的缺陷在于采用传统的天然产物提取方法水提或醇提，得到植物中所含所有化学成分的总提取物，并没有对总提取物进行有效的分离和纯化，致使其提取物的给药剂量较高和生物活性在同等剂量下并不明显，病人日服用剂量很大等缺陷，且其主成分和高含量成分异可利定的毒性比较明显，其LD₅₀为32.167mg/kg（汪波，云南地不容化学成分及阿朴菲型生物碱抗心律失常构效关系初步研究，硕士学位论文），致使其提取物在临床应用中存在一定的缺陷。

发明内容

本发明的目的在于提供一种秃疮花生物碱有效部位的制备方法。

一种秃疮花生物碱有效部位的制备方法，其特征在于该方法通过以下A、B、C、D、E以及F步骤制备：

A、酸水提取步骤：秃疮花药材粉碎，用浓酸配制浓度为0.1-10%的酸水溶液，加入5-15倍量药材质量的酸水溶液，浸泡1-24小时，回流提取1-3次，每次0.5-3小时，过滤，弃去秃疮花药渣，合并提取液，0.1-50%的碱性水溶液中和，减压回收水分得到秃疮花生物碱提取物；

B、醇沉除杂步骤：步骤A中的秃疮花生物碱提取物溶解在pH为7.2-12碱性水溶液中，搅拌下加入醇类有机溶剂，使醇类溶剂体积分数达到50－95%，搅拌，进行沉淀除渣，放置2-12小时，过滤除去杂质，滤液减压回收溶剂，得到秃疮花生物碱纯化产物；

C、萃取分离步骤：步骤B中的秃疮花生物碱纯化产物溶解在pH为1-4的酸水溶液中，用与水不互溶的有机溶剂萃取，分离阿普菲类生物碱，萃取2-4次，合并有机相，回收有机相中的有机溶剂得到秃疮花中总阿普菲类生物碱部位；水相进行下一步纯化；

D、大孔吸附树脂吸附分离除杂步骤：步骤C中萃取分离后的水相，调节到碱性，pH为7.2-10，作为聚苯乙烯二乙烯基苯聚合制成的大孔吸附树脂柱的上样液，循环上样吸附分离；薄层色谱鉴别，待生物碱吸附完全后，用1-10倍上样液体积的水洗脱除杂；1-5倍上样液体积的10%醇类水溶液洗脱吸附树脂柱进一步除杂；最后用1-5倍上样液体积的95%的酸性醇类溶剂洗脱吸附树脂柱，得到大孔吸附树脂纯化秃疮花生物碱部位，调节该洗脱液的pH值为中性；

E、异紫堇碱纯化步骤：步骤C中的阿普菲类生物碱部位用醇类溶剂重结晶，待结晶析出，过滤得到异紫堇碱，结晶母液回收溶剂，得到分离除去异紫堇碱的阿普菲类生物碱部位；

F、生物碱有效部位脱色处理步骤：将步骤D中的大孔吸附树脂纯化秃疮花生物碱部位和步骤E中分离除去异紫堇碱的阿普菲类生物碱部位二者合并，加入活性炭，醇类溶剂回流小时充分脱色，过滤，滤液减压回收溶剂，得到秃疮花生物碱有效部位。

本发明制备方法中的浓酸选自硫酸或盐酸。

本发明制备方法中的碱性水溶液选自0.1-50%的氨水或氢氧化钠水溶液。

本发明制备方法中的醇类溶剂选自乙醇或甲醇。

本发明制备方法中的萃取有机溶剂选自氯仿或二氯甲烷。

本发明的步骤E在制备秃疮花生物碱有效部位的过程中，同时分离制备得到异紫堇碱单体化合物。

本发明得到的秃疮花生物碱有效部位，该有效部位为棕黑色粉末状固体，通过化学成分分析和高效液相色谱方法测定由阿扑菲类、吗啡烷类、普鲁托品类和原小檗碱类异喹啉类生物碱构成，其包含的化合物化学结构用式表示。

式

式中的各个化合物均为已知化合物，其化学结构通过NMR，HR-ESI-MS等现代波谱技术和文献中的相应数据比较，确定各化合物化学结构。

通过动物体内药理实验表明，通过本发明制备的秃疮花生物碱有效部位具有较强的抗炎镇痛活性。

本发明的优点在于：

1、本发明采用酸水提取法，成功利用生物碱类化合物在酸性溶剂中成盐，增加生物碱类化合物在溶媒中的溶解度；采用醇类溶剂沉淀的前处理方法，去除提取物中的蛋白质，多糖及鞣质等植物体内普遍含有的大分子有机杂质；该方法工艺简单，提取效率高，杂质分离充分。

