CN114516884B - 一种高纯度他克莫司的提纯方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种高纯度他克莫司的提纯方法，其操作方法如下：以筑波链霉菌发酵产生的他克莫司粗提物为原料，将粗提物经稀土离子或银离子处理的键合不同基团的硅胶柱层析洗脱，收集高纯度组份，浓缩、结晶得他克莫司纯品。本发明方法不仅实现他克莫司与主要杂质的高选择性分离，有效抑制异构体转化，他克莫司纯度可达到99.2％以上，收率大于95％，纯度和收率显著提高，工艺简单便捷，适合于工业化、规模化生产等优点。
Description
技术领域
本发明属于生物制药工程领域，涉及一种微生物药物的提纯方法，具体涉及一种高纯度他克莫司的提纯方法。
背景技术
他克莫司(Tacrolimus，FK-506)是从筑波链霉菌S.tsukubaensis的发酵液中发现得到的大环内酯类抗生素，为新一代强效免疫抑制剂，作为肝、肾移植的一线用药，已在日本、美国等14个国家和地区上市。他克莫司能减少肝肾移植受体的急、慢性排斥反应，患者使用后的细菌和病毒感染率也较环孢素治疗者低，尤其是他克莫司有较强的亲肝性，对肝移植的功效比环孢素强。他克莫司不仅可用于防止器官移植免疫反应的发生，还可用于治疗已发生的免疫反应及自身免疫性疾病如系统性红斑狼疮，具有广阔的应用前景。
目前他克莫司主要的工业化生产方式还是微生物发酵法，通过链霉菌如筑波链霉菌(Streptomyces tsukubaensis)和吸水链霉菌(Streptomyces hygroscopicus)等发酵制备，但是链霉菌发酵生产他克莫司，常常伴随产生一些结构类似的杂质，主要有子囊霉素、二氢他克莫司、他克莫司8位差向异构体、他克莫司开环异构体(异构体1)等(图1中液相上他克莫司异构体相对保留时间RRT＝0.63，他克莫司和他克莫司异构体是可以转化的。业已通识，现有他克莫司分离纯化过程中采用反相洗脱体系中醇类溶剂和水溶液是异构体产生的诱因。他克莫司分离纯化的难点更多的是如何高效去除子囊霉素和二氢他克莫司)，这些物质的存在使得他克莫司采用常规的分离纯化方法完全分离而达到相应的纯度显得十分困难，这些杂质的含量控制直接影响他克莫司产品质量和生产效率。
关于他克莫司分离纯化的描述见于CN 102936253 B，CN 102863458 B，CN85109492，US.4,894366，US.6,576,135，US.6,881,341，US.2012065393，WO2005/010015，WO/2006/031664。这些专利报道了用有机溶剂萃取、吸附树脂、C18反相制备硅胶或改性聚合物来纯化他克莫司，其它主要采用高压液相制备色谱或高速逆流色谱，同样存在分离周期长、纯化收率低、分离效果差等问题，导致工业化生产以后产品的成本较高，给患者造成沉重的负担。因此，在技术上需要有生产他克莫司以及分离和纯化他克莫司的改进方法。
发明内容
本发明要解决的技术问题，在于提供一种高纯度他克莫司的提纯方法。
本发明是这样实现的：
将筑波链霉菌发酵产生的他克莫司粗提物采用如下方法进行操作：粗提物用有机溶剂配成饱和上样溶液，过滤，将粗提物经稀土离子或银离子处理的键合含巯基基团的硅胶柱层析洗脱，用一定比例的弱极性有机溶剂混合液作解析液进行梯度洗脱或恒定浓度洗脱，收集高纯度他克莫司组份，浓缩、结晶得他克莫司纯品。
进一步地，所述键合含巯基基团的硅胶，键合的基团为3-巯基丙基、2-巯基苯并噻唑或二巯基三嗪等。
进一步地，所述键合含巯基基团的硅胶的粒径为30～80um，孔径为
进一步地，所述稀土离子为Eu3+、Tb3+或其他稀土离子。
进一步地，所述稀土离子或银离子处理的键合含巯基基团的硅胶填料的用量为他克莫司粗提物上样量的20-200倍体积，优选50倍。
进一步地，所述弱极性有机溶剂混合液，为乙酸乙酯/石油醚、乙酸乙酯/正己烷、丙酮/石油醚、丙酮/正己烷，所述混合液体积比为1:10～1:3，优选丙酮/石油醚1:5。
进一步地，所述洗脱流速为0.5～1.5柱体积/小时(BV/h)，优选1.0BV/h。
进一步地，所述结晶，选用结晶溶剂为丙酮或乙酸乙酯中的一种。
