KR20070057915A - 매크롤라이드 화합물의 단리 방법 - Google Patents

매크롤라이드 화합물의 단리 방법 Download PDF

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Abstract

매크롤라이드 화합물이 수 중에서 불용성이지만, 놀랍게도 그 생성물의 대부분은 발효 액의 액체상 내에 발견된다. 그러므로, 전체 발효 액, 즉 소정의 매크롤라이드 화합물을 생성하는 미생물을 배양함으로써 얻어지는 현탁액의 프로세싱 공정은 매우 타탕하다. 본 발명은 저렴하고 환경적으로 허용가능한 용매에 의한 전체 발효 액의 프로세싱 방법을 교시하고 있다.
발효 액, 매크롤라이드, 태크롤리무스, 시롤리무스

Description

매크롤라이드 화합물의 단리 방법{PROCESS FOR ISOLATION OF MACROLIDE COMPOUNDS}
본 발명은 매크롤라이드(macrolide) 화합물, 즉 태크롤리무스(tacrolimus) 또는 시롤리무스(sirolimus) 또는 이들의 자연 발생적 유도체 및 발효 액(fermentation broth)으로부터 유래한 유사체를 단리하는 방법에 관한 것이다.
매크롤라이드 화합물 또는 매크롤라이드는 다-구성된 락톤 고리이다. 항생제로서 사용되는 에리트로마이신(erythromycin)은 그러한 매크롤라이드의 잘 알려진 예이다. 태크롤리무스 및 시롤리무스와 같은 다른 매크롤라이드가 종종 면역억제물질로서 사용되고 있다.
태크롤리무스, T-림프구에 대한 선택적 억제 효과를 지닌 매크롤라이드는 미국 특허 US 4,894,366 및 유럽 특허 EP 184,162에 최초 기재되어 있다. 또한, 태크롤리무스는 과학 논문[H. Tanaka et al., J. Am. Chem. Soc. 1987, 109, 5031-5033 및 T. Kino et al., J. Antibiot. 1987, 40, 1249-1255]에도 기재되어 있다.
시롤리무스는, 라파마이신(rapamycin)이라고도 칭하는 것으로, 미국 특허 US 3,929,992에 최초 기재되어 있다. 시롤리무스는 또한 과학 논문[C.Vezina et al., J. Antibiot. 1975, 28, 721-726, 및 S.N. Sehgal et al., J. Antibiot. 1975, 727-731]에도 기재되어 있다.
아스코마이신(ascomycin), 임의의 매크롤라이드는 태크롤라이드의 천연 유사체이다. 아스코마이신은 다음의 논문: 논문[H. Hatanaka et al., J. Antibiot. 1988, 41, 1592-1599] 및 논문[M. Morisaki et al., J. Antibiot. 1992, 45, 126-132]에 기재되어 있다. 태크롤라이드의 다른 천연 유도체 및 유사체가 특허 EP 358,508 및 GB 2,269,172에 기재되어 있다.
태크롤리무스 및 시롤리무스의 바람직한 제조 방법은 발효이고, 한편 양자의 화합물의 전체 합성이 또한 EP 378,318 및 문헌[K.C. Nicolaou et al., J. Am. Chem. Soc. 1993, 115, 4419]에 기재되어 있다.
