CZ381498A3

CZ381498A3 - Purifikační postup

Info

Publication number: CZ381498A3
Application number: CZ983814A
Authority: CZ
Inventors: Vilmos Kéri; Árvai Edit Nagyné; Lajos Deák; Györgyné Makó; Istvánné Miskolczy
Original assignee: BIOGAL Gyógyszergyár Rt.
Priority date: 1997-03-25
Filing date: 1998-03-23
Publication date: 1999-02-17
Also published as: AU737260B2; HK1020740A1; YU49468B; YU53598A; CA2255062C; PT920447E; NO985483D0; CA2255062A1; HUP9700645A3; WO1998042734A1; EP0920447B1; BG64215B1; CZ293687B6; SK283672B6; BG102911A; AU6848298A; HU9700645D0; UA58511C2; NO985483L; DK0920447T3

Description

Oblast techniky

Vynález se týká postupu pro chromatografické čištění cyklosporinu A ze surového produktu, obsahujícího směs cyklosporinů, za použití kolony plněné silikagelem a aplikací vícestupňové chromatografie na koloně plněnénormální silikagelovou fází za použití směsi rozpouštědel, obsahující jako hlavní složku toluen.

Dosavadní stav techniky

Cyklosporiny jsou cyklické undekapeptidy, které jsou na několika místech N-methylované. U většiny z nich byla potvrzena farmakologícká účinnost. Zatím je 2námo 25 členů této skupiny,..

I a jsou označovány písmeny A až Z. Jako první z nich byl získán z přírodního materiálu cyklosporin A, který byl. izolován z kultivační půdy kmene Tolypocladium inflatum Gams (Helv:

Chim.. Acta 59, 1075 (1976),). Nejprve byla tato sloučenina známa jako slabé fungicidní antibiotikum, později ale upoutala pozornost pro svůj imunosupresívní účinek (J.F. Borel a spol.: Immunology 32, 1017 (1977)). Pro tuto svoji vlastnost se používalo hlavně při heterotransplantacích (plic, srdce, ledvin, kostní dřeně nebo kůže). Farmakologické studie ukázaly, že tato sloučenina inhibuje jak humorální tak celulární imunitní odpovědi tím,, že zabraňuje proliferaci T-buněk a přerušuje syntézu interleukinu-2. Později se ukázalo, že sloučenina je účinná i při různých typech autoimunních a zánětlivých onemocnění, jako jsouautoimunní hematologické choroby, ulcerózní kolitida, Gravesova choroba, roztroušená skleróza, pspriáza a revmatická artritida. Byly též činěny pokusy s léčbou infekcí způsobených protozoami a s léčbou nádorů. Důležitost této skupiny sloučenin ukazuje fakt, že je

- 2 • * možno připravit mnoho syntetických příbuzných sloučenin vnesením různých aminokyselin a substituentů do molekuly (viz například patentové spisy EP 56732, CH 630062 a EP 29122) .

Většina cyklosporinů se připravuje fermentací. Jako příklady použitých kultur je možno uvést mikroorganizmy Cylindrocarpon Lucidum Booth (patentový spis č. CH 589,716), Trichoderma polysporum Rifai (patentový spis č. CH 603,790), nebo Tolypocladium varium (patentový spis č. HU 201,577). Po skončení fermentace se získá cyklosporinová směs, která podle charakteru pochodu může obsahovat různé nečistoty (přísady v kultivační půdě, odpěňovací prostředek, metabolity apod.).

Obvykle se produkt izoluje z fermentační směsi extrakčními pochody. Může se to provést tak, že se mycelium oddělí od fermentačního roztoku odstředěním nebo filtrací, pak se aktivní složka vylouží z mycelia methanolem nebo acetonem a filtrát se extrahuje rozpouštědly, která se nemísí s vodou. Při jiném známém způsobu se neprovede filtrace a celá fermentační směs se extrahuje s vodou nemísitelným organickým rozpouštědlem a organický extrakt se pak odpaří ve vakuu. Při extrakci organickým rozpouštědlem se však do organické fáze extrahují i sloučeniny lipidového charakteru a při dalším čištění působí potíže. K jejich odstranění byly vypracovány některé postupy (například švýcarský patentový spis č. 589,716 nebo vyložená německá patentová přihláška č. 2455859), při kterých po odstranění extrakčního rozpouštědla se odparek rozpustí ve vodném methanolu a pak se extrahuje několikrát stejným objemem petroletheru. Petroletherické extrakty se spojí a cyklosporiny se z nich získají vodným methanolem. Aktivní složka se pak mnohonásobnou extrakcí spojené vodně-methanolické fáze převede do ethylenchloridu, jenž se pak promyje vodou a odpaří k suchu. Surový produkt, získaný výšeuvedeným způsobem, obsahuje cyklosporiny a může se účinněji čistit jednou z následujících chromátografických metod.

