NO322211B1 - Fremgangsmate for rensing av syklosporin A, og syklosporin A med hoy renhet. - Google Patents
Fremgangsmate for rensing av syklosporin A, og syklosporin A med hoy renhet. Download PDFInfo
- Publication number
- NO322211B1 NO322211B1 NO19985483A NO985483A NO322211B1 NO 322211 B1 NO322211 B1 NO 322211B1 NO 19985483 A NO19985483 A NO 19985483A NO 985483 A NO985483 A NO 985483A NO 322211 B1 NO322211 B1 NO 322211B1
- Authority
- NO
- Norway
- Prior art keywords
- cyclosporine
- toluene
- volume
- column
- chromatography
- Prior art date
Links
- PMATZTZNYRCHOR-CGLBZJNRSA-N Cyclosporin A Chemical compound CC[C@@H]1NC(=O)[C@H]([C@H](O)[C@H](C)C\C=C\C)N(C)C(=O)[C@H](C(C)C)N(C)C(=O)[C@H](CC(C)C)N(C)C(=O)[C@H](CC(C)C)N(C)C(=O)[C@@H](C)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](CC(C)C)N(C)C(=O)[C@H](C(C)C)NC(=O)[C@H](CC(C)C)N(C)C(=O)CN(C)C1=O PMATZTZNYRCHOR-CGLBZJNRSA-N 0.000 title claims abstract description 80
- 108010036949 Cyclosporine Proteins 0.000 title claims abstract description 80
- 229960001265 ciclosporin Drugs 0.000 title claims abstract description 53
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 50
- 229930105110 Cyclosporin A Natural products 0.000 title claims abstract description 46
- 238000000746 purification Methods 0.000 title claims description 18
- YXFVVABEGXRONW-UHFFFAOYSA-N Toluene Chemical compound CC1=CC=CC=C1 YXFVVABEGXRONW-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 100
- 229930182912 cyclosporin Natural products 0.000 claims abstract description 45
- 238000004587 chromatography analysis Methods 0.000 claims abstract description 36
- 239000011877 solvent mixture Substances 0.000 claims abstract description 26
- 239000000741 silica gel Substances 0.000 claims abstract description 25
- 229910002027 silica gel Inorganic materials 0.000 claims abstract description 25
- VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N Silicium dioxide Chemical compound O=[Si]=O VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 24
- 239000012043 crude product Substances 0.000 claims abstract description 17
- CSCPPACGZOOCGX-UHFFFAOYSA-N Acetone Chemical compound CC(C)=O CSCPPACGZOOCGX-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 44
- XEKOWRVHYACXOJ-UHFFFAOYSA-N Ethyl acetate Chemical compound CCOC(C)=O XEKOWRVHYACXOJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 24
- 238000010828 elution Methods 0.000 claims description 12
- 238000011210 chromatographic step Methods 0.000 claims description 8
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 claims description 6
- XYKIUTSFQGXHOW-UHFFFAOYSA-N propan-2-one;toluene Chemical compound CC(C)=O.CC1=CC=CC=C1 XYKIUTSFQGXHOW-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 6
- ZNVBEWJRWHNZMK-SYOLRUPNSA-N (3s,6s,9s,12r,15s,18s,21s,24s,30s,33s)-33-[(e,1r,2r)-1-hydroxy-2-methylhex-4-enyl]-1,4,7,10,12,15,19,25,28-nonamethyl-6,9,18,24-tetrakis(2-methylpropyl)-3,21,30-tri(propan-2-yl)-1,4,7,10,13,16,19,22,25,28,31-undecazacyclotritriacontane-2,5,8,11,14,17,20,2 Chemical compound C\C=C\C[C@@H](C)[C@@H](O)[C@@H]1N(C)C(=O)[C@H](C(C)C)N(C)C(=O)[C@H](CC(C)C)N(C)C(=O)[C@H](CC(C)C)N(C)C(=O)[C@@H](C)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](CC(C)C)N(C)C(=O)[C@H](C(C)C)NC(=O)[C@H](CC(C)C)N(C)C(=O)CN(C)C(=O)[C@H](C(C)C)NC1=O ZNVBEWJRWHNZMK-SYOLRUPNSA-N 0.000 claims description 4
- OAMZXMDZZWGPMH-UHFFFAOYSA-N ethyl acetate;toluene Chemical compound CCOC(C)=O.CC1=CC=CC=C1 OAMZXMDZZWGPMH-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 4
- 125000003944 tolyl group Chemical group 0.000 claims description 2
- 239000007858 starting material Substances 0.000 claims 1
- OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N Methanol Chemical compound OC OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 48
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 27
- 239000000047 product Substances 0.000 description 26
- HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N Chloroform Chemical compound ClC(Cl)Cl HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 24
- YMWUJEATGCHHMB-UHFFFAOYSA-N Dichloromethane Chemical compound ClCCl YMWUJEATGCHHMB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 24
- 239000000463 material Substances 0.000 description 19
- VLKZOEOYAKHREP-UHFFFAOYSA-N n-Hexane Chemical compound CCCCCC VLKZOEOYAKHREP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 12
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 12
- 239000012535 impurity Substances 0.000 description 11
- RTZKZFJDLAIYFH-UHFFFAOYSA-N Diethyl ether Chemical compound CCOCC RTZKZFJDLAIYFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 10
- 239000002904 solvent Substances 0.000 description 10
- 108010036941 Cyclosporins Proteins 0.000 description 8
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 8
- 238000001704 evaporation Methods 0.000 description 7
- 230000008020 evaporation Effects 0.000 description 7
- 238000011049 filling Methods 0.000 description 7
- 239000003480 eluent Substances 0.000 description 6
- 238000011097 chromatography purification Methods 0.000 description 5
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 5
- 238000000855 fermentation Methods 0.000 description 5
- 230000004151 fermentation Effects 0.000 description 5
- 238000004128 high performance liquid chromatography Methods 0.000 description 5
- TWNQGVIAIRXVLR-UHFFFAOYSA-N oxo(oxoalumanyloxy)alumane Chemical compound O=[Al]O[Al]=O TWNQGVIAIRXVLR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N Carbon Chemical compound [C] OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 4
- 239000013067 intermediate product Substances 0.000 description 4
- JTOKYIBTLUQVQV-QRVTZXGZSA-N (3s,6s,9s,12r,15s,18s,21s,24s,30s,33s)-30-[(1r)-1-hydroxyethyl]-33-[(e,1r,2r)-1-hydroxy-2-methylhex-4-enyl]-1,4,7,10,12,15,19,25,28-nonamethyl-6,9,18,24-tetrakis(2-methylpropyl)-3,21-di(propan-2-yl)-1,4,7,10,13,16,19,22,25,28,31-undecazacyclotritriacontan Chemical compound C\C=C\C[C@@H](C)[C@@H](O)[C@@H]1N(C)C(=O)[C@H](C(C)C)N(C)C(=O)[C@H](CC(C)C)N(C)C(=O)[C@H](CC(C)C)N(C)C(=O)[C@@H](C)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](CC(C)C)N(C)C(=O)[C@H](C(C)C)NC(=O)[C@H](CC(C)C)N(C)C(=O)CN(C)C(=O)[C@H]([C@@H](C)O)NC1=O JTOKYIBTLUQVQV-QRVTZXGZSA-N 0.000 description 3
- UCOQITKXMNKTKF-MXGZYYNMSA-N (3s,6s,9s,12r,15s,18s,21s,24s,30s,33s)-33-[(e,1r,2r)-1-hydroxy-2-methylhex-4-enyl]-1,4,7,10,12,15,19,25,28,30-decamethyl-6,9,18,24-tetrakis(2-methylpropyl)-3,21-di(propan-2-yl)-1,4,7,10,13,16,19,22,25,28,31-undecazacyclotritriacontane-2,5,8,11,14,17,20,23 Chemical compound C\C=C\C[C@@H](C)[C@@H](O)[C@@H]1N(C)C(=O)[C@H](C(C)C)N(C)C(=O)[C@H](CC(C)C)N(C)C(=O)[C@H](CC(C)C)N(C)C(=O)[C@@H](C)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](CC(C)C)N(C)C(=O)[C@H](C(C)C)NC(=O)[C@H](CC(C)C)N(C)C(=O)CN(C)C(=O)[C@H](C)NC1=O UCOQITKXMNKTKF-MXGZYYNMSA-N 0.000 description 3
- QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N Acetic acid Chemical compound CC(O)=O QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 239000004480 active ingredient Substances 0.000 description 3
- 239000013543 active substance Substances 0.000 description 3
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 3
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 3
- 239000000945 filler Substances 0.000 description 3
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 3
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 3
- GBMDVOWEEQVZKZ-UHFFFAOYSA-N methanol;hydrate Chemical compound O.OC GBMDVOWEEQVZKZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- XELZGAJCZANUQH-UHFFFAOYSA-N methyl 1-acetylthieno[3,2-c]pyrazole-5-carboxylate Chemical compound CC(=O)N1N=CC2=C1C=C(C(=O)OC)S2 XELZGAJCZANUQH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 239000003208 petroleum Substances 0.000 description 3
- 239000012071 phase Substances 0.000 description 3
- 238000011069 regeneration method Methods 0.000 description 3
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 3
