ES2574646T3 - Separación y/o purificación de pneumocandina B0 a partir de C0 - Google Patents
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Abstract
Método de cromatografía de líquido de interacción hidrófila para la separación de la pneumocandina B0 de la pneumocandina C0 caracterizado por el uso de un fase estacionaria hidrófila que comprende sílice sin modificar y una fase móvil hidrófoba que comprende 80 % -90 % v/v de acetonitrilo y 10 %-20 % v/v de una solución acuosa ácida.
Description
Separación y/o purificación de pneumocandina B0 a partir de C0
5 Campo de la invención
La presente invención se refiere a métodos para la separación y purificación de compuestos de pneumocandina.
Antecedentes
Las pneumocandinas son hexapéptidos cíclicos antifúngicos con una cadena lateral de lípidos (ver Schwarts y otros, 1992, Journal of Antibiotics, Vol 45, núm. 12, páginas 1853-1866, Masurekar y otros, 1992, Journal of Antibiotics, Vol 45, núm. 12, páginas 1867-1874, Hensens y otros, 1992, Journal of Antibiotics, Vol 45, núm. 12, páginas 1875-1885, Schmatz y otros, 1992, Journal of Antibiotics, Vol 45, núm. 12, páginas 1886-1891 y Adefarati y otros, 1992, Journal of
15 Antibiotics, Vol 45, núm. 12, páginas 1953-1957 y US 5.021.341)
La actividad antifúngica de las pneumocandinas está conectada a la inhibición de la biosíntesis de 1,3β-glucanos, 1,3βglucano sintasa, una enzima de múltiples subunidades, es responsable de la construcción de la pared celular fúngica, la deposición del tabique de división, y el ensamblaje de la pared de ascosporas. La subunidad catalítica de este complejo de enzimas, una proteína de membrana integral, se ha identificado tanto en levaduras modelo Saccharomyces cerevisiae y Schizosaccharomyces pombe, y en los hongos patógenos tales como las especies de Candida, Aspergillus, Cryptococcus y Pneumocystis". (Curr Drug Targets Infect Disorders. 2001 agosto; 1 (2): 159-69 por Liu y Balasubramanian).
25 Las pneumocandinas y los derivados de la pneumocandina son útiles como ingredientes farmacéuticos activos (API) y/o productos intermedios para la producción de API. Los medicamentos que comprenden los API están destinadas para usar en el tratamiento terapéutico o profiláctico de enfermedades o afecciones que implican infecciones fúngicas.
Por ejemplo, los API de caspofungina es un derivado semisintético de la pneumocandina B0. La caspofungina, comercializada como Cancidas®, se indica en adultos y pacientes pediátricos (3 meses o más) para: el tratamiento empírico de presuntas infecciones por hongos en pacientes con fiebre, neutropénicos.
el tratamiento de la candidemia y de las siguientes infecciones por Candida: abscesos intraabdominales, peritonitis e infecciones espacio pleural. el tratamiento de la candidiasis esofágica. 35 el tratamiento de la aspergilosis invasiva en pacientes que son refractarios o intolerantes a otras terapias
Por lo tanto, se requiere que los API tengan alta pureza para la seguridad y eficacia de los medicamentos.
La pneumocandina B0 puede usarse como material de partida para la producción de caspofungina. Durante dicha producción, la pneumocandina C0 será considerada como una impureza . Por lo tanto, es conveniente separar la pneumocandina B0 de la pneumocandina C0, o incluso purificar la pneumocandina B0 a partir de la pneumocandina C0. La pneumocandina B0 se produce, a menudo, por la fermentación del hongo Glarea lozoyensis (anteriormente clasificado como Zalerion arboricola), pero muchos isómeros y derivados con propiedades fisicoquímicas similares, se coproducen en los procesos de fermentación.
45 La pneumocandina B0 y la pneumocandina C0 son isómeros que se diferencian por la posición de un grupo hidroxilo en solamente un residuo de prolina: Varios métodos para la separación de la pneumocandina B0 de las otras pneumocandinas (por ejemplo, la pneumocandina A0, B5, D0, E0) son conocidos. Sin embargo, los métodos de cristalización y de cromatografía en fase inversa han sido incapaces de separar la pneumocandina B0 de la pneumocandina C0. Estos dos isómeros difieren sólo
5 por la posición de un grupo hidroxilo en un residuo de prolina.
Para la separación de la pneumocandina B0 de la pneumocandina C0, se ha usado la cromatografía en fase normal utilizando fases móviles de acetato de etilo/metanol/agua. Este método, sin embargo, sufre de baja solubilidad de la pneumocandina en la solución de carga y también de algo baja robustez. Además, esta fase móvil no es muy compatible con los métodos de espectrometría de masas, lo que limita la utilidad del método para fines analíticos.