Podle postupu popsaného v americkém patentovém spisu

č. 4,117,118 se cyklosporinová směs nejprve přenese na kolonu

- 3 0 • 0 0

Sephadexu LH-20 a eluuje se methanolem. Pak se chromatografuje na koloně kysličníku hlinitého ve směsi toluenu a ethylacetátu (15 %) a pak na koloně silikagelu ve směsi chloroformu a ethanolu (2 %). I přes tuto opakovanou chromatografií není výsledný produkt čistý, ale je směsi cyklosporinu A a B.

0 00

Podobný chromatografický postup je popsán mezi jiným v americkém patentovém spisu č. 4,215,199, kde se hrubé čištění provádí na koloně silikagelu a jako eluentu se použije směs chloroformu a methanolu (v objemovém poměru 98:2). Eluát sé pak odpaří k suchu, odparek se rozpustí v methanolu a chromatografuje se na koloně Sephadexu LH-20 s methanolem jako eluentem. Eluované frakce se odpaří k suchu a odparek se rozpustí ve směsi chloroformu a methanolu (objemový poměr 98:2) a opět se podrobí chromatografií na silikagelu. Cyklosporin A se eluuje jako první. Odpařením příslušných dalších frakcí se získají čisté složky.

Podle německého patentového spisu č. DD 298276 se olejovitý surový produkt rozpustí v malém množství chloroformu a pak se chromatografuje na koloně kysličníku hlinitého s použitím chloroformu jako eluentu. Frakce, obsahující cyklosporin A, se odpaří ve vakuu, rozpustí v chloroformu a chromatografují se·na podobné koloně s chloroformem jako eluentem. Frakce, které obsahují aktivní látku, se opět odpaří ve vakuu. K odparku se přidá hexan a cyklosporin A se krystaluje. Produkt se promyje hexanem, vysuší se a nakonec se rekrystaluje ze směsi etheru a hexanu nebo acetonu.

Podle maďarského patentového spisu č. 201577 se surový produkt, získaný po odpaření, může přečistit na koloně silikagelu elucí směsí chloroformu a methanolu s postupně se zvyšující koncentrací methanolu. Chromatografický postup začíná s čistým chloroformem a pokračuje zvyšováním koncentrace methanolu v eluentu po 0,5% (objemových) krocích. Cyklosporin A se eluuje chloroformem obsahujícím 2 % objemová methanolu, cyklosporin B chloroformem obsahujícím 2,5 % objemových methanolu a

- 4 • * cyklosporin C chloroformem obsahujícím 3 % objemová methanolu. Odpařením příslušných frakcí se pak získají jednotlivé složky.

Výšeuvedené postupy popisují hlavně fermentační procedury, vedoucí k cyklosporinu, kde hlavním cílem purifikačních kroků je identifikace získaného produktu. Produkt je tedy izolován jen v malém množství a jsou udány pouze fyzikální a chemické charakteristiky, aniž by byly publikovány údaje o čistotě produktu a množství nečistot, které obsahuje.

Rúeger a spol. (Helv. Chim. Acta 59(4), 1075-1092 (1976)) izolovali pro identifikaci a strukturní analýzu malá množství čistého cyklosporinu A a C opakovanou chromatografií a jinými čisticími postupy. Podle této publikace surový produkt, získaný fermentací Trichoderma polysporum Rifai a obsahující hlavně cyklosporin A a C, se zbaví tuku methanolem a petroletherem.

