CN1891260B - 一种夏天无提取物及其制备方法和用途 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种夏天无提取物及制备方法和用途。该提取物含有原阿片碱和左旋四氢掌叶防己碱的总和不低于50％(w/w)其中原阿片碱在提取物中含量为24％-50％w/w；右旋四氢掌叶防已碱在提取物中含量为26％-50％w/w。经药理试验证明它可以作为N-甲基-D-天冬氨酸受体拮抗剂和乙酰胆碱酯酶抑制剂在制备防治由血管性痴呆或老年性痴呆引起的记忆不良的药物中应用。

Description

一种夏天无提取物及其制备方法和用途

技术领域

本发明涉及夏天无提取物及其制备方法和用途，更具体是涉及夏天无生物碱及其制备方法和它作为N-甲基-D-天冬氨酸受体拮抗剂和乙酰胆碱酯酶抑制剂在制备防治由血管性痴呆或老年性痴呆症引起的记忆不良药物中应用。

背景技术

血管性痴呆是由于脑血管病变导致脑神经病变而至记忆能力障碍的病症。脑卒中、脑外伤、脑占位性病变等均可导致脑血管性痴呆。阿尔滋海默症(AD)，也称早老性痴呆，是脑神经退行性病变导致影响多种高级皮层功能如记忆、思维、行为和情感的退行性脑病，病因未明。

目前治疗阿尔滋海默症和脑器质性病变引起记忆障碍的药物治疗手段主要包括：通过使用石杉碱甲、多奈哌齐等胆碱酯酶抑制剂抑制脑组织中乙酰胆碱酯酶活性，提高脑内乙酰胆碱的水平；通过使用尼莫地平、氟桂利嗪等钙离子拮抗剂扩张脑血管增加脑血流量；通过使用美金刚(memantine)等N-甲基-D-天冬氨酸(NMDA)受体拮抗剂选择性地作用于脑内NMDA受体，阻断病理状态下过高的谷氨酸诱导的效应；通过使用吡拉西坦等促进代谢药物改善各种类型脑缺氧及物理化学因素造成的脑损伤以达到辅助药物治疗。

其中NMDA受体拮抗剂是最有效的一种药物，尤其可用于治疗中到重度的痴呆症，而现有的胆碱酯酶抑制剂只对轻到中度的痴呆症有效。过量的谷氨酸释放与缺氧、局部缺血、中风和可能的阿尔茨海默病等一些急性和慢性疾病引起的神经退化有关，非竞争性NMDA受体拮抗剂通过阻断病理状态下过高的谷氨酸诱导的效应，起到治疗作用(S.K.Sonkusare，C.L.Kaul and P.Ramarao，Pharmacological Research，2005，51(1)：1-17)。

夏天无是罂粟科植物伏生紫堇(Corydalis decumbens(Thunb.)Pers.)的干燥块茎。夏天无的传统功能主治为祛风除湿，舒筋活血，通络止痛，降血压；主治风湿性关节炎，中风偏瘫，坐骨神经痛，小儿麻痹后遗症，腰肌劳损，跌扑损伤，高血压。

已有报道从中药夏天无中提取的总碱具有抗胆碱酯酶活性(徐丽华、顾振纶、蒋小岗等，药学学报2002，37(11)：902-903)、可抑制血小板聚集(高健、王天佑、何相好等，苏州大学学报(医学版)2004，24(2)：137-140)、增加痴呆大鼠脑内5-羟色胺和多巴胺含量(张熠、顾振纶、蒋小岗，苏州大学学报(医学版)2004，24(2)：134-146，143)、对东莨菪碱及D-半乳糖造成的两种学习记忆获得障碍大鼠的学习记忆能力均有明显的改善作用(邓湘平、顾振纶、谢梅林，中草药2003，34(4)：350-352)。未见有关夏天无提取物具有N-甲基-D-天冬氨酸受体拮抗剂的活性的报道。