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 3
- JTOKYIBTLUQVQV-UHFFFAOYSA-N Cyclosporin C Natural products CC=CCC(C)C(O)C1N(C)C(=O)C(C(C)C)N(C)C(=O)C(CC(C)C)N(C)C(=O)C(CC(C)C)N(C)C(=O)C(C)NC(=O)C(C)NC(=O)C(CC(C)C)N(C)C(=O)C(C(C)C)NC(=O)C(CC(C)C)N(C)C(=O)CN(C)C(=O)C(C(C)O)NC1=O JTOKYIBTLUQVQV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000001363 autoimmune Effects 0.000 description 2
- 238000004140 cleaning Methods 0.000 description 2
- 230000000052 comparative effect Effects 0.000 description 2
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 2
- 108010019248 cyclosporin C Proteins 0.000 description 2
- 238000011161 development Methods 0.000 description 2
- 230000018109 developmental process Effects 0.000 description 2
- FDSGHYHRLSWSLQ-UHFFFAOYSA-N dichloromethane;propan-2-one Chemical compound ClCCl.CC(C)=O FDSGHYHRLSWSLQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- IJKVHSBPTUYDLN-UHFFFAOYSA-N dihydroxy(oxo)silane Chemical compound O[Si](O)=O IJKVHSBPTUYDLN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000002349 favourable effect Effects 0.000 description 2
- 238000001914 filtration Methods 0.000 description 2
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 2
- QWXYZCJEXYQNEI-OSZHWHEXSA-N intermediate I Chemical compound COC(=O)[C@@]1(C=O)[C@H]2CC=[N+](C\C2=C\C)CCc2c1[nH]c1ccccc21 QWXYZCJEXYQNEI-OSZHWHEXSA-N 0.000 description 2
- 230000008018 melting Effects 0.000 description 2
- 238000002844 melting Methods 0.000 description 2
- 239000012074 organic phase Substances 0.000 description 2
- 239000003960 organic solvent Substances 0.000 description 2
- 238000012856 packing Methods 0.000 description 2
- 230000000144 pharmacologic effect Effects 0.000 description 2
- 238000001953 recrystallisation Methods 0.000 description 2
- 230000008929 regeneration Effects 0.000 description 2
- WSLDOOZREJYCGB-UHFFFAOYSA-N 1,2-Dichloroethane Chemical compound ClCCCl WSLDOOZREJYCGB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 208000023275 Autoimmune disease Diseases 0.000 description 1
- 208000023328 Basedow disease Diseases 0.000 description 1
- 206010009900 Colitis ulcerative Diseases 0.000 description 1
- 208000015023 Graves' disease Diseases 0.000 description 1
- 208000023661 Haematological disease Diseases 0.000 description 1
- 102000000588 Interleukin-2 Human genes 0.000 description 1
- 108010002350 Interleukin-2 Proteins 0.000 description 1
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 201000004681 Psoriasis Diseases 0.000 description 1
- 230000024932 T cell mediated immunity Effects 0.000 description 1
- 210000001744 T-lymphocyte Anatomy 0.000 description 1
- 241000223259 Trichoderma Species 0.000 description 1
- 241000123975 Trichoderma polysporum Species 0.000 description 1
- 201000006704 Ulcerative Colitis Diseases 0.000 description 1
- 230000001476 alcoholic effect Effects 0.000 description 1
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 1
- 230000000843 anti-fungal effect Effects 0.000 description 1
- 239000002518 antifoaming agent Substances 0.000 description 1
- 229940121375 antifungal agent Drugs 0.000 description 1
- 230000003115 biocidal effect Effects 0.000 description 1
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 1
- 210000001185 bone marrow Anatomy 0.000 description 1
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 1
- 239000007795 chemical reaction product Substances 0.000 description 1
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 1
- 150000008280 chlorinated hydrocarbons Chemical class 0.000 description 1
- UXTMROKLAAOEQO-UHFFFAOYSA-N chloroform;ethanol Chemical compound CCO.ClC(Cl)Cl UXTMROKLAAOEQO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- XFKWBMYVKWXMCO-UHFFFAOYSA-N chloroform;ethanol;ethyl acetate Chemical compound CCO.ClC(Cl)Cl.CCOC(C)=O XFKWBMYVKWXMCO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000004440 column chromatography Methods 0.000 description 1
- 239000012141 concentrate Substances 0.000 description 1
- 238000010924 continuous production Methods 0.000 description 1
- 125000004122 cyclic group Chemical group 0.000 description 1
- 238000004090 dissolution Methods 0.000 description 1
- 230000007613 environmental effect Effects 0.000 description 1
- 239000000284 extract Substances 0.000 description 1
- 239000000706 filtrate Substances 0.000 description 1
- 239000012467 final product Substances 0.000 description 1
- 238000005194 fractionation Methods 0.000 description 1
- 210000002216 heart Anatomy 0.000 description 1
- 238000010438 heat treatment Methods 0.000 description 1
- 230000028996 humoral immune response Effects 0.000 description 1
- 230000001506 immunosuppresive effect Effects 0.000 description 1
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 1
- 208000027866 inflammatory disease Diseases 0.000 description 1
- 238000011835 investigation Methods 0.000 description 1
- 210000003734 kidney Anatomy 0.000 description 1
- 150000002632 lipids Chemical class 0.000 description 1
- 238000011068 loading method Methods 0.000 description 1
- 210000004072 lung Anatomy 0.000 description 1
- 239000002207 metabolite Substances 0.000 description 1
- 125000002496 methyl group Chemical group [H]C([H])([H])* 0.000 description 1
- 244000005700 microbiome Species 0.000 description 1
- 201000006417 multiple sclerosis Diseases 0.000 description 1
- 239000005445 natural material Substances 0.000 description 1
- 230000003287 optical effect Effects 0.000 description 1
- 210000000056 organ Anatomy 0.000 description 1
- 239000011148 porous material Substances 0.000 description 1
- 230000035755 proliferation Effects 0.000 description 1
- 206010039073 rheumatoid arthritis Diseases 0.000 description 1
- 238000005070 sampling Methods 0.000 description 1
- 210000003491 skin Anatomy 0.000 description 1
- 238000001179 sorption measurement Methods 0.000 description 1
- 229910001220 stainless steel Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000010935 stainless steel Substances 0.000 description 1
- 238000012916 structural analysis Methods 0.000 description 1
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 description 1
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 1
- 238000002054 transplantation Methods 0.000 description 1
- 238000005292 vacuum distillation Methods 0.000 description 1
- 239000002699 waste material Substances 0.000 description 1
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K7/00—Peptides having 5 to 20 amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof
- C07K7/64—Cyclic peptides containing only normal peptide links
- C07K7/645—Cyclosporins; Related peptides
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P29/00—Non-central analgesic, antipyretic or antiinflammatory agents, e.g. antirheumatic agents; Non-steroidal antiinflammatory drugs [NSAID]
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
- A61P37/02—Immunomodulators
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Public Health (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Immunology (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Rheumatology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Pain & Pain Management (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
- Nitrogen And Oxygen Or Sulfur-Condensed Heterocyclic Ring Systems (AREA)
- Treatment Of Liquids With Adsorbents In General (AREA)
- Saccharide Compounds (AREA)
- Silicon Compounds (AREA)
- Separation Using Semi-Permeable Membranes (AREA)
Description
Den foreliggende oppfinnelse angår en fremgangsmåte for kromatografisk rensing av syklosporin A fra et råprodukt inneholdende syklosporinkompleks, ved å anvende en kolonne fylt med kiselgel og ved å anvende flettrinnskromatografi med en kolonne fylt med normalfase-kiselgel, og ved å anvende en løsningsmiddelblanding inneholdende toluen som hovedkomponent. Oppfinnelsen angår også syklosporin A med høy renhet, samt en fremgangsmåte for rensing i industriell skala av syklosporin A fra et råprodukt som inneholder syklosporinkompleks.