2、本发明充分依靠生物碱类化合物不同的结构类型具有不同的化学结构和不同的pKa值，调节总生物碱水溶液中的pH值，使各个生物碱具有不同的酸碱结合状态，但阿普菲类生物碱在强酸性介质中成盐，在有机溶剂中仍然具有较好的溶解度的特点，采用有机溶剂萃取法可以充分分离总生物碱中的阿普菲类生物碱。

3、本发明中的主要原材料秃疮花中，生物碱的高含量成分异紫堇碱（含量平均在0.5%），在醇类溶剂中依靠含量的显著差异和良好的结晶度，可以从阿普菲类生物碱中充分结晶析出，得到很好的分离效果；结晶母液中的阿普菲类生物碱包括未结晶完全的部分异紫堇碱重新加入到生物碱有效部位中，可以起到降低异紫堇碱含量，相应降低生物碱有效部位的生物体内毒性，但总体并不改变生物碱有效部位的化合物结构类型，相应不会降低中药提取物中各个发挥药理活性化合物之间的协同作用。

4、利用大孔吸附树脂的选择性吸附作用，采用聚苯乙烯二乙烯基苯聚合制成的大孔吸附树脂，可以选择吸附生物碱类等有机化合物，采用不同比例的有机溶剂，可以分步洗脱分离除去秃疮花提取物中的小分子蔗糖，无机盐等大极性化合物杂质，更进一步降低生物碱有效部位中的杂质含量，可以有效降低秃疮花生物碱有效部位的给药剂量。

综上所述，本发明的方法可以有效提高活性化合物的浓度，降低药物服用剂量，显著提高秃疮花生物碱的药理活性。

附图说明

图1为本发明生物碱制备方法中各个步骤得到生物碱部位的典型的HPLC-DAD检测液相色谱图（其中图1中标注为“酸性氯仿选择性萃取色谱图”是步骤C中“秃疮花中总阿普菲类生物碱部位”的典型液相色谱图；标注为“混合标准品色谱图”为式中所有单体标准化合物混合得到标准色谱图；标注为“大孔吸附树脂选择性吸附生物碱部位色谱图”为步骤D中“大孔吸附树脂纯化秃疮花生物碱部位”的典型液相色谱图；标注为“秃疮花酸水提取物色谱图”为本申请专利中使用的原料步骤A中“秃疮花药材”的酸水提取物典型液相色谱图。图中IS为异紫堇碱，CO为紫堇碱，SI为清风藤碱，PR为普罗托品，AL为别隐品碱，BE为小檗红碱，HY为5-羟基黄连碱，BR为小檗碱，色谱仪：安捷伦1100，色谱柱SinoChromODS-BPC₁₈，检测波长为270nm，流速为1mL/min，柱温为30℃。流动相：。A相为乙腈，B相为1%的磷酸水溶液（用三乙胺调节pH值为6.31），色谱洗脱梯度：以A相设置，0-20min：20%-26%；20-35min：26%-50%；35-37min：50%-50%；37-40min：50%-20%；40-45min：20%-20%。）

图2为生物碱部位HPLC-DAD检测液相色谱图。

具体实施方式

为了更清楚的理解本发明，以下结合实施例对本发明作进一步的说明，但本发明不限于以下实施例。

实施例1：秃疮花中生物碱有效部位的提取分离

A、酸水提取步骤：秃疮花药材4Kg粉碎，加入60L浓度为0.05%的硫酸水溶液，放置4h，回流提取1h，过滤，药渣加入40L浓度为0.05%的硫酸水溶液，回流提取2次，每次提取1h，过滤，三次过滤液合并，用10%NaOH溶液中和值至中性，减压回收溶剂，浓缩得到秃疮花生物碱提取物6.5L，HPLC-DAD检测。

B、醇沉除杂步骤：步骤A中秃疮花生物碱提取物，在机械搅拌下加入95%的乙醇20L，搅拌1h，自然放置4h，布氏漏斗过滤除杂，母液减压回收溶剂至无醇味，得除秃疮花生物碱纯化产物5L。

