CN105445399B - 一种选择性萃取顺式邻二羟基化合物的方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种选择性萃取顺式邻二羟基化合物的新方法，所述方法为将二氧化钛‑二氧化锆杂合金属氧化物材料与含有顺式邻位二羟基化合物的样品溶液相接触，再将材料与样品溶液分离。此方法解决了传统硼酸材料萃取顺式邻二羟基化合物时苛刻的碱性条件和无法避免的疏水非特异性吸附，且比单一的二氧化钛或二氧化锆萃取顺式邻二羟基化合物具有更高的萃取效率。可用于各种条件下对顺式邻二羟基化合物的高选择性捕集。

Description

一种选择性萃取顺式邻二羟基化合物的方法

技术领域

本发明涉及取样制样领域，具体地涉及一种选择性萃取顺式邻二羟基化合物的方法。

背景技术

顺式邻二羟基化合物的分离在很多领域特别是生物分析领域是备受关注的研究问题。因为生物或植物体内的大量活性物质都含有顺式邻二羟基，如核苷，糖类，核糖代谢物，糖蛋白，糖肽，甾醇类等。而这些物质的选择性富集对于他们的准确定量定性检测有至关重要的作用。传统的选择性富集方法是采用有机苯硼酸功能化的材料，在碱性条件下进行萃取(Anal.Bioanal.Chem.2005,382(4),1017-1026)。这种方法的缺点是无法避免苯硼酸基团或者材料基质产生的非特异性疏水吸附(J.chromatogr.2006,24(1),73-80)，导致材料的选择性低，且碱性的萃取条件会造成生物样品的分解。

二氧化钛或二氧化锆等副族金属氧化物具有强的Lewis酸性，对很多Lewis碱化合物(如磷酸化合物，羧酸化合物，氨基化合物)有强的配位交换作用(Chromatographia2003,57(5-6),409-412；Chromatographia 2002,55(1-2),33-37)。其中顺式邻二羟基或邻羟基羧酸等含有两个邻位的配位基团的化合物可与金属Lewis酸位点发生螯合作用形成五元环，所以这些具有Lewis酸性的金属氧化物对顺式邻二羟基或邻羟基羧酸化合物有特异性的识别作用(J.Liq.Chrom.&Rel.Technol.1999,22(6),843-856)。基于这种特异性识别作用，副族金属氧化物，如氧化钛或氧化锆等材料有潜力应用于顺式邻二羟基化合物的选择性萃取。目前，基于该作用的萃取方法较少，现有技术采用二氧化钛填装的固相萃取柱对DNA样品中的RNA杂质进行除杂(Anal.Chem.2013,85,10512-10518)，但其萃取容量有限(6mg/g)，萃取平衡常数未知。

发明内容

本发明要解决的技术问题是提供一种选择性萃取顺式邻二羟基化合物的方法，能在温和pH条件下进行萃取，并解决有机苯硼酸功能化材料的非特异性疏水吸附的问题，同时具有较高的萃取容量和效率。

本发明的技术方案如下：

一种选择性萃取顺式邻二羟基化合物的方法，其特征在于：将二氧化钛-二氧化锆杂合金属氧化物材料与含有顺式邻位二羟基化合物的样品溶液充分接触，萃取富集样品中的顺式邻位二羟基化合物；再将材料与样品溶液分离。

所述二氧化钛-二氧化锆杂合金属氧化物材料是表层为二氧化钛-二氧化锆杂合金属氧化物的固相材料；杂合金属氧化物中钛和锆互相掺杂于各自金属氧化物骨架内，掺杂金属氧化物中二氧化钛的摩尔浓度为10％-90％，优选25-75％，最优为50％。杂合金属氧化物比单一的二氧化钛或二氧化锆金属氧化物具有更高的Lewis酸性和更多的Lewis酸位点，从而使得顺式邻二羟基在Lewis酸位点上的螯合作用增强，具有更大的螯合容量，进而获得更高的顺式邻二羟基萃取效率。