Syklosporiner er sykliske undekapeptider som er N-metylerte på flere steder, og de fleste av dem har anerkjente farmakologiske effekter. I denne gruppe forbindelser har 25 vært kjent hittil, og disse er betegnet med bokstavene A til Z. Det første som ble separert var syklosporin A, som er et naturlig materiale. Det ble isolert fra kulturløsningen fra Tofypocladium inflatum Gams-stamme (Heiv. Chim. Acta 59, 1075/1076). Denne forbindelse ble først kjent som et lett antiftingalt antibiotikum, senere ble oppmerksomheten rettet mot dens immunundertrykkende effekt (J. F. Borel et al., Immunology 32 1017/1977). Av denne årsak ble forbindelsen først hovedsakelig anvendt ved organtransplantasjon fra andre personer (lunge, hjerte, nyre, benmarg, hud). Farmakologiske undersøkelser viste at forbindelsen inhiberer både de humorale og cellulære immunresponser ved å hindre proliferasjon av T-celler og den avbryter syntesen av interleukin-2. Senere ble det klargjort at den er effektiv ved forskjellige typer autoimmune og inflammatoriske sykdommer, slik som autoimmune hematolog-iske sykdommer, ulcerøs kolitt, Graves sykdom, multippel sklerose, psoriasis og reumatoid artritt. Ytterligere eksperimenter er også blitt utført for å helbrede infeksjoner forårsaket av protozoer og tumorer. Betydningen av denne gruppe vises ved det faktum at et antall syntetisk beslektede forbindelser kan fremstilles ved å innebygge forskjellige aminosyrer og substitusjoner (f.eks. patentene EP 56782, CH 630062 og EP 29122).
Mesteparten av syklosporinene fremstilles ved fermentering. Som eksempler på kulturer av mikroorganismene anvendes Cylindrocapron Lucidum Booth (patentskrift nr. CH 589 716); Trichodermapolysporum Ri/ ai (patentskrift nr. CH 603 790); Tofypocladium varium (patentskrift nr. HU 201 577). Ved slutten av fermenteringen dannes et syklosporinkompleks som også kan inneholde andre urenheter (bestanddeler av kulturmedium, antiskummemidler, metabolitter etc.) avhengig av prosessens karakter.
Vanligvis isoleres produktet fra kulturløsningen ved en ekstraksjonsprosess. Dette kan utføres ved å separere mycelet fra kulturløsningen ved sentrifugering eller filtrering, etterfulgt av oppløsning av den aktive bestanddel fra mycelet med metanol eller aceton og ekstraksjon av filtratet med ikke-vannblandbare løsningsmidler. En annen kjent utførelsesmetode er en fremgangsmåte uten filtrering hvor det anvendes ekstraksjon av hele kulturmediet med et ikke-vannblandbart organisk løsningsmiddel. Løsningsmidlet i den organiske fase avdampes ved vakuumdestillasjon. Under ekstraksjonen med det organiske løsningsmiddel blir imidlertid også forbindelsene med lipidkarakter overført til den organiske fase, hvilket forårsaker vanskeligheter ved den videre rensing. For å separere disse forbindelser finnes det kjente prosesser (f.eks. sveitsisk patentskrift nr. 589 716 eller tysk patentsøknad nr. 2455859) hvor, etter fjerning av ekstraksjonsmidlet, resten oppløses i en blanding av metanol-vann og ekstraheres deretter flere ganger med det samme volum petroleumeter. Petroleumeterporsjonene kombineres og syklosporinene gjenvinnes ved hjelp av en blanding av metanol-vann. Det aktive stoff overføres ved flere gangers ekstraksjon fra den kombinerte metanol-vannfase over i etylenklorid som deretter vaskes med vann og inndampes til tørrhet. Råproduktet fremstilt ved den ovennevnte metode, og som inneholder syklosporiner, kan renses mer effektivt ved hjelp av én av de kromatografiske metoder.
Ifølge en metode beskrevet i WO 96/12031 fremstilles syklosporin ved fermentering, hvoretter blandingen tilsatt metanol ekstraheres med metylenklorid, og ekstraktene behandles med aktivt karbon før kolonnekromatografering av det resulterende produkt på silikagel. Det ble derved oppnådd et produkt som inneholdt minst 98,5 % syklosporin A.
Ifølge en metode beskrevet i US patentskrift nr. 4 117 118 blir syklosporinblandingen først overført til en Sephadex LH-20-kolonne og eluert med metanol, deretter elueres den suksessivt i en aluminiumoksidkolonne med en blanding av toluen og etylacetat (15 %), og i en kiselgelkolonne med en blanding av kloroform og metanol (2 %). Til tross for den gjentatte kromatografi er ikke det resulterende produkt rent, men det er en blanding av syklosporin A og B.
En lignende kromatografisk prosess er beskrevet blant annet i US patentskrift nr. 4 215 199, hvor en grovrensing utføres med en 98:2 volumdeler blanding av kloroform og metanol på en kiselgelkolonne. Eluatet inndampes deretter til tørrhet. Resten oppløses i metanol og kromatograferes på en Sephadex LH-20-kolonne ved anvendelse av metanol som elueringsmiddel. Eluatfraksjonene inndampes tit tørrhet, resten oppløses deretter i en 98:2 volumdeler blanding av kloroform og metanol. Den kromatograferes på nytt på en kiselgel. Syklosporin A viser seg først i eluatet. Denne og de etterfølgende fraksjoner separeres og de rene komponenter oppnås ved inndamping av eluatene.
