JP2000511939A - シクロスポリンの精製方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 本発明の目的は、シリカゲルを充填したカラムを用い、正相シリカゲルを充填した該カラムに、主成分としてトルエンを含有する混合溶媒によって、多段階クロマトグラフィーを適用することにより、シクロスポリン複合体を含む粗生成物からシクロスポリンＡをクロマトグラフィーによって精製する方法を提供することである。

Description

【発明の詳細な説明】 シクロスポリンの精製方法 本発明の目的は、シリカゲルを充填したカラムを用い、正相シリカゲルを充填 した該カラムに、主成分としてトルエンを含有する混合溶媒によって、多段階ク ロマトグラフィーを適用することにより、シクロスポリン複合体を含む粗生成物 からシクロスポリンＡをクロマトグラフィーによって精製する方法を提供するこ とである。 シクロスポリン類は、数カ所においてＮ−メチル化されている環状ウンデカペ プチドであり、大部分のシクロスポリンにおいて薬理学的効果が確認されている これまでに、２５種からなるこのグループの化合物がシクロスポリンＡ〜Ｚとし て公知となっている。最初に、天然の物質であるシクロスポリンＡが見出され、 Tolypocladium inflatum Gams株の培養液から単離された（Helv．Chim．Acta 59 ,1075/1976）。最初、この化合物は、わずかに抗真菌性を示す抗生物質として知 られるようになり、後に、その免疫抑制効果が注目されるようになった （J.F.Borelら：Immunology,32,1017/1977）。この理由から、主として他人から の臓器移植（肺、心臓、腎臓、骨髄、皮膚）において使用されている。薬理学的 試験から、Ｔ細胞の増殖を妨害し、インターロイキン２の合成を阻止することに より、シクロスポリンＡが液性および細胞性免疫応答の両方を抑制することが立 証された。後に、シクロスポリンＡは、自己免疫性血液疾患、潰瘍性大腸炎、グ レーヴズ病、多発性硬化症、リューマチ性関節炎といったような、異なるタイプ の自己免疫および炎症性疾患に対して効果があることが明らかになった。プロト ゾアおよび腫瘍によって引き起こされる感染を治療するための試験も行われた。 このグループの重要性は、多くの合成関連化合物が、アミノ酸および置換基を異 なるものにすることによって製造することができるという事実によって示される （たとえば、特許EP56782,CH630062およびEP29122など）。 大部分のシクロスポリンは、発酵によって製造することができる。たとえば、 微生物Cylindrocarpon Lucidum Boothの培養（特許明細書番号CH589,716）； Trichoderma polysporum Rifai（特許明細書番号CH603,790）；Tolypocladium v arium（特許明細書番号HU201,577）を用いる。発酵の最終段階で、方法の特性に 応じて相異する、他の不純物（培養培地の成分、泡形成抑制剤、代謝物など）を 含むシクロスポリンが形成される。 通常、該生成物は、抽出手段によって培養液から単離される。この単離は、培 養液を遠心分離またはろ過して、菌糸体を分離し、次いでメタノールまたはアセ トンで有効成分を菌糸体から分別し、非水溶性溶媒でろ液を抽出することにより 行うことができる。他の公知の単離方法としては、非水溶性有機溶媒による全培 養液抽出を採用する、ろ過なしの方法が挙げられる。有機相の溶媒内容物は、真 空蒸留によって蒸発させる。しカル、有機溶媒抽出中に、脂質特性をもつ化合物 もまた有機相に移され、その結果、さらに精製することが困難になる。これらの 化合物を分離するために、抽出溶媒を除去した後に、残渣をメタノールと水の混 合液に溶解し、次いで同じ体積の石油エーテルで数回抽出するという、公知の方 法がある（たとえば、スイス特許明細書589,716またはドイツ特許公報第2455859 号など）。石油エーテルフラクションを合わせ、メタノール−水混合液を用いて 、シクロスポリンを回収する。有効物質を多段階抽出によってメタノール−水相 から塩化エチレンに抽出し、次いで水で洗浄し、蒸発乾固する。上記方法によっ て製造された粗生成物および含有されているシクロスポリンは、クロマトグラフ ィー法で、さらに効率よく精製することができる。 