발효 액으로부터 태크롤리무스 및 시롤리무스 둘 다를 단리하는 것은 이들의 매크롤라이드 생물량(biomass)의 저 농도 때문에 그리고 매크롤라이드가 고체상(균사체) 및 액체상(여과된 발효 액) 둘 다에 존재한다는 사실 때문에 어렵다. 그러므로, 매크롤라이드 화합물을 경제적으로 단리하는 방법은, 예를 들면 문헌[T. Kino et al., J. Antibiot. 1987, 40, 1249-1255]에 설명되어 있는 바와 같이, (1) 균사체의 분리 및 (2) 균사체 및 여과된 발효 액 둘 다의 분리 프로세싱을 필요로 한다. 또다른 가능성이 특허 출원 WO 03/68 980에 기술되어 있으며, 이 출원은 소수성 유기 용매를 사용하여 발효 액을 직접 추출하는 것에 대하여 특허 청구하고 있다.
발명의 개요
본 발명에 따른 방법은 전체 발효 액의 프로세싱을 가능하게 한다. 균사체로부터 매클로라이드 화합물을 추출하는 것은 전체 발효 액에 적합한 수혼화성 유기 용매를 첨가함으로써 달성된다. 이로써, 그 매클로라이드 화합물이 액상 내로 이동하게 된다. 이어서, 그 추출된 균사체가 분리된다. 액체상(수성 추출물)은 유기 추출물을 얻도록 적합한 비수혼화성 용매를 사용하여 추출함으로써 추가 처리된다. 이어서, 유기 추출물이 부분적으로 증발되고, 잔류물은 톨루엔 내로 이동되어 톨루엔 농축물을 얻게 된다. 이 톨루엔 용액은 이동상인 아세톤에 의해 극성화되는 톨루엔을 사용하는 실리카 겔 상의 크로마토그래피에 의해 추가 정제된다. 이어서, 매크롤라이드 화합물을 함유하는 분획이 농축되고, 잔류물은 적합한 용매로부터 결정화되어 소정의 매크롤라이드 화합물을 얻게 된다.
상기 방법의 또다른 양태에서, 수성 추출물은 비수혼화성 용매를 사용하는 처리를 수행하기 전에 균사체로부터 분리되지 않는다. 이 비수혼화성 용매가 수성 추출물 중의 균사체의 현탁액에 직접 첨가될 수 있고, 유기 추출물이 3상계(three phase system)로부터 분리될 수 있다.
발명에 관한 상세한 설명
전체 발효 액에 수혼화성 유기 용매를 첨가하는 공정은 매크롤라이드 화합물을 액체상 내로 추출시킨다. 이러한 수혼화성 용매는 지방족 알콜 또는 케톤의 공추출(co-extration)을 감소시킬 수 있다. 바람직한 용매는 아세톤, 2-프로판올 및 1-프로판올이다. 에탄올은 매크롤라이드 화합물을 추출시키는 데 사용할 수 있지만, 에탄올이 단리된 매크롤라이드 화합물과 반응할 수 있기 때문에 아세톤 및/또는 2-프로판올보다 덜 편리하다. 전체 발효 액에 수혼화성 유기 용매를 첨가함으로써 얻어지는 수성 추출물은 여과에 의해 또는 침전에 의해, 바람직하게는 원심 분리에 의해 추출된 균사체로부터 분리할 수 있다. 투명한 수성 추출물이 얻어지며, 이것은 임의의 증발 없이 추가 처리할 수 있다. 또한, 수성 추출물은 고체상의 분리 없이 처리할 수 있다.
수성 추출물의 추가 프로세싱 공정은, 균사체가 분리되어 있는지 또는 분리되어 있지 않는지의 여부에 따라, 수성 추출물에 비수혼화성 용매를 첨가하는 단계, 및 2상계 또는 3상계를 혼합하는 단계를 포함한다. 이로써, 그 매크롤라이드 화합물이 유기상으로 추출되고, 반면에 대부분 바닥 성분들(ballast components)은 수상 내에 머물게 된다. 그 비수혼화성 용매는 지방족 탄화수소를 제외한 임의의 비수혼화성 유기 용매일 수 있다. 바람직한 용매로는 톨루엔, 크실렌, 디클로로메탄, 디클로로에탄, tert-부틸 메틸 에테르 및 메틸 이소부틸 케톤이 있다. 본 발명은, 실시예에서 입증되어 있는 바와 같이, 단지 매우 적은 소량의 비수혼화성 용매만이 수성 추출물에 첨가되어도 매크롤라이드 화합물을 유기상으로 정량적으로 이동시킬 수 있기 때문에, 매크롤라이드 화합물의 정제 및 생성물의 농축을 개시하고 있다. 톨루엔은, 톨루엔의 비등점과 아세톤 또는 2-프로판올의 비등점의 실질적인 차이에 의해 사용된 용매들을 간단하게 회수하기 때문에, 바람직한 용매가 된다.