Ifølge tysk patentskrift nr. DD 298276 oppløses det oljeaktige råprodukt i en liten mengde kloroform og kromatograferes deretter på en aluminiumoksidkolonne med kloroform. Fraksjonene inneholdende syklosporin A inndampes i vakuum, oppløses i kloroform, kromatograferes på nytt på en lignende kolonne og elueres deretter med kloroform. Fraksjoner inneholdende det aktive stoff inndampes på nytt i vakuum. Heksan tilsettes til resten og syklosporin A krystalliseres. Produktet vaskes med heksan, tørkes deretter og «krystalliseres til slutt fra en blanding av eter og heksan eller aceton.
Ifølge ungarsk patentskrift nr. 201577 kan det oppnådde råprodukt etter inndamping renses på en kiselgelkolonne ved eluering med en blanding av kloroform og metanol under gradvis økning av konsentrasjonen av metanol. Prosessen startes med ren kloroform og fortsettes med trinnvis økning med 0,5 volum% metanol i eluatet. Syklosporin A elueres fira kolonnen med 2 volum%, syklosporin B med 2,5 volum% og syklosporin C med 3 voIum% metanol som inneholder kloroform. Komponentene oppnås ved inndamping av fraksjonene.
De ovennevnte prosesser beskriver hovedsakelig syklosporinfermenterings-prosedyrer hvor det første mål med rensetrinnene er å identifisere det oppnådde produkt. Produktet isoleres således kun i en liten mengde og kun de fysikalske og kjemiske karakteristika oppgis uten publikasjonsdata angående renhet av produktet og mengdene av urenhetene.
Rtteger et al, Heiv. Chim. Acta 59(4), s. 1075-92 (1976), isolerte små mengder rent syklosporin A og C ved gjentatte kromatograferinger og ved andre rensetrinn for identifikasjons- og strukturanalyse. Ifølge denne artikkel blir råproduktet fra fermenteringen av Trichoderma potysporum Ri/ ai, som hovedsakelig inneholder syklosporiner A og C, avfettet med metanol og petroleumeter. Etter inndamping oppløses resten i kloroform og kromatograferes ved gradienteluering med en 98,5:1,5 volum/volum blanding av kloroform og metanol som elueringsmiddel. Rent krystal-linsk syklosporin A oppnås med ytterligere kromatografering. Fraksjonen inneholdende syklosporin A oppløses i metanol og kromatograferes på en Sephadex LH-20-kolonne ved anvendelse av metanol som elueringsmiddel. Toppfraksjonen inndampes, oppløses i toluen og kromatograferes på en kolonne pakket med aluminiumoksid ved å anvende som elueringsmiddel toluen i nærvær av en økende konsentrasjon eddiksyre. Det krystallinske produkt oppnås etter inndamping av fraksjonene og behandling med aktivert karbon i en alkoholisk løsning.
En renseprosess som kan gjennomføres i industriell skala, er beskrevet i US patentskrift nr. 5 382 655. Ifølge denne prosess blir råproduktet inneholdende forskjellige syklosporinkomponenter utsatt for varmebehandling før kromatografering på kiselgelkolonne ved hjelp av blandinger av kloroform-etanol og kloroform-etylacetat-etanol. Det oppnådde produkt underkastes ytterligere kromatografering og rekrystallisering, hvilket resulterer i at produktet får en ren kvalitet som er tilstrekkelig god for produksjon av injeksjonsløsninger.
Rensing av råproduktet inneholdende blandingen av syklosporiner er meget vanskelig, fordi urenhetene med lignende kjemiske strukturer har meget lignende kromatografiske karakteristika som syklosporin A som hovedprodukt. Fordi de tidligere beskrevne prosesser viser at uansett anvendt løsningsmiddelblanding og på grunn av overlappingen av de kromatografiske topper, må ytterligere kromatografiske eller andre rensetrinn utføres for å oppnå bestemte komponenter i ren form. De hittil kjente renseprosesser er generelt ikke kun kjennetegnet ved det faktum at deres løsningsmiddelbehov er meget stort, men det er også nødvendig med anvendelse av 3-4 forskjellige typer løsningsmidler eller løsningsmiddelblandinger og 2-3 typer kolonne-fyllmaterialer. Som en konsekvens av disse fakta fordres flere typer kromatografiske teknikker og regenereringsmetoder innenfor en prosess, hvilket skaper vanskeligheter med utvikling av en enkelt konstruert og ensartet styrbar økonomisk teknologi i industriell skala.
Ifølge det første eksempel i patentsøknad WO 94/16091 anvendes en løsnings-middelblanding av toluen og aceton i et enkelt trinn. Det oppnådde produkt rekrystalli-seres fra en løsningsmiddelblanding av eter og heksan (utbytte: 66,6 %). Den optiske rotasjon av produktet er tilstrekkelig, men dets smeltepunkt er bemerkelsesverdig lavere enn smeltepunktet beskrevet i litteraturen, hvilket indikerer at produktet ikke er rent. Selv rekrystallisering fra et løsningsmiddel vil således gi et produkt med dårlig renhet og lavt utbytte.
Fra et miljøbeskyttelsessynspunkt oppstår ytterligere problemer ved anvendelse av klorerte hydrokarboner, fordi flere og flere land har gjort forsøk på å begrense anvendelse av disse.
Målet for foreliggende oppfinnelse er utvikling av en lett anvendelig kromatografisk rensemetode i industriell skala og som er egnet for fremstilling av syklosporin A-bestanddelen med et mye lavere innhold av urenheter enn det som tidligere er oppnådd, hvilket gjør at den kan anvendes i medisinsk praksis på en sikrere måte.
Målet med den foreliggende oppfinnelse er å utvikle en kromatografisk rense-teknologi som kun fordrer én type løsningsmiddelblanding og én type kolonnefyllmateriale.
Med den foreliggende oppfinnelse tilveiebringes således en fremgangsmåte for fremstilling av syklosporin A som har høy renhet, fra et syklosporinkompleksholdig råprodukt ved hjelp av kromatografering på en kiselgelkolonne. Fremgangsmåten er kjennetegnet ved at den omfatter flertrinnskromatografi med en løsningsmiddel-blanding inneholdende toluen som hovedkomponent.
Med oppfinnelsen tilveiebringes også en fremgangsmåte for rensing i industriell skala av syklosporin A fra et råprodukt som inneholder syklosporinkompleks, ved hjelp av kromatografering på kiselgelkolonne. Fremgangsmåten er kjennetegnet ved at det utføres flertrinnskromatografering på kolonnen inneholdende normalfase-kiselgel, med en løsningsmiddelblanding inneholdende toluen som hovedkomponent.
Ifølge oppfinnelsen fremstilles således syklosporin A med høy renhet, kjennetegnet ved at innholdet av syklosporin L, syklosporin U og syklosporin D er lavere enn 0,05 volum%, og at innholdet av syklosporin B og C er lavere enn 0,02 volum%.
Angående kolonnefyllmaterialene er anvendelse av aluminiumoksid for industrielle formål meget tvilsom, fordi det som en konsekvens av den lille spesifikke overflate, er meget liten belastningskapasitet og separasjonsevne. Det er dessuten ikke fordelaktig for industrielle formål fordi aluminiumoksid-fyllmaterialet er stivt og skjørt, og derfor er det behov for spesielt utstyr og spesiell teknologi. Dette fyllmateriale kan ikke anvendes i rustfrie stålkolonner som hyppig tømmes, og som vanligvis anvendes i den kjemiske industri.