所述接触方式是将材料放入样品溶液中进行静态萃取，或将材料填充在带有筛板的小柱或微管，然后将样品溶液通过小柱或微管进行动态萃取。

所述邻位二羟基化合物为含有顺式邻位二羟基基团的有机化合物，例如核苷，油菜素甾醇，核苷酸，糖类，糖肽，糖蛋白。

所述固相材料为二氧化钛-二氧化锆杂合金属氧化物微球、粉末、颗粒、膜或纤维，或者为表面担载有二氧化钛-二氧化锆杂合金属氧化物颗粒或薄层的固相材料。

所述样品溶液为含有顺式邻位二羟基化合物的pH>1的水溶液、无水有机溶剂、或者水和有机溶剂互溶的混合溶液，具体为动物尿液、动物血液、人尿液、人血液、动物唾液、人唾液、动物体液、人体液、植物提取液中的一种或二种以上。

这种萃取方法所涉及的相互作用为顺式邻二羟基的两个氧原子与杂合金属氧化物表面未配位完全的缺电子基Ti或Zr之间的Lewis酸配位作用。由于顺式邻二羟基本身不受pH影响，且Lewis酸位点也基本不受pH影响，所以本技术方案的萃取方法对样品的pH环境要求较低，在pH 3-11内均有较高的萃取效率。而由于杂合金属氧化物材料的等电点介于单一金属氧化物之间，接近7，所以在中性条件下杂合材料表面基本没有羟基的解离，使得其表面的离子交换的次级作用减小，选择性增强，使得材料在pH 7中性条件下具有很高的萃取效率。

本发明具有如下优点：

1、可以在宽pH范围内，选择性萃取水溶液或有机溶液中的顺式邻二羟基化合物，可直接应用于生理条件下生物原液的萃取。

2、由于萃取材料具有无机表面，完全避免了苯基、长链烃基等基团的引入，有效避免了非特异性疏水吸附。

3、与现有技术采用的单一金属氧化物相比，杂合金属氧化物具有更高的萃取效率。

4、萃取材料的选择性高，制备简单，不需要复杂的表面修饰或合成。

此方法解决了传统硼酸材料萃取顺式邻二羟基化合物时苛刻的碱性条件和无法避免的疏水非特异性吸附，且比单一的二氧化钛或二氧化锆萃取顺式邻二羟基化合物具有更高的萃取效率。可用于各种条件下对顺式邻二羟基化合物的高选择性捕集。