매크롤라이드가 유기상 내로 추출된 후, 분리된 유기상은 감압 하에 농축된다. 이 얻어진 농축물은 아세톤에 의해 단계적으로 극성화된 톨루엔을 사용하는 실리카 겔 상의 크로마토그래피에 의해 추가 처리된다. 유기 추출물의 증발에 의해 얻어지는 농축물은 크로마토그래피 컬럼에 직접 적재할 수 있다. 본 발명에 따른 방법의 최종적인 조작은 실시예에 설명되어 있는 바와 같이 적합한 유기 용매로부터 소정의 매크롤라이드 화합물을 함유하는 크로마토그래피 분획을 결정화하는 것이다.
실시예 1
태크롤라이드를 생성하는 스트렙토마이세스 속(Streptomyces sp .)을 침수 배양(submerged cultivation)함으로써 얻어지는 전체 발효 액 10 리터를 아세톤 10 리터로 희석하고, 이 현탁액을 4 시간 동안 교반하였다. 고체상을 여과로 분리하고, 여과액을 톨루엔 1000 ml로 2회 추출하였다. 톨루엔 추출물들을 합하고, 톨루엔을 감압 하에 증발시켜 부피 약 100 ml의 농축물을 형성시켰다. 이 농축물을 100 g 실리카 겔(Lichroprep Merck 60, 63-200 ㎛)로 충전된 크로마토그래피 컬럼에 적재하였다. 이 컬럼을 먼저 톨루엔(약 300 ml)로 세척하고, 이어서 톨루엔과 30%(v/v) 아세톤의 혼합물로 세척하였다. 태크롤리무스를 함유하는 분획들(TCL 모니터링)을 합하고, 증발 건조하여 잔류물을 생성시켰다. 이 잔류물(3.7 g)을 2-프로판올(10 ml) 및 물 20 ml 중에 용해시키고, 이 용액에 헥산 30 ml를 첨가하였다. 태크롤리무스의 결정화는 냉장고(약 + 2℃) 내에서 용액을 냉각시킴으로써 달성하였다. 결정질 태크롤리무스를 여과에 의해 분리하였다. 결정질 태크롤리무스 1.4 g을 얻었다.
실시예 2
시롤리무스를 생성하는 스트렙토마이세스 속(Streptomyces sp .)을 침수 배양함으로써 얻어지는 전체 발효 액 10 리터를 2-프로판올 10 리터로 희석하여 현탁액을 형성시켰다. 이 현탁액을 4 시간 동안 교반하였다. 고체 입자를 여과로 분리하고, 여과액을 톨루엔 1000 ml로 3회 추출하였다. 톨루엔 추출물들을 합하고, 감압 하에 증발하여 부피 약 100 ml의 농축물을 형성시키고, 이 농축물을 100 g 실리카 겔(Lichroprep Merck 60, 63-200 ㎛)로 충전된 크로마토그래피 컬럼에 적재하였다. 이 컬럼을 먼저 톨루엔(약 300 ml)로 세척하고, 이어서 톨루엔과 5~30%(v/v) 아세톤의 혼합물로 세척하였다. 태크롤리무스를 함유하는 분획들(TCL 모니터링)을 합하고, 증발 건조하여 잔류물을 생성시켰다. 이 잔류물(5.5 g)을 에틸 아세테이트(20 ml) 중에 용해시키고, 이 용액에 헥산 50 ml를 첨가하였다. 시롤리무스의 결정화는 결정화가 발생할 때까지 냉장고(약 + 2℃) 내에서 용액을 방치함으로써 달성하였다. 결정질 시롤리무스를 여과에 의해 분리하였다. 결정질 시롤리무스 2.1 g을 얻었다.
실시예 3
태크롤라이드를 생성하는 스트렙토마이세스 속(Streptomyces sp .)을 침수 배양함으로써 얻어지는 전체 발효 액 10 리터를 아세톤 10 리터로 희석하고, 이 현탁액을 2 시간 동안 교반하였다. 이어서, 톨루엔 2 리터를 첨가하고, 이 혼합물을 2 시간 동안 더 교반하였다. 최종적으로, 그 혼합물을 원심 분리기 상에서 처리하여, 유기 추출물 3.2 리터를 얻었다. 이 유기 추출물은 실시예 1에서 설명한 바와 같이 추가의 프로세싱 처리하였다.

