PL194252B1 - Sposób oczyszczania w procesie wytwarzania cyklosporyny A i sposób na skalę przemysłową oczyszczania cyklosporyny A oraz cyklosporyna A o dużej czystości - Google Patents

Abstract

1. Sposób oczyszczania w procesie wytwarzania cyklosporyny A, z duza czystoscia z surowego produktu zawierajacego kompleks cyklosporyny metoda chromatograficzna w kolumnie wypelnionej zelem krzemionkowym, znamienny tym, ze stosuje sie wielostopniowa chromatografie przy uzyciu mieszaniny rozpuszczalników zawierajacej toluen jako glówny skladnik. 9. Cyklosporyna A o duzej czystosci, znamienna tym, ze zawartosc cyklosporyny L, cyklospo- ryny U i cyklosporyny D jest mniejsza niz 0,05% wag. i zawartosc cyklosporyny B i C jest mniejsza niz 0,02% wag. PL PL PL PL PL PL PL PL PL

Description

Przedmiotem wynalazku jest sposób oczyszczania w procesie wytwarzania cyklosporyny A i sposób na skalę przemysłową oczyszczania cyklosporyny A oraz cyklosporyna A o dużej czystości. Jest to sposób chromatograficznego oczyszczania cyklosporyny A z surowego produktu zawierającego kompleks cyklosporyny przy użyciu kolumny wypełnionej żelem krzemionkowym i zastosowaniu wielostopniowej chromatografii w kolumnie wypełnionej żelem krzemionkowym z fazą normalną i mieszaniny rozpuszczalnika zawierającej toluen jako główny składnik.

Cyklosporyny są cyklicznymi undekapeptydami N-metylowanymi w kilku miejscach i większość z nich wykazuje potwierdzone efekty farmakologiczne. 25 związków z tej grupy jest znanych dotychczas i oznaczone są literami A do Z. Na początku wydzielono z nich cyklosporynę A, która jest naturalną substancją wyizolowaną z bulionowej hodowli szczepu Tolypocladium inflatum Gams (Helv. Chim. Acta 59, 1075/1976/). Ten pierwszy związek stał się znany jako antybiotyk o słabych własnościach grzybobójczych, późniejsze przyciągnęły uwagę ze względu na efekt immunopresyjny (J. F. Borel i in.: Immunology 32 1017/1977/). Z tego względu stosowano je głównie do przeszczepu organów od innych osób (płuco, serce, nerka, szpik kostny, skóra). Badania farmakologiczne wykazały, że inhibituje lub hamuje ona zarówno humoralne jak i komórkowe odpowiedzi immunologiczne przesłaniając proliferację komórek T i przerywając syntezę interleukiny-2. Później wyjaśniono, że jest ona skuteczna w różnego rodzaju chorobach autoimmunizacyjnych i zapalnych, takich jak autoimmunizacyjne choroby hematologiczne, zapalenie okrężnicy ropiejące, choroba Gravesa, stwardnienie rozsiane, łuszczyca, jak również zapalenie stawów gośćcowe. Następnie przeprowadzono również doświadczenia z leczeniem infekcji spowodowanej przez pierwotniaki i nowotwory. Na znaczenie grupy tych związków wskazuje fakt, że wytworzono liczne syntetyczne związki pokrewne przez wbudowanie w różne aminokwasy i substytuty (np. patenty EP 56782, szwajcarski 630062 i EP 29122).

Główną część cyklosporyn wytworzono na drodze fermentacji. Przykładowo jako kolonię mikroorganizmów stosowano Cylindrocarpon Lucidum Booth (szwajcarski opis patentowy nr 589716); Trichoderma polysporum Rifai (szwajcarski opis patentowy nr 603790) ; Tolypocladium varium (węgierski opis patentowy nr 201577). Pod koniec fermentacji powstaje kompleks cyklosporyny, który zawiera także inne zanieczyszczenia (składniki pożywki hodowlanej, środki przeciw spienianiu, metabolity, itp.) zależnie od charakteru procesu.

Produkt wydziela się na ogół z bulionu metodą ekstrakcji. Można to osiągnąć przez oddzielenie grzybni od bulionu przez odwirowanie lub filtrację, następnie rozpuszczenie aktywnego składnika grzybni w metanolu lub acetonie i ekstrakcję przesączu nie mieszającymi się z wodą rozpuszczalnikami. Innym znanym sposobem realizacji jest proces bez filtracji, z zastosowaniem ekstrakcji całego bulionu nie mieszającym się z wodą rozpuszczalnikiem organicznym. Rozpuszczalnik zawierający fazę organiczną odparowywany jest metodą destylacji próżniowej. Jednakże podczas ekstrakcji organicznym rozpuszczalnikiem przenoszone są do fazy organicznej również związki o charakterze lipidowym, co stwarza trudności w późniejszym oczyszczaniu. Znane są procesy oddzielania tych związków (np. szwajcarski opis patentowy nr 589716 lub opublikowane niemieckie zgłoszenie patentowe nr 2455859), zgodnie z którymi po usunięciu rozpuszczalnika ekstrakcyjnego pozostałość rozpuszcza się w mieszaninie metanol-woda i następnie ekstrahuje kilkakrotnie taką samą objętością eteru naftowego. Frakcje eteru naftowego łączy się i cyklosporyny odzyskuje się z nich stosując mieszaninę metanol-woda. Metodą wielostopniowej ekstrakcji aktywną substancję przenosi się z połączonej fazy metanol-woda do chlorku etylenu, który następnie przemywa się wodą i odparowuje do suchej masy. Wytworzony tą metodą surowy produkt zawierający cyklosporyny można oczyszczać bardziej skutecznie jedną z metod chromatograficznych.