Po odpaření se zbytek rozpustí v chloroformu a chromatografuj.e se gradientovou elucí směsí chloroformu a methanolu (v objemovém poměru 98,5:1,5). Čistý krystalický cyklosporin A se získá další chromatografií. Frakce, obsahující cyklosporin A, se rozpustí v methanolu a chromatografuje se na koloně Sephadexu LH-20 s použitím methanolu jako eluentu. Hlavní frakce se odpaří, odparek se rozpustí v toluenu a chromatografuje na kysličníku hlinitém za eluce toluenem s rostoucí koncentrací kyseliny octové. Krystalický produkt se získá po odpaření příslušných frakcí a přečištění aktivním uhlím v alkoholickém roztoku.

Čisticí postup, použitelný v průmyslovém měřítku, je popsán v americkém patentovém spisu č. 5382655. Podle tohoto postupu surový produkt, obsahující různé cyklosporinové složky, se podrobí tepelnému zpracování před tím, než se chromatografuje na koloně silikagelu ve směsích chloroform-dichlormethanethanol a chloroform-ethylacetát-ethanol. Získaný produkt se podrobí další chromatografií a rekrystalizací, čímž se obdrží čistý produkt, použitelný pro přípravu injekčních forem.

Čištění .surového produktu, obsahujícího směs cyklosporinů, je velmi obtížné, protože nečistoty mají podobné chemické struktury a mají velmi podobné chromatografické charakteristiky jako hlavní produkt, cyklosporin A. Uvedené postupy potvrzují, že bez ohledu na použitou směs rozpouštědel dochází k překryvu chromatografických pásů a že pro získání žádaných složek v čistém stavu jsou nutné další chromatografické nebo jiné purifikační kroky. Dosud známé čisticí postupy se obecně vyznačují nejen tím, že vyžadují velká množství rozpouštědel, ale také tím, že je nutno použít tří .'áž čtyř různých typů rozpouštědel nebo jejich směsí a dvou až tří typů kolonových náplní. V důsledku toho je při výrobě nutno použít.několik typů chromatografických technik a regeneračních metod, což činí potíže při vývoji jednoduchých, reprodukované zvládnutelných a ekonomických technologií v průmyslovém měřítku.

Z ekologického hlediska jsou nežádoucí chlorovaná rozpouštědla a stále více států se snaží omezit jejich .použití.

Co se týče materiálu pro náplň kolon, použití kysličníku hlinitého jako náplně pro průmyslové použití je velmi problematické, protože díky jeho malému specifickému povrchu* je zátěž a separační schopnost takových kolon velmi malá. Dále není kysličník hlinitý vhodný pro průmyslové využití proto, že je tuhý a křehký, a proto· vyžaduje speciální zařízení a technologii, která nemůže být použita v často 'vyprazdňovaných nerezových kolonách, které se běžně používají v chemickém průmyslu.

Náplně typu Sephadexu jsou velmi drahé a v případě cyklosporinových směsí je jejich účinnost velmi omezena, protože molekuly dělených sloučenin mají velmi podobnou velikost.

Podstata vynálezu

Podstata předloženého vynálezu spočívá ve vývoji chromatografické purifikační metody, která je snadno použitelná v průmyslovém měřítku a pomocí které je možno vyrábět cyklosporin A, obsahující mnohem méně nečistot než dosud, čímž se dosáhne větší bezpečnosti při použití v medicíně.

Cílem byl vývoj takové chromatografické purifikační technologie, která by vyžadovala jen jeden typ rozpouštědlové směsi a jeden typ kolonové náplně.

Jako kolonová náplň byl zvolen silikagel, a to pro své výhodné vlastnosti, jako je velký specifický povrch, vysoká pórovitost, příznivá sorbční schopnost,· snadná manipulace a relativně nízká cena.

K této náplni bylo nutno nalézt ideální metodu a ideální směs rozpouštědel, které by byly vhodné pro vysoce selektivní separaci cyklosporinových složek.

Pokusy ukázaly, že tento cíl může být realizován vícestupňovou chromatografii na koloně silikagelu a elucí směsí rozpouštědel,' jejíž hlavní složkou je toluen. Překvapivě bylo nalezeno, že, i cyklosporin U a L, které jsou cyklosporinu A nejbližší, mohou být separovány třístupňovou chromatografii na silikagelové koloně a elucí toluenem, obsahujícím aceton. Řečené složky se liší od cyklosporinu A pouze methylovou skupinou.