Técnica anterior
Varias publicaciones describen métodos para la purificación de pneumocandinas. 15 Purification of Pneumocandins by preparative silica-gel high-performance liquid chromatography Journal of Chromatography A, 831 (1999) 217-225 de Osawaa Osawaa y otros.
Preparative high-performance liquid chromatography of echinocandins Journal of Chromatography A, Volumen 27, Número 2, 11 de diciembre de 1998, páginas 373-389 de Roush y otros.
Normal Phase High-Performance Liquid Chromatography of Pneumocandins: In Situ Modification of Silica with L-Proline To Separate Structural Analogues 25 Biotechnol Prog. 2006 marzo-abril; 22 (2): 538-46 de Nti-Gyabaah y otros.
Ultrafast liquid chromatography/tandem mass Spectrometry bio analysis of polar analytes using packed silica columns Rapid Commun Mass Spectrom. 2002; 16 (17): 1613-21 de Shou y otros
WO2005026323 STATIONARY PHASES AND A PURIFICATION PROCESS USING THE STATIONARY PHASES
Transition Metal-Mediated Separation of Isomeric Pneumocandins by Capillary Electrochromatography 35 J. High Resol. Chromatogr, 1999, 22 (6).: 309-314 de Hoffman y Dovletoglou
Potential of HILIC-MS in quantitative bio analysis of drugs and drug metabolites
J. Sep. Sci. 2008, 31, 1481-1491 de Hsieh
Resumen de la invención
Esta invención proporciona la separación y purificación de compuestos de pneumocandina.
Más específicamente, se proporciona un método para la purificación de la pneumocandina B0.
45 Aún más específicamente, se proporciona un método para la separación de la pneumocandina B0 de la pneumocandina C0, mediante el uso una fase estacionaria hidrófila que comprende sílice sin modificar y una fase móvil hidrófoba que comprende 80% -90% v/v de acetonitrilo y 10% -20% v/v de una solución acuosa ácida.
Este método proporciona una separación muy rápida de B0 de C0 mediante el uso una fase móvil que es compatible con los métodos de espectrometría de masas.
Descripción detallada
55 Definiciones:
Como se usa en la presente descripción, los siguientes términos y expresiones se supone que tienen los significados definidos más abajo.
"Pneumocandinas" son hexapéptidos cíclicos o derivados de los mismos que comprenden un resto lipídico con actividad antifúngica.
"Pneumocandina B0" es un compuesto con la siguiente estructura:
65 Sin embargo, el término "Pneumocandina B0", como se usa en la presente, también incluye sales o estereoisómeros de la misma.
"Pneumocandina C0" es un compuesto con la siguiente estructura:
Sin embargo, el término "Pneumocandina C0", como se usa en la presente, también incluye sales o estereoisómeros de la misma.
45 "Separación" es cualquier método en donde un compuesto deseado se resuelve de otro (por métodos analíticos o preparativos).
"Purificación" es cualquier método de separación por el cual se incrementa la concentración de un compuesto deseado.
"Cromatografía" es cualquier técnica de purificación que implica una fase estacionaria y una fase móvil.
"Una fase estacionaria" es cualquier superficie que comprende ligandos capaces de retenedor los compuestos.
"Ligandos" son restos de la fase estacionaria, en la que se produce la unión de los compuestos.
55 "Una fase móvil" es cualquier fluido, disolvente, líquido o mezcla que puede filtrarse a través o a lo largo de la fase estacionaria en una dirección definida.
"Una fase móvil hidrófoba" es cualquier fase móvil que comprende un porcentaje alto de un disolvente orgánico y un porcentaje bajo de una solución acuosa (por ejemplo, ácido fórmico o TFA) y/o un tampón (por ejemplo, acetato de amonio o formiato de amonio).
"Cromatografía de fase inversa" es cualquier cromatografía en la que los componentes más polares o cargados se eluyen antes que los menos polares.
65 "Cromatografía en fase normal" es cualquier cromatografía en la que los componentes más polares o cargados se eluyen más tarde que los menos polares.
"Alto porcentaje" significa entre 60 % -100 % 5 "Bajo porcentaje" significa entre 0 % -40 %
"% v/v" significa porcentaje en volumen
HILIC es cualquier técnica cromatográfica que emplea un fase estacionaria hidrófila y fases móviles de disolventes orgánicos acuosos.
La presente invención permite la separación y la purificación de compuestos de pneumocandina por cromatografía, especialmente cromatografía de interacción hidrófila (HILIC), también conocido como cromatografía en líquida de
15 interacción hidrófila.