Zgodnie z metodą wskazaną w opisie patentowym St. Zjedn. Ameryki nr 4117118, mieszaninę cyklosporyny przenosi się najpierw do kolumny Sephadex LH-20 i eluuje metanolem, następnie w kolumnie wypełnionej tlenkiem glinu eluuje się kolejno mieszaniną toluenu i octanu etylu (15%) i w kolumnie wypełnionej żelem krzemionkowym eluuje się mieszaniną chloroformu i etanolu (2%). Pomimo powtórnego oczyszczania chromatograficznego uzyskany produkt nie jest czysty, lecz jest mieszaniną cyklosporyny A i B.

Podobny sposób chromatograficzny ujawniono między innymi w opisie patentowym St. Zjedn. Ameryki nr 4215199, zgodnie z którym wstępne oczyszczanie przeprowadza się w kolumnie wypełnionej żelem krzemionkowym z zastosowaniem mieszaniny chloroformu i metanolu 98:2% obj. Eluat odparowuje się następnie do suchej masy. Pozostałość rozpuszcza się w metanolu i oczyszcza chroPL 194 252 B1 matograficznie w kolumnie Sephadex LH-20 z zastosowaniem metanolu jako eluentu. Frakcje eluentu odparowuje do suchej masy, a następnie pozostałość rozpuszcza się w mieszaninie chloroform:metanol w stosunku 98:2% obj. Potem ponownie przeprowadza się chromatografię na żelu krzemionkowym. Cyklosporyna A pojawia się jako pierwszy eluat. Tę i kolejne frakcje oddziela się i czyste składniki otrzymuje się przez odparowanie eluatów.

Zgodnie z niemieckim opisem patentowym nr DD 298276 oleisty, surowy produkt rozpuszcza się w małej ilości chloroformu, a następnie poddaje się chromatografii w kolumnie wypełnionej tlenkiem glinu z zastosowaniem chloroformu. Frakcje zawierające cyklosporynę A odparowuje się pod zmniejszonym ciśnieniem, rozpuszcza w chloroformie, wprowadza do podobnej kolumny i następnie eluuje chloroformem. Frakcje zawierające aktywne substancje odparowuje się ponownie pod zmniejszonym ciśnieniem. Do pozostałości dodaje się heksanu i cyklosporynę A krystalizuje się. Produkt przemywa się heksanem i osusza, a na koniec krystalizuje z mieszaniny eteru i heksanu lub acetonu.

Zgodnie z węgierskim opisem patentowym nr 201577 uzyskany surowy produkt otrzymany po odparowaniu można oczyszczać w kolumnie wypełnionej żelem krzemionkowym eluując mieszaniną chloroformu i metanolu stopniowo zwiększając stężenie metanolu. Proces rozpoczyna się czystym chloroformem i kontynuuje zwiększając o 0,5% obj. zawartość metanolu w eluacie. Cyklosporyna A eluuje przy 2% obj., cyklosporyna B przy 2,5% obj., cyklosporyna C przy 3% obj. metanolu w chloroformie z kolumny. Składniki otrzymano przez odparowanie frakcji.

Wspomniane powyżej procesy opisano głównie dla procedur fermentacji cyklosporyny, gdzie zasadniczym celem jest oczyszczanie w celu identyfikacji otrzymanego produktu. Produkt wydziela się tylko w małych ilościach i podane są tylko właściwości fizyczne i chemiczne bez publikowania danych dotyczących czystości produktu i ilości zanieczyszczeń.

Rϋeger i Co./Helv. Chim. Acta 59(4), p. 1075-92 (1976) wydzielili małe ilości czystej cyklosporyny A i C przez powtarzalne chromatografie i inne etapy oczyszczania w celu identyfikacji i analizy strukturalnej. Zgodnie z tym artykułem surowy produkt otrzymany przez fermentację Trichoderma polysporum Rifai zawierający głównie cyklosporyny A i C odtłuszczono metanolem i eterem naftowym. Po odparowaniu pozostałość rozpuszczono w chloroformie i poddano chromatografii eluując gradientem mieszaniny chloroformu i metanolu jako eluentu w stosunku 98,5:1,5 obj./obj. Metodą chromatografii otrzymano następnie czystą krystaliczną cyklosporynę A. Frakcję zawierającą cyklosporynę A rozpuszczono w metanolu i poddano chromatografii w kolumnie Sephadex LH-20 stosując metanol jako eluent. Frakcje szczytowe odparowano, rozpuszczono w toluenie i poddano chromatografii w kolumnie wypełnionej tlenkiem glinu, z zastosowaniem toluenu jako eluentu, w obecności kwasu octowego w zwiększanych stężeniach. Krystaliczny produkt otrzymano po odparowaniu frakcji i obróbce węglem aktywowanym w roztworze alkoholowym.