米国特許第４１１７１１８号に記載されている方法では、まず、トルエンと酢 酸エチル（１５％）の混合液を用いてシクロスポリン混合物をセファデックスＬ Ｈ−２０カラムに移し、次いでクロロホルムとメタノール（２％）の混合液を用 いてシリカゲルカラムに移す。クロマトグラフィーを繰り返しているにもかかわ らず、得られる生成物は純粋ではなく、シクロスポリンＡとＢの混合物である。 シリカゲルカラムを用いてクロロホルムとメタノールの混合液(９８．２％v/v )で粗精製するという、類似したクロマトグラフィー法が、米国特許第４２１５ １９９号に開示されている。次いで、溶出液を蒸発乾固する。残渣をメタノール に溶解し、溶離液としてメタノールを用いるセファデックスＬＨ−２０カラムク ロマトグラフィーに付す。溶出フラクションを蒸発乾固し、次いで残渣をクロ ロホルムとメタノールの混合液（９８．２％ｖ／ｖ）に溶解する。再度シリカゲ ルクロマトグラフィーに付す。シクロスポリンＡが最初に溶離液に出現する。こ れと連続したフラクションをと分離し、溶離液を蒸発して純粋成分を得る。 ドイツ特許第ＤＤ２９８２６号では、油状生成物を少量のクロロホルムに溶解 し、次いで、クロロホルムを用いるアルミナクロマトグラフィーに付す。シクロ スポリン含有フラクションを真空蒸発し、クロロホルムに溶解し、同様のカラム に付し、次いでクロロホルムで溶離する。有効物質含有フラクションを再度真空 蒸発する。残渣にヘキサンを加え、シクロスポリンＡを結晶化する。生成物をヘ キサンで洗浄し、次いで乾燥し、最後にエーテルとヘキサンまたはアセトンの混 合液から再結晶させる。 ハンガリー特許第２０１５７７号にしたがって、シリカゲルカラムを用い、ク ロロホルムとメタノールの混合液で、メタノールの濃度を増加させて段階的に溶 離することによって蒸発後に得られた粗生成物を精製することができる。該方法 は、純クロロホルムから出発して、溶離液中のメタノールを０．５volume％ずつ 増加させる。シクロスポリンＡは、２vol％、シクロスポリンＢは、２．５vol％ 、シクロスポリンＣは、３vol％メタノールを含むクロロホルムによってカラム から溶出する。 上述した方法では、主としてシクロスポリン発酵操作について述べており、精 製段階の第一の目標は、得られた生成物を同定することである。したがって、生 成物は少量しか単離されず、生成物の純度および不純物の量に関する印刷された データのない物理的および化学的性質のみが得られている。 ーを繰り返し、他の精製方法で同定および構造分析をすることにより、少量の純 シクロスポリンＡおよびＣを単離した。この論文では、トリコデルマ・ポリスポ ラム・リファイの発酵から得られた、主としてシクロスポリンＡおよびＣを含有 する粗生成物をメタノールおよび石油エーテルで脱脂されている。蒸発後、残渣 をクロロホルムに溶解し、溶離液としてクロロホルムとメタノール（９８．５： １．５）混合液を用いる勾配溶離クロマトグラフィーに付す。さらにクロマトグ ラフィーを行うことにより純結晶シクロスポリンＡが得られる。シクロスポリン 含有フラクションをメタノールに溶解し、溶離液としてメタノールを用いるセフ ァデックスＬＨ−２０カラムクロマトグラフィーに付す。ピークフラクションを 蒸発し、トルエンに溶解し、酢酸濃度を増加させながら溶離液としてトルエンを 用いる酸化アルミニウム充填カラムクロマトグラフィーに付す。フラクションを 蒸発させ、アルコール性溶液中で活性炭処理すると結晶生成物が得られる。 工業スケールで実行可能な精製方法が、米国特許第５３８２６５５号に記載さ れている。該方法では、異なるシクロスポリン成分を含む粗生成物を加熱処理し た後、クロロホルム−エタノールおよびクロロホルム−酢酸エチル−エタノール の混合液を用いるシリカゲルカラムクロマトグラフィーに付す。得られる生成物 をさらにクロマトグラフィーに付し、再結晶すると注射液製造に適した純粋な生 成物が得られる。 シクロスポリンの混合物を含む粗生成物の精製は、不純物の化学構造が主要生 成物であるシクロスポリンＡと類似していることからクロマトグラフィー特性に おいて非常に類似しており、とても難しい。