KR20060052874A - 마크로라이드의 정제 방법 - Google Patents

마크로라이드의 정제 방법 Download PDF

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KR20060052874A
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빌모스 케리
졸탄 크조베크
안드레아 크소르바시
페렌 란탈
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테바 기오기스제르갸르 레스즈베니타르사사그
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Abstract

본 발명은 마크로라이드, 특히 타크로리무스의 정제 방법에 관한 것이며, 이 방법은 마크로라이드를 흡착 수지층 상에 로딩하고, 물 및 테트라히드로퓨란의 배합물과 같은 적절한 용리제로 용리시키는 것을 포함한다.

Description

마크로라이드의 정제 방법{METHOD OF PURIFYING MACROLIDES}
본 발명은 마크로라이드의 정제 방법에 관한 것이고, 더 구체적으로는 흡착 수지를 사용한 분리 방법에 의한 타크로리무스(tacrolimus), 아스코마이신(ascomycin), 시로리무스(sirolimus), 에베로리무스(everolimus), 또는 피메크로리무스(pimecrolimus)의 정제 방법에 관한 것이다.
관련 출원
본 출원은 미국 가출원 제 60/490,070호(2003년 7월 24일) 및 미국 가출원 제 60/539,363호(2004년 1월 26일)에 대한 우선권을 주장하고, 이들 출원의 내용은 본 명세서에서 참고로 인용된다.
마크로라이드는 치환기로서 하나 이상의 디옥시당을 갖는 다원 락톤 고리이다. 에리트로마이신(erythromycin), 아지트로마이신(azithromycin), 및 클라리트로마이신(clarithromycin)은 정균 활성 및/또는 살균 활성을 갖는 마크로라이드이다.
타크로리무스(FK 506)도 면역억제제이기도 한 마크로라이드 항생제이다. 시클로스포린보다 더 강력한 것인 타크로리무스는 T-림프구에 대해 선택적 억제 효과를 갖는 것으로 보고되어 있다.
피메크로리무스는 T 세포 및 비만 세포에 의해 염증 매개성 사이토카인의 생 성을 억제하는 것으로 보고되어 있는 마크로락탐 및 아스코마이신 유도체이다(The Merck Index 1331, Maryadele J. O'Neil et al. eds., 13th ed.2001). 피메크로리무스는 면역억제제로서 사용되는 것으로 보고되어 있다(The Merck Index 1331, Maryadele J. O'Neil et al. eds., 13th ed.2001).
또다른 마크로라이드인 시로리무스는 면역억제제로서 보고되어 있다. 시로리무스는 이식 거부 반응을 막기 위하여 이식 이후 시클로스포린 및 코르티코스테로이드와 함께 투여되어 왔다(Martindale: The Complete Drug Reference 568, Sean C. Sweetman ed., Pharmaceutical Press 33rd ed. 2002).
시로리무스의 유도체인 에베로리무스는 장기 이식 시에 사용되는 면역억제제로서 보고되어 있다(Martindale at 539).
마크로라이드는 통상적으로 발효에 의해 수득되지만, 일부에 대해서는 합성 경로가 공지되어 있다. 수득시의 마크로라이드는 여러 불순물을 함유하게 되고, 이 불순물은 각종 방법, 예를 들어 고속 액체 크로마토그래피(HPLC)에 의해 검출된다. 약학적 화합물 중 불순물의 존재는 바람직하지 않고, 여러 관할국의 보건 당국(예를 들어, 미국 식품 의약국)은 약제 중 불순물의 허용가능한 수준에 관한 지침을 마련하였다. 임의의 약제 중 불순물의 수준을 감소시키는 방법에 대한 필요성과 이의 상업적 이용가치는 자명하다.
발명의 요약
하나의 구체예에서, 본 발명은 마크로라이드, 특히 타크로리무스, 아스코마이신, 시로리무스(라파마이신), 에베로리무스, 및 피메크로리무스로부터 불순물을 분리하는(즉, 이들 중 불순물의 수준을 감소시키는) 방법에 관한 것이다. 이 방법은 마크로라이드의 로딩 충전물(loading charge)을 제조하는 단계; 이 로딩 충전물을 습식 흡착 수지층 상에 로딩하는 단계; 이 층을 THF 또는 아세토니트릴, 물, 및 임의로 추가의 유기 용매를 함유하는 용리제로 용리시키는 단계; 용리제의 주 분획(핵심부, heart cut)을 수집하는 단계, 및 감소된 불순물을 갖는 마크로라이드를 주 분획으로부터 분리하는 단계를 포함한다.