Proces oczyszczania realny w skali przemysłowej wskazano w opisie patentowym St. Zjedn. Ameryki nr 5382655. Zgodnie z tym procesem, surowy produkt zawierający różne składniki cyklosporyny poddano obróbce cieplnej przed chromatografią w kolumnie wypełnionej żelem krzemionkowym z zastosowaniem mieszanin dichlorometan i chloroform-octan etylu-etanol. Otrzymany produkt poddano następnie chromatografii i rekrystalizacji, co dało czysty produkt o jakości dobrej do injekcji.

Oczyszczanie surowego produktu zawierającego mieszaninę cyklosporyn jest bardzo trudne, ponieważ zanieczyszczenia o podobnej budowie chemicznej są bardzo podobne pod względem charakterystyk chromatograficznych do cyklosporyny A jako głównego produktu. Jak dowodzą tego opisane uprzednio procesy, bez względu na stosowaną mieszaninę rozpuszczalników i w celu otrzymania niektórych składników w czystej formie konieczne jest przeprowadzanie następnych etapów chromatograficznego lub innego oczyszczania. Znane dotychczas procesy oczyszczania charakteryzuje nie tylko fakt, że zapotrzebowanie na rozpuszczalnik jest znaczne, jak również niezbędne jest zastosowanie 3-4 różnych typów rozpuszczalników lub mieszanin rozpuszczalników i 2-3 rodzajów wypełnienia kolumn. Wkonsekwencji trzeba stosować kilka rodzajów technik chromatograficznych i regeneracji w jednym procesie, co stwarza trudności w opracowaniu ekonomicznej technologii przemysłowej z prostą aparaturą.

Stosowanie chlorowanych węglowodorów stwarza również problemy z punktu widzenia ochrony środowiska, gdyż w coraz większej ilości krajów czynione są wysiłki w celu ograniczenia ich zastosowania.

Z punktu widzenia materiałów wypełniających kolumny, zastosowanie tlenku glinu dla celów przemysłowych jest bardzo wątpliwe, ponieważ w konsekwencji jego małej powierzchni właściwej bardzo mała jest możliwość obciążenia i zdolność rozdzielenia. Ponadto, zastosowanie tlenku glinu

PL 194 252 B1 dla celów przemysłowych nie jest korzystne gdyż to wypełnienie jest sztywne i łatwo się kruszy, a zatem wymaga specjalnej aparatury i technologii. Nie może być on zatem stosowany w często opróżnianych kolumnach ze stali kwasoodpornej stosowanych na ogół w przemyśle chemicznym.

Wypełnienia typu Sephadex są bardzo drogie i w przypadku kompleksu cyklosporyny ich efektywność jest bardzo ograniczona, ponieważ wymiar cząsteczek jest bardzo zbliżony do siebie.

Przedmiotem niniejszego wynalazku jest opracowanie łatwej do zastosowania w skali przemysłowej metody chromatograficznego oczyszczania, nadającej się do wytwarzania cyklosporyny A zawierającej mniej zanieczyszczeń, a zatem do zastosowania w praktyce medycznej w bezpieczny sposób.

Naszym celem jest opracowanie takiej technologii chromatograficznego oczyszczania, która wymaga jedynie jednego typu mieszaniny rozpuszczalnikowej i jednego typu wypełnienia kolumny.

Jako wypełnienie kolumny zastosowano żel krzemionkowy z uwagi na jego korzystne właściwości, to jest dużą powierzchnię właściwą, duży wymiar porów, korzystną zdolność sorpcyjną, łatwość operowania i względnie niską cenę. Dobrano odpowiednią mieszaninę rozpuszczalników i sposób wypełnienia, odpowiedni do rozdzielenia składników cyklosporyny z dużą selektywnością.

W wyniku naszych doświadczeń stwierdziliśmy, że nasz cel można osiągnąć na drodze wielostopniowej chromatografii w kolumnie wypełnionej żelem krzemionkowym z zastosowaniem mieszaniny rozpuszczalników jako eluentu, w której głównym składnikiem jest toluen. Nieoczekiwanie odkryto, że cyklosporyna U i L, tj. składniki najbliższe cyklosporynie A można oddzielać metodą trzystopniowej chromatografii w kolumnie wypełnionej żelem krzemionkowym z zastosowaniem toluenu zawierającego aceton jak eluentu. Te składniki różnią się od cyklosporyny A jedynie grupą metylową.

Zgodnie z pierwszym przykładem zgłoszenia nr WO 94/16091 mieszaninę rozpuszczalników toluenu i acetonu stosuje się również w pojedynczym etapie. Otrzymany produkt rekrystalizuje się z mieszaniny rozpuszczalników eteru i heksanu. (Wydajność: 66,6%). Skręcalność optyczna produktu jest wystarczająca, lecz jego temperatura topnienia jest znacznie niższa niż opisana w literaturze, co oznacza, że produkt nie jest czysty. Nawet rekrystalizacja z rozpuszczalnika będzie dawała produkt o małej czystości i z małą wydajnością.