Podle prvního příkladu patentové aplikace č. WO 94/16091 se také používá směs toluenu a acetonu, ale v jednostupňové chromatografii. Získaný produkt se rekrystaluje ze směsi etheru a hexanu (výtěžek 66,6 %). Optická rotace produktu je sice dostatečná, ale teplota tání je výrazně nižší než je uvedeno v literatuře, což naznačuje, že produkt není čistý, a že tedy dokonce i rekrystalizací vznikne produkt o nízké čistotě a v nízkém výtěžku.

- 7 • »· • *fe · * * » · fefe ··

Postup podle předloženého vynálezu je vhodný pro separaci nejběžnějších nečistot jako cyklosporinu B a cyklosporinu C, které jsou nejvíce zastoupeny, a navíc i cyklosporinu D, U a L, které se vyskytují ve stopách. Obsah cyklosporinu B a C v konečném produktu cyklosporinu A, získaném postupem podle vynálezu, je méně než 0,02 % hmotnostních, zatímco obsah cyklosporinů L, U a D je pod 0,05 % hmotnostních.

Předmět předkládaného vynálezu je zlepšený postup pro čištění cyklosporinu A ze surového produktu, obsahujícího směs cyklosporinů, který umožňuje výrobu extrémně čistého cyklosporinu A ve velkém měřítku, pomocí chromatografické metody na koloně silikagelu, a to vícestupňové chromatografie s použitím směsi rozpouštědel, obsahující jako hlavní složku toluen. Dalším novým rysem postupu podle vynálezu je to, že se používá extrémně vysoká zátěž kolony. Při běžných chromatografíích není. množství násady na kolonu větší než 5-10 % náplně kolony, a pro cyklosporiny 'je to ještě méně.'

Vícestupňová chromatografie, směs rozpouštědel s toluenem jako hlavní složkou a vysoká kolonová zátěž spolu navzájem souvisí a žádaného vysoce čistého produktu j.e možno dosáhnout, pouze jejich kombinací.

Při postupu podle vynálezu se používá s výhodou 2-4 za sebou jdoucích chromatografických stupňů, s výhodou- tří stupňů.

Přetížení kolony je největší v prvním chromatografickém stupni, ale dobré oddělení aktivní složky od nečistot umožňuje přetížit kolonu i v následujících dvou stupních chromatografie.

Při čištěni podle vynálezu je výhodné používat směs toluenaceton, obsahující nejvýše 30 % objemová acetonu.

Jiné výhodné provedení postupu podle vynálezu je použití směsi toluen-ethylacetát, ve které je, koncentrace ethylacetátu nižší než 35 % objemových.

- 8 -hr- ----ΜΙ

Při čištění postupem podle vynálezu je výhodné alespoň jednou použít gradientovou elucí.

Pokusy ukázaly, že pro čištění cyklosporinové směsi podle vynálezu je výhodné použít 10-30 % objemových, lépe 13-18 % objemových acetonu, a 10-35 % objemových nebo 15-20 % objemových ethylacetátu.

Podle jiného provedení podle vynálezu se v případě třístupňové chromatografie provádí eluce toluenem.obsahujícím 15 % objemových acetonu nebo -1-8 % objemových ethylacetátu. V prvním stupni se oddělí hlavní podíl cyklosporinu C, ve druhém stupni se odstraní větší Část cyklosporinů B, L a U, a konečně ve třetím stupni se obsah cyklosporinů L a U a jiných neidentifikovaných nečistot může snížit pod 0,05 % hmotnostních. Zatímco ztráta cyklosporinu A v prvním stupni je minimální, v předních'frakcích druhé á třetí chromatografie se odstraní značné množství cyklosporinu A spolu s.cyklosporinem D, který je mu velmi podobný. Tento podíl cyklosporinu A se může získat zpět ve velmi čisté formě ve čtvrtém stupni.

Pro porovnání je v následující tabulce uveden obsah nečistot v cyklosporinu A podle USP standardu, obsah nečistot v injekčním lékovém prostředku SANDIMMUN*a obsah nečistot

v cyklosporinu A,	který byl	připraven	postupem podle	vynálezu.
Nečistota	USP	standard	SANDIMMUN®	Příklad 1
Cyklosporin C		-	0,17	0,05
Cyklosporin B		-	0,21	0, 05
Neidentifikované	sloučeniny	0,09	0,35	0,05
Cyklosporin L		0, 05	0,35	0, 05
Cyklosporin U		-	-	0, 05
Cyklosporin D		0,12	-	0,05

Z uvedených údajů je zřejmé, že kvalita cyklosporinu A získaného podle předloženého vynálezu podstatně převyšuje parametry injekčního preparátu SANDIMMUN® a převyšuje' dokonce i požadavky USP.

fcfc· · • · ·· «

Bfcfc *♦· fcfcfcfc ·♦ — Τ·

Postup podle vynálezu se dá aplikovat na čistění surového produktu v malém i ve velkém měřítku.

