BG64215B1 - Метод за пречистване на циклоспорин - Google Patents

Description

Област на техниката

Изобретението се отнася до метод за хроматографско пречистване на циклоспорин А от суров продукт, съдържащ циклоспоринов комплекс чрез използване на колона, съдържаща силикагел и чрез прилагане на многостепенна хроматография с колона, напълнена с нормална фаза силикагел и смес от разтворители, съдържащи толуол като основен компонент.

Предшестващо състояние на техниката

Циклоспорините са ундекапептиди с Nметилиране на няколко места и повечето от тях проявяват фармакологичен ефект. 25 елемента от тази група съединения са познати отдавна, като се обозначават с буквите от А до Z. Първоначално от тях е отделен циклоспорин А, който е естествен продукт, изолиран от бульон с културата Tolypocladium inflatum Gams strain. (Helv. Chim. Acta 59 1075 /1976/). Това съединение става известно отначало като слабо антигьбичен антибиотик, а впоследствие привлича вниманието с имуннозащитния си ефект. (J. F. Borel et al: Imunology 32 1017 / 1977/). Поради тази причина препаратът е използван главно при трансплантацията на органи от донори (бял дроб, бъбрек, кости, кожа). Фармакологичните изпитвания доказват, че това съединение инхибира както хуморални, така и клетъчни имунни проблеми, възпрепятства разпространението на Т-клетките и прекъсва синтеза на интерлевкин-2. С пречистването му препаратът става по-ефикасен при различни видове автоимунни и възпалителни заболявания, като автоимунните хематологични болести, язвени колити, Graves-заболявания, мултиплетна склероза, псориазис, ревматоиди артрити и други подобни. Направени са, също така, експерименти за лечение на инфекции, причинени от протозоа, и на туморни образования. Най-същественото, установено за тази група съединения, е това, че част от тях, синтетично свързани, могат да се получат чрез изграждане на различни аминокиселини и техни заместители (напр. ЕР 56782, СН 630062 и ЕР 29122).

Основната част от циклоспорините се получават чрез ферментация. Като примерите, в които са използвани култури от микроорганизмите Cylindrocarpon Lucidum Booth (швейцарски патент No CH 589 716); Trichoderma polysporum Rifai (швейцарски патент CH 03790); Tolypocladium varium (унгарски патент No HU 201 577). В края на ферментацията се образува циклоспоринов комплекс, който може да съдържа различни примеси (компоненти от средата, в която е поставена културата, антипенители, метаболити и други), зависещи от характера на самия метод.

Най-общо продуктът се отделя от разтвора чрез екстракционни методи. Разделянето на мицела от бульона може да стане чрез центрофугиране или филтрация, след което активната съставка на мицела се разтваря с метанол или ацетон и се провежда екстракция на филтрата с неподдаващи се на смесване с вода разтворители. Друг известен и използван в практиката метод е този, при който не се прилага филтрация, а целият бульон се подлага на екстракция с неподдаващи се на смесване с вода разтворители. Разтворителят, съдържащ органичната фаза, се изпарява чрез дестилация под вакуум. Обаче по време на екстракцията с органичен разтворител, съединенията, имащи липиден характер, също преминават в органичната фаза, което създава трудности при следващо пречистване. От друга страна, има известни методи за отделянето на тези съединения (напр. СН 589 716 или публикуваното заявление на германски патент No 2455859), където след отстраняването на екстрахиращия разтворител, остатъкът се разтваря в смес метанол-вода и впоследствие неколкократно се екстрахира със също такова количество по обем петролев етер. Порциите петролев етер се събират, след което циклоспорините се извличат от екстракта със смес метанол-вода. Активната съставка се пренася чрез мултиекстракция от събраната метанолводна фаза в етиленов хлорид, който след това се промива с вода и се изпарява до сухо. Полученият по описания по-горе метод суров продукт, съдържащ циклоспорини, може да се пречисти по-ефикасно чрез някой от хроматографските методи.