Z opisu patentowego WO 96/12031 znane jest otrzymywanie cyklosporyny A, której czystość określano teoretycznie jako czystość końcową około 100%.

Z analizy przykładów wykonania tego sposobu wynika, że w pojedynczym etapie chromatografii jako jedyny eluent stosuje się octan etylu, przy 3,4% obciążeniu kolumny. Otrzymuje się produkt z wydajnością 66,6%.

Produkt ten po rekrystalizacji wykazuje skręcalność optyczną satysfakcjonującą, ale oznaczona temperatura topnienia jest dużo niższa niż to wskazuje literatura fachowa. Ta obniżona temperatura topnienia wskazuje, że produkt nie jest dostatecznie czysty i zawiera wciąż dodatkowe zanieczyszczenia.

Po rekrystalizacji, produkt wykazuje skręcalność optyczną satysfakcjonującą, ale obniżona temperatura topnienia, w stosunku do wskazywanej w literaturze fachowej, wskazuje, że cyklosporyna A nie jest dostatecznie czysta i następne krystalizacje lub chromatografie są niezbędne do otrzymania czystego produktu.

W opisie tego sposobu oczyszczania cyklosporyny A wskazano, że frakcje zawierające czystą cyklosporynę A były zbierane do następnego traktowania. Z tego wynika, że frakcje pre-, główna i post- są wybrane pomiędzy frakcjami zebranymi po eluowaniu kolumny. Główna frakcja jest wydzielana i zawiera „czystą cyklosporynę A. Ta główna frakcja jest ponownie oczyszczana, przez krystalizację, która jest dodatkowym etapem oczyszczania. Rekrystalizacja powoduje również stratę około 10-15% materiału.

W tym znanym sposobie nawet nie wspomniano o wielkim problemie podczas oczyszczania cyklosporyny A tj. o zanieczyszczeniach innymi cyklosporynami takimi jak cyklosporyna L, U, D, B i C, które są bardzo trudne do usunięcia. Cyklosporyny U i L różnią się od cyklosporyny A jedynie grupą metylową.

Podanie tylko temperatury topnienia i skręcalności dla produktu, w znanym z opisu patentowego WO 96/12031 sposobie, bez wspomnienia nawet o cyklosporynie L, U, D i B, które są zawarte wtym produkcie, wskazuje, że te pomiary były robione dla nich wszystkich razem.

Czystość wyrażona we wszystkich przykładach w tym sposobie jako „98,5-100% bardzo mocno sugeruje, że prawdziwa czystość produktu nie jest określona dla wszystkich przykładów a jedynie uśredniona.

PL 194 252 B1

Poziom czystości cyklosporyny A osiągnięty dzięki zastosowaniu sposobu oczyszczania cyklosporyny A według wynalazku był nieznany i nieosiągalny przy zastosowaniu znanych ze stanu techniki sposobów. We wszystkich publikacjach kładzie się nacisk na to, że cyklosporyna A jako produkt naturalny jest typowo zanieczyszczona innymi formami cyklosporyn, które są ekstremalnie trudne do oddzielenia od cyklosporyny A.

W sposobie według wynalazku rozdzielono te formy cyklosporyn (cyklosporyny L, U, D, B i C, wskazując ich zawartość w produkcie) w procesie jedynie chromatografii według wynalazku, z minimalnymi stratami produktu uzyskując bardzo dobrą wydajność i czystość poszczególnych cyklosporyn, a zwłaszcza cyklosporyny A.

Sposób według niniejszego wynalazku stosuje się do oddzielenia najczęstszych zanieczyszczeń cyklosporyny A takich jak cyklosporyny B i C występujące w największych ilościach i ponadto cyklosporyny D, U i L występujące w ilościach śladowych. Zawartość cyklosporyny B i C w końcowym produkcie cyklosporynie A uzyskanej tym sposobem jest mniejsza niż 0,02% wag., podczas gdy cyklosporyny L, U i D wynosi poniżej 0,05% wag.

Przedmiotem naszego wynalazku jest ulepszony sposób oczyszczania cyklosporyny A z surowego produktu zawierającego kompleks cyklosporyny, umożliwiający również wytwarzanie bardzo czystej cyklosporyny A w dużej skali, z zastosowaniem chromatograficznej metody w kolumnie wypełnionej żelem krzemionkowym metodą wielostopniowej chromatografii przy użyciu mieszaniny rozpuszczalników zawierającej toluen jako główny składnik. Inną nową cechą tego sposobu jest to, że stosuje się bardzo duże obciążenie kolumny. W typowej praktyce chromatograficznej obciążenia kolumny nie przekraczają 5-10% ładunku kolumny i wartość ta jest niższa dla cyklosporyn.

Wielostopniowa chromatografia, mieszanina rozpuszczalników zawierająca toluen jako główny składnik i duże obciążenia kolumny są powiązane (związane ze sobą) i pożądany wynik można osiągnąć jedynie łącząc je razem. Wszystkie te trzy powyższe cechy trzeba więc stosować jednocześnie wcelu uzyskania bardzo czystego produktu.