发明内容

本发明的目的是提供一种夏天无提取物，该提取物具有NMDA受体拮抗剂和乙酰胆碱酯酶抑制剂的双重活性，可用于制备防治由血管性痴呆或老年性痴呆症引起的记忆不良的药物。

本发明的另一目的是提供该夏天无提取物的制备方法。

夏天无药材符合《中华人民共和国药典》2000年版一部231页“夏天无”项下的各项规定。

一般方法提取的夏天物总碱含有多量的季铵碱型生物碱，主要含小檗碱(berberine)、巴马汀(palmatine)、药根碱(jatrorrhizine)、小檗红碱(berberubine)，这一类化合物在生理pH条件下是离子型的，难以从胃肠道吸收，难以通过血脑屏障，与本发明揭示的提取物主要作用于中枢神经的用途无关；该类化合物，以小檗碱为例，通常具有胃肠道副反应。故本发明揭示的夏天无活性提取物系从夏天无药材中提取的主要含有生物碱的有效部位，该有效部位不含季胺碱成分(以小檗碱和巴马汀为代表)。夏天无总碱中以右旋比扣扣灵碱和右旋紫堇米定碱为代表的内酯环生物碱具有GABA_A受体激动剂的活性，对部分总者具有导致癫痫发作的可能，该些成分也不具有与最终提取物的用途相关的作用，故本发明的提取物中除去了该些组分。

总的工艺路线是这样的：先将药材按常规方法提取总生物碱，总生物碱中经硅胶柱层析，分离得到有效部位为几乎不含季胺碱的部位，该部位用热碱液处理，除去具有内酯环结构的生物碱，最后得到有效部位一提取物A。

更具体的提取物A的制备方法：采用一般植物化学教科书中收载的总生物碱提取工艺及可提取夏天无药材中的总生物碱，总的来说是利用生物碱的弱碱性和易溶解于极性有机溶剂的性质加以提取的。比如以不同浓度的乙醇溶液，浸泡药材后制得浸出液，回收溶剂后加以萃取或沉淀等操作的初步纯化。还可以用离子交换树脂进行总生物碱的提取。

典型的工艺的包含这样一些步骤：

1.总碱的制备。一种方法是将药材以浓度低于95％的乙醇加热回流或室温下渗漉制备浸出液，浸出液回收溶剂后残渣为粗浸膏，粗浸膏溶解在稀矿酸中，用与水不互溶的弱极性有机溶剂，比如乙酸乙酯，进行萃取，以除去脂溶性的非生物碱成分；萃取后分离的水层再用碱调pH值至7.5～8.0，然后用与水不互溶极性或弱极性有机溶剂，比如氯仿、二氯甲烷、乙酸乙酯、乙醚等，萃取游离型的生物碱，分离有机相，弃去水相，回收有机相的溶剂后即得总生物碱。另一种方法是用稀酸溶液，比如稀硫酸、稀盐酸、稀醋酸等为溶解，对药材进行渗漉，渗漉液通过强酸型阳离子交换树脂吸附生物碱，再以碱化乙醇洗脱，收集洗脱液，回收乙醇，残渣为总生物碱。

2.总生物碱再继续以下分离纯化步骤：以100-200目的层析用硅胶(青岛海洋化工厂出品)装柱，总生物碱用等量氯仿溶解后上样，总生物碱上样量与硅胶用量之比为1∶20，以丙酮为洗脱剂，收集硅胶用量的5至10倍体积的洗脱液，回收溶剂，收集残渣。

3.残渣再以热碱液处理，使具有内酯环结构的生物碱开环，形成水溶性的盐，从提取物中除去。这里热的碱液处理可以是将上一步得到残渣加入到10～20％(w/v)的氢氧化钠溶液中，在70～90℃，最佳为80C水浴上反应0.5～小时。反应液用氯仿或二氯甲烷萃取其他非内酯坏结构的生物碱，回收溶剂后的残渣即为提取物A。

对提取物A的化学成分进行分离和结构鉴定的研究。结果表明提取物A中主要成分有原阿片碱、右旋四氢掌叶防己碱。

用于成分研究的分离纯化过程：提取物A约100g，用500mL无水酒精热溶，置冰箱过夜，析出沉淀，滤出，不溶物用100mL氯仿热溶，再加入50mL无水酒精，先后析出CD-1和CD-4；取酒精溶解溶液1/2体积，浓缩，硅胶(100～200目)柱层析，石油醚，氯仿，氯仿-甲醇梯度冲洗，共收得16个流份：石油醚部位1为空白，氯仿洗脱流份经再次硅胶(硅胶H，400目)柱层析(加0.5个大气压)，氯仿-甲醇梯度冲洗，收得6个流份，2-4流份析出CD-10；洗脱流份5-6析出CD-1。

化合物CD-1，无色棱晶(氯仿-甲醇)，熔点209～210℃。EI-MS显示分子离子峰为353，基峰148；1H-NMR(400MHz，CDCl₃，δ，ppm)显示与原阿片碱的结构相吻合。与文献[Planta Med.65(1999)：218-21.Protopine from Corydalis ternate has anticholinesterase andantiamnesic activities.]光谱数据和原阿片碱对照品TLC对照，证实CD-1为原阿片碱(Protopine)。