Fyllstoffer av Sephadex-typen er meget dyre, og i tilfellet med syklosporinkomplekset er deres effektiviteter meget begrensede fordi molekylstørrelsene ligger meget nær hverandre.
På grunn av fordelaktige egenskaper - høy spesifikk overflate, høy pore-størrelse, gunstig sorpsjonsevne, lett håndtering og forholdsvis lav pris - ble kiselgel anvendt som kolonnefyllmateriale. For dette fyllmateriale må det utvelges en ideell løsningsmiddelblanding og en fremgangsmåte som er egnet for å separere syklosporin-komponentene med høy selektivitet.
Som et resultat av eksperimentene ble det med den foreliggende oppfinnelse funnet at dette mål kan realiseres ved hjelp av flertrinnskromatografering på en kiselgelkolonne ved anvendelse av en løsningsmiddelblanding som elueringsmiddel der hovedkomponenten er toluen. Det ble uventet funnet at selv syklosporin U- og L-komponenter som ligger nærmest syklosporin A, kan separeres ved hjelp av tretrinnskromatografering på en kiselgelkolonne ved anvendelse av toluen inneholdende aceton som elueringsmiddel. Disse komponenter skiller seg kun fra syklosporin A ved en metylgruppe.
Fremgangsmåten ifølge foreliggende oppfinnelse er egnet for å separere de mest hyppige urenheter, slik som syklosporin B og C som er til stede i de største mengder, og dessuten syklosporin D, U og L som er til stede i spormengder. Innholdet av syklosporin B og C i syklosporin A-sluttproduktet oppnådd på denne måte, er lavere enn 0,02 volum%, mens innholdet av syklosporiner L, U og D er lavere enn 0,05 volum%.
Målet for foreliggende oppfinnelse er en forbedret fremgangsmåte for rensing av syklosporin A fra et råprodukt inneholdende et syklosporinkompleks, hvilket også muliggjør produksjon av ekstremt rent syklosporin A i stor skala ved hjelp av en kromatografisk fremgangsmåte på en kiselgelkolonne ved anvendelse av flertrinnskromatografi med en løsningsmiddelblanding inneholdende toluen som hovedkomponent. Et annet nytt trekk ved fremgangsmåten er at det appliseres ekstremt store mengder på kolonnen. Ved den konvensjonelle kromatografiske praksis utgjør mengden applisert på en kolonne ikke mer enn 5-10 % av kolonnekapasiteten, og denne verdi er lavere for syklosporiner.
Ved flertrinnskromatografien er løsningsmiddelblandingen inneholdende toluen som hovedkomponent og den høye kolonnebelastning forbundet med hverandre, og det ønskede resultat kan kun oppnås ved den kombinerte anvendelse av disse. Alle de tre ovennevnte egenskaper bør således anvendes samtidig for å oppnå det ekstremt rene produkt.
Ifølge den foreliggende oppfinnelse anvendes fortrinnsvis 2-4 påfølgende kromatografiske trinn og mer hensiktsmessig 3 trinn.
Overbelastningen av kolonnen er høyest i det første kromatografitrinn. Den klare separasjon av det aktive stoff og urenhetene tillater også anvendelse av høy kolonnebelastning i de etterfølgende to kromatografitrinn.
Ved rensingen er det gunstig å anvende en løsningsmiddelblanding av toluen-aceton som inneholder høyst 30 volum% aceton.
Ifølge en annen gunstig fremgangsmåte anvendes en løsningsmiddelblanding av toluen-etylacetat hvori etylacetatkonsentrasjonen er lavere enn 35 volum%.
Ved renseprosessen er det gunstig å anvende gradienteluering minst én gang. Ifølge eksperimentene vedrørende den foreliggende oppfinnelse, ble det funnet at det for rensing av syklosporinkomplekset er gunstig å anvende 10-30 volum%, og mer foretrukket 13-18 volum% aceton, og 10-35 volum% eller 15-20 volum% etylacetat.
I overensstemmelse med en fremgangsmåte ifølge den foreliggende oppfinnelse utføres elueringen ved en tretrinns kromatografering med toluen inneholdende 15 volum% aceton eller 18 volum% etylacetat. I det første trinn separeres hoved-mengden av syklosporin C, i det andre trinn separeres mesteparten av syklosporin B, L-og U-komponenter fjernes, og i det tredje trinn kan til sist mengdene av L- og U-komponenter og andre uidentifiserte urenheter reduseres til mindre enn 0,05 volum%. I det første trinn er tapet av syklosporin A minimalt, men i de innledende fraksjoner i det andre og tredje trinn fjernes en betydelig mengde syklosporin A sammen med syklosporin D-komponenten som er meget lik syklosporin A. Dette syklosporin A kan gjenvinnes i en meget ren form i det fjerde trinn.
I tabellen nedenfor er det som sammenligning oppført urenhetsprofilene for syklosporin A, USP-standard, den aktive syklosporin A-bestanddel fra "SANDIMMUN"-injeksjon og også dataene for syklosporin A-produktet fremstilt ved foreliggende oppfinnelse.
Fra dataene fremgår at kvaliteten av syklosporin A oppnådd ved den foreliggende oppfinnelse er betydelig høyere enn kvaliteten av "SANDIMMUN"-injeksjonen og overoppfyller dessuten USP-kravene.
Fremgangsmåten ifølge oppfinnelsen er dessuten anvendelig for rensing av råprodukt i både liten og stor skala.
Foruten det faktum at fremgangsmåten ifølge oppfinnelsen er i stand til å tilveiebringe rent syklosporin A, har den også noen ikke uvesentlige teknologiske fordeler. Fordi det kun anvendes én type teknologisk fremgangsmåte (kromatografi), kan renseprosessen håndteres ensartet, den er dessuten repeterbar og kan omdannes til en kontinuerlig prosess. En spesiell fordel er dessuten at det kun anvendes én type løsningsmiddelblanding i de tre kromatografiske trinn, fordi regenereringen av både kolonnene og løsningsmidlene da blir enklere.
En ytterligere spesiell fordel ved fremgangsmåten er at de sterktbindende urenheter forblir på kolonnen i det første kromatograferingstrinn, hvilket i høy grad letter regenerering av kolonnedladninger i de etterfølgende to trinn.
Oppfinnelsen beskrives nærmere ved hjelp av eksemplene.
I et sammenligningseksempel (eksempel 4) blir det vist at ved anvendelse av en løsningsmiddelblanding av diklormetan-aceton i en tretrinnskromatografering som hittil vanligvis er anvendt i de kjente prosesser, kunne det ikke produseres et slutt-produkt med tilsvarende renhet.
Eksempel 1
Rensin<g> av svklosporin- råprodukt ved hjelp av tretrinns kromatografi ved anvendelse av en løsningsmiddelblandin<g> av toluen- aceton
Kvalitet av syklosporin-råproduktet:
Første trinn
Kromatografien utføres med to kromatografiske kolonner forbundet i serie, hver med et volum på 8 liter og med en kappe, diameter 10 cm, lengde 100 cm. Hver av de to kolonner inneholder 3,95 kg Merck-type kiselgel med kornstørrelse 0,04-0,063 mm. Ved den første kromatografering inneholder begge kolonner ny kiselgel. Ved den neste kromatografering separeres den første kolonne og en forbindelse med andre kolonne som inneholder ny kiselgel. For hver ytterligere kromatografering anvendes kun en ny kolonne.