Vedle toho, že postup podle vynálezu poskytuje čistý cyklosporin A, má i nezanedbatelné technologické přednosti. Protože se používá pouze jeden typ technologické metody (chromatografie), je čistící.pochod jednotně proveditelný, nadto, je ho možno opakovat a může být převeden na kontinuální proces. Dále je postup podle vynálezu specielně výhodný v tom, .že se ve všech třech chromatografických stupních používá pouze jeden typ směsi rozpouštědel, a proto je regenerace kolonových náplní i rozpouštědel jednodušší.

Další zvláštní výhodu má postup v tom, že v prvním chromatografickém kroku zůstanou na koloně sloučeniny se silnou afinitou k náplni, což velmi usnadní regeneraci kolonových náplní v dalších dvou stupních.

Vynález je ilustrován následujícími příklady, aniž.by se jimi. omezoval jakkoliv jeho rozsah.

Srovnávací příklad (příklad 4) ukazuje, že při použití směsi dichlormethan-aceton, která byla dosud běžně užívána jako eluent ve známých postupech, ani třístupňová chromatografie neposkytla produkt o kvalitě srovnatelné s kvalitou konečného produktu, získaného postupem podle vynálezu.

Příklady provedeni vynálezu

Příklad 1

Čistění surového cyklosporinového produktu třístupňovou chromatografií s použitím směsi toluen-aceton jako eluentu

Složení výchozí Cyklosporin A Cyklosporin B Cyklosporin C Cyklosporin L Cyklosporin U Cyklosporin D surové cyklosporinové směsi:

60,9 % hmotnostních

11,2 % hmotnostních

8,3 % hmotnostních 1,79 % hmotnostních 1,58 % hmotnostních 1,25 % hmotnostních

J' «·· · *

4 4 • 4 44

- 104·«· ··

Stupeň 1

Chromatografie se provádí na dvou chromatografických kolonách s pláštěm, zapojených v sérii. Každá z nich má obsah 8 litru, průměr 10 cm a délku 100 cm. Každá kolona obsahuje 3,95 kg silikagelu. (Merck .Kieselgel, velikost částic 0, 04-0, 063 mm).

V prvé chromatografií obsahují obě kolony nový silikagel, v další chromatografií se prvá kolona .odpojí a připojí se k ní druhá kolona, obsahující čerstvou silikagelovou náplň. V každé další chromatografií se použije jenom jedna nová kolona.

Příprava surového produktu

4,1 kg surového produktu o čistotě 60,9 % hmotnostních se rozpustí v 15 litrech toluenu. Získá se tak 19 litrů roztoku, který se přivádí na vrch první kolony přes filtr rychlostí 2,4 litrů/hod. Po nanesení se materiál eluuje směsí aceton-toluen v objemovém poměru 13:87, až objem eluátu z druhé kolony činí 39 litrů. Obsah cyklosporinů v eluentu je analyzován chromatografií na tenké vrstvě (TLC). Frakce, které neobsahují cyklosporin se jímají jako odpad. Po zjištění cyklosporinů v eluátu se jímá 28 litrů eluátu jako hlavní frakce. Takto získaný meziprodukt I obsahuje 3,23 kg sušiny.

Složení je následují

Cyklosporin A Cyklosporin B Cyklosporin C Cyklosporin L Cyklosporin U Cyklosporin D

Výtěžek počítaný ha % hmotnostních 10,1 % hmotnostních

1.6 % hmotnostních

1.7 % hmotnostních 1,5 % hmotnostních

1,3 % hmotnostních klosporin A je 97 %.

Stupeň 2

Separace se provádí na 1 metr dlouhé osmilitrové koloně s pláštěm, která obsahuje 3,95 kg silikagelu (Merck Kieselgel 60; 0,015-0,040 mm).