Zgodnie z niniejszym wynalazkiem stosuje się korzystnie 2-4 stopniową chromatografię, a korzystniej trzystopniową.

Przeciążenie kolumny jest najwyższe w pierwszym stopniu chromatograficznym. Określone rozdzielenie aktywnej substancji i zanieczyszczeń umożliwia również zastosowanie dużego obciążenia kolumny w późniejszych dwóch etapach chromatografii.

Do oczyszczania korzystne jest zastosowanie mieszaniny rozpuszczalników toluen-aceton, zawierające co najwyżej 30% obj. acetonu.

Zgodnie z inną korzystną metodą stosuje się mieszaninę rozpuszczalników toluen-octan etylu, w której stężenie octanu etylu wynosi poniżej 35% obj.

W procesie oczyszczania korzystne jest stosowanie eluowania, co najmniej jednym gradientem.

Zgodnie z naszymi doświadczeniami stwierdzono, że do oczyszczania kompleksu cyklosporyny poddawanego obróbce w naszym przypadku, korzystne jest zastosowanie 10-30% obj. i korzystniej 13-18% obj. acetonu i 10-35% obj. lub 15-20% obj. octanu etylu.

Zgodnie z możliwym sposobem według wynalazku eluowanie przeprowadza się w przypadku trzystopniowej chromatografii przy użyciu toluenu zawierającego 15% obj. acetonu lub 18% obj. octanu etylu. W pierwszym etapie oddziela się część cyklosporyny C, w drugim etapie usuwa się większą część cyklosporyny B, L i U i w końcu w trzecim etapie może być zmniejszona ilość składników L i U i innych niezidentyfikowanych zanieczyszczeń do poniżej 0,05% obj. Strata cyklosporyny A w pierwszym etapie jest minimalna, jednakże we wstępnych frakcjach drugiego i trzeciego etapu znaczne ilości cyklosporyny A zostają usunięte wraz z cyklosporyną D bardzo zbliżoną do cyklosporyny A. Ta cyklosporyna A może zatem być odzyskiwana w bardzo czystej formie w czwartym etapie.

W poniższej tabeli podano dla porównania zakres zanieczyszczeń cyklosporyny A według wzorca USP, cyklosporyny A jako aktywnego składnika do injekcji SANDIMMUN®i jak również dane dotyczące cyklosporyny A będącej produktem wytworzonym według niniejszego wynalazku.

PL 194 252 B1

	Wzorzec USP	SANDIMMUN®	Produkt według przykładu l
Zanieczyszczenia	% wag.	% wag.	% wag.
Cyklosporyna C	-	0,17	0,05
Cyklosporyna B	-	0,21	0,05
Nieznane	0,09	0,35	0,05
Cyklosporyna L	0,05	0,35	0,05
Cyklosporyna U	-	-	0,05
Cyklosporyna D	0,12	-	0,05

Na podstawie tych danych można stwierdzić, że jakość cyklosporyny A otrzymanej sposobem według niniejszego wynalazku znacznie przekracza parametry preparatu do injekcji SANDIMMUN®, aponadto przekracza również wymagania USP.

Sposób według niniejszego wynalazku nadaje się do oczyszczenia surowego produktu zarówno w małej jak i dużej skali.

Oprócz tego, że sposób według wynalazku nadaje się do wytwarzania czystej cyklosporyny A, to ma on również znaczące zalety technologiczne. Ze wzglądu na to, że zastosowano tylko jedną metodę technologiczną (chromatografię), proces oczyszczania można prowadzić w sposób jednolity, ponadto jest on powtarzalny i może być zmieniony w proces ciągły. Oprócz tej dodatkowej zalety i zuwagi na to, że zastosowano mieszaninę rozpuszczalników tylko jednego typu w trzech etapach chromatografii, regeneracja zarówno kolumn jak i rozpuszczalników staje się łatwiejsza.

Kolejną specjalną zaletą tego sposobu jest fakt, że w pierwszym etapie chromatografii silnie wiążące zanieczyszczenia pozostają na kolumnie, co znacznie ułatwia regenerację wsadu kolumny w późniejszych dwóch etapach.

Wynalazek przedstawiono w poniższych przykładach, nie ograniczając zakresu ochrony.

W przykładzie porównawczym (przykład lV) wskazano, że zastosowanie mieszaniny rozpuszczalników dichlorometan-aceton w 3 etapowej chromatografii stosowanej na ogół w znanych procesach, nie można otrzymać końcowego produktu z podobną czystością.

Przykład l

Oczyszczanie cyklosporyny z surowego produktu metodą trzystopniowej chromatografii z zastosowaniem mieszaniny rozpuszczalników toluen-aceton

Jakość surowego produktu wyjściowej cyklosporyny:

Cyklosporyna A zawartość 60,9% wag.

Cyklosporyna B zawartość 11,2% wag.

Cyklosporyna C zawartość 8,3% wag.

Cyklosporyna L zawartość 1,79% wag.

Cyklosporyna U zawartość 1,58% wag.

Cyklosporyna D zawartość 1,25% wag.

