CN102335596A - 一种固定相和利用该固定相纯化脂肽的方法 - Google Patents

一种固定相和利用该固定相纯化脂肽的方法 Download PDF

Info

Publication number
CN102335596A
CN102335596A CN2010102304412A CN201010230441A CN102335596A CN 102335596 A CN102335596 A CN 102335596A CN 2010102304412 A CN2010102304412 A CN 2010102304412A CN 201010230441 A CN201010230441 A CN 201010230441A CN 102335596 A CN102335596 A CN 102335596A
Authority
CN
China
Prior art keywords
phase
kangding
knob
lipopeptid
mutually
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
CN2010102304412A
Other languages
English (en)
Inventor
刘石东
何兵明
张兆利
卓忠浩
季晓铭
高霄梁
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Shanghai Techwell Biopharmaceutical Co Ltd
Original Assignee
Shanghai Techwell Biopharmaceutical Co Ltd
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Shanghai Techwell Biopharmaceutical Co Ltd filed Critical Shanghai Techwell Biopharmaceutical Co Ltd
Priority to CN2010102304412A priority Critical patent/CN102335596A/zh
Publication of CN102335596A publication Critical patent/CN102335596A/zh
Pending legal-status Critical Current

Links

Images

Landscapes

  • Treatment Of Liquids With Adsorbents In General (AREA)

Abstract

本发明公开了一种固定相和利用该固定相纯化脂肽的方法。所述固定相具有如下结构或其盐形式：
Figure DSA00000196153700011
其中R是H，(CH2)nCONH2，(CH2)nNH2或(CH2)nNH(CH2)nCONH2；m是2或3；n是1-8；和R1是C2-C6烷基。本发明还公开了利用该固定相纯化脂肽的方法。

