CN101031654A - 结晶他克莫司的分离方法 - Google Patents

Abstract

本发明是一种用于分离他克莫司及其类似物、子囊霉素和tsucubamycin B以及制备足够纯结晶他克莫司的简单方法，该方法利用了他克莫司的惊人性能并且涉及萃取、提纯和结晶来生产纯的结晶他克莫司。

Description

结晶他克莫司的分离方法

发明领域

本发明涉及一种从发酵液中分离结晶他克莫司的方法。

                     发明背景

他克莫司，也称为FK 506，是一种对于T-淋巴细胞具有选择性抑制作用的天然存在的大环内酯。其被用作免疫抑制药物。例如专利US4,894,366和EP 184,162中首先描述了他克莫司，随后一些科学著作也描述了它：H.Tanaka et al.J.Am.Chem.Soc.1987，109，5031-5033和T.Kino et al.J.Antibiot.1987，40，1249-1255。

用于制备他克莫司的优选方法是发酵，虽然例如EP 378,318中也描述了其全合成。从发酵液中分离他克莫司是比较困难的，不幸的是，大多数产生他克莫司的菌株还产生子囊霉素和一些其它大环内酯化合物，例如tsucubamycin B，因此，在纯他克莫司的分离方法中必须涉及他克莫司和其它大环内酯的分离，分离他克莫司的另一个困难是其在生物质中的浓度低，并且事实上该化合物通常存在于固相(菌丝体)和液相(过滤发酵液)两者之中。因此，经济地分离后他克莫司的方法需要分离菌丝体以及对菌丝体和过滤发酵液两者的分离后加工，例如T.Kino et al.J.Antibiot.1987，40，1249-1255中所述。专利申请WO03/68 980中描述了另一种可能性，该专利申请要求保护利用疏水性有机溶剂直接萃取全部发酵液。

子囊霉素和tsucubamycin B是他克莫司的天然类似物：当他克莫司在大环内酯物骨架的21位上含有烯丙基时，子囊霉素在那里具有乙基而tsucubamycin B具有丙基，例如H.Hatanaka et al.(J.Antibiot.1988，41，1592-1599)和M.Morisaki at al.(J.Antibiot.1992，45，126-132)所述。例如专利EP 358,508和GB 2,269,172描述了他克莫司的其它天然衍生物和类似物。

分离他克莫司和其它大环内酯抗生素(大环内酯类)，即子囊霉素和tsucubamycin B是非常困难的，这是由于这些化合物类似。令人满意的分离不可能是通过迄今为止报道的任何结晶方法。因而唯一的可能是柱色谱法，许多HPLC方法已经在文献中有描述，它们全都采用反相系统，例如Y.Nakimi et al.Chromatographia 1995，40，253-258，T.Nishikawa et al.Pharm.Res.1993，10，1785-1789，T.Akashi et al J.Pharm.Biomed.Anal.1996，14，339-346。反相系统对于制备色谱法是不方便的，因为其含水流动相促进了他克莫司异构化为其互变异构体：Y.Nakimi et al.Chromatographia 1995，40，253-258。此外，从洗提液中分离他克莫司也是有困难的。

专利申请WO 01/18 007中描述了分离他克莫司和子囊霉素和tsucubamycin B的另一种可能性，其中使用了具有含银离子流动相的反相色谱法。然而使用含水流动相仍然是该方法的缺点。

                      发明概述

根据本发明的方法提供了一种以高收率从发酵液中分离非常纯的他克莫司的简单方法。通过将适当的与水混溶的有机溶剂加入全部发酵液中来完成从菌丝体萃取大环内酯物。如此将大环内酯混合物转移到液相，然后将萃取的菌丝体分离，并且通过用适当的不与水混溶的溶剂萃取来进一步加工液相(含水萃取物)，如此得到有机萃取物。然后将有机萃取物部分地蒸发，得到他克莫司浓缩液。利用适当的有机溶剂作为流动相，通过银盐改性的硅胶色谱法进一步提纯该他克莫司浓缩液。然后将含有足够纯他克莫司的成分浓缩，并且从适当溶剂中结晶残余物，得到纯结晶他克莫司。