Etap pierwszy

Chromatografię przeprowadza się w dwóch połączonych szeregowo kolumnach chromatograficznych, każda o objętości 8 litrów, średnicy 10 cm, długości 100 cm. Każda z dwóch kolumn zawiera 3,95-3,95 kg żelu krzemionkowego Merck typu Kieselgel o wymiarze ziaren 0,04-0,063 mm. W pierwszej chromatografii obie kolumny są wypełnione świeżym żelem krzemionkowym. W przypadku następnych chromatografii oddziela się pierwszą kolumnę i przyłącza się drugą kolumnę wypełnioną świeżym żelem krzemionkowym. W każdej następnej chromatografii stosuje się tylko jedną nową kolumnę.

Wytwarzanie surowego produktu

4,1 kg surowego produktu o czystości 60,9% wag. rozpuszczonego uprzednio w 15 litrach toluenu wprowadza się do pary połączonych szeregowo kolumn. 19 litrów otrzymanego roztworu wprowadza się na szczyt pierwszej kolumny poprzez filtr z szybkością 2,4 l/godzinę. Po wprowadzeniu tego materiału eluuje się mieszaniną rozpuszczalników aceton-toluen w stosunku 13:87% obj. aż do osiąPL 194 252 B1 gnięcia przy dnie drugiej kolumny objętości wypływającej cieczy 39 litrów. Zawartość cyklosporyny w odebranej cieczy analizuje się metodą TLC. Frakcje nie zawierające cyklosporyny odbiera się jako odpad. 28 litrów odebranej cieczy z chwilą, gdy pojawiła się cyklosporyna uważa się za frakcję główną. Zawartość suchego związku pośredniego l otrzymanego tą metodą wynosi 3,23 kg.

Jakość: cyklosporyna A 75% wag. cyklosporyna B 10,1% wag. cyklosporyna C 1,6% wag. cyklosporyna L 1,7% wag. cyklosporyna U 1,5% wag. cyklosporyna D 1,3% wag.

Wydajność przeliczona na cyklosporynę A: 97%

Etap drugi

Rozdzielenie przeprowadza się w 1 metrowej kolumnie z płaszczem o objętości 8 litrów. Kolumna zawiera żel krzemionkowy Merck Kieselgel 60 (0,015-0,040 mm). Masa wypełnienia wynosi 3,95 kg.

Roztwór o objętości około 3 litrów i zawierający 370 g suchego związku pośredniego otrzymanego w pierwszym etapie wprowadza się do kolumny z szybkością 2,4 l/godzinę, a następnie przemywa się 1 litrem toluenu.

Po wprowadzeniu tego materiału do kolumny eluuje się 10 litrami mieszaniny aceton:toluen w stosunku 15:85% obj. i następnie 20 litrami mieszaniny aceton:toluen w stosunku 25:75% obj. Szybkość przepływu rozpuszczalnika dla pierwszych 17 litrów frakcji wynosi 2,4 l/godzinę, a następnie od 18 litra-5 l/godzinę. Frakcje analizuje się metodą TLC. 1-11 litrów frakcji stanowi odpad, frakcje 1219 litrów uważa się za przejściowe frakcje l i pobiera się z nich próbki. Występujące w nich zanieczyszczenia analizuje się metodą HPLC i traktuje się je jako frakcje wstępne lub łączy się z frakcjami głównymi. W ten sposób można otrzymać 80 g suchego materiału występującego w frakcjach wstępnych, a następnie odparować do suchej masy. Frakcje 20-25 litrów łączy się jako frakcję główną. Frakcje 26-31 litrów uważa się za przejściowe i po analizie łączy się je z frakcją główną lub traktuje jako frakcje późniejsze.

Otrzymaną powyższym sposobem frakcję główną odparowuje się do suchej masy w odparowalniku warstewkowym zaopatrzonym w wahadłowe mieszadło. Otrzymuje się 234 g związku pośredniego llz wydajnością 80% i o następującej jakości:

cyklosporyna A 95% wag. cyklosporyna U 1,2% wag. cyklosporyna L 0,7% wag. cyklosporyna B <0,1% wag. cyklosporyna D 0,5% wag. cyklosporyna C 0,1% wag.

Etap trzeci

Chromatografię przeprowadza się w kolumnach o wymiarach i kształtach geometrycznych opisanych dla etapu 1 i 2.

Przygotowuje się 1,7 litra roztworu toluenu zawierającego 220 g suchego związku pośredniego Il otrzymanego w drugim etapie i wprowadza na szczyt kolumny z szybkością przepływu 2,4 l/godzinę i następnie przemywa się 1 litrem toluenu.

Kolumny eluuje się 20 litrami mieszaniny aceton:toluen w stosunku 15:85% obj. i następnie cyklosporynę eluuje się 20 litrami mieszaniny aceton:toluen w stosunku 25:75% obj.

Szybkość przepływu przy eluowaniu pierwszych 31 litrów frakcji wynosi 2,4 l/godzinę, a następnie frakcji od 32 litra wynosi 5 l/godzinę.