또다른 구체예에서, 본 발명은 전술한 방법에 의해 제조된 마크로라이드, 특히 타크로리무스, 아스코마이신, 시로리무스(라파마이신), 에베로리무스, 및 피메크로리무스에 관한 것이다.
본원에서 사용된 바와 같이, 상온이라는 용어는 약 0℃ 내지 약 40℃의 온도, 바람직하게는 약 10℃ 내지 약 35℃의 온도를 의미한다.
본원에서 사용된 바와 같이, 감압이라는 용어는 약 760 mmHg 미만의 압력을 의미한다.
본원에서 사용된 바와 같이, 반용매라는 용어는 그 중 마크로라이드가 기껏해야 조금 용해되는, 상온에서 일반적으로는 액체인 물질을 의미한다.
본원에서 사용된 바와 같이, "불순물"이라는 용어는 소정의 마크로라이드와 상이한 보유 시간을 갖는 임의의 화합물을 의미한다. 상이한 보유 시간은, 예를 들어 하기에 기술되는 HPLC 방법에 의해 측정될 수 있다.
본원에서 사용된 바와 같이, RRT0.95 및 RRT1.25라는 용어는 각각 아스코마이신 및 디히드로타크로리무스를 의미하고, 이들은 타크로리무스 중 불순물이며, 하기에 기술된 바와 같이, HPLC 분석시 약 0.95 및 1.25의 (타크로리무스에 대한) 상대적 보유 시간을 갖는다.
액체 혼합물 또는 배합물에 관하여 본원에서 사용된 바와 같이, 부피 백분율 또는 부피%라는 용어는 하기 수학식에 의해 계산되는 부피 분율을 의미한다(A 종에 대해 예시함):
부피%A = WtA x ρA / (WtA x ρA + WtB x ρB)
(식 중, WtA 및 WtB는 각각 A 종 및 B 종의 ｇ 단위의 중량이고,
ρA 및 ρB는 각각 A 종 및 B 종의 g/㎖ 단위의 밀도임).
하나의 실시양태에서, 본 발명은 마크로라이드를 그 내부의 불순물로부터 분리하기 위한(즉, 마크로라이드 중의 불순물의 수준을 감소시키기 위한) 크로마토그래피 방법을 제공한다. 분리(감소)는 마크로라이드를 흡착 수지층 상에 로딩하고, THF 또는 아세토니트릴, 물, 및 임의로 추가의 유기 용매를 함유하는 용리제로 용리시킴에 의해 실행된다. 본 발명의 실시에 바람직한 마크로라이드로는 타크로리무스, 아스코마이신, 시로리무스, 에베로리무스, 및 피메크로리무스를 들 수 있다. 타크로리무스가 마크로라이드인 경우, 감소되는 불순물은 적어도 아스코마이신 및 디히드로타크로리무스를 포함하고, HPLC에 의한 이들의 정량화는 하기에 기재되어 있다. 아스코마이신이 마크로라이드인 경우, 감소되는 불순물은 적어도 타크로리무스를 포함한다. 사용되는 마크로라이드는 임의의 공급원 유래일 수 있다.
본 발명의 실시에 있어서, 감소(분리)는 마크로라이드의 로딩 충전물로 로딩된 흡착 수지층을 용리제로 용리시켜 배출액을 수득함에 의해 달성된다. 본 발명의 실시에 유용한 흡착 수지는 종래 기술에서 잘 공지되어 있고, 바람직하게는 가교된, 비이온성 스티렌-디비닐 벤젠 재료이지만, 이는 화학적으로 변형될 수 있다. 아크릴계 흡착 수지도 공지되어 있다. 흡착 수지는 고도의 다공성 구조를 갖고, 이의 표면은 각종 화학종을 흡수한 후 배출할 수 있다. 흡수 및 배출은 환경, 예를 들어 사용되는 용매에 의해 영향을 받을 수 있다. 극성 용매(예를 들어, 물)의 존재 하에, 흡착 수지는 소수성 양상을 나타낸다. 비극성 용매(예를 들어, 탄화수소)가 사용되는 경우, 흡착 수지는 약간의 극성 양상을 나타낸다. 통상적으로, 흡착 수지는 거대망상 구조를 갖고, 약 300 ㎡/ｇ 이상의 표면적을 갖는다.