««· 9 *9 ··«

- 11 * 9 999 9 9 * ·· · ,,. ·· ··

Asi 3 litry roztoku meziproduktu I, získaného v prvním stupni a obsahujícího 370 g sušiny, se aplikují na kolonu rychlostí 2,4 litrů/hod a pak se promyjí 1 litrem toluenu.

Po aplikaci na kolonu se materiál eluuje 10 litry směsi aceton-toluen (v objemovém poměru 15:85) a pak 20 litry směsi aceton-toluen (v objemovém poměru 25:75). Do objemu 17 litrů eluátu je průtok eluentu 2,4 litrů/hod a po 18 litrech se zvýší na 5 litrů/hod. Jednotlivé frakce se analyzují TLC. Frakce od 1 až do 11 litrů jsou odpad, frakce 12-19.litrů jsou považovány za kritické a jsou z nich odebrány vzorky, které se analyzují HPLC. Podle analýzy se považují za přední frakci, nebo se spojí s hlavními frakcemi. Po odpaření přední frakce se získá 80 g suchého materiálu. Frakce 20-25 litrů se spojí jako hlavní frakce. Frakce 26-31 litrů se považují opět za kritické a po analýze se buď spojí s hlavní frakcí nebo se považují za zadní frakcí.

Hlavní frakce, která se takto získá, se odpaří k suchu ve filmové odparce spojené s vibračním míchadlem. Získá se tak 234 g {80 %, meziproduktu II o následujícím složení:

Cyklosporin A Cyklosporin U Cyklosporin L Cyklosporin B Cyklosporin D Cyklosporin C

95 %	hmotnostních
1,2	%	hmotnostních
0,7	%	hmotnostních
<0,1	%	hmotnostních
0,5	%	hmotnostních
0,1	%	hmotnostních

Stupeň 3

Chromatografie se provede na kolonách stejné konstrukce a geometrických parametrů jak jsou popsány v prvním a druhém stupni.

Z meziproduktu II, získaného ve stupni 2, se připraví 1,7 litru toluenového roztoku, obsahujícího 220 g suchého materiálu, a tento roztok se uvádí na vrch kolony rychlostí 2,4 litrů/hod. Pak se promyje 1 litrem toluenu.

• ·· · φ φ ·· ·*

- 12φφφφ *· • * • · • · φφφ »··

Kolona se eluuje 20 litry směsi aceton-toluen v objemovém poměru 15:85 a pak 20 litry směsi aceton-toluen v objemovém poměru 25:75. Do 31 litrů eluátu je průtok 2,4 litrů/hod a od 32 litrů se zvýší na 5 litrů/hod. Prvních 18 litrů je odpad, frakce 19-23 litrů jsou přední kritické frakce I. Vzorky frakcí se analyzují HPLC na obsah sušiny a nečistot a podle výsledku analýzy se považují za přední frakci nebo se spojí s hlavní frakcí. Frakce 29-38 litrů se spojí jako hlavní frakce. Frakce 39-41 litrů se jímají po litrových porcích a jsou považovány za kritické frakce II. Podle výsledků analýzy se buď spojí s hlavní frakcí nebo se považují za zadní frakci.

Po odpaření k suchu se celkem získá g přední frakce.

Spojená hlavní frakce po odpaření k suchu poskytne 157 g čistého cyklosporinu ve výtěžku 75 %. Složení produktu je následující:

Cyklosporin A Cyklosporin L Cyklosporin U Cyklosporin D Cyklosporin B Cyklosporin C

99,6 % hmotnostních <0,05 % hmotnostních <0,05 % hmotnostních <0,05 % hmotnostních <0,02 % hmotnostních <0,02 % hmotnostních

Příklad 2 ....

Chromatografické čištění surového cyklosporinového produktu ve čtyřech stupních na koloně silikagelu s pevným dnem s použitím směsí toluen-aceton nebo toluen-ethylacetát

Surový cyklosporinový produkt se přečistí třístupňovou chromatografií, jak je popsáno v příkladu 1. Přední frakce, získané ve třech chromatografických stupních, se přečistí ve čtvrtém stupni s použitím směsi toluen-ethylacetát.

Stupeň 4

Konstrukce a geometrické parametry chromatografické kolony jsou stejné jako je popsáno v příkladu 1. Kolona je naplněna

- 13 4 4 4

4444 ·· • · • » ·

444 444 » » • 4 · 4 ·

4 4 ♦ 4 44 silikagelem Merck Kieselgel 60 (0,015-0,040mm), jak je popsáno v příkladu 1.