Description

一种固定相和利用该固定相纯化脂肽的方法
技术领域
本发明涉及脂肽的纯化方法，更具体地，本发明涉及到一种固定相和利用该固定相纯化脂肽的方法。
背景技术
近年来，在某些真菌的发酵液中发现了具有抗真菌活性的环肽类物质。这些肽类，主要是环状的六肽，通常被称为棘白菌素类物质，如纽莫康定，WF11899，棘球白素等。对这些环肽类物质进行化学修饰可以得到用于临床治疗的半合成抗生素。化合物I(纽莫康定B0)是天然产物，一般用于作为合成化合物II的原料。化合物II的醋酸盐作为一种肽类抗生素用于治疗侵袭性曲霉菌感染、食管念珠菌病、由念珠菌属引起的腹内脓肿病、胸膜炎、腹腔感染，以及嗜中性粒细胞减少症患者不明致病源引起的发热等。该化合物的醋酸盐(醋酸卡泊芬净，商品名科赛斯，CANCIDAS)目前作为静脉给药的抗真菌药在多个国家销售。
Figure BSA00000196153900011
化合物I
Figure BSA00000196153900021
化合物II
脂肽类如化合物I是发酵过程中的常见产物，在该发酵过程中，许多密切相关的类似物与所需产物一起产生。
具有1065道尔顿分子量的化合物I(纽莫康定B0)是天然产物，通过发酵作为次级代谢产物产生。化合物I(纽莫康定B0)和两种关键类似物杂质纽莫康定B5和E0的结构都属于二甲基肉蔻酸酯侧链偶联的环状六肽，如表1所示。
表1纽莫康定B0和其三种类似物
  化合物   R1   R2   R3   R4   R5   R6
  纽莫康定B0(I)   OH   OH   Me   OH   H   OH
  纽莫康定B5   OH   H   Me   OH   H   OH
  纽莫康定E0   OH   OH   Me   OH   H   H
硅胶色谱利用所需的产物包括纽莫康定B5和E0在内的类似物杂质的富羟基环状六核的结合亲和性的细微差异来实现分离。纽莫康定B5和E0，是纽莫康定B0的发酵产物中的两种关键类似物杂质，在发酵产物中所占比例约为6-10％，在硅胶HPLC纯化中，洗脱时非常接近纽莫康定B0。故为了使含有这些类似物杂质的原料经纯化后能达到所需的纯度，可以加载在色谱柱上的纽莫康定B0粗品的量受到很大的限制。所以人们极其努力地提高对关键杂质的分离度。
国际申请WO2004/042350公开了一种利用氨基酸作为流动相改性剂，以提高杂质分离效果的方法，但该方法后处理中需除去其中的氨基酸，操作比较繁复。中国申请CN1845751公开了一种N-β-丙氨酰胺基丙基二氧化硅的固定相，以及利用该固定相和特定的流动相纯化肽或脂肽的方法，但此方法对结构类似杂质如纽莫康定B5和E0的分离效果较差，且收率也不高。
因此，本领域迫切需要提供一种操作简单、得率和分离效果显著的纯化脂肽的方法。
发明内容
本发明旨在提供一种固定相。
本发明的另一个目的是利用提供的固定相进行脂肽的纯化。
在本发明的第一方面，提供了一种具有如下结构或其盐形式的固定相，
Figure BSA00000196153900031
其中
R是H，(CH2)nCONH2，(CH2)nNH2或(CH2)nNH(CH2)nCONH2；
m是2或3；
n是1-8；和
R1是C2-C6烷基。
在另一优选例中，所述的固定相具有以下结构：
其中R1是C2、C4、C5、或C6烷基。
在另一优选例中，所述固定相具有如下结构：
Figure BSA00000196153900042
在另一优选例中，所述固定相具有如下结构：
Figure BSA00000196153900043
其中R2是C1、C2、或C3烷基。
在另一优选例中，所述固定相具有如下结构：
Figure BSA00000196153900044
在本发明的第二方面，提供了一种利用具有固定相和流动相的液体色谱体系纯化脂肽的方法，所述的方法包括步骤：负荷脂肽的选自上述本发明提供的固定相经流动相洗脱，得到纯化的脂肽。
所述方法的流动相包含溶剂A，溶剂B和水；所述溶剂A选自C1-4醇、C1- 4酮中的一种或多种的混合物；所述溶剂B选自二氯甲烷、己烷、庚烷、乙酸乙酯、乙酸异丙脂、乙腈中的一种或多种的混合物。在另一优选例中，所述流动相中，溶剂A和溶剂B的体积比为0.01-100∶1，该流动相含有水0.1-10v/v％。