Съгласно метод, описан в US 4117118, сместа от циклоспорини се прекарва най-напред през колона Sephadex LH-20 и се елюира с метанол, след което се елюира внимателно в колона с двуалуминиев триокис със смес на толуол и етилов ацетат (15%), и в колона със силикагел, като за елюент се използва смес на хлороформ и етанол (2%). Въпреки неколкократното хроматографиране, получаваният продукт не е чист и при това представлява смес на циклоспорините А и В,

Подобен хроматографски метод е показан в US 4 215 199, при който се извършва грубо пречистване в колона със силикагел и със смес от хлороформ и метанол в съотношение 98:2% об. Елюатът се подлага на изпаряване до сухо. Остатъкът се разтваря в метанол и се подлага на хроматография в колона тип Sephadex LH-20 с метанол като елюент. Фракциите елюат се подлагат на изпаряване до сухо, след което остатъкът се разтваря в смес на хлороформ и метанол в съотношение 98:2% об. Разтворът се подлага отново на хроматография през колона със силикагел. Циклоспоринът А се извлича най-напред. Тази и следващите фракции се отделят и чистите компоненти се получават чрез изсушаване на елюатите.

Съгласно DD 298276 омасленият суров продукт се разтваря в малко количество хлороформ, след което се подлага на хроматография в колона с двуалуминиев триоксид и хлороформ. Фракциите, съдържащи циклоспорин А, се изсушават под вакуум, разтварят се в хлороформ, обработват се на подобна колона и се елюират с хлороформ. Фракциите, съдържащи активната субстанция, се изсушават отново под вакуум. Към остатъка се добавя хексан, при което циклоспоринът А изкристализира. Продуктът се измива с хексан, изсушава се и накрая се подлага на прекристализация от смес, съдържаща етер и хексан или ацетон.

Съгласно HU 201577 суровият продукт, получен след изсушаване, може да бъде пречистен в колона със силикагел чрез елюиране със смес от хлороформ и метанол при нарастваща концентрация на метанола. Процесът стартира с чист хлороформ и продължава със стъпка на нарастване на метанола в елюата с 0,5% об. Циклоспорин А се отделя при 2% об., циклоспорин В - при 2,5% об., циклоспорин С - при 3% об. метанол в хлороформа от колоната. Компонентите се получават след изсушаване на фракциите.

Методите, посочени по-горе, описват главно процедури на ферментация на циклоспорините, в които първоначалната цел на ета пите на пречистване е идентификация на получавания продукт. При това продуктът се изолира в малки количества и се дават само физически и химически характеристики без публикуване на данни, отнасящи се до чистотата на продукта и количеството на примесите.

Rueger u Co. /Helv. Chim. Acta 59(4), ρ. 1075-92 (1976)/ изолират малки количества чист циклоспорин А и С чрез многократна хроматография и чрез други етапи на пречистване за идентификация и структурен анализ. Съгласно цитираната статия суровият продукт, получен от ферментацията на Trichoderma polysporum Rifai, съдържащ главно циклоспорините А и С, се обезмаслява с метанол и петролев етер. След изсушаване на остатъка, същият се разтваря в хлороформ и се подлага на хроматография и степенно елюиране със смес на хлороформ и метанол в съотношение 98,5:1,5 об./об. като елюент. Чист на кристали циклоспорин А се получава при допълнителна хроматография. Фракцията, съдържаща циклоспорин А, се разтваря в метанол и се подлага на хроматография през колона тип Sephadex LH20 с използване на метанол като елюент. Върховите фракции се изсушават, разтварят се в толуол и се подлагат на хроматография в колона с алуминиев оксид, използвайки толуол за елюент, в присъствието на оцетна киселина с нарастваща концентрация. След изсушаване на фракциите и обработка с активен въглен в разтвор на алкохол, се получава продукта под формата на кристали.

Метод за пречистване, приложим за индустриално производство, е описан в US 5382655. Съгласно този метод продуктът, съдържащ различни циклоспоринови компоненти, се подлага на гореща обработка преди хроматографията през колона със силикагел чрез смеси хлороформ-дихлорметан-етанол и хлороформ-етилов ацетат-етанол. Полученият продукт се обработва отново чрез хроматография и рекристализация, при което полученото вещество е с чистота, задоволителна за инжекционно приложение.

Пречистването на суровия продукт, съдържащ смес от циклоспорини, е много трудно, тъй като примесите са подобни по химичен строеж и са много близки по хроматографски характеристики с циклоспорин А, явяващ се основен продукт. В описаните методи се доказва, че невнимателното използване на смесите от разтворители може да доведе до застъпване на хроматографските пикове и да наложи допълнителни пречиствателни етапи, за да се стигне до получаването на желаните компоненти в чист вид. Известните методи за пречистване се характеризират най-вече не само с факта, че условията за разтваряне са в широк обхват, но се прилагат от 3 до 4 типа разтворители или техни смеси, което налага и 2-3 вида пълнеж на колоните. В резултат на това за реализирането им са задължително необходими няколко вида хроматографски техники и регенериращи методики по време на изпълнението, което създава трудности за изработването на прости конструкции и съоръжения, осигуряващи икономични, с индустриална значимост технологии.