Fremstilling av råprodukt
4,1 kg råprodukt med renhet 60,9 volum%, oppløst i 15 1 toluen, som gir 191 løsning, appliseres på et kolonnepar forbundet i serie. Løsningen appliseres på toppen av kolonnen gjennom et filter med en tilførselshastighet på 2,4 l/time. Etter appliseringen elueres materialet med en løsningsmiddelblanding av 13:87 volumdeler aceton-toluen inntil volumet av eluatet ved bunnen av den andre kolonne er 39 liter. Syklo-sporininnholdet i eluatet analyseres ved hjelp av TLC. Fraksjoner som ikke inneholder syklosporin oppsamles som avfall. 28 liter av eluatet inneholder syklosporin og betraktes som hovedfraksjonen. Tørrmaterialinnholdet i det oppnådde mellomprodukt I er 3,23 kg.
Utbytte beregnet for syklosporin A: 97 %
Andre trinn
Separasjon utføres på en 1 meter lang 8 liters kolonne med kappe. Kolonnen inneholder Merck kiselgel 60 (0,015-0,040 mm). Massen av fyllmaterialet er 3,95 kg. Ca. 3 liter løsning av mellomprodukt I oppnådd i det første trinn, som inneholder 370 g tørrmateriale, appliseres på kolonnen med en tilførselshastighet på 2,4 l/time og vaskes deretter med 1 liter toluen.
Etter appliseringen av materialet elueres kolonnen med en 10 liter blanding av 15:85 volumdeler aceton:toluen og deretter med 20 liter 25:75 volumdeler aceton:toluenløsninger.
Gjennomstrømningshastigheten av løsningsmidlet inntil et fraksjonsvolum på 17 liter er 2,4 l/time, og derfra til et fraksjonsvolum på 18 liter er gjennomstrømnings-hastigheten 5 l/time. Fraksjoner analyseres ved hjelp av TLC. Fraksjonene fra 1 til 11 liter kastes, fraksjoner fra 12 til 19 liter betraktes som kritiske I-fraksjoner og prøver uttas fra disse. Urenhetsprofller for fraksjonene analyseres ved hjelp av HPLC og disse håndteres som forfraksjoner eller kombineres med hovedfraksjonene. På denne måte kan det oppnås 80 g tørrmateriale som inneholder forfraksjon som deretter inndampes til tørrhet. Fraksjoner fra 20 til 25 liter kombineres som hovedfraksjon. Fraksjonene fra 26 til 31 liter betraktes som kritiske fraksjoner, og etter analyse kombineres disse med hovedfraksjonen eller håndteres som etterfraksjon.
Hovedfraksjonen inndampes til tørrhet i en filmfordamper montert med et oscillerende røreverk. Det oppnås 234 g mellomprodukt II med et utbytte på 80 % og med den følgende kvalitet:
Tredje trinn
Kromatograferingen utføres på kolonnene med den samme konstruksjon og de geometriske størrelser som beskrevet i første og andre trinn!
1,7 liter toluenløsning inneholdende 220 g tørrmateriale tilberedes av mellomprodukt II oppnådd i det andre trinn og appliseres på toppen av kolonnen med en tilførselshastighet på 2,4 l/time og vaskes deretter med 1 liter toluen.
Kolonnen elueres med en blanding av 20 liter 15:85 volumdeler aceton:toluen og syklosporinet elueres deretter med en blanding av 20 liter 25:75 volumdeler aceton:toluen. Gjennomstrømningshastigheten for elueringen inntil fraksjonen ved 31 liter er 2,4 l/time og derfra til 32 liter er elueringshastigheten 5 l/time. Fraksjonene fra 1 til 18 liter kastes, fraksjonene fira 12 til 23 liter er forfraksjoner og betraktes som kritiske I-fraksjoner. Prøver tas fra disse for å analysere tørrmaterialinnholdet og urenhetsprofilene ved hjelp av HPLC. Etter analyse behandles de som forfraksjoner eller kombineres med hovedfraksjonene. Fraksjonene fra 29 til 38 liter kombineres som hovedfraksjon. Fraksjonene fra 39 til 41 liter oppsamles i porsjoner å én liter og betraktes som kritiske fraksjoner II. Etter analyse kombineres disse med hovedfraksjonen eller behandles som etterfraksjon.
Som et resultat av fraksjonsoppsamlingen kan det oppnås 70 g forfraksjon etter inndamping til tørrhet.
Hovedfraksjoner kombineres og etter inndamping til tørrhet oppnås 157 g rent syklosporin med et utbytte på 75 %. Kvaliteten av produktet er som følger:
Eksempel 2
Kromato<g>rafisk rensin<g> av svklosporin- råprodukt på en stasjonær firetrinns kiselgelkolonne med anvendelse av løsningsmiddelblandinger av toluen- aceton eller toluen- etvlacetat
Syklosporin-råprodukt renses ved hjelp av tretrinnskromatograferingen beskrevet i eksempel 1. Forfraksjoner fra tretrinnskromatograferingen renses i det fjerde trinn på en stasjonær kolonne med en løsningsmiddelblanding av toluen-etylacetat.
Fjerde trinn
Konstruksjon og geometriske størrelser for den kromatografiske kolonne er de samme som beskrevet i eksempel 1. Kolonnen inneholder Merck kiselgel 60 (0,015-0,040 mm) som angitt i eksempel 1.
Kolonnen tilsettes et konsentrat fra forfraksjonen i en mengde på 260 g materiale oppløst i 2,5 liter toluen, med en tilførselshastighet på 2,4 l/time.
Den appliserte prøve vaskes med 1 liter toluen og kolonnen elueres deretter med en blanding av 20 liter 17:82 volumdeler etylacetat:toluen med en gjennom-strømningshastighet på 2,4 l/time, deretter fortsettes elueringen med en blanding av 40 liter 28:72 volumdeler etylacetat:toluen.
I de oppsamlede fraksjoner blir fraksjonene fra 1 til 19 liter kastet. Etter HPLC-analyse blir fraksjonene fra 20 til 25 liter kastet eller kombineres med hovedfraksjonen. Fraksjonene fra 26 til 35 liter oppsamles som hovedfraksjon. Etter prøveuttak og HPLC-analyse blir fraksjonene fra 36 til 42 liter enten kombinert med hovedfraksjonen eller kastet. Oppsamlet hovedfraksjon fra 23 til 42 liter beskrevet ovenfor, inndampes til tørrhet. På denne måte oppnås 195 g rent syklosporin A inneholdende 99,6 volum% aktiv bestanddel, med et utbytte på 75 % og med følgende kvalitet:
Eksempel 3
Kromato<g>rafisk rensin<g> av svklosporin- rå<p>rodukt på en stasjonær totrinns kiselgelkolonne ved anvendelse av en løsnin<g>smiddelblanding av toluen- aceton
Syklosporin-råprodukt renses i overensstemmelse med den samme prosess som er beskrevet i det første trinn i eksempel 1, og det oppnås syklosporin-mellomprodukt I med den samme kvalitet. Den videre fremgangsmåte er som følger:
Andre trinn
Kolonnen tilføres 3 liter mellomprodukt I inneholdende 370 g tørket materiale, med en tilførselshastighet på 2,4 l/time, og deretter vaskes den tilførte prøve med 1 liter toluen.
Etter applisering elueres kolonnen med en blanding av 10 liter 15:85 volumdeler aceton:toluen, og deretter fortsettes elueringen med en blanding av 20 liter 25:75 volumdeler aceton:toluen.