在该方法的另一实施方式中，可通过用水和与水混溶的有机溶剂的混合物萃取分离的含他克莫司的菌丝体来制备含水萃取物。该含水萃取物的进一步加工与如上所述相同。

在该方法的另一实施方式中，在用不与水混溶的溶剂进行处理之前没有将含水萃取物与菌丝体分离。可将不与水混溶的溶剂直接加入菌丝体在含水萃取物中的悬浮液中，然后可将有机萃取物从三相体系中分离。

在该方法的另一实施方式中，可以在银盐改性的硅胶色谱上提纯之前没入另一色谱步骤。在该步骤中，利用适当的有机溶剂作为流动相在硅胶上提纯他克莫司浓缩液，并且将所得的含他克莫司的馏分和其它大环内酯化合物在银盐改性硅胶上进一步提纯。

                      附图说明

图1.他克莫司浓缩物的硅胶制备色谱法，利用甲苯和丙酮85∶15(v/v)的混合物作为流动相(根据馏分的HPLC分析重建)。

图2.他克莫司浓缩物的硝酸银改性的硅胶制备色谱法(根据实施例3制备)，利用甲苯和丙酮85∶15(v/v)的混合物作为流动相(根据馏分的HPLC分析重建)。

图3.在实施例1中所得的结晶他克莫司的HPLC分析。

图4.在实施例2中所得的在第一次色谱法之后的残余物的HPLC分析。

图5.在实施例2中所得的结晶他克莫司的HPLC分析。

                    本发明详细说明

虽然他克莫司不溶于水，但是在发酵液的液相中发现了惊人高份额的他克莫司，特别是当发酵过程的总产量小的时候。因此，加工全部发酵液，即通过培养产生他克莫司的微生物而得的悬浮液，是非常可取的。根据本发明方法能够利用便宜和环保上可接受的溶剂来加工全部发酵液。将适当的与水混溶的有机溶剂加入全部发酵液导致大环内酯混合物被萃取到液相中。这样的与水混溶的溶剂可以是低级脂族醇或酮，优选溶剂是丙酮、2-丙醇或1-丙醇。另一方面，甲醇是不方便的，这是由于它反应性高，其有助于他克莫司的分解。乙醇的反应性比甲醇显著降低，虽然如此它不是不足取的，并因此可将乙醇用于萃取大环内酯化合物，但是它比上述溶剂丙酮、1-丙醇、和/或2-丙醇便利性差。

可通过过滤或沉淀，优选通过离心分离法将通过把与水混溶的有机溶剂加入全部发酵液而得到的含水萃取物从萃取的菌丝体中分离出来，并将所得澄清的含水萃取物在没有任何蒸发的条件下进一步加工。第二种可能性是在没有固相分离的条件下加工该含水萃取物。

另一种可能性，如何制备他克莫司的含水萃取物，是用水和与水混溶的溶剂的混合物萃取分离的菌丝体。当菌株产量高的发酵液被加工时，这种情形大体上是方便的。在此情形中，存在于发酵液中的他克莫司部分可忽略，并且只有从产量的观点来看，菌丝体的简单加工是可接受的。其优点在于方法更简单并且溶剂耗费量低，如实施例2所证明的。用于萃取分离的菌丝体的适当的与水混溶的溶剂优选是丙酮、1-丙醇、和/或2-丙醇。

将含水萃取物在没有任何浓缩的条件下进一步加工，这是该方法的另一优点。不管菌丝体是否被分离，对含水萃取物的进一步加工都包括将不与水混溶的溶剂加入含水萃取物和将所得两相或三相体系混合。从而将他克莫司和其它大环内酯类萃取到有机相，同时大部分镇重成分残存在水相中。除了脂族烃之外，几乎任何不与水混溶的有机溶剂可用作适当的不与水混溶的溶剂，但是现实原因(环保问题方面和经济实用性)限制仅使用一些溶剂如甲苯、二甲苯、二氯甲烷、、二氯乙烷、叔丁基甲基醚、或异丁基甲基酮。甲苯是优选的溶剂，这是由于其价格、环保可接受性、对人类健康的危险小及其它以下所述方面。该操作的目的不仅仅是提纯他克莫司，还是将产物部分浓缩，因为仅非常小量的甲苯可被加入到含水萃取物中以使大环内酯定量转移到有机相，如实施例所证明的。甲苯的另一优点是使用过的溶剂回收简单，这是由于丙酮或2-丙醇和甲苯的沸点差别相当大。