От гледна точка на околната среда възникват допълнителни проблеми, свързани с приложението на хлорирани въглеводороди, тъй като все повече страни полагат усилия да ограничават употребата им.

Относно материалите, използвани за пълнеж на колоните, приложението на алуминиев оксид като пълнеж при индустриално производство е много рисковано, тъй като вследствие на неговата малка специфична повърхност капацитетът на натоварване и възможностите за разделяне са много малки. Също така не е изгоден за промишлено приложение и поради това, че пълнежът от алуминиев оксид е нееластичен, крехък е и лесно трошлив, което от своя страна изисква специално оборудване и технология. Той не може да се използва в лесно обслужваните колони от неръждаема стомана, най-често срещани в химическото оборудване.

Пълнежът от типа Sephadex е много скъп, а при използването му при циклоспориновия комплекс е с много ниска производителност, тъй като размерите на молекулите са много близки едни до други.

Техническа същност на изобретението

Задачата на изобретението е създаването на лесно приложим и надежден метод за хроматографско пречистване в промишлен мащаб, подходящ за производството на веществото циклоспорин А, което да съдържа значително по-малко примеси спрямо досега използваното в медицинската практика.

Целта е да се създаде такава технология за хроматографско пречистване, която да изисква само един вид смес от разтворители и един тип пълнеж за колоните.

Силикагелът се използва като пълнеж в колоните поради неговите благоприятни характеристики - висока специфична повърхност на единица обем, голяма порьозност, изключително висока сорбционна активност, лесно достъпен и сравнително евтин материал. Именно при такъв пълнеж могат да бъдат подбрани най-подходящите смес от разтворители и метод, с които да се осигури разделянето на циклоспориновите компоненти при висока селективност.

В резултат на експериментите е установено, че целта може да се постигне чрез многостепенна хроматография през колона със силикагел, като за елюент се използва смес с основен компонент толуол. Оказа се, че циклоспорините U и L, които са най-близко до циклоспорин А, могат да бъдат разделени чрез тристепенна хроматография в колона със силикагел, използвайки толуол, съдържащ ацетон като елюент. Тези компоненти се различават от циклоспорин А само по една метилова група.

Съгласно първия пример във WO 94/ 1609 в едностепенен процес се използва също смес от разтворители, съдържаща толуол и ацетон. Полученият продукт се подлага на рекристализация в смес от разтворители, състояща се от етер и хексан (66% добив). Оптическата ротация на продукта е задоволителна, но точката на топене е значително по-ниска от описаната в литературата, което показва, че продуктът не е чист. Следователно, дори чрез прекристализация от разтворителя се получава продукт с ниски чистота и добив.

Методът съгласно изобретението е подходящ за отделяне на най-често срещаните примеси като циклоспорините В и С, които са и в най-голямо количество и освен това циклоспориновите компоненти D, U и L могат да бъдат отделени дори и когато са в незначителни количества.

В получения по този начин краен продукт циклоспорин А циклоспорините В и С са по-малко от 0,02% об., докато циклоспорините L, U и D са със съдържание, по-ниско от 0,05% об.

Задачата на изобретението е подобрен метод за пречистване на циклоспорин А от суров продукт, съдържащ циклоспоринов ком плекс, който също така осигурява възможности за производството на изключително чист циклоспорин Λ в големи количества чрез хроматографски метод в колона със силикагел, прилагайки многостепенна хроматография със смес от разтворители, съдържаща толуол като основен компонент. Друга новост на метода е прилагането на изключително високото натоварване на колоната спрямо конвенционалната хроматографска практика, където обхватът на натоварване се изчислява за не повече от 5-10% от възможния товар, като тази стойност е по-ниска за циклоспорините.

Многостепенната хроматография, сместа от разтворители с толуол като основен компонент и високото натоварване на колоната са взаимно свързани, така че желаният резултат може да се постигне само при комплексното им оценяване и приложение. Посочените три параметъра трябва да се използват по такъв начин, че да се получи продукт с висока чистота.