純粋体の特定成分を得るためには、 採用された溶媒に関係なく、またクロマトグラフィーピークのオーバーラップが 原因で、これまでに記載した方法では、さらにクロマトグラフィーまたは他の精 製段階を実施する必要があるということが実証される。これまでに公知の精製方 法は、一般に、その溶媒要件がかなり大きいということばかりでなく、３〜４種 の異なるタイプの溶媒または溶媒混合物および２〜３種のカラム充填物の適用が 必要であることも特徴である。これらの結果から、ひとつの方法の中に、数種類 のタイプのクロマトグラフィーテクニックおよび再生法が必要ということになり 、単純な構成で、かつ一定に管理しやすく経済的に工業スケールテクノロジーに 応用しうるものとなるのが困難になっている。 環境保護という観点から、塩素化炭化水素の適用は、ひとつ以上の国において その使用を制限しようという努力がなされているために、さらに問題を生じる。 カラムの充填物質については、その表面積が小さいことからローディングキャ パシティーおよび分離能力が非常に小さいので、酸化アルミニウムの適用は非常 に疑問の残るところである。さらに、酸化アルミニウム充填物は硬くてもろいの で、充填するのに特別の装置および技術が必要となるため、工業利用の目的には 利点がない。酸化アルミニウム充填物は、化学工業において通常使用されるステ ンレス鋼カラムには、頻繁には使用できない。 セファデックスタイプの充填物は、非常に高価であり、シクロスポリン複合体 に使用する場合、互いの分子の大きさが非常に近いため、それらの能率は非常に 限定される。 本発明の目的は、医薬として安全に使用しうるように不純物の少ないシクロス ポリンＡ成分を製造するのに適した工業的スケールで容易に適用しうるクロマト グラフィー精製法を提供することである。 我々の目的は、一種類の溶媒および一種類のカラム充填物しか必要としない、 このようなクロマトグラフィー精製技術を開発することである。 表面積が大きいこと、孔形が大きいこと、吸着能力が適当であること、扱いが 容易であり、価格が比較的安いこと、といったような有利な特徴をもつために、 シリカゲルをカラム充填物として用いた。シクロスポリン成分を高い選択性をも って分離するのに適当なこの充填物にとって最善の溶媒混合物および方法が選択 されなければならなかった。 実験の結果、我々は、溶離液として主成分がトルエンである混合溶媒を用い、 シリカゲルカラムで多段階クロマトグラフィーを行うことによって我々の目的が 実現するのを確認した。驚くべきことに、溶離液としてアセトンを含有するトル エンを用いてシリカゲルカラムで三段階クロマトグラフィーを行うことによって シクロスポリンＡに最も近いシクロスポリンＵおよびＬ成分でさえも分離できる ことがわかった。これらの成分は、シクロスポリンＡとメチル基が異なるだけで ある。 ＷＯ９４／１６０９１の最初の実施例には、トルエンとアセトンの混合溶媒も 単一段階にて用いられている。得られる生成物を、エーテルとヘキサンの混合溶 媒からの再結晶に付す（収率：６６．６％）。該生成物の旋光性は十充分である が、その融点は文献に記載されているものよりも著しく低く、このことは生成物 が純粋でないことを示している。したがって、溶媒から再結晶してもなお純度が 低く、収率の低い生成物しか得られない。 本発明方法は、大量に存在する最もよく出現する不純物であるシクロスポリン ＢおよびシクロスポリンＣの分離、さらに痕跡量で存在するシクロスポリンＤ、 ＵおよびＬ成分の分離に適している。得られる最終生成物であるシクロスポリン Ａ中のシクロスポリンＢおよびＣ含量は、０．０２vol％以下であり、一方シク ロスポリンＤ、ＵおよびＬ含量は、０．０５vol％以下である。 本発明の目的は、非常に純粋なシクロスポリンＡを大量に生産することが可能 な、主成分としてトルエンを含有する混合溶媒を用い、シリカゲルカラムで多段 階クロマトグラフィーを行うことを特徴とする、シクロスポリン複合体を含有す る粗生成物からシクロスポリンＡを精製する方法を提供することである。本発明 方法の他の新規な特徴は、カラムに非常に大量に充填しうることである。常套の クロマトグラフィー手法では、カラム充填量は、カラムチャージ量の５〜１０％ 以下であり、この値は、シクロスポリンにとって低いものである。 多段階クロマトグラフィー、主成分としてトルエンを含有する溶媒混合液およ び高カラム充填が相互に関係しており、それらの組み合わせによってのみ所望の 結果が達成される。