然后将含有他克莫司和其它大环内酯的分离的有机萃取物浓缩，使用甲苯的另一优点在此是明显的，文献中所述的方法需要通过干燥剂将含有他克莫司的萃取物干燥。根据本发明方法使用甲苯作为不与水混溶的溶剂不需要干燥。通过简单的蒸发作用将存在于有机萃取物中的水除去，由此得到具有甲苯和干他克莫司浓缩物的共沸物。

根据本发明得到的他克莫司浓缩物含有他克莫司和存在于发酵液中的所有其它相关大环内酯，特别是子囊霉素和tsucubamycin B。因此，进一步的加工必须包括从相关大环内酯中分离他克莫司。如上所述，所有已知色谱系统利用反相色谱法。实验证实硅胶正相色谱法能够将他克莫司在一定程度上与子囊霉素而不是tsucubamycin B分离，如图1所示。另一方面，发现可通过银盐改性的硅胶正相色谱法将他克莫司与子囊霉素和tsucubamycin B两者分离。虽然子囊霉素比他克莫司和tsucubamycin B在没有银盐的硅胶上留存更多，然而他克莫司实质上比tsucubamycin B和子囊霉素两者在银盐改性的硅胶上留存更多，如图2所示。事实上两种杂质子囊霉素和tsucubamycin B在银盐改性的柱上停留时间短为制备提纯他克莫司提供了极好的基础。

银作为硅胶改性剂的作用的基本原理在于其能够与他克莫司的烯丙基形成络合物，然而在其它相关大环内酯结构中缺少该基团。类似地，一些其它过渡金属，例如铂族金属的盐或络合物能够形成η-烯丙基络合物并以类似的方式起作用，但是使用银作为硅胶改性剂是极其优选的，这是由于其价格低并且再生更简单。在适当的银盐之中，有二元无机盐例如硝酸盐、氟化物、氯酸盐、高氯酸盐、硝酸盐或诸如此类，和/或有机盐例如醋酸盐、三氟醋酸盐、苯甲酸盐、环己烷丁酸盐、乙酰丙酮化物或诸如此类，或通过直接结合到色谱吸附剂的适当官能团能够形成的盐。由于某些银盐是光敏性的或部分溶解于用来提纯大环内酯的流动相中，因此优选采用硝酸银来达到其稳定性。

实验证明用于将他克莫司从相关大环内酯化合物通过银盐改性的硅胶色谱分离的适当溶剂可以是常用溶剂的不同混合物，如二氯甲烷及其与丙酮、异丁基甲基酮或叔丁基甲基醚的混合物，或甲苯与丙酮、异丁基甲基酮或叔丁基甲基醚或脂族醇与乙酸的某些酯例如乙酸乙酯、乙酸丙酯和/或乙酸丁酯的混合物。优选溶剂是甲苯与丙酮或异丁基甲基酮的混合物。可以是以等度方式完成分离。于是适当的流动相将含有大约15％(v/v)丙酮和大约85％(v/v)甲苯，相应的大约50％(v/v)甲苯和大约50％(v/v)异丁基甲基酮。另一种可能性是采用梯度方式在银盐改性硅胶上进行色谱提纯。使用以上定义的优选溶剂意味着色谱法从例如纯甲苯开始，并且通过加入丙酮或异丁基甲基酮，流动相的极性逐步增大。当他克莫司浓缩物被直接装填到柱上时，采用梯度方式是必要的。另一方面，当装填到柱上的材料被预提纯以使其不含有如下所述镇重杂质时，等度方式是方便的。

在本发明的另一实施方式中，完成他克莫司浓缩物的色谱提纯可以用两个步骤，两者都采用正相色谱法。在第一步中，在硅胶上提纯他克莫司浓缩物，得到含有大环内酯混合物的馏分。该操作的意义是除去镇重杂质而不是大环内酯。然后在第二步中，将来自第一色谱法的大环内酯馏分在银盐改性硅胶上提纯。这种两步提纯的优点是事实上仅将提纯的成分装填到填充了银盐改性的硅胶的柱上，其导致该柱的寿命比较久。此外，第二色谱法可以是以等度方式完成的，它是非常方便的。

采用非含水溶剂作为流动相从tsucubamycin B和子囊霉素正相色谱分离他克莫司是根据本发明方法的基本特征和主要优点。他克莫司和其它大环内酯比较不稳定。它们趋向于异构化为所谓的互变异构体(他克莫司互变异构体I和互变异构体II)，在用作反向色谱法流动相的含水溶液中这种异构化是特别迅速的。此外，从正相色谱法所得洗提液分离产物是非常简单的：可在真空下将该溶剂蒸发，其对于产物是无害的。另一方面，从反向分离之后所得的含水洗提液中分离产物是非常困难的，并且通常伴有产物的部分损失。