Съгласно изобретението за предпочитане се прилагат 2-4 хроматографски етапа последователно и по-целесъобразно три етапа.

Претоварването на колоната е най-високо в първия етап на хроматографиране. За точното разделяне на активната съставяща от примесите се допуска по-високо натоварване в два последователни етапа на хроматографиране.

За пречистването е подходящо да се използва смес от разтворители толуол-ацетон, която съдържа повече от 30% об. ацетон.

Съгласно друг подходящ метод се из10 ползва толуол-ацетатна смес от разтворители, в която концентрацията на етилов ацетат е по-ниска от 30% об.

В процеса на пречистване е подходящо при5 лягането поне веднъж на степенно елюиране.

При експериментите е установено, че за пречистването на циклоспориновия комплекс, извършвано по този начин, е уместно да се използват 10-30% об., по-точно 13-18% об. ацетон и 10-35% об. или 15-20% об. етилов ацетат.

Съгласно възможностите на метода от изобретението елюирането се извършва в случая на тристепенна хроматография, с толуол, съдържащ 15% об. ацетон или 18% об. етилов ацетат. Основната част циклоспорин С се отделя в първия етап, във втория етап се извлича по-голямата част от циклоспорините В, L и U и накрая, в третия етап - количествата от L и U компоненти и други примеси, които могат да се редуцират до общо под 0,05% об. В първия етап загубата на циклоспорин А е минимална, обаче при префракциите на втори и трети етап значителни количества от циклоспорин А се извличат заедно с компонента циклоспорин D, който е много близко до циклоспорин А. Оттук циклоспорин А може да се получи в много чист вид в четвърти етап.

За сравнение по-долу таблично са дадени данни за примесите в циклоспорин А съгласно изискванията на USP стандарт, данни за циклоспорин А като активна съставка на инжекционния препарат Sandimmum и съответните стойности за продукта циклоспорин А, произведен съгласно изобретението.

Продукт	USP стандарт, об. %	Sandimmum об. %	Пример 1 изобретението об. %
Циклоспорин С	-	0,17	0,05
Циклоспорин В	-	0,21	0,05
Неизвестни	0,09	0,35	0,05
Циклоспорин L	0,05	0,35	0,05
Циклоспорин U	-	-	0,05
Циклоспорин D	0,12	-	0,05

От данните в таблицата е видно, че качеството на циклоспорин А, получен по изобретението, значително надвишава параметрите на Sandimmum инжекциите и е многократно над изискванията на USP условията.

Методът съгласно изобретението е подходящ за пречистване на суров продукт както в малки, така и в големи количества.

Независимо от факта, че методът в изобретението има предимството, че осигурява получаването на чист циклоспорин А, той има и някои други предимства. Прилагането на един вид технологичен метод (хроматография) дава възможност при управлението на процеса на пречистване, който е еднотипен, от постоянно повторяем да се превърне в непрекъснат. Освен това използването на само един вид смес от разтворители позволява регенерирането на разтворителите и колоните да става по-просто.

Допълнително специфично предимство на метода е това, че в първия етап на хроматографиране най-силно свързани в колоната остават примесите, което значително облекчава регенерацията на колоната по време на следващите два етапа.

Изобретението се пояснява със следващите примери, без да се ограничава в претенциите си единствено с тях.

Примери за изпълнение на изобретението

В сравнителен пример (пример 4) е показано, че сместа разтворители дихлорметанацетон, използвана главно при тристепенна хроматография в познатите методи, не може да доведе до краен продукт с такава чистота.

Пример 1. Пречистване на циклоспоринов суров продукт чрез тристепенна хроматография с използване на смес от разтворители толуол-ацетон.

Качество на началния циклоспоринов суров продукт:

Съдържание в об. % на: циклоспорин А 60,9, циклоспорин В 11,2, циклоспорин С 8,3, циклоспорин L 1,79, циклоспорин U 1,58, циклоспорин D 1,25.

I етап. Хроматографирането се извършва с две хроматографски колони, свързани в серия, всяка с обхват по 8 1, диаметър 10 сш, дължина 100 сш. Всяка от двете колони съдържа 3,95-3,95 kg силикагел, тип Merck Kieselgel, с едрина на зърната 0,04-0,063 шш. При първото хроматографиране двете колони съдържат свеж силикагел. При следващото хроматографиране първата колона се отделя, а втората се свързва към такава, съдържаща свеж силикагел. По-нататък при всяко следващо хроматографиране се включва само една нова колона.