본 발명의 실시에 있어서 유용한 흡착 수지는 Rohm 및 Haas 사 제인 Amberlite(등록 상표) XAD를 포함하고, 일부를 언급하면, XAD 4, XAD 7 HP, XAD 16 HP, XAD 761, 및 XAD 1180를 들 수 있다. 또한 Mitsubishi 사 제의 Diaion 흡착 수지도 유용하며, 일부를 언급하면 HP 10, HP 20, HP 21, HP 30, HP 40, HP 50, SP 800, SP 825, SP 850, SP 875, SP 205, SP 206, SP 207, HP1MG 및 HP2MG를들 수 있다. Amberlite(등록상표) XAD 1180은 본 발명의 실시에서 사용하기에 바람직한 흡착 수지의 예이다. Amberlite XAD 1180은 거대망상 구조의 가교된 방향족 중합체이다. 이는 비이온성, 소수성의 가교된 중합체이고, 이의 흡착 특성은 (연속 중합체 상 및 연속 공극 상 모두를 함유하는) 이의 특화된 거대망상 구조, 넓은 표면적, 및 이의 표면의 방향족 특성으로부터 비롯한다. 표면적은 500 ㎡/ｇ 이상이다. 공극률은 0.60 ㎖/㎖ 이상이다. 제품 데이타 시트인 PDS 0205 A - 98년 1월 - 1/2는 이 수지에 대한 추가의 정보를 제공한다.
본 발명의 방법의 첫번째 단계에서, 마크로라이드의 로딩 충전물이 흡착 수지층 상에 로딩된다. 로딩 충전물은 반용매와 배합된, 유기 용매 중 마크로라이드의 용액으로서 제공될 수 있다.
대안으로, 마크로라이드의 로딩 충전물은 흡착 수지층 상에 로딩되기 이전에 흡착 수지의 로딩부 상에 흡착(증착)된다. 임의로 물을 함유하는, 유기 용매 중의 마크로라이드의 용액은 흡착 수지 및 반용매와 배합된다. 흡착 수지는 층 제조에 사용되는 수지와 동일하거나, 이는 상이한 흡착 수지일 수 있다. 흡착 수지의 로딩부는 층의 부피의 약 33% 내지 약 50%일 수 있다. 그 후, 로딩부는 습식 흡착층과 병치되어 로딩 충전물로 로딩된 층을 제공한다.
로딩 충전물이 그로부터 로딩되는 용액의 제조에 사용되는 유기 용매는 테트라히드로퓨란(THF), 아세톤 아세토니트릴(ACN), 메탄올, 에탄올, n-부탄올, n-프로판올, 이소-프로판올, 에스테르(예를 들어, 에틸 아세테이트), 및 쌍극성 비양성자성 용매, 예컨대 디메틸포름아미드(DMF)로 이루어진 군 중에서 선택된 것이 바람직하다. 가장 바람직하게는, 유기 용매는 THF, 아세톤 또는 ACN이다. 마크로라이드가 타크로리무스인 경우, THF 및 ACN이 바람직한 용매이다. 바람직하게는, 반용매는 물 또는 직선형 또는 분지형의 알칸 또는 시클로알칸, 예컨대 헥산, 헵탄 또는 시클로헥산이다. 반용매의 첨가는 용액 중 마크로라이드의 용해도를 감소시키고, 이는 샘플이 흡착 수지의 로딩부 상에 흡착되는 것을 촉진하는 것으로 생각된다. 반용매를 서서히 첨가하여, 마크로라이드의 부분적 덩어리 침전을 야기하여 오염 및 폐색을 야기할 수 있는 큰 농도 구배를 막는다. 바람직하게는, 반용매에 대한 용매의 비율은 40% 이하이다.
마크로라이드 용액, 흡착 수지의 로딩부, 및 반용매의 배합은 교반기가 장착된 임의의 편리한 용기(예를 들어, 교반 탱크 반응기) 내에서 수행될 수 있다.
특정 실시양태에서, 흡착 수지의 로딩부는 칼럼 내에 포함되고, 재순환 시스템 내의 칼럼을 통해 마크로라이드 용액의 유량과 접촉된다. 반용매는 흡착 수지의 로딩부를 통해서 및 로딩부 주위로 흐르는 용액의 스트림으로 점차 도입되고, 이에 따라 마크로라이드 샘플은 흡착 수지의 로딩부 상에 점차 흡착된다.