所述方法中所述的脂肽为卡泊芬净、米卡芬净、或阿尼芬净的发酵产物前体。在另一优选例中，所述脂肽为卡泊芬净的发酵产物前体：纽莫康定(Pneumocandin)B0。
在本发明的第三方面，提供了一种利用上述本发明提供的方法制备的脂肽，所述的脂肽中纽莫康定B5和E0的HPLC含量小于1％。
在另一优选例中，所述的脂肽中纽莫康定B5和E0的HPLC含量小于0.3％。
据此，本发明提供了一种操作简单、得率和分离效果显著的纯化脂肽的方法。
附图说明
图1为本发明的固定相A和B的制备流程图。
图2为实施例7中纽莫康定B0粗品原料的色谱分析图。
图3为实施例7中固定相为N-β-丙氨酰胺基丙基二氧化硅的纯化效果色谱分析图。
图4为实施例7中固定相A纯化效果色谱分析图。
图5为实施例7中固定相B纯化效果色谱分析图。
图6为实施例7中固定相C纯化效果色谱分析图。
图7为实施例7中固定相D纯化效果色谱分析图。
图8为实施例7中固定相E纯化效果色谱分析图。
图9为实施例7中固定相F纯化效果色谱分析图。
图10为实施例10中乙酸乙酯、甲醇、水，流动相体系纯化效果色谱分析图。
图11为实施例10中正己烷、甲醇、水，流动相体系纯化效果色谱分析图。
具体实施方式
发明人经过广泛而深入的研究，发现了一种固定相，具有以下结构或其盐形式：
Figure BSA00000196153900051
其中
R是H，(CH2)nCONH2，(CH2)nNH2或(CH2)nNH(CH2)nCONH2；
m是2或3；
n是1-8；和
R1是C2-C6烷基。
进一步地，发明人发现利用该固定相可纯化得到高纯度脂肽，收率高，且纯化方法简单。
在本发明的一个实施例中，以上结构中的m为3，并且R1是C2、C4-C6烷基，也就是固定相具有如下结构：
Figure BSA00000196153900061
在本发明的另一个实施例中，以上结构中的m为2，固定相具有如下结构：
Figure BSA00000196153900062
其中R2是C1、C2、或C3烷基。
特别地，作为一个优选的例子，所述固定相具有如下结构：
Figure BSA00000196153900063
固定相A
或具有如下结构：
Figure BSA00000196153900064
固定相B
或具有如下结构：
Figure BSA00000196153900071
固定相C
或具有如下结构：
Figure BSA00000196153900072
固定相D
或具有如下结构：
Figure BSA00000196153900073
固定相E
或具有如下结构：
Figure BSA00000196153900074
固定相F
本发明提供了利用上述本发明提供的各种结构的固定相和流动相的液体色谱体系纯化脂肽的方法。
本发明所述的脂肽为卡泊芬净，米卡芬净或阿尼芬净的发酵产物前体，特别地，所述的脂肽为卡泊芬净的发酵产物前体：纽莫康定(Pneumocandin)B0。
本发明一个优选实施例中，纯化脂肽的方法包括步骤：
第一步，将含纽莫康定B0的发酵产物(粗品)加载到装填有本发明提供的下述结构的固定相的高效液相色谱(HPLC)柱上：
或
Figure BSA00000196153900082
其中R是H，(CH2)nCONH2，(CH2)nNH2或(CH2)nNH(CH2)nCONH2；
n是1-8；
R1是C2-C6烷基；
R2是C1、C2、或C3烷基；
第二步，用洗涤缓冲液进行洗涤；
第三步，用流动相进行洗脱，得到纯化的脂肽。
上述第一步中，高效液相色谱(HPLC)柱的体积为0.004-1.8L，加载在色谱柱上的纽莫康定B0粗品的量为0.018-40g，较佳的为0.036-30g
本文使用的术语“洗涤缓冲液”指在洗脱目标多肽分子之前，用来洗涤或重平衡装填有固定相的HPLC色谱柱的缓冲液。方便的，洗涤缓冲液和加样缓冲液可以同一缓冲液，但这不是必须的。
如本文所用，“流动相”和“洗脱缓冲液”可以互换使用，都是指用来将目标多肽从固相上洗脱下来的缓冲液。
在本发明中，所述流动相包含溶剂A，溶剂B和水；所述溶剂A选自下述的一种或多种的混合：C1-4醇、C1-4酮；所述溶剂B选自下述的一种或多种的混合：二氯甲烷、己烷、庚烷、乙酸乙酯、乙酸异丙脂、和乙腈。