Sin estar atados por la teoría, se cree que durante la purificación por HILIC se crea un sistema de extracción líquidolíquido. La fase móvil forma una capa rica en agua en la superficie de la fase estacionaria altamente polar. Los analitos se distribuyen entre el estacionaria la capa rica en agua con altos contenidos acuosos y el fase móvil con contenidos en su mayoría orgánicos. Los analitos que poseen mayor polaridad tendrán una mayor afinidad por la capa acuosa estacionaria que los analitos que poseen una polaridad más débil. Por lo tanto, probablemente tiene lugar una separación basada en la polaridad y el grado de solvatación de un compuesto. Sin embargo, el mecanismo de HILIC exacto está aún sin resolver en el campo.
25 Hay varios tipos de fases estacionarias polares, tales como, por ejemplo, columnas de sílice sin modificar, amino, y zwitteriónica (ZIC) comercialmente disponibles para separación/purificación por HILIC.
Para la presente invención, se prefieren las superficies de sílice sin modificar que comprende silanoles y/o siloxanos.
La HILIC a menudo proporciona una fase móvil orgánica alta y acuosa baja que es favorable a MS en términos de sensibilidad.
Se prefiere que la fase móvil contenga un porcentaje alto de un disolvente orgánico (por ejemplo ACN) y un porcentaje bajo de una solución acuosa ácida (por ejemplo, ácido fórmico o TFA) y/o un tampón (por ejemplo, acetato de amonio o
35 formiato de amonio).
La muestra de pneumocandina se disuelve en la fase móvil y pasa a través de la fase estacionaria y de esta manera la separación es permitida. De esta manera, la pneumocandina B0 se puede separar de la pneumocandina C0 o de otras pneumocandinas. Esta separación cromatográfica puede llevarse a cabo a escala preparativa o analítica.
Esta invención proporciona un método para la separación y la purificación de compuestos de pneumocandina.
Más específicamente se proporciona un método para la purificación de la pneumocandina B0.
45 Aún más específicamente, se proporciona un método para la purificación de B0 usando una fase estacionaria hidrófila y fase móvil hidrófoba.
La fase móvil hidrófoba podría comprender 60 %-98 % de acetonitrilo, o más preferentemente 75 %-95 % de acetonitrilo
o incluso más preferentemente 80 %-90 % de acetonitrilo o más preferentemente 85 %-87 % de acetonitrilo.
La fase móvil hidrófoba podría comprender 2 %-40 % de soluciones acuosas, o más preferentemente 5 %-25 % de soluciones acuosas o aún más preferentemente 10 %-20 % de soluciones acuosas con la máxima preferencia 13 %-15 % de soluciones acuosas.
55 En otra modalidad, la fase móvil comprende acetonitrilo, agua y acetato de amonio.
En otra modalidad, esta invención proporciona un método para la separación de la pneumocandina B0 de otros compuestos.
En otra modalidad, esta invención proporciona un método para la separación de la pneumocandina B0 de otras pneumocandinas.
En aún otra modalidad, esta invención proporciona un método para la separación de la pneumocandina B0 de la pneumocandina C0.
65 Para poder crear un método analítico para analizar el contenido de B0 y C0 en una muestra, fue necesario separar los dos compuestos por cromatografía o encontrar iones específicos de los compuestos, calificadores o transiciones MS/MS. Ya que ninguno de los estándares B0 o C0 suministrados era lo suficientemente puro, se tuvo que desarrollar una separación rápida de B0 o C0 o incluso antes de que pudieran realizarse los experimento de MS. Ya que la
5 cromatografía en fase inversa no mostró resultados prometedores, se decidió tratar de establecer un método basado en la cromatografía de fase normal. Las pruebas iniciales se realizaron en una columna Agilent-NH2, con diferente combinaciones de acetonitrilo (ACN) y 0,1 % de solución de acetato de amonio en agua (AMAC), lo que mostró signos de separación, pero la resolución estaba lejos de ser lo suficientemente buena para dar una separación inicial de los dos compuestos. Una columna de HILIC Ascentis Express, de Sigma-Aldrich se probó después basada en que esta es de un tipo de "fase normal" de columna y que la tecnología de partículas de núcleo fundido es conocida para dar una buena resolución. Después de poner a prueba diferentes combinaciones de ACN y AmAc se seleccionó una mezcla de 85/15 (ACN/AmAc). El resultado fue una separación inicial de B0 y C0. El aumento del contenido de ACN dio tiempos de retención más largos, pero picos más amplios, y aumentar el contenido AMAC dio tiempos de retención más cortos pero menos separación. B0 y C0 fueron controlados con ESI/MS en el modo positivo.