예로서, 마크로라이드가 타크로리무스인 경우, 용액은 약 100 ｇ/ℓ일 수 있고 반용매의 부피는 용액 부피의 약 5배 이상일 수 있다. 흡착 수지의 로딩부의 벌크 부피는 용액의 부피와 대략적으로 동일할 수 있다. 당업자는 통상의 실험에 의해 이 비율을 최적화하여 흡착 수지의 로딩부 상에 마크로라이드를 흡착시킬 수 있다는 것을 공지하고 있을 것이다.
흡착의 실질적인 완료는 용액 중 잔류하는 마크로라이드의 농도를 모니터링함에 의해 측정될 수 있고, 이러한 흡착의 실질적인 완료 후에, 로딩 충전물은 잔류하는 용액으로부터 분리된다. 분리는 여과에 의한 것일 수 있다. 로딩 충전물의 제조를 위해 재순환 칼럼이 사용되는 경우, 이 칼럼은 재순환 시스템으로부터 간단하게 디커플링된다.
본 실시양태의 잇따른 단계에서, 이제 마크로라이드로 로딩된 로딩부가 제조된 습식 흡착 수지층에 병치된다. 이 층은 적절한 용기의 내부에 한정된다. 바람직하게는, 이 층은 칼럼 내부에 한정되고, 이때 칼럼의 단면적은 원형인 것이 바람직하다. 층의 제조를 위하여, 소정량의 흡착 수지가 물 또는 물 및 용매(예를 들어, THF 또는 ACN)의 혼합물과 함께 슬러리화된다. 층이 큰 직경을 갖는 경우, 물 - 용매의 배합물이 유리하다. 그 후, 슬러리는 소정의 용기로 옮겨지고, 이때 용기는 칼럼 크로마토그래피에서 사용되는 것과 같은 원형 칼럼인 것이 바람직하다. 물(또는 물 - 용매 배합물)이 습식 흡착 수지층으로부터 배출된다. 크로마토그래피 칼럼의 제조 및 패킹의 방법은 당업자 및 일상인에게 잘 공지되어 있고, 공지된 방법을 본 발명의 방법에 맞추어 용이하게 조절할 수 있다.
로딩부는 습식 흡착 수지층 상에 단순히 층으로서 병치될 수 있다. 로딩 충전물이 재순환 시스템 내에서 제조되는 경우, 로딩 충전물을 포함하는 용기는, 이와 흐름 소통 상태를 만드는 임의의 수단에 의하여 습식 흡착 수지층을 보유하는 컨테이너에 커플링될 수 있다.
마크로라이드 중 불순물의 수준이 감소되게 하는, 마크로라이드(예를 들어, 타크로리무스, 아스코마이신, 시로리무스, 에베로리무스, 또는 피메크로리무스) 및 불순물의 분리는 용리제를 로딩 충전물을 통해 통과시키고, 이어서 로딩 충전물에 병치되고 이와 흐름 소통 상태로 존재하는 것인 흡착 수지층으로 통해 통과시킴에 의해 수행된다.
용리제는 물 및 유기 용매, 예컨대 THF 또는 ACN을 포함한다. 특히 타크로리무스가 마크로라이드인 경우, 바람직한 용리제는 필수적으로는 약 20 부피% 내지 약 50 부피%의 THF, 가장 바람직하게는 약 31 부피% 내지 약 40 부피%의 THF를 갖는, THF 및 물의 혼합물이다. 유기 용매, 예컨대 메탄올, 아세토니트릴, 아세톤 또는 n-부탄올이 THF-물 용리제와 함께 사용되는 경우, THF 함량은 38 부피% 미만, 바람직하게는 약 4 부피% 내지 약 38 부피%이다. 또다른 바람직한 용리제는 약 30 부피% 내지 약 70 부피%의 아세토니트릴, 가장 바람직하게는 약 40 부피% 내지 약 65 부피%의 아세토니트릴을 갖는, 아세토니트릴 및 물의 혼합물이다. 용리제가 아세토니트릴 및 물의 혼합물인 경우, 용리제는 1 부의 용리제당 약 0.0005 부 내지 약 0.003 부의 무기산을 포함할 수 있다. 바람직한 무기산은 인산이다.