したがって、優れて純粋な生成物を得るためには、上記３つ の特性すべてを同時に使用すべきである。 本発明方法にしたがって２〜４段階のクロマトグラフィーを行うのが好ましく 、３段階がさらに好ましい。 カラムの過充填は、第１段階のクロマトグラフイーにおいて最も高い。それに 続く２段階のクロマトグラフィーにおいても同様に、有効物質と不純物とを確実 に分離することによって、高いカラム充填量を採用しうる。 このような精製には、多くとも３０vol％のトルエンを含む、トルエンとアセ トンの混合溶媒の使用が好ましい。 他の好ましい方法では、トルエンと酢酸エチルの混合溶媒を、酢酸エチル濃度 ３５％以下で用いる。 該精製方法においては、少なくとも一度は、勾配溶離を行うのが好ましい。 我々の実験において、本発明にしたがってシクロスポリン複合体を精製するに は、１０〜３０vol％のアセトンの使用が好ましく、１３〜１８vol％のアセトン および１０〜３５vol％または１５〜２０vol％の酢酸エチルの使用がさらに好ま しいことことがわかった。 本発明方法にしたがって、３段階クロマトグラフィーの場合、溶離はアセトン １５vol％または酢酸エチル１８vol％を含むトルエンで行う。第１段階では、大 部分のシクロスポリンＣが分離され、第２段階では、シクロスポリンＢ、Ｌおよ びＵが多量に除去され、最後の第３段階では、ＬおよびＵならびに他の不純物の 量は、０．０５vol％以下にまで引き下げることができる。第１段階では、シク ロスポリンＡの損失は最小であるが、第２および第３段階のプレフラクションで は、かなりの量のシクロスポリンＡが、構造の近いシクロスポリンＤ成分ととも に除去される。このシクロスポリンＡは、第４段階で非常に純粋なシクロスポリ ンＡとして回収することができる。ＵＳＰスタンダードのシクロスポリンＡ、す なわち有効成分としてシクロスポリンＡを含む注射液ＳＡＮＤＩＭＭＵＮ（登録 商標）の不純物プロフィールを比較するために、本発明方法で精製した該シクロ スポリンＡ生成物の不純物プロフィールを下記表に示す。 実施例１にしたがって処理したＵＳＰスタンダード ＳＡＮＤＩＭＭＵＮ（登録商標）注射液 不純物 vol％ vol％ vol％ シクロスポリンＣ − 0.17 0.05 シクロスポリンＢ − 0.21 0.05 未知不純物 0.09 0.35 0.05 シクロスポリンＬ 0.05 0.35 0.05 シクロスポリンＤ − − 0.05 シクロスポリンＵ 0.12 − 0.05 上記データから、本発明方法にしたがって得られたシクロスポリンＡの品質は ＳＡＮＤＩＭＭＵＮのパラメーターをかなり超えており、さらにＵＳＰの要件も 容易にクリアしていることがわかる。 本発明方法は、少量および大量のいずれの規模にも適用可能である。 本発明方法は、純粋なシクロスポリンＡを製造しうるという事実に加えて、い くらかの無視できない技術的利点も有している。ただひとつの技術的方法（クロ マトグラフィー）を使用しているために、本発明精製方法は一規則正しく管理し うるものであり、さらに繰り返し可能であって、継続的方法に変換可能である。 さらに３つのクロマトグラフィー段階において、ただひとつのタイプの混合溶媒 を使用するので、カラムと溶媒の両方の再生が、より簡単になるという特別の利 点がある。 本発明方法のさらに他の利点は、第１段階のクロマトグラフィーにおいて多量 に結合する不純物がカラム上に残るために、次の２つの段階のカラムチャージの 再生を大きく促進することである。 本発明を次に述べる実施例によって詳しく説明するが、これらに制限されるも のではない。 比較例（実施例４）では、公知の方法においてこれまでに通常採用されている ３つの段階のクロマトグラフィーにおいてジクロロメタン−アセトンの混合溶媒 をに適用した場合に、最終生成物が同程度の純度に達しないことが示される。実施例１ トルエン−アセトン混合溶媒を適用した３段階クロマトグラフィーによるシク ロスポリン粗生成物の精製 出発シクロスポリン粗生成物の品質： シクロスポリンＡ含量 ６０．９vol％ シクロスポリンＢ含量 １１．２vol％ シクロスポリンＣ含量 ８．３vol％ シクロスポリンＬ含量 １．７９vol％ シクロスポリンＵ含量 １．５８vol％ シクロスポリンＤ含量 １．