所述流动相中，溶剂A和溶剂B的体积比为0.01-100∶1，较佳地为0.1-10∶1；所述流动相含有水0.1-10v/v％，较佳地含有水1.0-8.0％。
特别地，所述流动相为二氯甲烷，甲醇和水的混合物，且其体积比为80∶20∶2。
本发明提到的上述特征，或实施例提到的特征可以任意组合。本案说明书所揭示的所有特征可与任何组合物形式并用，说明书中所揭示的各个特征，可以任何可提供相同、均等或相似目的的替代性特征取代。因此除有特别说明，所揭示的特征仅为均等或相似特征的一般性例子。
本发明的主要优点在于：
1、本发明提供的纯化脂肽的方法不需要在流动相中添加流动相改性剂，避免了繁杂的后处理操作，有利于工业化生产和降低成本。
2、本发明的纯化脂肽的方法物质得率和分离效果得到特别显著的提高。
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则所有的百分数、比率、比例、或份数按重量计。
文中所提到的柱体积(此后称作cv)定义为穿过柱体所需溶剂的体积。柱负荷是指一次纯化施加到柱内的物质(粗脂肽)的量。柱负荷还可以称柱进样或进样负荷。
除非另行定义，文中所使用的所有专业与科学用语与本领域熟练人员所熟悉的意义相同。此外，任何与所记载内容相似或均等的方法及材料皆可应用于本发明方法中。文中所述的较佳实施方法与材料仅作示范之。
下述实施例中纽莫康定B0纯度检测所用的方法：
收集组分，通过反相HPLC进行分析，样本在Waters分析性HPLC体系上进行分析。反相HPLC分析用于测定纽莫康定B0和其它类似物，包括纽莫康定E0，纽莫康定B5。反相分析采用YMCJ’球柱(JM08SO4-2546WT)的梯度HPLC法，粒径4μm和孔径80。柱子为4.6mm内径(i.d..)×250cm并且保持在30℃。采用的两种流动相是0.1％磷酸(A)和乙腈(B)。洗脱梯度是从60％A和40％B(体积比)开始并且在45分钟内以1.5mL/分钟变化为1％A和99％B，并且在210nm下UV检测。
实施例1
固定相A的制备
于500ml圆底烧瓶中，依次投入99g丙烯酰胺、33g 4-氨基丁基三乙氧基硅烷和300ml二氯甲烷，20～25℃下搅拌17～18h。过滤去除未反应完的丙烯酰胺，向滤液中加入110ml水，搅拌10min，静置，分层后，弃除水相。有机相加入30g无水硫酸钠脱水。真空浓缩得到22.5g油状物。
于1L四颈烧瓶中，依次投入600ml甲苯和150g 300～400目硅胶。加热到110℃下回流脱水3h。停止加热，降温，待反应液的温度降至50℃后，用30ml甲苯溶解22.5g油状物，将含有22.5g油状物甲苯溶液，缓慢滴加其中，约30min滴毕，滴毕后继续加热至110℃，回流2h。停止加热，待反应液冷却到室温后，过滤。滤饼用800ml的二氯甲烷和甲醇(V/V＝1∶1)的混合溶液洗涤三到四次。洗涤完毕后抽干，得到150g固定相A，取部分填充到4.6mm内径(i.d.)×250mm长HPLC柱内用于评估。
实施例2
固定相B的制备
于1000ml圆底烧瓶中，依次投入200g丙烯酰胺、58g 4-氨基丙基甲基二甲氧基硅烷和600ml二氯甲烷，20～25℃下搅拌17～18h。过滤去除未反应完的丙烯酰胺，真空浓缩滤液得到62.5g油状物。
于3000mL四颈烧瓶中，依次投入1200mL甲苯和300g 300～400目硅胶。加热到110℃下回流脱水3h。停止加热降温，待反应液的温度降至50℃后，用60ml甲苯溶解62.5g油状物，将含有62.5g油状物甲苯溶液，缓慢滴加其中，约30min滴毕，滴毕后继续加热至110℃，回流2h。停止加热，待反应液冷却到室温后，过滤。滤饼用1600mL的二氯甲烷和甲醇(V/V＝1∶1)的混合溶剂洗涤三到四次。洗涤完毕后抽干，得到312g  固定相B，取部分填充到4.6mm内径(i.d.)×250mm长HPLC柱内用于评估。
实施例3
固定相C的制备
于1L四颈烧瓶中，依次投入600ml甲苯和150g 300～400目硅胶。加热到110℃下回流脱水3h。停止加热降温，待反应液的温度降至50℃后，用30ml甲苯溶解35g N-(2-氨乙基)-3-氨丙基三甲氧基硅烷，然后缓慢滴加至反应液中，约30min滴毕，滴毕后继续加热至110℃，回流2h。停止加热，待反应液冷却到室温后，过滤。滤饼用800ml的二氯甲烷和甲醇(V/V＝1∶1)的混合溶剂洗涤三到四次。洗涤完毕后抽干，得到140g固定相C，取部分填充到4.6mm内径(i.d.)×250mm长HPLC柱内用于评估。