용리제는 로딩부 및 로딩부에 병치된 흡착 수지층을 통하여 층의 총 단면적에 의존하는 속도(용리제의 유량에 대해 수직으로 측정됨)로 용리된다. 바람직하게는, (단면적에 대한) 유속은 약 25 ㎝/h 미만이고, 약 15 ㎝/h 미만인 것이 바람직하다. 더 느린 용리 속도는 용리 시간을 연장시키지만, 분리 효율을 개선시킨다. 개선된 분리 효율을 위하여, 약 90 ㎖/시간의 용리 속도가 바람직하다.
흡착 수지층 밖으로 흐르는 용리제(즉, 배출액)는, 정지상(예를 들어, 고정층) 상의 화학종의 바람직한 보유량에 따라, 당업자에게 통상적인 크로마토그래피와 같은 분리 방법을 사용하여 하나 이상의 분획으로 수집된다. 유기산, 예컨대 인산이 용리제에 첨가될 수 있다.
바람직하게는, 층을 용리제의 양으로 용리시킨 후, 이 층을 제2 층과 흐름 소통 상태로 배치하여, 제1 층으로부터 나오는 배출액이 제2 층을 통해 용리되게 한다. 제1 층 및 제2 층에서의 용리 후, 제2 층은 제1 층로부터 디커플링(즉, 흐름 소통 상태가 단절됨)될 수 있고, 디커플링되는 것이 바람직하며, 용리는 오로지 제2 층을 통해 계속된다. 용리제는 약 33 부피% 내지 약 35 부피%의 THF를 갖는, THF 및 물의 혼합물이다.
임의로, 추가의 칼럼이 시스템에 연결될 수 있다.
분획의 농도 및 조성은 임의의 편리한 수단에 의해 모니터링될 수 있다. 마크로라이드 중 불순물, 특히 아스코마이신 및 디히드로타크로리무스의 검출 및 정량화는 하기에 기술된 HPLC 방법에 의해 수행될 수 있다.
특히, 칼럼 로딩 및 용리제의 조성 및 유속에 따라서, 용액 중 원래 존재한 마크로라이드의 약 60 중량% 초과, 바람직하게는 약 60 중량% 내지 약 90 중량%를 포함하는 배출액의 주 분획(핵심부, heart cut)이 수집된다. 타크로리무스가 마크로라이드인 경우, THF-물(31 내지 40 부피%의 THF)이 용리제이고, 주 분획이 수집되며, 최종 분리된 생성물은 (하기의 HPLC에 의해 측정시) 약 0.1 면적% 이하의 RRT0.95 불순물을 갖는다.
필요에 따라, 불순물로부터 분리되고 이에 따라 낮은 수준의 불순물을 갖는 마크로라이드는 임의의 적절한 수단(예를 들어, 추출, 동결건조, 증발, 반용매의 첨가)에 의해 용리제로부터 분리될 수 있다. 유용한 반용매로서 물, 알칸 및 시클로알칸을 들 수 있다. 분리 방법은 조합될 수 있다. 예를 들어, 반용매는 농축된 용리제와 배합될 수 있다.
바람직한 분리 방법은 70℃ 이하, 바람직하게는 60℃ 이하에서, 바람직하게는 760 mmHg의 압력에서 주 분획을 초기 부피의 약 50%로 농축하는 것을 포함하고, 이에 따라 생성물의 결정이 수득된다. 용리제의 리터당 약 1 ㎖ 내지 약 10 ㎖의 산이 농축 이전에 첨가되어 마크로라이드를 안정화시키는 것이 바람직하다.
임의로, 농축된 주 분획을 상온에서 보류 시간 동안 유지시킨다. 보류 시간을 사용하는 경우, 바람직한 보류 시간은 약 1 내지 약 4 일이다. 감소된 불순물을 갖는 마크로라이드의 결정은 임의의 통상적 수단, 예를 들어 여과(중력 또는 진공)에 의해 회수된다.
회수된 생성물에 본 발명의 방법에 따른 몇번의 추가 처리를 실행함에 의해 불순물을 더 감소시킬 수 있다. 본 발명의 방법에 의해 달성된, 마크로라이드 중 불순물의 감소는 하기에 기술된 바와 같은 HPLC 방법에 의해 모니터링될 수 있다.