Подготовка на суровия продукт. 4,1 kg суров продукт с чистота 60,9% об. циклоспорин А се въвежда в част от колоните, свързани в серии, като предварително се разтваря в 15 1 толуол. Получават се 19 1 разтвор, който се въвежда в първата колона отгоре през филтър със захранваща скорост 2,4 Ι/h. След натоварването материалът се елюира със смес от разтворители, състояща се от ацетон:толуол в съотношение 13:87% об., докато обемът на елюата на изхода в основата на втората колона стане 39 1. Съдържанието на циклоспорин в елюата се анализира чрез TLC. Фракциите, несъдържащи циклоспорин, се събират като отпадък. 28 1 елюат след появата на циклоспорин се определят като основна фракция. Съдържанието на сухо вещество в междинния продукт, получен по този начин, е 3,23 kg.

Качество, в об. %: циклоспорин А 75, циклоспорин В 10,1, циклоспорин С 1,6, циклоспорин L 1,7, циклоспорин U 1,5, циклоспорин D 1,3.

Добив, изчислен като циклоспорин А: 97%.

II етап. Разделянето се извършва в колона с дължина 1 ш, поемаща 8 1. Колоната съдържа силикагел, тип Merck Kieselgel 60, с размери 0,015-0,040 mm. Масата на пълнежа е 3,95 kg.

Междинен продукт I под формата на разтвор, получен в първия етап и съдържащ около 31 обем с 370 g сухо вещество в него, се прекарва през колоната със скорост на захранване 2,4 Ι/h, след което се измива с 1 1 тоулол.

След натоварването материалът в колоната се елюира с 10 1 смес ацетон:толуол в съотношение 15:75% об. и след това със смес ацетон:толуол в съотношение 25:75% об.

Скоростта на обливане с разтворител до 17-ия 1 фракция е 2,4 Ι/h, след това от 18ия 1 фракция е 5 Ι/h. Фракциите се анализират чрез TLC. 1-11 1 фракции са отпадък, фракциите 12-191 се считат за критични I фракции и от тях се взимат проби за изпитване. Недостатъчно чистите профили се анализират на HPLC и се третират като предфракции или се присъединяват към главната фракция. Предфракцията, която може да се получи по този начин, съдържа 80 g сухо вещество, което се отделя след изпаряване до сухо. 20-251 фрак ции се събират като главна фракция. 26-31 1 фракции се считат за критични фракции и след анализ се подават към главната фракция или се третират като постфракция.

Главната фракция, получена по този начин, се изпарява до сухо на лентов изпарител и разбъркване чрез вибрации. 234 g от междинен продукт II се получава с добив 80% и при следното качество в тегл. %: циклоспорин А 95, циклоспорин U 1,2, циклоспорин L 0,7, циклоспорин В 0,1, циклоспорин D 0,5, циклоспорин С 0,1.

III етап. Хроматографията се провежда в колона със същата конструкция и геометрични размери както описаната в I и II етап.

1,7 1 разтвор на толуол, съдържащ 220 g сухо вещество, се приготвя от междинен продукт II, получен във втори етап и се подава през върха на колоната със скорост на захранване 2,4 Ι/h, след което се извършва промивка с 1 1 толуол.

Колоната се елюира с 20 1 смес ацетон:толуол в съотношение 15:85% об., след което елюирането продължава с 20 1 смес ацетон:толуол в съотношение 25:75% об. Скоростта на обливане при елюирането до 31-ия 1 фракция е

2,4 Ι/h, от 32-ия 1 тя се увеличава на 51/h.

Фракциите 1-18 1 са отпадък, фракции 19-23 1 са предфракции и се определят като критични I фракции. От тях се взимат проби за анализ на съдържанието на сухо вещество и състава на примесите чрез HPLC. Според анализа критичната фракция се подава като предфракция или се смесва с основната фракция. 29-38 1 фракции се третират като основна фракция. 39-41 1 фракции се събират на порции по 11 и се определят като критични фракции II. Според резултатите от анализа те се смесват с главната фракция или се третират като постфракция.

След изпаряване на събраните фракции до сухо е възможно да се получат 70 g предфракция.