Gjennomstrømningshastigheten for løsningsmidlet er 2,4 l/time inntil 17 liter og 5 l/time derfra til 18 liter.
I overensstemmelse med TLC- og HPLC-analyse blir fraksjonene fra 1 til 11 liter kastet, fraksjonene fra 12 til 20 liter er forfraksjoner, fraksjonene fra 21 til 24 liter betraktes som hovedfraksjonene og fraksjonene fra 25 liter til endt eluering behandles som etterfraksjoner. Acetonvaskefraksjonene kastes.
Etter fraksjonering kombineres de oppsamlede hovedfraksjoner og inndampes til tørrhet for å gi 114 g syklosporin A med et utbytte på 41 % og med like god produktkvalitet som anført i eksempel 1.
Eksempel 4
Sammenlignin<g>seksempel for rensing av råprodukt ved hjelp av tretrinns kromatografi med anvendelse av en løsningsmiddelblanding av diklormetan- aceton
Kvaliteten av syklosporin-råproduktet (det samme som anvendt i eksempel 1):
Første trinn
Kromatografisk utstyr og fyllmateriale er det samme som beskrevet i eksempel 1. Et kolonnepar forbundet i serie tilføres 4,1 kg råprodukt med renhet 60,9 % i 15 liter diklormetanløsning.
Etter applisering av prøven elueres kolonnen med diklormetan med en gjennomstrømningshastighet på 2,4 l/time til 35 liter eluat er oppsamlet.
Fraksjoner fra 1 til 10 liter kastes, mens fraksjonene fra 11 til 35 liter betraktes som hovedfraksjoner. TørrstofFuinholdet i mellomprodukt I oppnådd på denne måte er 2,9 kg, innhold av aktiv bestanddel er 75 volum%.
Andre trinn
Kromatografisk utstyr og fyllmateriale er det samme som beskrevet i eksempel 1.
Kolonnen tilføres på toppen 3 liter mellomprodukt I inneholdende 350 g tørrstoff, med en tilførselshastighet på 2,4 l/time. Elueringen utføres med en blanding av 10 liter aceton:diklormetan, 1:9 volumforhold, og fortsettes deretter med en blanding av 25 liter aceton:diklormetan, 2:8 volumforhold, og sluttføres med aceton med en tilførselshastighet på 2,4 l/time. Ifølge TLC-analyse var volumet av forfraksjonen 13 liter, volumet av hovedfraksjonen var 22 liter og volumet av etterfraksjonen var 11 liter. 22 liter hovedfraksjon ble inndampet til tørrhet og det ble oppnådd 220 g mellomprodukt II med renhet 91 %.
Tredje trinn
Kromatografisk utstyr og fyllmateriale er det samme som beskrevet i eksempel 1.
Kolonnen tilføres 220 g mellomprodukt II, og diklormetanløsningen tilføres til kolonnen med en hastighet på 2,4 l/time. Elueringen utføres med en blanding av 20 titer aceton:diklormetan, 1:9 volumforhold, og fortsettes deretter med en blanding av 30 liter aceton:diklormetan, 2:8 volumforhold, og sluttføres med aceton med en hastighet på 2,4 l/time.
De første fraksjoner inntil 26 liter betraktes som forfraksjoner, deretter oppsamles 26 liter hovedfraksjon og til slutt 11 liter etterfraksjon.
26 liter hovedfraksjon ble inndampet til tørrhet og det ble oppnådd 140 g mellomprodukt III med følgende kvalitet:
Claims (13)
1. Fremgangsmåte for fremstilling av syklosporin A som har høy renhet, fra et syklosporinkompleksholdig råprodukt ved hjelp av kromatografering på en kiselgelkolonne,
karakterisert ved at fremgangsmåten omfatter flertrinnskromatografi med en løsningsmiddelblanding inneholdende toluen som hovedkomponent.
2. Fremgangsmåte ifølge krav 1,
karakterisert ved at det utføres 2 til 4 påfølgende kromatografiske trinn.
3. Fremgangsmåte ifølge krav 1,
karakterisert ved at det utføres 3 påfølgende kromatografiske trinn.
4. Fremgangsmåte ifølge krav 1,
karakterisert ved at toluen-aceton anvendes som løsningsmiddelblanding.
5. Fremgangsmåte ifølge krav 1,
karakterisert ved at løsningsmiddelbtandingen er toluen som inneholder høyst 30 volum% aceton.
6. Fremgangsmåte ifølge krav 1,
karakterisert ved at det anvendes en løsningsmiddelblanding av toluen-etylacetat.
7. Fremgangsmåte ifølge krav 6,
karakterisert ved at det anvendes toluen som inneholder høyst 35 volum% etylacetat.
8. Fremgangsmåte ifølge krav 1,
karakterisert ved at gradienteluering anvendes i bare ett kromatografisk trinn.
9. Syklosporin A med høy renhet,
karakterisert ved at innholdet av syklosporin L, syklosporin U og syklosporin D er lavere enn 0,05 volum%, og at innholdet av syklosporin B og C er lavere enn 0,02 volum%.
10. Fremgangsmåte for rensing i industriell skala av syklosporin A fra et råprodukt som inneholder syklosporinkompleks, ved hjelp av kromatografering på kiselgelkolonne,
karakterisert ved at det utføres flertrinnskromatografering på kolonnen inneholdende normalfase-kiselgel, med en løsningsmiddelblanding inneholdende toluen som hovedkomponent
11. Fremgangsmåte ifølge krav 1 eller 10,
karakterisert ved at syklosporinkomplekset anvendt som startmateriale ved kromatograferingen oppvarmes til 80-120 °C før kromatografering.
12. Fremgangsmåte ifølge krav 1 eller 10,
karakterisert ved at det anvendes toluen inneholdende 10-30 % aceton.
13. Fremgangsmåte ifølge krav 1 eller 10,
karakterisert ved at det anvendes toluen inneholdende 10-35 volum% etylacetat.