C、萃取分离步骤：步骤B中的除杂生物碱提取物，加水适量溶解，0.1%硫酸调节pH到3.0，用水定容至4L，加入2L氯仿，机械搅拌萃取1h，放置待分层，分离氯仿层，萃取3次，每次用2L氯仿。氯仿萃取物加入无水硫酸钠干燥，过夜，以上氯仿萃取物减压回收溶剂至干得到秃疮花中总阿普菲类生物碱部位30g，HPLC-DAD检测，水相进行下一步纯化。

D、大孔吸附树脂吸附分离除杂步骤：步骤C中萃取分离后的水相，用NaOH水溶液调节pH为中性，浓缩至2L，用NaOH水溶液调节pH为碱性，pH为9，作为聚苯乙烯二乙烯基苯聚合制成的大孔吸附树脂（树脂型号为LX-28）柱的上样液，采用直径和柱高比（径高比）为1:10的色谱柱，填充预处理过的聚苯乙烯二乙烯基苯大孔吸附树脂（LX-28），成为大孔树脂吸附色谱柱，取上述上样液加于大孔树脂吸附色谱柱，流出液循环吸附2h，薄层色谱鉴别（展开剂为氯仿：甲醇=4:1），待吸附平衡后，用8L水洗脱树脂柱，弃去洗脱液，再用4L10%的乙醇溶液洗脱树脂柱，弃去洗脱液；然后用95%的酸性乙醇溶剂6L，洗脱树脂柱，得到大孔吸附树脂纯化秃疮花生物碱部位，调节该洗脱液的pH值为中性。

E、异紫堇碱纯化步骤：步骤C中的阿普菲类生物碱部位用甲醇重结晶，待结晶析出，过滤得到异紫堇碱15g，结晶母液回收溶剂，得到分离除去异紫堇碱的阿普菲类生物碱部位；

F、生物碱有效部位脱色处理步骤：将步骤D中的大孔吸附树脂纯化秃疮花生物碱部位和步骤E中分离除去异紫堇碱的阿普菲类生物碱部位二者合并，加入30g活性炭，甲醇回流2小时，脱色，布氏漏斗抽滤，滤液减压回收甲醇，得到秃疮花生物碱有效部位80g，取样进行HPLC-DAD检测。

实施例2：秃疮花中生物碱有效部位的提取分离

A、酸水提取步骤：秃疮花药材4Kg粉碎，加入40L浓度为0.01%的盐酸水溶液，放置24h，回流提取1h，提取3次，过滤，药渣弃去，滤液合并，用NaOH溶液中和值至中性，减压回收溶剂，浓缩至4L，取样进行HPLC-DAD检测。

B、醇沉除杂步骤：步骤A中秃疮花生物碱提取物，在机械搅拌下加入甲醇20L，搅拌1h，自然放置4h，离心过滤除杂，母液减压回收溶剂至粘稠状，加水溶解，得除秃疮花生物碱纯化产物5L。

C、萃取分离步骤：步骤B中的除杂生物碱提取物，加水适量溶解，0.1%硫酸调节pH到3.0，用水定容至4L，加入2二氯甲烷，振荡萃取1h，放置待分层，分离二氯甲烷层，萃取3次，每次用2L二氯甲烷。二氯甲烷萃取物加入无水硫酸钠干燥，过夜，以上二氯甲烷萃取物减压回收溶剂至干得到秃疮花中总阿普菲类生物碱部位28g，HPLC-DAD检测，水相进行下一步纯化。

D、大孔吸附树脂吸附分离除杂步骤：步骤C中萃取分离后的水相，用氨水溶液调节pH为中性，浓缩至2L，用氨水溶液调节pH为碱性，pH为9，作为聚苯乙烯二乙烯基苯聚合制成的大孔吸附树脂（树脂型号为LX-10）柱的上样液，采用直径和柱高比（径高比）为1:5的色谱柱，填充预处理过的聚苯乙烯二乙烯基苯大孔吸附树脂（LX-10），成为大孔树脂吸附色谱柱，取上述上样液加于大孔树脂吸附色谱柱，流出液循环吸附2h，薄层色谱鉴别（展开剂为氯仿：甲醇=4:1），待吸附平衡后，用8L水洗脱树脂柱，弃去洗脱液，再用4L10%的乙醇溶液洗脱树脂柱，弃去洗脱液；然后用95%的酸性乙醇溶剂6L，洗脱树脂柱，得到大孔吸附树脂纯化秃疮花生物碱部位，调节该洗脱液的pH值为中性。