От събраните количества главна фракция след изпаряване до сухо се получават 157 g чист циклоспорин, което е 75% добив. Качеството на чистия продукт е следното в тегл.%: циклоспорин А 99,6, циклоспорин L 0,05, циклоспорин U 0,05, циклоспорин D 0,05, циклоспорин В 0,02, циклоспорин С 0,02.

Пример 2. Хроматографско пречистване на циклоспоринов суров продукт на четири етапа през колона с пълнеж от силикагел, в неподвижна фаза с използване на смеси от разтво рители толуол-ацетон или толуол-етилов ацетат.

Циклоспориновият суров продукт се пречиства чрез триетапна хроматография, описана в пример 1. Предфракциите, получени в трите хроматографски етапа, се пречистват на четвъртия етап в неподвижна слой със смес от разтворители толуол-етилов ацетат.

IV етап. Конструкцията и геометричните размери на колоната са същите, както описаните в пример 1. Съдържанието на колоната е същото, както в пример 1, а именно силикагел, тип Merck Kieselgel 60 (0,015-0,040 mm).

Колоната се зарежда с концентрат, получен от 260 g предфракция, разтворени в 2,51 толуол. Скоростта на захранването е 2,41/h.

Съдържание на циклоспорин А - 80,6% об. Съдържание на циклоспорин D - 4,2% об. Зареденият продукт се промива с 1 1 толуол, след което колоната се елюира с 20 1 смес етилов ацетат:толуол в съотношение 17:83 при скорост на обливане 2,4 Ι/h и елюирането продължава с 401 смес на етилов ацетатстолуол в съотношение 28:72. Фракциите 1-19 1 са отпадък, а събраните 20-25 1 фракции се определят като отпадък или главна фракция след анализ HPLC. 26-35 1 фракции се третират като главна фракция. 36-42 1 фракции се анализират чрез HPLC, като се взимат проби от тях и съгласно резултатите се смесват с главната фракция или се третират като отпадък. Главната фракция 23-42, получена по описания начин, се изпарява до сухо. При тази обработка се получават 195 g чист продукт циклоспорин А с 99,6% тегл. активна съставка при добив 75% и следното качество в тегл.%: циклоспорин А 99,6, циклоспорин D 0,05, циклоспорин U -, циклоспорин L -.

Пример 3. Хроматографско пречистване на циклоспоринов суров продукт на два етапа в колона със силикагел, в неподвижна фаза и с използването на смес от разтворители толуол-ацетон.

Циклоспориновият суров продукт се пречиства съгласно процесите, описани в първия етап на пример 1, при което се получава междинен продукт I с посоченото качество. Понататък методът е следния:

II етап. Колоната се пълни с 3 1 междинен продукт I, съдържащ 370 g сухо вещество, при скорост на захранване 2,4 Ι/h, след което зареденият материал се промива с 1 1 толуол.

След натоварването колоната се елюира с 101 смес ацетон:толуол в съотношение 15:85% об. и операцията продължава с 20 1 смес ацетон:толуол в съотношение 25:75% об.

Скоростта на обливане с разтворителите до 17-ия 1 е 2,4 Ι/h и 5 1/h от 18-ия 1.

В съответствие с резултатите от TLC и HPLC анализи 1-111 фракции са отпадък, 1220 I фракции са предфракция, 21-24 I фракции се считат за главна фракция и фракциите от 25-ия 1 до края се третират като постфракции. Отмитите с ацетон фракции са отпадък.

След фракционирането събраните главни фракции се обединяват и изсушават до сухо, при което се получават 114 g от продукта циклоспорин А с добив 41 % и с високото качество, съответстващо на описаното в пример 1.

Пример 4. Пример за сравнение на пречистването на суров продукт чрез тристепенна хроматография и приложение на смес разтворители дихлорметан-ацетон.

Качество на началния циклоспоринов суров продукт (отговарящо на използвания в пример 1):

Съдържание в об. % на: циклоспорин А 60,9, циклоспорин В 11,2, циклоспорин С 8,3, циклоспорин L 1,79, циклоспорин U 1,58, циклоспорин D 1,25.

I етап. Хроматографското оборудване и пълнежът са идентични с описаните в пример 1. Една част от колоните, свързани в серии, се зарежда с 4,1 g суров продукт с чистота 60,9% об., разтворен в 15 1 дихлорметан.

След натоварването материалът в колоните се елюира с дихлорметан при скорост на обливане 2,4 Ι/h до събирането на 35 1 елюат.