Frakcje 1-18 litra są odpadowe, frakcje 19-23 litra są frakcjami wstępnymi uważanymi za przejściowe frakcje I. Pobiera się z nich próbki w celu zanalizowania zawartości suchego materiału i występujących zanieczyszczeń stosując metodę HPLC. Po analizie traktuje się je jako frakcje wstępne lub łączy się z frakcjami głównymi. Frakcje 29-38 litrowe łączy się jako frakcje główne. Frakcje 39-41 litra zbiera się w porcjach 1 litrowych i uważa za przejściowe frakcje II. Po analizie łączy się je z frakcją główną lub traktuje jako frakcję późniejszą.

Po zebraniu frakcji i odparowaniu do suchej masy można z frakcji wstępnej otrzymać 70 g.

Główne frakcje łączy się i po odparowaniu do suchej masy otrzymuje się 157 g czystej cyklosporyny z wydajnością 75%. Jakość produktu jest następująca:

cyklosporyna A 99,6% wag.

PL 194 252 B1 cyklosporyna L <0,05% wag. cyklosporyna U <0,05% wag. cyklosporyna D <0,05% wag. cyklosporyna B <0,02% wag. cyklosporyna C <0,02% wag.

Przykła d II

Chromatograficzne oczyszczanie surowego produktu cyklosporyny w czterostopniowym złożu stacjonarnym w kolumnie wypełnionej żelem krzemionkowym z zastosowaniem układu toluen-aceton lub toluen-octan etylu jako mieszaniny rozpuszczalników

Surowy produkt cyklosporyny oczyszcza się metodą trzystopniowej chromatografii opisanej wprzykładzie l. Frakcje wstępne otrzymane w trzech etapach chromatografii oczyszcza się w czwartym etapie w złożu stacjonarnym z zastosowaniem mieszaniny rozpuszczalników toluen-octan etylu.

Etap cztery

Konstrukcja i wymiary geometryczne kolumn chromatograficznych są takie same jak opisano wprzykładzie l. Kolumny wypełnione są żelem krzemionkowym typu Merck Kieselgel 60 (0,015-0,040 mm) jak to opisano w przykładzie l.

Kolumny zasila się koncentratem uzyskanym z frakcji wstępnej w ilości 260 g materiału rozpuszczonego w 2,5 litra toluenu z szybkością zasilania 2,4 l/godzinę.

cyklosporyna A zawartość 80,6% wag. cyklosporyna D zawartość 4,2% wag.

Tę próbkę przemywa się 1 litrem toluenu, a następnie kolumny eluuje się 20 litrami mieszaniny octan etylu:toluen w stosunku 17:83% obj. z szybkością 2,4 l/godzinę, a następnie eluowanie kontynuuje się 40 litrami mieszaniny octan etylu:toluen w stosunku 28:72% obj.

Zbierane frakcje 1-19 litra są odpadowe. Na podstawie analizy HPLC frakcje 20-25 litra traktuje się jako odpadowe lub łączy się z frakcją główną. Frakcje 26-35 litra zbiera się jako frakcje główne. Zfrakcji 36-42 litra zbiera się próbki i analizuje metodą HPLC oraz łączy się z frakcją główną lub odprowadza jako odpad. Opisane powyżej frakcje 23-42 litra zbiera się jako frakcję główną i odparowuje do suchej masy. W ten sposób otrzymuje się 195 g czystej cyklosporyny A zawierającej 99,6% wag. aktywnego składnika, z wydajnością 75% i o następującej jakości:

cyklosporyna A 99,6% wag. cyklosporyna D <0,05% wag. cyklosporyna U cyklosporyna L Przykła d lII

Chromatograficzne oczyszczanie surowego produktu cyklosporyny w dwustopniowym złożu stacjonarnym w kolumnie wypełnionej żelem krzemionkowym z zastosowaniem mieszaniny rozpuszczalnikowej toluen-aceton

Surowy produkt cyklosporyny oczyszcza się sposobem opisanym w etapie 1 przykładu l uzyskując pośrednią cyklosporynę l o takiej samej jakości. Następnie przeprowadza się następujący proces:

Etap drugi

Do kolumny wprowadza się 3 litry związku pośredniego I zawierającego 370 g suchego materiału z szybkością przepływu 2,4 l/godzinę, a następnie tę próbkę przemywa się 1litrem toluenu.

Po obciążeniu kolumnę eluuje się 10 litrami mieszaniny aceton:toluen w stosunku 15:85% obj., a następnie eluowanie kontynuuje się z 20litrami mieszaniny aceton:toluen w stosunku 25:75% obj.

Szybkość przepływu rozpuszczalnika wynosi 2,4 l/godzinę aż do 17 litra i 5 l/godzinę od 18 litrów.

Zgodnie ze wskazaniami TLC i HPLC frakcje 1-11 litra są odpadowe, frakcje 12-20 są frakcjami wstępnymi, frakcje21-24 uważa się za frakcje główne i frakcje od 25 do końca traktuje się jako frakcje późniejsze. Frakcje z przemywania acetonem są odpadowe.

Główne frakcje łączy się i po odparowaniu do suchej masy uzyskuje się 114 g cyklosporyny A z wydajnością 41% i z jakością produktu tak dobrą jak to opisano w przykładzie I.