260 g koncentrátu získaného z předních frakcí se rozpustí ve 2,5 litrech toluenu a roztok se nanese na kolonu rychlostí 2,4 litrů/hod. Koncentrát obsahuje 80,6 % hmotnostních cyklosporinu A a 4,2 % hmotnostních cyklosporinu D. Po promytί 1 litrem toluenu se kolona eluuje 20 litry směsi ethylacetát-toluen (v objemovém poměru 17:83) rychlostí 2,4 litrů/hod a pak 40 litry směsi ethylacetát-toluen {v objemovém poměru 28:72).

Frakce 1 až 19 litrů jsou odpad. Frakce 20-25 litrů se podle výsledku HPLC analýzy buď považují za odpad nebo se spojí s hlavnífrakcí. Frakce 26-35 litrů se jímají jako hlavní frakce. Frakce 36-42 litrů se podle výsledků HPLC analýzy buď spojí s hlavní frakcí.nebo se považují za odpad. Hlavní frakce (frakce 23-42 litrů) se odpaří k suchu, čímž se získá 195 g (výtěžek 75 %) cyklosporinu A o čistotě 99,6 % hmotnostních následujícího složení:

Cyklosporin A 99,6 % hmotnostních

Cyklosporin D <0,05 % hmotnostních

Cyklosporin U .Cyklosporin L

Příklad 3

Chromatografícké čištění surového cyklosporinového produktu ve dvou stupních na koloně silikagelu s pevným dnem s použitím směsi toluen-aceton

Cyklosporinový surový produkt se přečistí jak je popsáno ve stupni 1 v příkladu 1. Získá se cyklosporinový meziprodukt I stejné kvality, jaká je uvedena v příkladu 1. Dále se postupuje následovně:

Stupeň 2

Na kolonu se aplikují 3 litry roztoku meziproduktu I, obsahujícího 370 g suchého materiálu, a to rychlostí 2,4 litrů/hod. Pak se vzorek promyje jedním litrem toluenu.

- 14Kolona se eluuje 10 litry směsi aceton-toluen {v objemovém poměru 15:85) a pak 20 litry směsi aceton-toluen (v objemovém poměru 25:75). Do 17 litrů eluátu je průtok 2,4 litrů/hod, od litrů je průtok 5 litrů/hod.

· • · •44 444 · ·

4 4

Podle TLC a HPLC analýzy jsou frakce 1-11 litrů odpad, frakce 12-20 litrů jsou přední frakce, frakce 21-24 litrů jsou hlavní frakce a frakce od 25 výše jsou zadní frakce. Frakce vymyté acetonem jsou odpad.

Hlavní frakce se spojí a odpaří k suchu, čímž se získá 114 g cyklosporinu A ve výtěžku 41 % a v téže vysoké kvalitě, jaká je uvedena v příkladu 1.

Příklad 4

Srovnávací příklad čištění surového produktu třístupňovou chromatografii s použitím směsi dichlormethan-aceton

Složení výchozího surového cyklosporinového produktu je následující (stejné

Cyklosporin A Cyklosporin B Cyklosporin C Cyklosporin L Cyklosporin U Cyklosporin D jako v příkladu 1):

60,9 % hmotnostních

11,2 % hmotnostních

Stupeň 1

Chromatografické vybavení a náplň jsou stejné jako v příkladu 1. Na jeden pár kolon, zapojených v sérii, se aplikuje 4,1 kg surového produktu o čistotě 60,9 % v 15 litrech dichlormethanu.

Po aplikaci se kolona eluuje dichlormethanem rychlostí

2,4 litrů/hod a jímá se 35 litrů eluátu.

Frakce 1-10 litrů jsou odpad, frakce 11-35 litrů se považují za hlavní frakci. Takto získaný meziprodukt I obsahuje 2,9 kg sušiny a 75 % hmotnostních aktivní složky.

- 15 4·· · ·· • 44 ··♦ ··* 4 · * · · «4 4*>

Stupeň 2

Chromatografické vybavení a náplň jsou tytéž jako v příkladu 1.