实施例4
固定相D的制备
于1L四颈烧瓶中，依次投入600ml甲苯和150g 300～400目硅胶。加热到110℃下回流脱水3h。停止加热降温，待反应液的温度降至50℃后，用30ml甲苯溶解35gN-(2-氨乙基)-3-氨丙基二甲氧基甲基硅烷，然后缓慢滴加至反应液中，约30min滴毕，滴毕后继续加热至110℃，回流2h。停止加热，待反应液冷却到室温后，过滤。滤饼用800ml的二氯甲烷和甲醇(V/V＝1∶1)的混合溶剂洗涤三到四次。洗涤完毕后抽干，得到145g固定相D，取部分填充到4.6mm内径(i.d.)×250mm长HPLC柱内用于评估。
实施例5
固定相E的制备
于500ml圆底烧瓶中，依次投入99g丙烯酰胺、46g N-(2-氨乙基)-3-氨丙基二甲氧基甲基硅烷和300ml二氯甲烷，20～25℃下搅拌17～18h。过滤去除未反应完的丙烯酰胺，向滤液中加入110ml水，搅拌10mi n，静置，分层后，弃除水相。有机相加入30g无水硫酸钠脱水。真空浓缩得到29.5g油状物。
于1L四颈烧瓶中，依次投入600ml甲苯和150g 300～400目硅胶。加热到110℃下回流脱水3h。停止加热降温，待反应液的温度降至50℃后，用30ml甲苯溶解29.5g油状物，将含有29.5g油状物甲苯溶液，缓慢滴加其中，约30min滴毕，滴毕后继续加热至110℃，回流2h。停止加热，待反应液冷却到室温后，过滤。滤饼用800ml的二氯甲烷和甲醇(V/V＝1∶1)的混合溶剂洗涤三到四次。洗涤完毕后抽干，得到165g固定相E，取部分填充到4.6mm内径(i.d.)×250mm长HPLC柱内用于评估。
实施例6
固定相F的制备
于500ml圆底烧瓶中，依次投入99g丙烯酰胺、45g N-(2-氨乙基)-3-氨丙基三甲氧基硅烷和300ml二氯甲烷，20～25℃下搅拌17～18h。过滤去除未反应完的丙烯酰胺，向滤液中加入110ml水，搅拌10min，静置，分层后，弃除水相。有机相加入30g无水硫酸钠脱水。真空浓缩得到28.9g油状物。
于1L四颈烧瓶中，依次投入600ml甲苯和150g 300～400目硅胶。加热到110℃下回流脱水3h。停止加热降温，待反应液的温度降至50℃后，用30ml甲苯溶解28.9g油状物，将含有28.9g油状物甲苯溶液，缓慢滴加其中，约30min滴毕，滴毕后继续加热至110℃，回流2h。停止加热，待反应液冷却到室温后，过滤。滤饼用800ml的二氯甲烷和甲醇(V/V＝1∶1)的混合溶剂洗涤滤饼三到四次。洗涤完毕后抽干，得到150g固定相F，取部分填充到4.6mm内径(i.d.)×250mm长HPLC柱内用于评估。
实施例7
七种固定相分离效果比较
采用4.6mm内径(i.d.)×250cm长分析级HPLC柱，来比较采用纽莫康定B0及其类似物的分析负荷时通过不同的固定相得到的保留和选择特性。不同的固定相包括：(1)N-β-丙氨酰胺基丙基二氧化硅(CN1845751中使用的固定相)，(2)本发明的固定相A，(3)本发明的固定相B，(4)本发明的固定相C，(5)本发明的固定相D，(6)本发明的固定相E，(7)本发明的固定相F。所有这些固定相填充物具有300-400目粒径，所使用的流动相为80/20/2(v/v/v)的二氯甲烷/甲醇/水。用纯度为82.5％的纽莫康定B0粗品(其分析色谱图见图2)作为纯化的样品，其中纽莫康定B5和E0的含量为8.5％，制备该粗品的方法公开在美国专利5202309、5194377和6610822中。
使用之前，柱子用10个柱体积的甲醇冲洗，并且用2个柱体积的二氯甲烷冲洗，然后用3个柱体积的流动相平衡，纽莫康定B0的进样量为36mg，流动相流速为0.15mL/分钟。在每次运行时，通过UV检测278nm的吸收度。
流动相为80/20/2(v/v/v)的二氯甲烷/甲醇/水洗脱，收集馏分用反相HPLC检测纽莫康定B0的纯度，其分析色谱图见图3，图4，图5，图6，图7，图8，图9，评价分离的效果见表2，表3。
表2
表3
  固定相C   固定相D   固定相E   固定相F