在本发明的另一实施方式中，在从2-丙醇和水的混合物中蒸发流动相之后通过残余物的结晶，可从色谱馏分得到结晶他克莫司。从2-丙醇和水的混合物中结晶可通过将残余物溶解在2-丙醇中并添加水来完成，通过实验发现应该使用至少1重量份的2-丙醇来溶解1重量份的在蒸发色谱馏分之后所得的残余物，并且2-丙醇和水的体积比应该是大约1∶1-1∶2。当加入某些脂族烃如己烷或庚烷以便结晶时，结晶的提纯效果可进一步得到改善。对添加的脂族烃体积没有限制，但是对于提纯效果有一些影响。

用于结晶他克莫司的另一种适当溶剂是二异丙基醚。通过将色谱成分蒸发成干残余物和将该成分溶解在二异丙基醚中来完成从该溶剂中结晶。

                       实施例

以下实施例欲进一步举例说明某些本发明的某种优选实施方式并且本质上不起限制作用。利用至多常规的实验，那些本领域技术人员将确认对于在此所述特定工序的许多同等物。

                       实施例1

              从全部发酵液中分离他克莫司

将通过产生他克莫司的链霉菌(Streptomyces sp.)的深层培养而得到的全部发酵液10.0升用10.0升2-丙醇稀释并且将该悬浮液搅拌4小时。通过过滤分离固相并且用1000ml甲苯将滤液萃取两次。将合并的甲苯萃取液在减压下蒸发到体积约为25ml并且根据HPLC分析，该浓缩物含有2.12g他克莫司、0.25g子囊霉素和0.11g tsucubamycinB。将该浓缩物装填到20g硝酸银改性的填充了200g硅胶(LichroprepMerck 60，25-40μm)的色谱柱。将该色谱柱首先用甲苯(约400ml)清洗，然后用异丁基甲基酮逐步极化的甲苯(至多60％(v/v))清洗。将含纯他克莫司成分(HPLC监测)合并，将其蒸干并且从二异丙基醚中结晶残余物(1.8g)，得到1.1g结晶产物，根据HPLC分析含有95.8％他克莫司、0.7％子囊霉素、少于0.1％的tsucubamycin B和大约1％他克莫司互变异构体-HPLC记录示于图3。

                    实施例2

            从干菌丝体中分离他克莫司

根据HPLC分析含有0.21％他克莫司的40.0kg干菌丝体是通过将产生他克莫司的链霉菌(Streptomyces sp.)深层培养而得到的200升发酵液进行加工来制备的。用50％(v/v)丙酮萃取该菌丝体，得到40.0升含水萃取物，然后用4升甲苯将含水萃取物萃取两次，得到15升有机萃取物。将该有机萃取物浓缩到体积约为1升。将该浓缩物装填到含有4.0kg硅胶(Merck 100，63-200μm)的柱。首先用甲苯(约30升)、然后用丙醇逐步极化的甲苯(至多20％(v/v)的丙酮)清洗该柱。将含他克莫司的馏分(TLC监测)合并并将其蒸干，得到残余物(第一次色谱法之后的残余物，130g)，根据HPLC分析其含有61.6％他克莫司、7.9％子囊霉素和3.5％tsucubamycin B-该材料的HPLC记录示于图4。利用甲苯和丙酮85∶15(v/v)的混合物，将第一次色谱法之后的残余物通过100g硝酸银改性的用1000g硅胶(Lichroprep Merck60，25-40μm)填充的柱色谱进一步提纯。通过HPLC监测色谱成分，将含有小于0.5％子囊霉素的馏分合并并且浓缩。使含有多于0.5并少于10％子囊霉素的馏分再循环。将10g该材料在一个色谱运行中提纯，并且将该色谱法重复17次(13次用于浓缩物以及4次用于再循环的馏分)，采用的柱是相同的。最后，得到了通过将合并的提纯成分浓缩而得的94.9g干残余物，将该残余物溶解在250ml 2-丙醇和350ml水中，将500ml正庚烷加入该溶液，通过冷却和混合使该产物结晶。通过过滤得到结晶他克莫司，用正庚烷清洗并且干燥。将该产物从相同的溶剂混合物中再一次重结晶，得到65.6g干产物。根据HPLC分析，重结晶产物含有98.21％他克莫司、0.32％子囊霉素、0.08％tsucubamycin B和0.78％他克莫司互变异构体-HPLC记录示于图5中。