２５vol％ 第１段階 容積８リットル、カバー付き、直径１０cm、長さ１００cmのクロマトグラフィ ー用カラムを２本直列に連結したものを用いてクロマトグラフィーを行う。２つ のカラムの両方に、粒径０．０４〜０．０６３mmのメルクタイプのキーセルゲル シリカゲル３．９５kgが充填されている。第１のクロマトグラフィーでは、両カ ラムは、新鮮なシリカゲルを含んでいる。次のクロマトグラフィーでは、第１の カラムを分離して、第２のカラムを新鮮なシリカゲルを含むカラムに結合する。 各クロマトグラフィーにおいてはただひとつの新しいカラムを使用する。 粗生成物の精製 あらかじめトルエン１５リットルに溶解した純度６０．９％の粗生成物４．１ kgを、直列に連結した一対のカラムに通す。１９リットルの溶液をフィルターを 通して２．４リットル／時間の供給速度でカラムの頂部から注ぐ。処置後、物質 を、第２のカラムの底部の溶出液の体積が３９リットルになるまで、１３．８７ vol％のアセトン−トルエン混合溶媒で溶離する。溶出液のシクロスポリン含量 をＴＬＣで分析する。シクロスポリンを含まないフラクションを集めて捨てる。 シクロスポリンが検出された２８リットルの溶出液が主要フラクションである。 この過程で得られた中間物質の乾燥含量は３．２３kgである。 品質： シクロスポリンＡ ７５vol％ シクロスポリンＢ １０．１vol％ シクロスポリンＣ １．６vol％ シクロスポリンＬ １．７vol％ シクロスポリンＵ １．５vol％ シクロスポリンＤ １．３vol％ シクロスポリンＡに換算した収率：９７％ 第２段階 長さ１メートル、容量８リットルのカバー付きカラムで分離を行う。カラムに はメルクキーセルゲル６０シリカゲル（０．０１５〜０．０４０mm）を入れる。 充填物の重量は３．９５kgである。第１段階で得られた中間体Ｉを含む乾燥物質 （約３リットルおよび３７０ｇ）を処置速度２．４リットル／時間でカラムに処 置し、次いで１リットルのトルエンで洗浄する。 物質を処置した後、アセトン：トルエン（１５：８５vol％）１０リットル、 次いでアセトン：トルエン（２５：７５vol％）２０リットルの混合溶媒で溶離 する。溶媒の速度は１７リットルフラクションまで２．４リットル／時間、次い で１８リットルフラクションからは５リットル／時間である。フラクションをＴ ＬＣで分析する。１〜１１リットルフラクションは捨て、１２〜１９リットルフ ラクションを臨界的Ｉフラクションとみなし、ここからサンプルを得る。それら の不純物プロフィールをＨＰＬＣで分析し、プレフラクションとして扱うかまた は主要フラクションに合せる。この方法で、プレフラクションを含む、８０ｇの 乾燥物質が得られ、次いでそれらを蒸発乾固する。２０〜２５リットルフラクシ ョンを主要フラクションとして合せる。２６〜３１リットルフラクションは、臨 界的フラクションとみなし、分析後、主要フラクションと合せるかまたはプレフ ラクションとして扱う。上記のようにして得られた主要フラクションを振動攪拌 器を搭載したフィルムエバポレーターで蒸発乾固する。中間体ＩＩ（２３４ｇ） が、収率８０％、下記の品質で得られる。 シクロスポリンＡ ９５vol％ シクロスポリンＵ １．２vol％ シクロスポリンＬ ０．７vol％ シクロスポリンＢ ＜０．１vol％ シクロスポリンＤ ０．５vol％ シクロスポリンＣ ０．１vol％ 第３段階 第２段階と同じ構造および大きさのカラムでクロマトグラフイーを行う。 第２段階で得られた中間体ＩＩから、２２０ｇの乾燥物質を含むトルエン溶液 １．７リットルを調製し、処置速度２．４リットル／時間で処置し、トルエン１ リットルで洗浄する。アセトン：トルエン（１５：８５vol％）２０リットル、 次いでアセトン：トルエン（２５：７５vol％）２０リットルの混合溶媒で溶離 する。溶媒の速度は３１リットルフラクションまで２．４リットル／時間、次い で３２リットルフラクションからは５リットル／時間である。１〜１８リットル フラクションは捨て、１２〜２３リットルフラクションが、プレフラクションで あり、臨界的Ｉフラクションとみなす。乾燥物質の含有物を分析するために、そ れらからサンプルを作成し、不純物プロフィールをＨＰＬＣで分析する。分析後 、 プレフラクションとして扱うかまたは主要フラクションに合せる。２９〜３８リ ットルフラクションを主要フラクションとして合せる。