  B0纯度(％)   97.7   97.9   98.0   97.4
  B5和E0(％)   0.28   0.31   0.22   0.24
  收率(％)   94.0   94.8   95.2   93.9
实施例8
固定相A纯化纽莫康定B0中试实施
将实施例1中制备的固定相A填充入内径80mm(i.d.)×600mm制备柱中，柱压30bar，柱床体积约1.8L。柱子用2个柱体积的甲醇冲洗，并且用1个柱体积的二氯甲烷冲洗，在进行纯化的一个样品进样前，用2个柱体积流动相平衡。用纯度为83.1％的纽莫康定B0粗品作为纯化的样品，制备该粗品的方法公开在美国专利5202309、5194377和6610822中。其中纽莫康定B5和E0的含量为8.5％，纽莫康定B0的进样量为19.2g，上样后用流动相为80/20/2(v/v/v)的二氯甲烷/甲醇/水洗脱，流速100毫升/分钟，5-12个柱体积为纽莫康定B5和纽莫康定E0的馏分，13-14柱体积为纽莫康定B0的馏分。得到的富集截留物(纽莫康定B0)收率96.1％，纯度97.7％，纽莫康定B5和E0的含量为0.28％。
实施例9
固定相B纯化纽莫康定B0中试实施
按实施例2中制备方法制备固定相B填充入内径80mm(i.d.)×600mm制备柱中，柱压30bar，柱床体积约1.8L。柱子用2个柱体积的甲醇冲洗，并且用1个柱体积的二氯甲烷冲洗，在进行纯化的一个样品进样前，用2个柱体积流动相平衡，用纯度为81.9％的纽莫康定B0粗品作为纯化的样品。其中纽莫康定B5和E0的含量为8.5％，制备该粗品的方法公开在美国专利5202309、5194377和6610822中。纽莫康定B0的进样量为20.1g，上样后用流动相为80/20/2(v/v/v)的二氯甲烷/甲醇/水洗脱，流速100毫升/分钟，4-12个柱体积为纽莫康定B5和纽莫康定E0的馏分，13-15柱体积为纽莫康定B0的馏分。得到的富集截留物(纽莫康定B0)收率95.4％，纯度97.9％，纽莫康定B5和E0的含量为0.22％。
实施例10
不同流动相纯化纽莫康定B0实验比较
将实施例1中制备的固定相A填充入80mm内经(i.d.)×600mm制备柱中，柱压30bar，柱床体积约1.8L。柱子用2个柱体积的甲醇冲洗，并且用1个柱体积的乙酸乙酯冲洗，在进行纯化的一个样品进样前，用2个柱体积流动相88/9/7(v/v/v)乙酸乙酯/甲醇/水平衡。用纯度为83.1％的纽莫康定B0粗品作为纯化的样品，纽莫康定B5和E0含量为8.5％。通过将粗品溶解在为75/20/8(v/v/v)乙酸乙酯/甲醇/水的混合物中制备进样溶液，纽莫康定B0的进样量为18.3g，上样后用流动相为88/9/7(v/v/v)乙酸乙酯/甲醇/水洗脱，流速为100mL/分钟，6-10个柱体积为纽莫康定B5和纽莫康定E0的馏分，11-13柱体积为纽莫康定B0的馏分。得到的富集截留物(纽莫康定B0)收率94.1％，纯度96.9％，纽莫康定B5和E0的含量为0.94％，分析色谱图见图10。
实施例11
将实施例1中制备的固定相A填充入80mm内经(i.d.)×600mm制备柱中，柱压30bar，柱床体积约1.8L。柱子用2个柱体积的甲醇冲洗，并且用1个柱体积的正己烷冲洗，在进行纯化的一个样品进样前，用2个柱体积流动相75/24/4(v/v/v)正己烷/甲醇/水平衡，流速为100mL/分钟。用纯度为83.1％的纽莫康定B0粗品作为纯化的样品，纽莫康定B5和E0含量为8.5％。纽莫康定B0的进样量为18.3g，上样后用流动相为75/24/4(v/v/v)正己烷/甲醇/水洗脱，7-12个柱体积为纽莫康定B5和纽莫康定E0的馏分，13-16柱体积为纽莫康定B0的馏分。得到的富集截留物(纽莫康定B0)收率91.1％，纯度97.2％，纽莫康定B5和E0的含量为0.70％分析色谱图见图11。
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并非用以限定本发明的实质技术内容范围，本发明的实质技术内容是广义地定义于申请的权利要求范围中，任何他人完成的技术实体或方法，若是与申请的权利要求范围所定义的完全相同，也或是一种等效的变更，均将被视为涵盖于该权利要求范围之中。