附图说明

图1为核苷和脱氧核苷萃取前样品液(i)和萃取后洗脱液(ii)的色谱图。

脱氧核苷和核苷的浓度比为1:1(a)，50:1(b)和500:1(c)；峰1-4分别为胞苷，2’-脱氧胞苷，肌苷和2’-脱氧肌苷。

图2为二氧化钛-二氧化锆杂化金属氧化物纳米颗粒担载的二氧化硅微球与单一二氧化钛或二氧化锆纳米颗粒担载的二氧化硅微球富集核苷的萃取回收率对比图。

图3为二氧化钛-二氧化锆杂化金属氧化物纳米颗粒担载的介孔二氧化硅的透射电镜图，其中插图为未担载纳米颗粒的介孔二氧化硅。

图4为二氧化钛-二氧化锆杂化金属氧化物纳米颗粒担载的介孔二氧化硅富集原尿中的腺苷的洗脱液(i)和原尿直接进样(ii)的色谱图。

具体实施方式

下面结合附图和实施例来详细说明本发明，在此本发明的示意性实施例以及说明用来解释本发明，但并不作为对本发明的限定。

实施例1：用二氧化钛-二氧化锆杂化金属氧化物纳米颗粒担载的二氧化硅微球从过量脱氧核苷中选择性的萃取核苷

1)材料合成：将1g粒径5微米的二氧化硅多孔微球洗涤、烘干，再分散在10mL的0.05mol/mL十二烷基磺酸钠水溶液中萃取30min并洗净干燥待用。将四丁基钛酸酯和正丁醇锆混合于乙醇中得到溶液A 15mL，最终浓度为20％(v/v)，四丁基钛酸酯和正丁醇锆两者体积比例为1:1。将溶液A缓慢滴加于含有质量浓度2％乙酸的乙醇溶液中，形成溶胶溶液并充分水解。然后将二氧化硅加入到溶液中搅拌3小时，得到的二氧化硅与溶液离心分离，并用甲醇洗涤三次。在60℃下烘干待用。

2)样品配置：分别将终浓度5000ng/mL的2’-脱氧胞苷和2’-脱氧肌苷、500ng/mL的2’-脱氧胞苷和2’-脱氧肌苷和10ng/mL的2’-脱氧胞苷和2’-脱氧肌苷与终浓度10ng/mL肌苷和胞苷混合在蒸馏水中。

3)萃取过程：称取5mg萃取材料加入0.5mL样品中，振荡30min，然后离心弃去上清液，并用蒸馏水洗涤三次。

4)萃取效果验证：向洗涤后的材料中加入质量浓度5％甲酸水溶液0.5mL。振荡30min后离心，吸取洗脱液进样，以液相色谱-串联质谱分离检测，将得到的谱图与未用材料处理的样品液的色谱图比较，如图1所示。可以看出仅核苷可以在洗脱液中检测出来，而高浓度的脱氧核苷样品液经过萃取后，其洗脱液中几乎不含有脱氧核苷。

实施例2：二氧化钛-二氧化锆杂化金属氧化物纳米颗粒担载的二氧化硅微球与纯二氧化钛或二氧化锆纳米颗粒担载的二氧化硅微球富集核苷的对比

1)材料合成：将1g粒径5微米的二氧化硅多孔微球洗涤、烘干，再分散在10mL的0.05mol/mL的十二烷基磺酸钠水溶液中萃取30min并洗净干燥待用。合成杂合材料时将四丁基钛酸酯和正丁醇锆混合于乙醇中得到溶液A 15mL，终浓度为20％(v/v)，四丁基钛酸酯和正丁醇锆两者体积比例为1:1。合成单一氧化物担载的材料时将终浓度20％(v/v)的四丁基钛酸酯或正丁醇锆溶于乙醇中得到溶液A15mL。将溶液A缓慢滴加于含有质量浓度2％乙酸的乙醇溶液中，形成溶胶溶液并充分水解。然后将二氧化硅加入到溶液中搅拌3h，得到的二氧化硅与溶液离心分离，并用甲醇洗涤三次。在60℃下烘干待用。

2)样品配置：分别将五种核苷(胞苷，腺苷，尿苷，肌苷和鸟苷)溶于蒸馏水中。每种核苷的浓度都为50ng/mL。

3)萃取过程：称取5mg萃取材料加入0.5mL样品中，振荡30min，然后离心弃去上清液，并用蒸馏水洗涤三次。

4)萃取效果验证：向洗涤后的材料中加入质量浓度5％甲酸水溶液0.5mL。振荡30min后离心，吸取洗脱液进样，以液相色谱-串联质谱分离检测，将得到的谱图与未用材料处理的样品液的色谱图比较计算出萃取回收率，如图2所示。由图2可以看出，杂合的金属氧化物明显比单一的金属氧化物具有更高的萃取效率。