３９〜４１リットルフラ クションは、１リットルポーションに集め、臨界的フラクションＩＩとみなす。 分析後、主要フラクションと合せるかまたはポストフラクションとして扱う。フ ラクション収集の結果として、蒸発乾固後、７０ｇのプレフラクションが得られ る。主要フラクションを合せ、蒸発乾固すると１５７ｇの純粋なシクロスポリン が、収率７５％で得られる。生成物の品質である。 シクロスポリンＡ ９９．６vol％ シクロスポリンＬ ＜０．０５vol％ シクロスポリンＵ ＜０．０５vol％ シクロスポリンＤ ＜０．０５vol％ シクロスポリンＢ ＜０．０２vol％ シクロスポリンＣ ＜０．０２vol％実施例２ トルエン−アセトン混合溶媒またはトルエン−酢酸エチル混合溶媒を適用した 固定ベッド４段階シリカゲルクロマトグラフィーによるシクロスポリン粗生成物 の精製 シクロスポリンの粗生成物を実施例１で述べた３段階クロマトグラフィーで精 製する。該３段階クロマトグラフィーで得られたプレフラクションを第４段階に おいて、トルエン−酢酸エチル混合溶媒によって固定ベッドで精製する。 第４段階 クロマトグラフィーカラムの構造および大きさは、実施例１で記載したものと 同じである。カラムには、メルクキーセルゲル６０シリカゲル（０．０１５〜０ ．０４０mm）を実施例１の記載と同様に入れる。プレフラクションから得た濃縮 物を、２．５リットルのトルエンに２６０ｇを溶解した量にて、処置速度２．４ リットル／時間でカラムに付す。 シクロスポリンＡ含量 ８０．６vol％ シクロスポリンＤ含量 ４．２vol％ 処置したサンプルを１リットルのトルエンで洗浄し、次いで該カラムを酢酸エ チル：トルエン（１７：８３vol％）２０リットル、次いで酢酸エチル：トルエ ン（２８：７２vol％）４０リットルの混合溶媒で、流速２．４リットル／時間 にて溶離する。フラクション収集物のうち、１〜１９リットルフラクションは捨 てる。ＨＰＬＣで分析後、２０〜２５リットルフラクションは、捨てるかまたは 主要フラクションに合せる。２６〜３５リットルフラクションを主要フラクショ ンとして合せる。サンプル収集およびＨＰＬＣ分析後、３６〜４２リットルフラ クションは、主要フラクションと合せるかまたは捨てる。上記主要フラクション （２３〜４２リットル）を蒸発乾固する。この経路で、９９．６vol％の有効成 分を含有する１９５ｇの純粋なシクロスポリンＡが収率７５％にて得られる。品 質を下記に示す。 シクロスポリンＡ ９９．６vol％ シクロスポリンＤ ＜０．０５vol％ シクロスポリンＵ − シクロスポリンＬ −実施例３ トルエン−アセトン混合溶媒を適用した固定ベッド２段階シリカゲルクロマト グラフィーによるシクロスポリン粗生成物の精製 シクロスポリンの粗生成物を実施例１の第１段階で述べた方法で精製し，同品 質のシクロスポリン中間体Ｉを得る。さらなる精製過程を次に示す。 第２段階 乾燥物質３７０ｇを含む中間体３リットルを処置速度２．４リットル／時間で カラムに処置し、次いで処置したサンプルをトルエン１リットルで洗浄する。 アセトン：トルエン（１５：８５vol％）１０リットル、次いでアセトン：ト ルエン（２５：７５vol％）２０リットルの混合溶媒でカラムを溶離する。 溶媒の流速は、１７リットルまでは２．４リットル／時間であり、１８リット ルからは５リットル／時間である。ＴＬＣおよびＨＰＬＣ検出にしたがって、１ 〜１１リットルフラクションは捨て、１２〜２０フラクションは、プレフラクシ ョンであり、２１〜２４フラクションは、主要フラクションとみなし、２５リッ トルフラクションから最終フラクションまでをポストフラクションとして扱う。 洗浄アセトンフラクションは捨てる。 フラクション収集後、集めた主要フラクションを合せ、蒸発乾固して１１４ｇ のシクロスポリンＡを収率４１％、実施例１と同じ良好な品質の生成物として得 る。実施例４ ジクロロメタン−アセトン混合溶媒を適用した３段階クロマトグラフィーによ るシクロスポリン粗生成物の精製に対する比較例 出発シクロスポリン粗生成物の品質（実施例１で使用したものと同じ）： シクロスポリンＡ含量 ６０．９vol％ シクロスポリンＢ含量 １１．２vol％ シクロスポリンＣ含量 ８．３vol％ シクロスポリンＬ含量 １．７９vol％ シクロスポリンＵ含量 １．５８vol％ シクロスポリンＤ含量 １．