Claims (20)

  1. 발효 액으로부터 매크롤라이드 화합물을 단리하는 방법으로서,
    (a) 발효 액을 수혼화성 유기 용매로 희석하여 수성 추출물을 얻는 단계,
    (b) 수성 추출물을 비수혼화성 용매로 pH 약 5 내지 약 12에서 추출하여 유기 추출물을 얻는 단계,
    (c) 유기 추출물을 부분적으로 증발시켜 매크롤라이드 화합물의 농축물을 얻는 단계,
    (d) 이동상으로서 톨루엔과 아세톤의 혼합물을 사용하는 실리카 겔 상의 크로마토토그래피로 농축물을 정제하여 매크롤라이드 화합물을 함유하는 분획을 얻는 단계,
    (e) 매크롤라이드 화합물을 함유하는 분획을 농축하는 단계, 및
    (f) 적합한 용매로부터 잔류물을 결정화하는 단계
    를 포함하는 방법.
  2. 재1항에 있어서, 수혼화성 유기 용매는 에탄올, 1-프로판올, 2-프로판올 또는 아세톤으로 이루어진 군 중에서 선택하는 것인 방법.
  3. 재2항에 있어서, 수혼화성 유기 용매가 2-프로판올이거나, 또는 아세톤 또는 2-프로판올과 아세톤과의 혼합물인 방법.
  4. 제1항에 있어서, 수성 추출물은 비수혼화성 용매에 의한 처리를 수행하기 전에 여과 또는 침전에 의해 고체상으로부터 분리하는 것인 방법.
  5. 제1항에 있어서, 수성 추출물은 비수혼화성 용매에 의한 처리를 수행하기 전에 고체상으로부터 분리하지 않는 것인 방법.
  6. 제1항에 있어서, 비수혼화성 용매는 톨루엔, 크실렌, 디클로로메탄, 디클로로에탄, tert-부틸 메틸 에테르 또는 메틸 이소부틸 케톤으로 이루어진 군 중에서 선택하는 것인 방법.
  7. 제6항에 있어서, 비수혼화성 용매가 톨루엔인 방법.
  8. 제1항에 있어서, 발효 액은 전체 발효 액을 의미하는 것인 방법.
  9. 제6항에 있어서, 전체 발포 액은 매크롤라이드 화합물을 생성하는 스트렙토마이세스 속(streptomyces sp .) 미생물을 배양함으로써 얻어지는 현탁액을 의미하는 것인 방법.
  10. 제1항 또는 제9항에 있어서, 매크롤라이드 화합물은 태크롤리무스 또는 시롤 리무스 또는 이들 화합물의 자연 발생 유도체 또는 유사체를 의미하는 것인 방법.
  11. 제1항에 있어서, 매크롤라이드 화합물의 농축물은 매크롤라이드 화합물을 함유하는 톨루엔 용액을 의미하는 것인 방법.
  12. 재1항에 있어서, 농축물은 실리카 겔에 의해 충전되어 있고, 아세톤에 의해 단계적으로 극성화된 톨루엔에 의해 세척되는 컬럼에 도입하는 것인 방법.
  13. 제12항에 있어서, 톨루엔 대 아세톤의 부피비가 1:1 이하인 방법.
  14. 제1항에 있어서, 매크롤라이드 화합물을 함유하는 분획은 무수 잔류물로 농축하는 것인 방법.
  15. 제1항에 있어서, 태크롤리무스의 결정화의 사용에 적합한 용매가 2-프로판올과 물의 혼합물인 방법.
  16. 제15항에 있어서, 2-프로판올과 물의 부피비가 1:1 내지 1:3인 방법.
  17. 제15항에 있어서, 결정화는 헥산을 첨가하여 수행하는 것인 방법.
  18. 제17항에 있어서, 헥산의 양은 한정되지 않는 것인 방법.
  19. 제1항에 있어서, 태크롤리무스 또는 시롤리무스의 결정화에 적합한 용매가 디이소프로필 에테르이거나, 또는 에틸 아세테이트 또는 아세톤과 헥산과의 혼합물인 방법.
  20. 제19항에 있어서, 에틸 아세테이트 또는 아세톤과 헥산의 부피비가 1:1 내지 1:5인 방법.
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