E、异紫堇碱纯化步骤：步骤C中的阿普菲类生物碱部位用乙醇重结晶，待结晶析出，过滤得到异紫堇碱16g，结晶母液回收溶剂，得到分离除去异紫堇碱的阿普菲类生物碱部位；

F、生物碱有效部位脱色处理步骤：将步骤D中的大孔吸附树脂纯化秃疮花生物碱部位和步骤E中分离除去异紫堇碱的阿普菲类生物碱部位二者合并，加入30g活性炭，乙醇回流2小时，脱色，布氏漏斗抽滤，滤液减压回收乙醇，得到秃疮花生物碱有效部位85g，取样进行HPLC-DAD检测。

实施例3：秃疮花中生物碱有效部位的提取分离

A、酸水提取步骤：秃疮花药材4Kg粉碎，加入40L浓度为0.01%的硫酸水溶液，放置浸泡4h，回流提取1h，过滤，药渣用40L浓度为0.01%的硫酸水溶液再回流提取2次，每次1h，合并三次过滤液，用NaOH溶液中和值至中性，减压回收溶剂，浓缩至4L，取样进行HPLC-DAD检测。

B、醇沉除杂步骤：步骤A中秃疮花生物碱提取物，在机械搅拌下加入95%的乙醇20L，搅拌1h，自然放置4h，离心过滤除杂，母液减压回收溶剂至无醇味，得除秃疮花生物碱纯化产物5L。

C、萃取分离步骤：步骤B中的除杂生物碱提取物，加水适量溶解，0.1%盐酸调节pH到3.0，用水定容至4L，加入2L乙酸乙酯，振荡萃取1h，放置待分层，分离乙酸乙酯层，萃取3次，每次用2L乙酸乙酯。乙酸乙酯萃取物加入无水硫酸钠干燥，过夜，以上乙酸乙酯萃取物减压回收溶剂至干得到秃疮花中总阿普菲类生物碱部位20g，HPLC-DAD检测，水相进行下一步纯化。

D、大孔吸附树脂吸附分离除杂步骤：步骤C中萃取分离后的水相，用氨水溶液调节pH为中性，浓缩至2L，用氨水溶液调节pH为碱性，pH为9，作为聚苯乙烯二乙烯基苯聚合制成的大孔吸附树脂（树脂型号为D101）柱的上样液，采用直径和柱高比（径高比）为1:6的色谱柱，填充预处理过的聚苯乙烯二乙烯基苯大孔吸附树脂（D101），成为大孔树脂吸附色谱柱，取上述上样液加于大孔树脂吸附色谱柱，流出液循环吸附2h，薄层色谱鉴别（展开剂为氯仿：甲醇=4:1），待吸附平衡后，用8L水洗脱树脂柱，弃去洗脱液，再用4L10%的乙醇溶液洗脱树脂柱，弃去洗脱液；然后用95%的酸性乙醇溶剂6L，洗脱树脂柱，得到大孔吸附树脂纯化秃疮花生物碱部位，调节该洗脱液的pH值为中性。

E、异紫堇碱纯化步骤：步骤C中的阿普菲类生物碱部位用甲醇重结晶，待结晶析出，过滤得到异紫堇碱14g，结晶母液回收溶剂，得到分离除去异紫堇碱的阿普菲类生物碱部位；

实施例4：秃疮花中生物碱有效部位的提取分离

A、酸水提取步骤：秃疮花药材4Kg粉碎，加入40L浓度为0.05%的硫酸水溶液，放置5h，回流提取2次，每次提取2h，过滤，三次过滤液合并，用10%NaOH溶液中和值至中性，减压回收溶剂，浓缩得到秃疮花生物碱提取物6.0L，HPLC-DAD检测。

C、萃取分离步骤：步骤B中的除杂生物碱提取物，加水适量溶解，0.1%盐酸调节pH到3.0，用水定容至4L，加入2L氯仿，机械搅拌萃取1h，放置待分层，分离氯仿层，萃取3次，每次用2L氯仿。氯仿萃取物加入无水硫酸钠干燥，过夜，以上氯仿萃取物减压回收溶剂至干得到秃疮花中总阿普菲类生物碱部位26g，HPLC-DAD检测，水相进行下一步纯化。