进一步地，所述收集高纯度他克莫司组份，采用UHPLC方法进行纯度分析并测定收集液，合并纯度大于99％的他克莫司收集液。
本发明的原理在于：首先，键合含巯基基团的功能硅胶可以和稀土离子或银离子螯合，然后将上述硅胶填料用于分离他克莫司粗提物，由于他克莫司结构上与子囊霉素和二氢他克莫司比较，他克莫司侧链含有碳碳双键，在结合稀土离子或银离子的键合功能基团硅胶填料上，稀土离子或银离子可以与不饱和碳碳双键形成稳定配合物，可以实现他克莫司的选择性分离。同时键合功能基团硅胶采用的是正相洗脱体系，不用使用醇类溶剂和水溶液洗脱，避免他克莫司异构化的产生。
本发明的优点在于：实现他克莫司与主要杂质的高选择性分离，所选洗脱体系有效抑制异构体转化，获得的他克莫司纯度和收率显著提高，他克莫司纯度可达到99.2％以上，收率大于95％，分离纯化过程条件温和、分离过程高效便捷、分离制备量大，适合自动化生产，具有很高的经济效益。
附图说明
下面参照附图结合实施例对本发明作进一步的说明。
图1是本发明中链霉菌发酵产生的他克莫司粗提物的UHPLC图谱，其中1：他克莫司；2：子囊霉素；3：二氢他克莫司。
图2是本发明中实施例1制得的他克莫司的中压制备图谱。
图3是本发明中实施例1制得的高纯度他克莫司的UHPLC图谱。
具体实施方式
本发明涉及一种高纯度他克莫司的提纯方法，将筑波链霉菌发酵产生的他克莫司粗提物采用如下方法进行操作：
以粗提物用有机溶剂配成饱和上样溶液，过滤，将粗提物经稀土离子或银离子处理的键合含巯基基团的硅胶柱层析洗脱，用一定比例的弱极性有机溶剂混合液作解析液进行梯度洗脱或恒定浓度洗脱，收集高纯度他克莫司组份，浓缩、结晶得他克莫司纯品。
进一步地，所述有机溶剂包括丙酮或乙酸丁酯。
进一步地，所述键合含巯基基团的硅胶，键合的基团为3-巯基丙基、2-巯基苯并噻唑或二巯基三嗪等。上述键合硅胶填料可自行采购。
进一步地，所述稀土离子或银离子(均为市售)处理，将键合硅胶填料用甲醇溶液浸泡，然后加入稀土离子或银离子，常温避光搅拌24小时，过柱，甲醇冲洗即可使用。
进一步地，所述键合不同基团的硅胶的粒径为30～80um，孔径为
进一步地，所述稀土离子为Eu3+、Tb3+或其他稀土离子。
进一步地，所述稀土离子或银离子处理的键合不同基团的硅胶填料的用量为他克莫司粗提物上样量的20-200倍体积，优选50倍。
进一步地，所述弱极性有机溶剂混合液，为乙酸乙酯/石油醚、乙酸乙酯/正己烷、丙酮/石油醚、丙酮/正己烷，所述混合液体积比为1:10～1:3，优选丙酮/石油醚1:5。
进一步地，所述洗脱流速为0.5～1.5柱体积/小时(BV/h)，优选1.0BV/h。
进一步地，所述结晶，选用结晶溶剂为丙酮或乙酸乙酯中的一种。
其中他克莫司粗提物的获取：链霉菌发酵结束后，发酵液板框过滤，菌渣乙醇浸泡，收集乙醇浓缩至无醇味后，加入乙酸乙酯萃取，收集萃取液，脱色、浓缩、结晶得到粗提物(参考专利：ZL20181007773.7《一种他克莫司粗晶的制备方法》)。
以下结合实施例对本发明作进一步地说明。
实施例一
将他克莫司粗提物20g，用50ml丙酮充分溶解，过滤。层析柱装有经过硝酸银处理的键合3-巯基丙基的硅胶填料(粒径40um，孔径)1.0L，层析柱预先用石油醚平衡，样品溶液上正相柱吸附，先用石油醚洗脱3倍柱体积，然后用丙酮/石油醚(1:5)混合液洗脱液等度洗脱，控制洗脱流速1.0BV/h，分离纯化得到的洗脱物用UHPLC方法进行纯度分析并测定收集液，合并纯度大于99％的他克莫司收集液，收率98.2％(收率＝纯品重量×纯度/(粗提物上样重量×粗提物纯度))。收集液浓缩至干，少量丙酮饱和溶解，抽滤，静置结晶，得他克莫司纯品17.5g。
实施例二
将他克莫司粗提物50g，用80ml乙酸丁酯充分溶解，过滤。层析柱装有经过硝酸银处理的键合二巯基三嗪的硅胶填料(粒径40um，孔径)3.0L，层析柱预先用石油醚平衡，样品溶液上正相柱吸附，先用石油醚洗脱3倍柱体积，然后用乙酸乙酯/石油醚(1:3)混合液洗脱液等度洗脱，控制洗脱流速1.0BV/h，UHPLC方法测定收集液，合并纯度大于99％的他克莫司收集液，收率96.4％。收集液浓缩至干，少量乙酸乙酯饱和溶解，抽滤，静置结晶，得他克莫司纯品42.8g。