实施例3：用二氧化钛-二氧化锆杂化金属氧化物纳米颗粒担载的介孔二氧化硅富集原尿中的核苷

1)材料合成：同实施例1。其中二氧化硅多孔微球以介孔二氧化硅代替。其透射电镜图如图3所示。

2)样品配置：原尿保存于-21℃，解冻后取0.1mL直接进行萃取。

萃取过程：同实施例1。

1)萃取效果验证：同实施例1。其中洗脱液体积为0.02mL。用液相色谱-串联质谱分析洗脱液，将得到的谱图与未用材料处理的原尿样品的色谱图比较，如图4所示。可以发现处理后的样品比原尿样品的腺苷峰高了将近20倍，而按萃取和洗脱体积计算实际富集最多5倍。高于富集倍数的灵敏度主要源于材料的高萃取选择性，有效排除了原尿基质中能够抑制质谱响应的干扰物，证明了杂合材料具有高萃取效率和选择性。

实施例4：用二氧化钛-二氧化锆杂化金属氧化物颗粒的填充固相萃取柱萃取油菜素甾醇

1)材料合成：将四丁基钛酸酯和正丁醇锆混合于乙醇中得到溶液A，终浓度为20％(v/v)，两者体积比例为1:1。将溶液A缓慢滴加于含有质量浓度2％乙酸的乙醇溶液中，形成溶胶溶液并充分水解。将溶胶温度升高到30℃缓慢搅拌直到形成凝胶，然后保持此温度陈化10h后离心洗涤，然后干燥。得到大颗粒材料，经过研磨筛分得到大约50微米的填料。

2)样品配置：将10 ng/mL油菜素甾醇类化合物(包括BL,CS,TE,TY,d-CS)溶解在乙腈中。

3)填充柱制备：采用干法填柱法将约10mg材料填入0.5mm内径4cm长的PEEK管中，尾端连接带有筛板的二通。

4)萃取过程：通过泵将1mL样品以0.2mL/min的速度推入柱内。

5)萃取效果验证：以0.1mL质量浓度5％甲酸于柱内进行洗脱，洗脱液真空蒸干后复溶于乙腈中，加入1mg/mL氨基苯硼酸和质量浓度2％吡啶在70℃下进行衍生。衍生液用液相色谱-串联质谱进行分离检测。

Claims (7)

1.一种选择性萃取顺式邻二羟基化合物的方法，其特征在于：将二氧化钛-二氧化锆杂合金属氧化物材料与含有顺式邻二羟基化合物的样品溶液充分接触，萃取富集样品中的顺式邻二羟基化合物；再将材料与样品溶液分离；

所述二氧化钛-二氧化锆杂合金属氧化物材料是表层为二氧化钛-二氧化锆杂合金属氧化物的固相材料；杂合金属氧化物中钛和锆互相掺杂于彼此或各自的金属氧化物骨架内；掺杂金属氧化物中二氧化钛的摩尔浓度为10%-90%。

2.按照权利要求1所述的方法，其特征在于：所述接触方式是将材料放入样品溶液中静置或搅拌进行静态萃取，或将材料填充在一端或两端带有筛板的萃取柱或微管中，样品溶液流过萃取柱或微管进行动态萃取。

3.按照权利要求1所述的方法，其特征在于：所述顺式邻二羟基化合物为核苷、油菜素甾醇、核苷酸、糖类、糖肽、糖蛋白中的一种或两种以上。

4.按照权利要求1所述的方法，其特征在于：所述固相材料为二氧化钛-二氧化锆杂合金属氧化物微球、粉末、颗粒、膜或纤维，或者为表面担载有二氧化钛-二氧化锆杂合金属氧化物颗粒或薄层的固相材料。

5.按照权利要求1所述的方法，其特征在于：所述样品溶液为含有顺式邻二羟基化合物的无水有机溶剂、pH>1的水溶液或者pH>1的水和有机溶剂互溶的混合溶液。

6.按照权利要求5所述的方法，其特征在于：所述样品溶液为动物体液、人体液、植物提取液中的一种或两种以上。

7.按照权利要求6所述的方法，其特征在于：所述动物体液为动物尿液、动物血液、动物唾液，所述人体液为人唾液、人血液、人尿液。