Na vrch kolony se aplikují 3 litry meziproduktu I, obsahujícího 350 g sušiny, rychlostí 2,4 litrů/hod. Eluce se provádí 10 litry směsi aceton-dichlormethan (v objemovém poměru 1:9), pak 25 litry směsi aceton-dichlomethan (v objemovém.poměru 2:8), a nakonec acetonem. Průtok je 2,4 litrů/hod.

Podle HPLC analýzy je objem přední frakce 13.litrů, objem hlavní frakce 22 litrů a objem zadní frakce 11 litrů. Hlavní frakce (22 litrů) se odpaří k suchu, čímž- se získá 220 g meziproduktu II o čistotě 91 %.

Stupeň 3

Chromatografické vybavení a náplň jsou tytéž jako je popsáno v příkladu 1

Na kolonu se aplikuje dichlormethanový koncentrát 220 g meziproduktu II rychlostí 2,4 lí.trů/hod.. Eluce se provádí rychlostí 2,4 litrů/hod, a to 20 litry směsi acetondichlormethan (v objemovém poměru 1:9), pak 30 litry směsi aceton-dichlormethan (v objemovém poměru 2:8) a nakonec acetonem.

Prvních 26 litrů eluátu se považuje za přední frakce, dalších 2 6 litrů za hlavní 'frakci a konečně 11 litrů za zadní frakce.

Hlavní frakce (26 meziproduktu III,

Cyklosporin A Cyklosporin U Cyklosporin D Cyklosporin L Cyklosporin B Cyklosporin C litrů) se odpaří k suchu, čímž se získá 140 g který má následující složení: .

93,6 % hmotnostních 0,6 % hmotnostních 0,3 % hmotnostních 0,2 % hmotnostních 0,1 % hmotnostních 0,1% hmotnostních • 4 • 4 4 ·· »4

1ψ V/y-ů

Claims

PATENTOVÉ NÁROKY

- 164 ·

4«· *·♦

1. Purifikační postup pro přípravu vysoce čistého cyklosporinu A ze surového produktu, obsahujícího cyklosporinovou směs, pomocí chromatografické metody na silikagelově koloně, který se vyznačuje tím, že se.použije vícestupňová chromatografie ve směsi rozpouštědel, obsahující jako hlavní složku toluen.
2. 'Postup podle nároku 1, vyznačující se tím, že se provedou 2-4 následné chromatografické stupně.
3. Postup podle nároku 1, vyznačující se tím, že se provedou 3 následné chromatografické .stupně.
4. Postup podle nároku 1, vyznačující se tím, že se jako směs rozpouštědel použije směs toluen-aceton.
5. Postup podle nároku 4, vyznačující se tím, že se použije toluen, obsahující nejvýše 30 % acetonu.
6. Postup podle nároku 1, vyznačující se tím, že se jako směs rozpouštědel použije směs toluen-ethylacetát.
7. Postup podle nároku 6, vyznačující se tím, že se použije toluen, obsahující nejvýše 35 % objemových .ethylacetátu.
8. Postup podle nároku 1, vyznačuj·.ící se tím, že se., nejméně v jednom chromátografickém stupni použije gradientově eluce.
9. Vysoce čistý cyklosporin A, vyznačující se tím, že obsahuje méně než 0,05 %. hmotnostních cyklosporinu L, cyklosporinu U a cyklosporinu D a méně než 0,02 % hmotnostních cyklosporinu B a cyklosporinu C.

- 17• · · • * · · · « · · • · · · • · • · * · ·» ···
10. Postup v průmyslovém měřítku pro čištění cyklosporinu A z cyklosporinové směsi, obsahující surový produkt, s použitím chromatografické metody na šilikagelové koloně, který se vyznačuje tím, že se použije vícestupňové chromatografie na koloně s normální fází silikagelu ve směsi rozpouštědel, obsahující jako hlavní složku toluen.
11. Kterýkoli z postupů podle nároku 1 nebo 10, který se vyznačuje tím, že cyklosporinové směs, použitá jako výchozí materiál chromatografie, se před ehromatografií zahřeje na 80-120 ^eC.
12. Kterýkoli z postupů podle nároku 1 nebo 10, který se vyznačuje tím, že se použije toluenu s obsahem 10-30 % acetonu.
13. Kterýkoli z postupů podle nároku 1 nebo 10, k t e r ý se vyznačuje, t i m, že se použije .toluenu s .obsahem 10-35 % objemových ethylacetátu.