实施例三
将他克莫司粗提物20g，用50ml丙酮充分溶解，过滤。层析柱装有经过稀土离子Eu3+处理的键合2-巯基苯并噻唑的硅胶填料(粒径40um，孔径 )1.0L，层析柱预先用石油醚平衡，样品溶液上正相柱吸附，先用石油醚洗脱3倍柱体积，然后用丙酮/石油醚(1:5)混合液洗脱液等度洗脱，控制洗脱流速1.0BV/h，用UHPLC方法测定收集液，合并纯度大于99％的他克莫司收集液，收率93.4％。收集液浓缩至干，少量丙酮饱和溶解，抽滤，静置结晶，得他克莫司纯品16.8g。
以上实施例1-3的收率不同，主要是材料造成，不同的材料结合的稀土离子或银离子的数量不同，使得他克莫司的分离效果有所差异，导致收率不同。
请参阅图1-3所示，上述实施例一中的样品采用中压液相色谱仪进行制备(制备柱填料即为银离子处理的功能性键合硅胶)，洗脱获得的洗脱物采用超高压液相色谱UHPLC检测。中压液相色谱仪：EZPurifyIII，上海利穗有限公司。UHPLC检测条件为：色谱柱UHPLCXB-C18柱(2.1*50mm，1.8um)；流动相：0.03％磷酸水溶液-乙腈叔丁基甲醚混合液(80:20)＝58:42；检测波长210nm；流速0.4ml/min；柱温60℃。
本发明有益之处在于：
一是所选层析填料键合3-巯基丙基、二巯基三嗪或2-巯基苯并噻唑的硅胶结合稀土离子或银离子，能与烯键的π电子相互作用，改变硅胶的吸附特性，从而实现他克莫司与有关杂质的高效分离，本发明在杂质分离的选择性、产品收率、制备效率更具优势；
二是层析填料键合巯基丙基、二巯基三嗪或2-巯基苯并噻唑的功能化硅胶，与稀土离子或银离子结合，与现有方法相比，具有更长稳定性、高再现性、强光稳定性，使其具有高分辨率，高载量，高回收率等特点(由于他克莫司、子囊霉素和二氢他克莫司结构相似，极性相近，采用普通硅胶填料很难使其分开，载量低，且回收率低；另外采用普通硅胶直接和金属离子结合作为填料，稳定性差，易见光氧化变黑，重现率低。)；
三是所选洗脱溶剂体系，避免水、甲醇、乙醇等极性溶剂的使用，从而有效抑制他克莫司的异构化。与现有方法相比，本发明分离纯化过程条件温和、分离过程高效便捷、分离制备量大、分离度高，且提纯后获得的目标产物纯度高，同时本发明适合自动化生产，具有很高的经济效益。
虽然以上描述了本发明的具体实施方式，但是熟悉本技术领域的技术人员应当理解，我们所描述的具体的实施例只是说明性的，而不是用于对本发明的范围的限定，熟悉本领域的技术人员在依照本发明的精神所作的等效的修饰以及变化，都应当涵盖在本发明的权利要求所保护的范围内。
Claims (5)
1.一种他克莫司的提纯方法，其特征在于：将筑波链霉菌发酵产生的他克莫司粗提物采用如下方法进行操作：粗提物用有机溶剂配成饱和上样溶液，过滤，滤液经稀土离子或银离子处理的键合含巯基基团的硅胶填料进行柱层析洗脱，采用弱极性有机溶剂混合液作解析液进行梯度洗脱或恒定浓度洗脱，收集他克莫司组份，浓缩、结晶得他克莫司纯品；
所述巯基基团为3-巯基丙基、2-巯基苯并噻唑或二巯基三嗪；
所述稀土离子为Eu3+；
所述弱极性有机溶剂混合液，包括乙酸乙酯/石油醚、乙酸乙酯/正己烷、丙酮/石油醚或丙酮/正己烷，所述混合液体积比为1:10～1:3；
所述柱层析洗脱的洗脱流速为0.5～1.5柱体积/小时。
2.如权利要求1所述的一种他克莫司的提纯方法，其特征在于：所述键合含巯基基团的硅胶填料的粒径为30～80um，孔径为
3.如权利要求1所述的一种他克莫司的提纯方法，其特征在于：所述稀土离子或银离子处理的键合含巯基基团的硅胶填料的用量为他克莫司粗提物上样量的20-200倍体积。
4.如权利要求1所述的一种他克莫司的提纯方法，其特征在于：所述结晶，选用的结晶溶剂包括丙酮或乙酸乙酯。
5.如权利要求1所述的一种他克莫司的提纯方法，其特征在于：所述收集他克莫司组份，采用UHPLC方法进行纯度分析并测定收集液，合并纯度大于99％的他克莫司收集液。
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