Claims (12)

1.一种具有如下结构或其盐形式的固定相，
其中
R是H，(CH2)nCONH2，(CH2)nNH2或(CH2)nNH(CH2)nCONH2；
m是2或3；
n是1-8；和
R1是C2-C6烷基。
2.如权利要求1所述的固定相，其特征在于，所述的固定相具有以下结构：
Figure FSA00000196153800012
其中R1是C2、C4、C5、或C6烷基。
3.如权利要求2所述的固定相，其特征在于，所述固定相具有如下结构：
Figure FSA00000196153800013
4.如权利要求1所述的固定相，其特征在于，所述固定相具有如下结构：
Figure FSA00000196153800014
其中R2是C1、C2、或C3烷基。
5.如权利要求4所述的固定相，其特征在于，所述固定相具有如下结构：
Figure FSA00000196153800021
6.一种利用具有固定相和流动相的液体色谱体系纯化脂肽的方法，其特征在于，所述的方法包括步骤：负荷脂肽的选自权利要求1-5任一所述的固定相经流动相洗脱，得到纯化的脂肽。
7.如权利要求6所述的方法，其特征在于，所述流动相包含溶剂A，溶剂B和水；所述溶剂A选自C1-4醇、C1-4酮中的一种或多种的混合物；所述溶剂B选自二氯甲烷、己烷、庚烷、乙酸乙酯、乙酸异丙脂、乙腈中的一种或多种的混合物。
8.如权利要求7所述的方法，其特征在于，所述流动相中，溶剂A和溶剂B的体积比为0.01-100：1，该流动相含有水0.1-10v/v％。
9.如权利要求6所述的方法，其特征在于，所述脂肽为卡泊芬净、米卡芬净、或阿尼芬净的发酵产物前体。
10.如权利要求9所述的方法，其特征在于，所述脂肽为卡泊芬净的发酵产物前体：纽莫康定(Pneumocandin)B0。
11.一种利用权利要求6所述的方法制备的脂肽，其特征在于，所述的脂肽中纽莫康定B5和E0的HPLC含量小于1％。
12.如权利要求11所述的脂肽，其特征在于，所述的脂肽中纽莫康定B5和E0的HPLC含量小于0.3％。
CN2010102304412A 2010-07-19 2010-07-19 一种固定相和利用该固定相纯化脂肽的方法 Pending CN102335596A (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN2010102304412A CN102335596A (zh) 2010-07-19 2010-07-19 一种固定相和利用该固定相纯化脂肽的方法