1-10 1 фракции е отпадък, докато 11-35 1 фракции се счита за главна фракция. По този начин се получава междинен продукт I със сухо вещество 2,9 kg, активният принцип в което е 75%.

II етап. Хроматографското оборудване и пълнежът са идентични с описаните в пример 1.

Колоната се зарежда отгоре с 3 1 междинен продукт I, съдържащ 350 g сухо вещество, със скорост на захранване 2,4 Ι/h. Елюирането се извършва с 10 1 смес ацетон:дихлорметан в съотношение 1:9 об. части, след което се продължава с 25 1 смес ацетонщихлорметан в съотношение 2:8 об. части и се приключва с ацетон, подаван със скорост 2,4 1/h.

Според резултатите от TLC анализа обемът на предфракцията е 13 1, обемът на главната фракция е 22 1 и обемът на постфракцията е 11 1. Главната фракция от 22 1 се изпарява до сухо, като в резултат се получават 220 g междинен продукт II с чистота 91 %.

Ш етап. Хроматографското оборудване и пълнежът са същите, както описаните в пример 1.

Пълнежът се натоварва с 220 g междинен продукт II, като концентрацията на дихлорметан се поддържа при скорост 2,4 1/h. Елюира се с 20 1 смес ацетон:дихлорметан в съотношение 1:9 об. части, след което се продължава с 30 1 смес ацетон:дихлорметан в съотношение 2:8 об. части и се завършва с ацетон при скорост 2,4 1/h.

Първоначалните 26 1 фракции се считат за предфракции, следващите 26 1 се отделят като главна фракция и последните 11 1 се третират като постфракции.

Главната фракция в количество 26 1 се изпарява до сухо, в резултат на което се получават 140 g междинен продукт III със следното качество в тегл.%: циклоспорин А 98,6, циклоспорин U 0,6, циклоспорин D 0,3, циклоспорин L 0,2, циклоспорин В 0,1, циклоспорин С 0,1.

Claims (13)

1. Метод за получаване на циклоспорин А с висока чистота от циклоспоринов комплекс, съдържащ се в суров продукт, чрез хроматографски метод в колона със силикагел, характеризиращ се с използването на многостепенна хроматография и смес от разтворители, състояща се от толуол като основен компонент.

2. Метод съгласно претенция 1, характеризиращ се с това, че се провеждат последователно 2-4 хроматографски етапа.

3. Метод съгласно претенция 1, характеризиращ се с това, че се провеждат последователно 3 хроматографски етапа.

4. Метод съгласно претенция 1, характеризиращ се с това, че се използва смес от толуол и ацетон като разтворител.

5. Метод съгласно претенция 4, характеризиращ се с това, че се използва смес от разтворителите толуол и ацетон, в която съдържанието на ацетон е повече от 30%.

6. Метод съгласно претенция 1, характеризиращ се с това, че се използва смес от разтворители, свдьржаща толуол и етилов ацетат.

7. Метод съгласно претенция 6, характеризиращ се с това, че се използва смес от разтворители толуол-етилов ацетат, в която съдържанието на етилов ацетат е повече от35%.

8. Метод съгласно претенция 1, характеризиращ се с това, че се използва постепенна елюация в поне един хроматографски етап.

9. Циклоспорин А с висока чистота, получен съгласно претенции от 1 до 8, характеризиращ се с това, че съдържанието на циклоспорин L, циклоспорин U и циклоспорин D в него е по-ниско от 0,05% об., а съдържанието на циклоспорин В и циклоспорин С в него е по-ниско от 0,02% об.

10. Индустриално приложим метод за пречистване на циклоспорин А от циклоспоринов комплекс, съдържащ се в суров продукт, чрез хроматографски метод в колона със силикагел, характеризиращ се с това, че многостепенната хроматография се провежда в ко- лона, съдържаща нормална фаза силикагел със смес от разтворители, чието основно съдържание е толуол.

11. Метод съгласно претенции от 1 до

5 10, характеризиращ се с това, че циклоспориновият комплекс, използван за суровина при хроматографирането се нагрява до 80-100°С преди началото на хроматографията.

12. Метод съгласно претенции от 1 до 10, характеризиращ се с това, че се използва толуол, съдържащ 10-30% ацетон.

13. Метод съгласно претенции от 1 до 10, характеризиращ се с това, че се използва толуол, съдържащ 10-35% об. етилов ацетат.