２５vol％ 第１段階 クロマトグラフィー装置および充填物は実施例１に記載したものと同じである 。直列に連結した一対のカラムに、ジクロロメタン溶液１５リットルに溶解した 純度６０．９％の４．１ｋｇの粗生成物を処置する。 サンプルを通した後、流速２．４リットル／時間にてカラムをジクロロメタン で溶離し、３５リットルの溶出液を集める。１〜１０リットルのフラクションは 捨て、１１〜３５リットルのフラクションを主要フラクションとみなす。この経 路で得られた中間体Ｉの乾燥重量は、２．９ｋｇであり、有効成分の含有量は、 ７５vol%である。 第２段階 クロマトグラフィー装置および充填物は実施例１に記載したものと同じである 。乾燥物質３５０ｇを含む３リットルの中間体Ｉを供給速度２．４リットル／時 間 にてカラムに処置する。アセトン：ジクロロメタン混合溶媒（１：９）１０リッ トル、次いでアセトン：ジクロロメタン混合溶媒（２：８）２５リットル、およ び最後にアセトンで、流速２．４リットル／時間にて溶離を行う。ＴＬＣ分析に よると、プレフラクションの体積は１３リットル、主要フラクションは２２リッ トルおよびポストフラクションは１１リットルであった。２２リットルの主要フ ラクションを蒸発乾固し、結果として２２０ｇの中間体ＩＩを純度９１％で得た 。 第３段階 クロマトグラフィー装置および充填物は実施例１に記載したものと同じである 。２２０ｇの中間体ＩＩを含むジクロロメタン濃縮物を供給速度２．４リットル ／時間にて充填物に流す。アセトン：ジクロロメタン混合溶媒（１：９）２０リ ットル、次いでアセトン：ジクロロメタン混合溶媒（２：８）３０リットル、お よび最後にアセトンで、流速２．４リットル／時間にて溶離を行う。最初の２６ リットルフラクションがプレフラクションとみなされ、次の２６リットルが主要 フラクションであり、最後の１１リットルがポストフラクションである。２６リ ットルの主要フラクションを蒸発乾固し、結果として１４０ｇの中間体ＩＩＩを 次の品質で得た。 シクロスポリンＡ ９８．６vol％ シクロスポリンＵ ０．６vol％ シクロスポリンＤ ０．３vol％ シクロスポリンＬ ０．２vol％ シクロスポリンＢ ０．１vol％ シクロスポリンＣ ０．１vol％

【手続補正書】 【提出日】平成１１年２月３日（１９９９．２．３） 【補正内容】 （Ｉ）明細書の補正 i）２頁下から８行、「メタノール」を「エタノール」に訂正。 ii）４頁８行、「クロロホルム−エタノール」を「クロロホルム−ジクロロメ タン−エタノール」に訂正。 iii）９頁６行、「カラムの頂部」を「第１のカラムの頂部」に訂正。 iv）１０頁下から３行、「１２〜２３」を「１９〜２３」に訂正。 （II）請求の範囲の補正 別紙の通り。 （別紙） 請求の範囲 １．主成分としてトルエンを含有する混合溶媒を用いる多段階クロマトグラフ ィーを行うことを特徴とする、シリカゲルカラムを用いるクロマトグラフィーに よって、シクロスポリン複合体を含む粗生成物からシクロスポリンＡを高純度で 製造するための精製方法。 ２．２〜４段階のクロマトグラフィーを続いて行う請求項１に記載の方法。 ３．３段階のクロマトグラフィーを続いて行う請求項１に記載の方法。 ４．混合溶媒としてトルエン−アセトンを用いる請求項１に記載の方法。 ５．多くとも３０％のアセトンを用いる請求項４に記載の方法。 ６．トルエン−酢酸エチルの混合溶媒を用いる請求項１に記載の方法。 ７．多くとも３５vol%の酢酸エチルを含むトルエンを用いる請求項６に記載の 方法。 ８．少なくとも１つの段階のクロマトグラフィーステップにおいて、勾配溶離 を用いる請求項１に記載の方法。 ９．シクロスポリンＬ、シクロスポリンＵおよびシクロスポリンＤ含量が、０ ．０５vol%以下であり、シクロスポリンＢおよびＣ含量が、０．０２vol%以下で ある高純度シクロスポリンＡ。 １０．主成分としてトルエンを含有する混合溶媒で正相シリカゲルを含むカラ ムで多段階クロマトグラフィーを行うことを特徴とする、シリカゲルカラムクロ マトグラフィー法で、工業的スケールにおいて、シクロスポリン複合体を含む粗 生成物からシクロスポリンＡを精製する方法。 １１．クロマトグラフィーを行う前に、クロマトグラフィーの出発物質として 用いるシクロスポリン複合体を８０〜１２０℃に加熱することを特徴とする請求 項１または１０のいずれかに記載の方法。 １２．アセトンを１０〜３０％含むトルエンを用いる請求項１または１０のい ずれかに記載の方法。 １３．酢酸エチルを１０〜３５％含むトルエンを用いる請求項１または１０の いずれかに記載の方法。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ａ６１Ｋ 37/02 (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ， ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，Ｌ Ｕ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ， ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，ＫＥ，ＬＳ，Ｍ Ｗ，ＳＤ，ＳＺ，ＵＧ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＬ，ＡＭ ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ， ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，Ｅ Ｓ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＥ，ＧＨ，ＧＭ，ＧＷ，ＨＵ，ＩＤ ，ＩＬ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ， ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，Ｍ Ｇ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ， ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，Ｖ Ｎ，ＹＵ，ＺＷ (72)発明者 デアーク，ラヨシュ ハンガリー、ハー―4031デブレツェン、ソ テョリ・ウート62番 (72)発明者 マコー，ジョエルジェネー ハンガリー、ハー―4031デブレツェン、ト ロムビターシュ・ウート８、イ／10番 (72)発明者 ミシュコルツィ，イシュトヴァーネー ハンガリー、ハー―4025デブレツェン、バ ルナ・ウート６、イ／６番

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．主成分としてトルエンを含有する混合溶媒を用いる多段階クロマトグラフ ィーを行うことを特徴とする、シリカゲルカラムを用いるクロマトグラフィーに よって、シクロスポリン複合体を含む粗生成物からシクロスポリンＡを高純度で 製造するための精製方法。 ２．２〜４段階のクロマトグラフィーを続いて行う請求項１に記載の方法。 ３．３段階のクロマトグラフィーを続いて行う請求項１に記載の方法。 ４．混合溶媒としてトルエン−アセトンを用いる請求項１に記載の方法。 ５．多くとも３０％のアセトンを用いる請求項１に記載の方法。 ６．トルエン−酢酸エチルの混合溶媒を用いる請求項１に記載の方法。 ７．多くとも３５vol%の酢酸エチルを含むトルエンを用いる請求項６に記載の 方法。 ８．少なくとも１つの段階のクロマトグラフィーステップにおいて、勾配溶離 を用いる請求項１に記載の方法。 ９．シクロスポリンＬ、シクロスポリンＵおよびシクロスポリンＤ含量が、０ ．０５vol%以下であり、シクロスポリンＢおよびＣ含量が、０．０２vol%以下で ある高純度シクロスポリンＡ。 １０．主成分としてトルエンを含有する混合溶媒で正相シリカゲルを含むカラ ムで多段階クロマトグラフィーを行うことを特徴とする、シリカゲルカラムクロ マトグラフィー法で、工業的スケールにおいて、シクロスポリン複合体を含む粗 生成物からシクロスポリンＡを精製する方法。 １１．クロマトグラフィーを行う前に、クロマトグラフィーの出発物質として 用いるシクロスポリン複合体を８０〜１２０℃に加熱することを特徴とする請求 項１または１０のいずれかに記載の方法。 １２．アセトンを１０〜３０％含むトルエンを用いる請求項１または１０のい ずれかに記載の方法。 １３．酢酸エチルを１０〜３５％含むトルエンを用いる請求項１または１０の いずれかに記載の方法。