Applications Claiming Priority (2)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
HU9700645A HU223054B1 (hu) | 1997-03-25 | 1997-03-25 | Tisztítási eljárás nagytisztaságú ciklosporin A előállítására |
PCT/HU1998/000029 WO1998042734A1 (en) | 1997-03-25 | 1998-03-23 | Process of purification of cyclosporin |
Publications (3)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
NO985483L NO985483L (no) | 1998-11-24 |
NO985483D0 NO985483D0 (no) | 1998-11-24 |
NO322211B1 true NO322211B1 (no) | 2006-08-28 |
Family
ID=89994909
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
NO19985483A NO322211B1 (no) | 1997-03-25 | 1998-11-24 | Fremgangsmate for rensing av syklosporin A, og syklosporin A med hoy renhet. |
Country Status (22)
Country | Link |
---|---|
EP (1) | EP0920447B1 (no) |
JP (1) | JP2000511939A (no) |
AT (1) | ATE223434T1 (no) |
AU (1) | AU737260B2 (no) |
BG (1) | BG64215B1 (no) |
CA (1) | CA2255062C (no) |
CZ (1) | CZ293687B6 (no) |
DE (1) | DE69807635T2 (no) |
DK (1) | DK0920447T3 (no) |
ES (1) | ES2180159T3 (no) |
HK (1) | HK1020740A1 (no) |
HU (1) | HU223054B1 (no) |
IL (1) | IL126871A0 (no) |
NO (1) | NO322211B1 (no) |
NZ (1) | NZ332718A (no) |
PL (1) | PL194252B1 (no) |
PT (1) | PT920447E (no) |
RU (1) | RU2182577C2 (no) |
SK (1) | SK283672B6 (no) |
UA (1) | UA58511C2 (no) |
WO (1) | WO1998042734A1 (no) |
YU (1) | YU49468B (no) |
Families Citing this family (4)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
EP2151450A1 (de) * | 2008-07-29 | 2010-02-10 | Sandoz AG | Verfahren zur Aufarbeitung von mikrobiologisch hergestellten zyklischen Oligopeptiden |
DE102009037551A1 (de) * | 2009-08-17 | 2011-02-24 | MAX-PLANCK-Gesellschaft zur Förderung der Wissenschaften e.V. | Cyclosporinderivate |
HUP1500502A2 (en) * | 2015-10-26 | 2017-04-28 | Rotachrom Tech Kft | Process for the purification of cyclosporin-a |
CN114653350A (zh) * | 2022-02-25 | 2022-06-24 | 江苏九阳生物制药有限公司 | 一种环孢素a层析硅胶的再生方法 |
Family Cites Families (3)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
HU213553B (en) * | 1992-05-25 | 1997-07-28 | Biogal Gyogyszergyar | Process for isolating of cyclosporin-a |
FI92334C (fi) * | 1992-12-30 | 1994-10-25 | Leiras Oy | Menetelmä syklosporiinien tuottamiseksi ja menetelmässä käytettävä uusi Tolypocladium-kanta |
KR100304324B1 (ko) * | 1994-10-13 | 2001-11-22 | 김용규 | 사이클로스포린a의제조방법 |
-
1997
- 1997-03-25 HU HU9700645A patent/HU223054B1/hu not_active IP Right Cessation
-
1998
- 1998-03-23 PL PL98330142A patent/PL194252B1/pl not_active IP Right Cessation
- 1998-03-23 YU YU53598A patent/YU49468B/sh unknown
- 1998-03-23 DE DE69807635T patent/DE69807635T2/de not_active Expired - Fee Related
- 1998-03-23 CZ CZ19983814A patent/CZ293687B6/cs not_active IP Right Cessation
- 1998-03-23 EP EP98913969A patent/EP0920447B1/en not_active Expired - Lifetime
- 1998-03-23 ES ES98913969T patent/ES2180159T3/es not_active Expired - Lifetime
- 1998-03-23 WO PCT/HU1998/000029 patent/WO1998042734A1/en active IP Right Grant
- 1998-03-23 AU AU68482/98A patent/AU737260B2/en not_active Ceased
- 1998-03-23 CA CA002255062A patent/CA2255062C/en not_active Expired - Fee Related
- 1998-03-23 SK SK1618-98A patent/SK283672B6/sk unknown
- 1998-03-23 AT AT98913969T patent/ATE223434T1/de not_active IP Right Cessation
- 1998-03-23 JP JP10545312A patent/JP2000511939A/ja not_active Ceased
- 1998-03-23 DK DK98913969T patent/DK0920447T3/da active
- 1998-03-23 NZ NZ332718A patent/NZ332718A/xx unknown
- 1998-03-23 PT PT98913969T patent/PT920447E/pt unknown
- 1998-03-23 UA UA98116251A patent/UA58511C2/uk unknown
- 1998-03-23 RU RU98123499/04A patent/RU2182577C2/ru active
- 1998-03-23 IL IL12687198A patent/IL126871A0/xx unknown
- 1998-11-10 BG BG102911A patent/BG64215B1/bg unknown
- 1998-11-24 NO NO19985483A patent/NO322211B1/no not_active IP Right Cessation
-
1999
- 1999-12-09 HK HK99105786A patent/HK1020740A1/xx not_active IP Right Cessation
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
AU737260B2 (en) | 2001-08-16 |
ATE223434T1 (de) | 2002-09-15 |
IL126871A0 (en) | 1999-09-22 |
EP0920447B1 (en) | 2002-09-04 |
AU6848298A (en) | 1998-10-20 |
YU49468B (sh) | 2006-05-25 |
NO985483L (no) | 1998-11-24 |
CZ381498A3 (cs) | 1999-02-17 |
PL194252B1 (pl) | 2007-05-31 |
WO1998042734A1 (en) | 1998-10-01 |
JP2000511939A (ja) | 2000-09-12 |
CZ293687B6 (cs) | 2004-07-14 |
UA58511C2 (uk) | 2003-08-15 |
PL330142A1 (en) | 1999-04-26 |
YU53598A (en) | 1999-11-22 |
DE69807635T2 (de) | 2003-08-07 |
SK161898A3 (en) | 1999-05-07 |
BG102911A (en) | 1999-09-30 |
DK0920447T3 (da) | 2002-12-16 |
NO985483D0 (no) | 1998-11-24 |
DE69807635D1 (de) | 2002-10-10 |
CA2255062A1 (en) | 1998-10-01 |
EP0920447A1 (en) | 1999-06-09 |
BG64215B1 (bg) | 2004-05-31 |
HUP9700645A3 (en) | 2001-11-28 |
SK283672B6 (sk) | 2003-11-04 |
RU2182577C2 (ru) | 2002-05-20 |
NZ332718A (en) | 2000-04-28 |
HUP9700645A2 (hu) | 1999-06-28 |
HU9700645D0 (en) | 1997-05-28 |
CA2255062C (en) | 2008-06-17 |
ES2180159T3 (es) | 2003-02-01 |
HU223054B1 (hu) | 2004-03-01 |
HK1020740A1 (en) | 2000-05-19 |
PT920447E (pt) | 2002-11-29 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
EP0056782B1 (en) | Novel cyclosporins | |
EP0938493A1 (en) | Method of isolating cyclosporins | |
CZ285518B6 (cs) | Způsob čištění cyklosporinu A | |
US6306306B1 (en) | Chromatographic process for obtaining highly purified cyclosporin A and related cyclosporins | |
EP0801686B1 (en) | Process for preparing cyclosporin a | |
NO322211B1 (no) | Fremgangsmate for rensing av syklosporin A, og syklosporin A med hoy renhet. | |
US6423233B1 (en) | Purification process | |
WO1997046575A1 (en) | Method of isolating cyclosporins | |
KR100496929B1 (ko) | 시클로스포린의정제방법 | |
US8691770B2 (en) | Method for processing microbiologically produced cyclic oligopeptides | |
HRP980604A2 (en) | Purification process | |
CN101031654A (zh) | 结晶他克莫司的分离方法 | |
CN111909176B (zh) | 一种从他克莫司分离废液中回收子囊霉素、他克莫司8-丙基类似物的方法 | |
CN109232674B (zh) | 从南山茶中提取白杨素-8-C-β-D-葡萄糖苷的方法 | |
CN109485682B (zh) | 提取山奈酚乙酰基半乳糖苷类化合物的方法 | |
CN1099892C (zh) | 灵芝孢子中抗肿瘤成分的分离技术 | |
SU1168254A1 (ru) | Способ получени розавина | |
CA2108655A1 (en) | Supercritical co2 extraction of cyclosporin a | |
CN115785006A (zh) | 环(酪氨酸-缬氨酸)的制备方法 | |
CN116323605A (zh) | 从萝芙木属植物中提取α育亨宾的改进工业方法及其提取物 | |
HU213934B (en) | Process for isolation of cyclosporin a | |
KR100341355B1 (ko) | 사이클로스포린a의제조방법 |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
MM1K | Lapsed by not paying the annual fees |