                      实施例3

               制备硝酸银改性的硅胶

在加热下将10.0g结晶硝酸银溶解于1000ml甲醇中，并将100g硅胶(Lichroprep Merck 60，25-40μm)加入该溶液，然后将悬浮液蒸干，将残余物在60mbar真空和70℃下干燥。

Claims (27)

1.一种从发酵液中分离结晶他克莫司的方法，其包括以下步骤：

a)制备他克莫司的含水萃取物；

b)用PH值约为5-8的不与水混溶的溶剂萃取所述含水萃取物，由此得到有机萃取物并由其蒸发得到他克莫司浓缩物；

c)将所述他克莫司浓缩物色谱提纯由此得到纯他克莫司；

d)从适当的溶剂结晶所述纯他克莫司而得到结晶他克莫司。

2.权利要求1所述的方法，其中所述含水萃取物是通过用一种与水混溶的有机溶剂稀释所述发酵液来制备的。

3.权利要求2所述的方法，其中使用至少0.5体积份的与水混溶的有机溶剂来稀释1体积份的所述发酵液。

4.权利要求2所述的方法，其中最大限度使用2体积份的与水混溶的有机溶剂来稀释1体积份的所述发酵液。

5.权利要求1和2所述的方法，其中与水混溶的有机溶剂是乙醇、1-丙醇、2-丙醇或丙酮、或其混合物。

6.权利要求1和2所述的方法，其中在萃取到不与水混溶的溶剂中之前通过过滤或沉淀将所述含水萃取物从固相中分离出来。

7.权利要求1和2所述的方法，其中在萃取到不与水混溶的溶剂中之前没有将所述含水萃取物从固相中分离出来。

8.权利要求1中所述的方法，其中所述不与水混溶的溶剂是甲苯、二甲苯、二氯甲烷、二氯乙烷、叔丁基甲基醚、甲基异丁基酮或其混合物。

9.权利要求8中所述的方法，其中所述不与水混溶的溶剂是甲苯。

10.权利要求1中所述的方法，其中通过从所述发酵液分离菌丝体，并将其用水和与水混溶的有机溶剂的混合物萃取来制备所述含水萃取物。

11.权利要求10所述的方法，其中所述与水混溶的有机溶剂是乙醇、1-丙醇、2-丙醇、丙酮或其混合物。

12.权利要求10所述的方法，其中所述用于萃取的有机溶剂和水的混合物至少含有30％水。

13.权利要求10所述的方法，其中用大约50％丙酮水溶液来萃取所述菌丝体。

14.权利要求10所述的方法，其中由1千克干菌丝体而得到小于2升的含水萃取物。

15.权利要求1所述的方法，其中所述他克莫司浓缩物的色谱提纯是通过正相色谱法来完成的。

16.权利要求1和15所述的方法，其中所述色谱提纯是采用两种不同的色谱吸附剂在两个步骤中完成的。

17.权利要求1和15所述的方法，其中所述色谱提纯是在一个步骤中完成的。

18.权利要求15和16所述的方法，其中至少一个色谱步骤是在银盐改性的硅胶上完成的。

19.权利要求18所述的方法，其中所述银盐是硝酸银。

20.权利要求15所述的方法，其中所述浓缩物的色谱提纯是采用有机溶剂作为流动相来完成的。

21.权利要求20所述的方法，其中所述有机溶剂是甲苯或二氯甲烷与异丁基甲基酮、丙酮或叔丁基甲基醚或脂族醇与乙酸的酯的混合物。

22.权利要求20和21所述的方法，其中所述有机溶剂是甲苯和丙酮的混合物。

23.权利要求1所述的方法，其中从2-丙醇和水的混合物中结晶所述纯他克莫司。

24.权利要求15所述的方法，其中所述2-丙醇和水的体积比为1∶1-1∶2。

25.权利要求23所述的方法，其中所述结晶是通过加入己烷来完成的。

26.权利要求25所述的方法，其中对所述己烷的量没有限制。

27.权利要求1所述的方法，其中从二异丙基醚中结晶所述纯他克莫司。

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