化合物CD-10，黄色针状结晶。[α]_D ²⁵：+277.0°(c 1.0，CHCl₃)，1H NMR(400MHz，CDCl₃)与文献氢谱数据[J.O.C.，1990，55：1932]相吻合。CD-10被鉴定为右旋四氢掌叶防己碱(d-四氢掌叶防己碱)。

采用高效液相色谱法测定提取物A中主要组分的含量(％w/w)。含量测定用的对照品均由中国科学院上海药物研究所提供。对于提取物A，作为指标性组分，原阿片碱和右旋四氢掌叶防己碱的总和在提取物中的比例应不低于50％(w/w)。其中，原阿片碱在提取物中含量可以从24％-50％(w/w)；右旋四氢掌叶防己碱在提取物中含量可以从26％-50％(w/w)。

用于含量测定方法是反相高效液相色谱法。一个优选的方法是以十八烷基硅烷键合硅胶为填料，甲醇-乙腈-0.2％H₃PO₄(10∶15∶75)为流动相，等度洗脱，检测波长254nm。当选用色谱柱C18(Diamonsil C₁₈，250×4.5mm，5μm)，室温条件(17～22℃)，流动相流速1ml/min时，最先洗脱的成分是原阿片碱，其后是右旋四氢掌叶防己碱，保留时间分别约为17～19分钟和20～22分钟。采用外标法进行定量测定。

夏天无提取物A的生物活性：

提取物A委托国家新药筛选中心进行NMDA受体拮抗剂和乙酰胆碱酯酶抑制剂的两项生物测试，测试模型分别是：1.NMDA受体[³H]MK-801结合试验；2.大鼠皮层乙酰胆碱酯酶体外抑制。

NMDA受体[³H]MK-801结合试验。测试方法：在[³H]MK-801(Dupont，24Ci/mmol)结合于大鼠大脑皮层NMDA受体，观察受试品对[³H]MK-801结合的影响。结果评定：抑制率大于30％为有效，小于30％为无效。试验结果，提取物A在浓度为0.01mg/ml、0.1mg/ml、1mg/ml分别对NMDA受体与[³H]MK-801的特异性结合的抑制率为35％、82.5％和91.5％。表明提取物A在0.01mg/ml浓度上可以有效抑制NMDA受体。

胆碱酯酶抑制作用的粗筛。采用大鼠大脑皮层乙酰胆碱酯酶试验方法。抑制率大于50％为有效，小于50％无效。结果显示：提取物A在浓度0.026mg/ml时，对乙酰胆碱酯酶抑制率为52.7％，有效。

动物试验。大鼠双侧颈总动脉结扎60分钟，手术后第9天大鼠在Morris水迷津中的学习能力降低，到达终点的时间显著增加，进入盲端的错误次数明显增多。手术前10分钟腹腔注射(ip)给予提取物A 300mg/kg，可显著改善这一功能的降低，到达终点的时间(19.6±2.4秒vs 53.6±9.7秒)和进入盲端的错误次数(2.4±0.7vs 11.3±2.7)都明显改善。提取物A 200mg/kg(ip)预处理，对小鼠icv输注NMDA受体激动剂-喹啉酸引发的惊厥发作产生一定保护作用，动物惊厥发生率较对照组降低41±9.2％，对喹林酸诱发的海马神经细胞损害也显示明显保护作用。

所以，提取物A具有用于与人中枢神经NMDA受体结合相关的，以及和胆碱酯酶活性相关的，表现为记忆缺失以及衰退疾病的治疗的用途。特别是脑血管病变导致脑缺血，进而导致神经受损的记忆不良如中风后遗症中记忆衰退的症状，以及与NMDA受体相关的神经退化导致的老年性记忆不良的治疗，比如老年性痴呆症的治疗用途。

提取物A在临床使用时可以制成片剂、胶囊、颗粒剂、口服溶液等口服制剂，也适合制成注射液和注射用粉针剂用于肌肉注射或静脉注射。

附图说明

图1是提取物A的高效液相色谱图(CD1＝原阿片碱，CD10＝右旋四氢掌叶防己碱)。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明作进一步的描述，但不限制本发明。