E、异紫堇碱纯化步骤：步骤C中的阿普菲类生物碱部位用甲醇重结晶，待结晶析出，过滤得到异紫堇碱10g，结晶母液回收溶剂，得到分离除去异紫堇碱的阿普菲类生物碱部位；

F、生物碱有效部位脱色处理步骤：将步骤D中的大孔吸附树脂纯化秃疮花生物碱部位和步骤E中分离除去异紫堇碱的阿普菲类生物碱部位二者合并，加入30g活性炭，甲醇回流2小时，脱色，布氏漏斗抽滤，滤液减压回收甲醇，得到秃疮花生物碱有效部位60g，取样进行HPLC-DAD检测。

实施例5：秃疮花生物碱有效部位对小鼠热板刺激痛阈的影响

1.实验动物：雌性昆明种小白鼠（20.0–22.0g）由中国农业科学院兰州兽医研究所提供。

2.试验方法：给药前对实验动物进行筛选，选择对热板刺激疼痛敏感的小鼠为实验动物，先测2次基础痛阈，热板温度设为55℃。选择基础痛阈10-30s且反应稳定的小鼠60只，随机分为6组，生物碱有效部位高剂量组（40mg/Kg），生物碱有效部位中剂量组（20mg/Kg），生物碱有效部位低剂量组（10mg/Kg），元胡止痛滴丸对照组（300mg/Kg），异紫堇碱（20mg/Kg）对照组和空白对照组。按体重灌胃给药（每只小鼠约为0.2mL）后30min测定小鼠舔后足的潜伏期为痛阈值，作为痛阈改变统计数据，比较各组用药前后痛阈时间得差异。

3.实验结果：秃疮花生物碱有效部位在高、中、低三个剂量都具有一定的抗热板刺激疼痛作用，相对阳性对照药物元胡止痛滴丸和异紫堇碱单体化合物，秃疮花生物碱有效部位对热刺激引起的疼痛具有较阳性药物更强的镇痛活性，与空白对照即生理盐水组比较，秃疮花生物碱有效部位具有极显著差异（结果见表1）。

表1.秃疮花生物碱有效部位对小白鼠热板刺激痛阈改变结果（n=10）

与生理盐水组相比^*p<0.05,^**P<0.01。

实施例6：秃疮花生物碱有效部位对小鼠化学刺激疼痛的反应

1.实验动物：雄性昆明种小白鼠（20.0–22.0g）由中国农业科学院兰州兽医研究所提供。

2.试验方法：小鼠60只，随机分为6组，生物碱有效部位高剂量组（40mg/Kg），生物碱有效部位中剂量组（20mg/Kg），生物碱有效部位低剂量组（10mg/Kg），元胡止痛滴丸对照组（300mg/Kg），异紫堇碱（20mg/Kg）对照组和空白对照组。给药后0．5h后，按剂量10mL/kg腹腔注射0.5%的醋酸溶液，计数20min内小鼠的扭体次数，进行统计学处理并计算疼痛的抑制率。抑制率/%=(对照组的扭体次数-给药组的扭体次数)/对照组的扭体次数×100。

3.实验结果：秃疮花生物碱有效部位在高、中、低三个剂量都具有一定的对抗醋酸致炎因素引起的痛觉刺激疼痛作用，相对阳性对照药物元胡止痛滴丸和异紫堇碱单体化合物，秃疮花生物碱有效部位对醋酸引起的小鼠扭体反应的幅度和持续时间显著性降低，显著性减低20min内小鼠的扭体次数，高剂量和中剂量的抑制率均大于40%，并具有显著性差异，提示秃疮花生物碱部位具有对抗炎性因素引起的疼痛反应。（结果见表2）。

表2.秃疮花生物碱有效部位对小白鼠醋酸刺激引起的扭体反应（n=10）

与生理盐水组相比^*p<0.05,^**P<0.01。

Claims

1.一种秃疮花生物碱有效部位的制备方法，其特征在于该方法通过以下A、B、C、D、E以及F步骤制备：

2.如权利要求1所述的方法，其特征在于浓酸选自硫酸或盐酸。

3.如权利要求1所述的方法，其特征在于碱性水溶液选自0.1-50%的氨水或氢氧化钠水溶液。

4.如权利要求1所述的方法，其特征在于醇类溶剂选自乙醇或甲醇。

5.如权利要求1所述的方法，其特征在于萃取有机溶剂选自氯仿或二氯甲烷。