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN2010102304412A CN102335596A (zh) 2010-07-19 2010-07-19 一种固定相和利用该固定相纯化脂肽的方法

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN102335596A true CN102335596A (zh) 2012-02-01

Family

ID=45511689

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN2010102304412A Pending CN102335596A (zh) 2010-07-19 2010-07-19 一种固定相和利用该固定相纯化脂肽的方法

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN102335596A (zh)

Cited By (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN103145810A (zh) * 2012-12-20 2013-06-12 深圳翰宇药业股份有限公司 一种制备米卡芬净的方法
CN103193868A (zh) * 2013-04-25 2013-07-10 华北制药集团新药研究开发有限责任公司 一种棘白菌素类抗真菌药阿尼芬净的纯化方法
CN104250289A (zh) * 2013-06-28 2014-12-31 博瑞生物医药技术(苏州)有限公司 一种纽莫康定b0的分离纯化方法
CN104447961A (zh) * 2013-09-13 2015-03-25 浙江震元制药有限公司 棘白菌素b母核的提取方法

Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2005026323A2 (en) * 2003-09-05 2005-03-24 Merck & Co., Inc. Stationary phases and a purification process using the stationary phases
CN1733797A (zh) * 2005-08-30 2006-02-15 宁波市激素制品有限公司 胸腺五肽纯化工艺方法
CN101193894A (zh) * 2005-06-09 2008-06-04 马林克罗特公司 通过制备色谱法分离和纯化纳曲酮的方法

Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2005026323A2 (en) * 2003-09-05 2005-03-24 Merck & Co., Inc. Stationary phases and a purification process using the stationary phases
CN101193894A (zh) * 2005-06-09 2008-06-04 马林克罗特公司 通过制备色谱法分离和纯化纳曲酮的方法
CN1733797A (zh) * 2005-08-30 2006-02-15 宁波市激素制品有限公司 胸腺五肽纯化工艺方法

Cited By (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN103145810A (zh) * 2012-12-20 2013-06-12 深圳翰宇药业股份有限公司 一种制备米卡芬净的方法
CN103145810B (zh) * 2012-12-20 2016-02-17 深圳翰宇药业股份有限公司 一种制备米卡芬净的方法
CN103193868A (zh) * 2013-04-25 2013-07-10 华北制药集团新药研究开发有限责任公司 一种棘白菌素类抗真菌药阿尼芬净的纯化方法
CN103193868B (zh) * 2013-04-25 2015-10-28 华北制药集团新药研究开发有限责任公司 一种棘白菌素类抗真菌药阿尼芬净的纯化方法
CN104250289A (zh) * 2013-06-28 2014-12-31 博瑞生物医药技术(苏州)有限公司 一种纽莫康定b0的分离纯化方法
CN104447961A (zh) * 2013-09-13 2015-03-25 浙江震元制药有限公司 棘白菌素b母核的提取方法
CN104447961B (zh) * 2013-09-13 2018-05-15 浙江震元制药有限公司 棘白菌素b母核的提取方法

Similar Documents

Publication Publication Date Title
EP2623611B1 (en) Method for purifying cyclic lipopeptide or salt thereof
AU2011307731B2 (en) Process for purifying cyclic lipopeptide compounds or salts thereof
CN102335596A (zh) 一种固定相和利用该固定相纯化脂肽的方法
CN102838568A (zh) 一种从红豆杉中提取紫杉醇的方法
CN102952179B (zh) 一种高纯度米卡芬净前体化合物的制备方法
CN102952178A (zh) 一种高纯度棘白霉素类化合物的制备方法
CN102816207B (zh) 卡泊芬净前体pneumocandinB0组分的纯化方法
CN104072390A (zh) 一种艾司西酞普兰化合物及其制备方法
CN106770863B (zh) 检测液态乳制品中残留农药含量的方法
CN108169471A (zh) 黄曲霉毒素b1和b2适配体亲和柱及其制备方法与应用
CN102993251B (zh) 一种用高效液相色谱纯化台勾霉素b的方法
EP2552937B1 (en) A process for purification of pneumocandin
AU2004273029A1 (en) Stationary phases and a purification process using the stationary phases
CN105218645B (zh) 一种高纯度高收率的卡泊芬净杂质c0的制备方法
CN104784972B (zh) 一种橙皮苷类免疫亲和柱的制备及其应用
CN103554133B (zh) 一种制备高纯度他克莫司的工艺
CN103923190A (zh) 从多黏菌素b的混合组分中分离纯化多黏菌素b1的方法
CN108191956B (zh) 组合型配基、组合型仿生层析介质及其制备方法和应用
CN104945468B (zh) Mmaf手性异构体的制备方法及其应用
CN107778360B (zh) 一种制备醋酸卡泊芬净的方法
CN105445399B (zh) 一种选择性萃取顺式邻二羟基化合物的方法
CN113801202A (zh) 一种醋酸卡泊芬净杂质g的制备方法
CN113801201A (zh) 一种醋酸卡泊芬净杂质b的制备方法
CN105695541B (zh) 一种抗生素nvp018中间体的分离纯化方法
JP2000511939A (ja) シクロスポリンの精製方法

Legal Events

Date Code Title Description
C06 Publication
PB01 Publication
C10 Entry into substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
C12 Rejection of a patent application after its publication
RJ01 Rejection of invention patent application after publication

Application publication date: 20120201