Przykład IV

Przykład porównawczy oczyszczania surowego produktu metodą trzystopniowej chromatografii z zastosowaniem mieszaniny dichlorometan-aceton jako rozpuszczalnika

Jakość surowego produktu wyjściowej cyklosporyny (taka sama jak stosowana w przykładzie I):

Cyklosporyna A zawartość 60,9% wag.

Cyklosporyna B zawartość 11,2% wag.

PL 194 252 B1

Cyklosporyna C zawartość Cyklosporyna L zawartość Cyklosporyna U zawartość Cyklosporyna D zawartość

8,3% wag.

1,79% wag.

1,58% wag.

1,25% wag.

Aparatura chromatograficzna i wypełnienie jest takie samo jak opisano w przykładzie l. Do jednej pary połączonych szeregowo kolumn wprowadza się 4,1 kg surowego produktu o czystości 60,9% w 15 litrach dichlorometanu.

Po obciążeniu próbnym kolumny eluuje się dichlorometanem z szybkością przepływu 2,4 l/godzinę aż do zebrania 35 litrów wypływającej cieczy.

Frakcje 1-10 litra są odpadowe, podczas gdy frakcje 11-35 litra uważa się za frakcje główne. Zawartość otrzymanego tym sposobem suchego związku pośredniego l wynosi 2,9 kg, zawierającego 75% wag. aktywnego składnika.

Etap drugi

Aparatura chromatograficzna i wypełnienie są takie same jak opisano w przykładzie l.

Na szczyt kolumny wprowadza się 3 litry związku pośredniego I zawierającego 350 g suchego materiału z szybkością przepływu 2,4 l/godzinę. Eluowanie przeprowadza się 10 litrami mieszaniny aceton:dichlorometan w stosunku 1:9 obj., a następnie 25 litrami mieszaniny aceton:dichlorometan w stosunku 2:8 obj.i na koniec acetonem z szybkością przepływu 2,4 l/godzinę.

Na podstawie analizy metodą TLC objętość frakcji wstępnej wynosiła 13 litrów, objętość frakcji głównej wynosiła 22 litry i objętość frakcji późniejszej wynosiła 11 litrów. 22 litry głównej frakcji odparowano do suchej masy i w efekcie uzyskano 220 g związku pośredniego lI jako produktu o czystości 91%.

Etap trzeci

Aparatura chromatograficzna i wypełnienie są takie same jak opisano w przykładzie l.

Do wypełnionej kolumny wprowadza się 220 g związku pośredniego ll w postaci koncentratu w dichlorometanie z szybkością 2,4 l/godzinę. Eluowanie przeprowadza się 20 litrami mieszaniny aceton:dichlorometan w stosunku 1:9 obj., a następnie 30 litrami mieszaniny aceton:dichlorometan w stosunku 2:8 obj. i na zakończenie przepuszcza się aceton z szybkością przepływu 2,4 l/godzinę.

Pierwsze 26 litrów frakcji uważa się za frakcję wstępną, następnie zbiera się 26 litrową frakcję główną i na koniec odbiera się 11 litrów frakcji późniejszych.

litrów frakcji głównej odparowano do suchej masy i w efekcie otrzymano 140 g związku pośredniego lll jako produktu o następującej jakości:

Claims (12)

1. Sposób oczyszczania w procesie wytwarzania cyklosporyny A, z dużą czystością z surowego produktu zawierającego kompleks cyklosporyny metodą chromatograficzną w kolumnie wypełnionej żelem krzemionkowym, znamienny tym, że stosuje się wielostopniową chromatografię przy użyciu mieszaniny rozpuszczalników zawierającej toluen jako główny składnik.

2. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że przeprowadza się kolejno 2-4 stopniową chromatografię.

3. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że przeprowadza się kolejno 3 stopniową chromatografię.

4. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że jako mieszaninę rozpuszczalników stosuje się toluen-aceton.

5. Sposób według zastrz. 4, znamienny tym, że stosuje się toluen zawierający co najwyżej 30% acetonu.

6. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że stosuje się mieszaninę rozpuszczalników toluen-octan etylu.

PL 194 252 B1

7. Sposób według zastrz. 6, znamienny tym, że stosuje się toluen zawierający co najwyżej 35% obj. octanu etylu.

8. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że w co najmniej jednym stopniu chromatografii stosuje się eluowanie gradientowe.

9. Cyklosporyna A o dużej czystości, znamienna tym, że zawartość cyklosporyny L, cyklosporyny U i cyklosporyny Djest mniejsza niż 0,05% wag. i zawartość cyklosporyny B i C jest mniejsza niż 0,02% wag.

10. Sposób na skalę przemysłową oczyszczania cyklosporyny A z surowego produktu zawierającego kompleks cyklosporyny metodą chromatograficzną w kolumnie wypełnionej żelem krzemionkowym, znamienny tym, że wielostopniową chromatografię przeprowadza się w kolumnie wypełnionej żelem krzemionkowym z fazą normalną z zastosowaniem mieszaniny rozpuszczalników zawierającej toluen jako główny składnik.

11. Sposób według zastrz. 10, znamienny tym, że stosuje się toluen zawierający 10-30% acetonu.

12. Sposób według zastrz. 10, znamienny tym, że stosuje się toluen zawierający 10-35% objętościowych octanu etylu.