15 Este método proporciona sorprendentemente una separación rápida de B0 de C0 con una fase móvil que es compatible con los métodos de espectrometría de masas (la fase móvil es volátil y da una alta eficiencia de ionización). El método puede separar B0 de C0 en menos de 5 minutos o incluso menos de 3 minutos.
Las siguientes abreviaturas se usan con los significados especificados a lo largo de esta descripción:
Abreviaturas:
API -ingredientes farmacéuticos activos
25 HILIC -cromatografía de líquidos de interacción hidrófila LC -cromatografía de líquidos HPLC -cromatografía de líquidos de alto rendimiento MS -espectrometría de Masas MS/MS -espectrometría de masas en tándem ESI/MS -ionización por electrospray espectrometría de masas TOF -tiempo de Vuelo ZIC -columna zwitteriónica ACN -acetonitrilo AMAC -acetato de amonio
35 TFA -ácido trifluoroacético
EJEMPLOS
En este experimento se usó un sistema HPLC Agilent 1200 se acoplado a un espectrómetro de masas Agilent 6520 Q-TOF. El sistema HPLC Agilent 1200 consistía en una bomba binaria, desgasificador, automuestreador termostatizado y compartimento termostatizado de columnas (fijado a 25 °C). Se usó una columna Supelco Ascentis Express HILIC de 15 cm x 4,6 mm, 2,7 µm. La fase móvil consistía en 15% v/v 0,1% p/p de acetato de amonio pH 4,5 y 85% v/v de ACN. El
45 régimen de flujo fue de 1 ml/min. La figura 1A muestra que esta configuración cromatográfica es capaz de separar la pneumocandina B0 de la pneumocandina C0 en una mezcla que contiene ambos isómeros. La figura 1B muestra la identificación del pico de pneumocandina B0 mediante el uso un estándar de referencia de pneumocandina B0 pura. La figura 1C muestra la identificación del pico de la pneumocandina C0 mediante el uso un estándar de referencia de la pneumocandina C0 pura. La separación cromatográfica y los tiempos de retención podrían verse afectados por la alteración de los contenidos de acetato de amonio o ACN. El aumento del contenido de ACN resultó en tiempos de retención más largos y picos más amplios. El aumento del contenido de acetato de amonio dio lugar a tiempos de retención más cortos y disminución de la separación.
55
Fig. 1 Cromatogramas de masas selectivos de diferente experimentos de LC-MS. (A) Separación cromatográfica de la pneumocandina B0 de la pneumocandina C0 en una mezcla que contiene ambos isómeros. (B) Identificación del pico de pneumocandina B0 mediante el uso de un estándar de referencia de pneumocandina B0 pura. (C) Identificación del pico de la pneumocandina C0 mediante el uso un estándar de referencia de pneumocandina C0 pura.
35 Ejemplo II
En este experimento, se usó un sistema HPLC Thermo Fisher Surveyor. El sistema HPLC Surveyor consistía en una bomba cuaternaria, desgasificador, automuestreador con termostato y un compartimento termostatizado de columnas (fijado a 40 °C). Se usó una columna Supelco Ascentis Si HILIC de 15 cm x 2,1 mm, 5 µm. La fase móvil consistía en 13% v/v 0,1% p/p de acetato de amonio pH 4,5 y 87% v/v de ACN. El régimen de flujo fue de 0,2 ml/min. La figura 2 muestra que esta configuración cromatográfica es capaz de separar la Pneumocandina B0 de la pneumocandina C0 en una muestra que contiene ambos isómeros:
Claims (7)
-
imagen1 Reivindicaciones1. Método de cromatografía de líquido de interacción hidrófila para la separación de la pneumocandina B0 de la pneumocandina C05 caracterizado por el uso de un fase estacionaria hidrófila que comprende sílice sin modificar y una fase móvil hidrófoba que comprende 80 % -90 % v/v de acetonitrilo y 10 %-20 % v/v de una solución acuosa ácida. - 2. El método de acuerdo con la reivindicación 1, en donde la separación es una purificación. 10
-
- 3.
- El método de acuerdo con la reivindicación 1, en donde la fase estacionaria comprende grupos siloxano.
-
- 4.
- El método de acuerdo con la reivindicación 1, en donde la fase estacionaria comprende grupos silanol.
15 5. El método de acuerdo con la reivindicación 1, en donde la fase estacionaria comprende grupos siloxano y silanol. - 6. El método de acuerdo con la reivindicación 1, en donde la fase móvil comprende 15% v/v 0,1% de acetato deamonio acuoso y 85% v/v de acetonitrilo. 20
-
- 7.
- El método de acuerdo con la reivindicación 1, en donde el tiempo de separación es de menos de 5 minutos.
-
- 8.
- El método de acuerdo con la reivindicación 1, en donde el tiempo de separación es de menos de 3 minutos.
8
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