实施例1

提取物A制备：10千克夏天无粗粉用8升95％工业酒精渗漉，渗漉液减压浓缩得粗浸膏。将粗浸膏加热下溶于1.5升pH 2的稀盐酸中，用等体积乙酸乙酯萃取三次除去酯溶性非生物碱部分，水层用浓氨水调pH至8，用等体积的氯仿萃取三次，氯仿萃取液减压浓缩至干，得120克总碱。总碱上减压液相色谱柱纯化。2千克硅胶(100-200目)，将100克总碱用氯仿溶解上样，15升丙酮洗脱，洗脱液蒸干，得残渣82.1克。取20克残渣，搅拌下加入10％NaOH水溶液100ml于80℃水浴反应0.5小时。放冷至室温，加水至总体积为500ml，用氯仿萃取三次(400ml，300ml，300ml)，合并氯仿液，用400ml水洗一次，氯仿液减压浓缩至干，60℃真空干燥，得提取物A 15.7克。

实施例2

提取物A制备：10千克夏天无粗粉以10倍量1％硫酸渗漉提取，渗漉液通过731型阳离子交换树脂(树脂用量与生药量相等)，水洗至流出液呈中性，再以1％氢氧化铵的乙醇溶液洗脱，收集5倍生药量的洗脱液，回收乙醇至干，得总碱122克。称取2千克硅胶(100-200目)装柱，将100克总碱用二氯甲烷溶解上样，15升丙酮洗脱，洗脱液蒸干，得残渣80.4克。取20克残渣，搅拌下加入10％NaOH水溶液100ml于80℃水浴反应0.5小时。放冷至室温，加水至总体积为500ml，用二氯甲烷萃取三次(400ml，300ml，300ml)，合并有机相，用400ml水洗一次，减压浓缩至干，60℃真空干燥，得提取物A 15.2克。

实施例3

对实施例1和2获得提取物A进行含量检测。色谱条件：以十八烷基硅烷键合硅胶为填料(Diamonsil C₁₈，250×4.5mm，5μm)，甲醇-乙腈-0.2％H₃PO₄(10∶15∶75)为流动相，流动相流速1ml/min，等度洗脱，检测波长254nm，室温条件。对照品溶液配制，取原阿片碱和右旋四氢掌叶防己碱对照品，用流动相分别配制成浓度为10μg/ml的溶液，即得。供试品溶液配制，取提取物A，用流动相配制成浓度为20μg/ml的溶液，即得。取上述两种溶液注入色谱仪，测定峰面积，以外标法计算含量。结果如下：

Claims (5)

1.一种夏天无提取物，其特征在于，原阿片碱、右旋四氢掌叶防己碱的总和在提取物中的比例不低于50％w/w，其中原阿片碱在提取物中含量为24％-50％w/w；右旋四氢掌叶防己碱在提取物中含量为26％-50％w/w；

所述的夏天无提取物的制备方法，包括如下步骤：

(1)总生物碱的制备：

将药材以浓度低于95％的乙醇加热回流或室温下渗漉制备浸出液，浸出液回收溶剂后残渣为粗浸膏，粗浸膏溶解在稀矿酸中，用与水不互溶的弱极性有机溶剂乙酸乙酯进行萃取，以除去脂溶性的非生物碱成分；萃取后分离的水层再用碱调pH值至7.5～8.0，然后用与水不互溶极性或弱极性有机溶剂氯仿、二氯甲烷、乙酸乙酯或乙醚萃取游离型的生物碱，分离有机相，弃去水相，回收有机相的溶剂后即得总生物碱；

(2)总生物碱分离纯化：

总生物碱用等量氯仿溶解后上100-200目硅胶柱层析，样品量与硅胶用量为1∶20，丙酮为洗脱剂，收集洗脱液，减压浓缩得残渣；

(3)上述残渣用热碱液处理：

残渣用10％-20％w/v NaOH溶液反应0.5-1小时，除去具有内酯环结构的生物碱，再用氯仿或二氯甲烷萃取其他非内酯环结构的生物碱，减压浓缩得提取物。

2.根据权利要求1所述的夏天无提取物，其特征在于，总生物碱采用以下方法制备：用稀硫酸、稀盐酸或稀醋酸对药材进行渗漉，渗漉液通过强酸型阳离子交换树脂吸附生物碱，再以碱化乙醇洗脱，收集洗脱液，回收乙醇，残渣即为总生物碱。

3.根据权利要求1所述的夏天无提取物，其特征在于，步骤(3)中的残渣用热碱液处理时温度为70～90℃。

4.权利要求1所述的夏天无提取物在制备防治由血管性痴呆或老年性痴呆症引起的记忆不良药物中的应用。

5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，所述药物为片剂、胶囊、颗粒剂、口服溶液、注射液或注射粉针剂。

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