또다른 실시양태에서, 마크로라이드는 타크로리무스이고, 적어도 불순물인 아스코마이신 및 디히드로타크로리무스의 수준은 감소된다. 기타 불순물의 수준도 감소된다. 이 방법은 흡착 수지, 특히 거대망상 수지, 예컨대 Amberlite(등록상표) XAD 1180 및 Diaion HP 20의 로딩부의 존재 및 부재 하에, 타크로리무스의 용액을 포함하는 타크로리무스의 로딩 충전물을 제조하는 단계; 이 로딩 충전물을 용기 내부, 특히 칼럼 내부에 포함될 수 있는, 습식 흡착 수지, 특히 Amberlite(등록상표) XAD 1180 및 Diaion HP 20에 로딩하는 단계; 이 로딩부 및 흡착 수지를, 테트라히드로퓨란(THF) 및 물의 혼합물(약 20 부피% 내지 약 50 부피%의 THF, 특히 약 31 부피% 내지 약 40 부피%의 THF), 또는 아세토니트릴(ACN) 및 물의 혼합물(약 30 부피% 내지 약 70 부피%의 아세토니트릴 및 특히 약 40 부피% 내지 약 65 부피%의 아세토니트릴)인 용리제로 용리시키는 단계; (초기 순도에 따라) 약 60% 초과, 바람직하게는 약 60% 내지 약 90%의 초기의 타크로리무스를 함유하는 용리제의 적어도 주 분획(핵심부)을 수집하고, 임의로, 감소된 불순물을 갖는 타크로리무스를 예를 들어 감압에서 산의 존재 하에, 예를 들어 주 분획(들)을 농축함에 의해, 주 분획으로부터 분리하고, 이에 따라 수득된 생성물을 임의로 회수하는 단계를 포함한다.
또다른 실시양태에서, 본 발명은 전술한 방법에 따라 제조된 타크로리무스를 제공한다.
또다른 실시양태에서, 마크로라이드는 아스코마이신이고, 적어도 불순물인 타크로리무스의 수준은 감소된다. 기타 불순물의 수준도 감소된다. 이 방법은 흡착 수지, 특히 거대망상 수지, 예컨대 Amberlite(등록상표) XAD 1180 및 Diaion HP 20의 로딩부의 존재 및 부재 하에, 아스코마이신의 용액을 포함하는 아스코마이신의 로딩 충전물을 제조하는 단계; 이 로딩 충전물을 용기 내부, 특히 칼럼 내부에 포함될 수 있는, 습식 흡착 수지, 특히 Amberlite(등록상표) XAD 1180 및 Diaion HP 20에 로딩하는 단계; 이 로딩부 및 흡착 수지를, 테트라히드로퓨란(THF) 및 물의 혼합물(약 20 부피% 내지 약 50 부피%의 THF, 특히 약 31 부피% 내지 약 40 부피%의 THF), 또는 아세토니트릴(ACN) 및 물의 혼합물(약 30 부피% 내지 약 70 부피%의 아세토니트릴 및 특히 약 40 부피% 내지 약 65 부피%의 아세토니트릴)인 용리제로 용리시키는 단계; (초기 순도에 따라) 약 60% 초과, 바람직하게는 약 60% 내지 약 90%의 초기의 아스코마이신을 함유하는 용리제의 적어도 주 분획(핵심부)을 수집하고, 임의로, 감소된 불순물을 갖는 아스코마이신을 예를 들어 감압에서 산의 존재 하에, 예를 들어 주 분획(들)을 농축함에 의해, 주 분획으로부터 분리하고, 이에 따라 수득된 생성물을 임의로 회수하는 단계를 포함한다.
또다른 실시양태에서, 본 발명은 전술한 방법에 따라 제조된 아스코마이신을 제공한다.
또다른 실시양태에서, 마크로라이드는 시로리무스이다. 이 방법은 흡착 수지, 특히 거대망상 수지, 예컨대 Amberlite(등록상표) XAD 1180 및 Diaion HP 20의 로딩부의 존재 및 부재 하에, 시로리무스의 용액을 포함하는 시로리무스의 로딩 충전물을 제조하는 단계; 이 로딩 충전물을 용기 내부, 특히 칼럼 내부에 포함될 수 있는, 습식 흡착 수지, 특히 Amberlite(등록상표) XAD 1180 및 Diaion HP 20에 로딩하는 단계; 이 로딩부 및 흡착 수지를, 테트라히드로퓨란(THF) 및 물의 혼합물(약 20 부피% 내지 약 50 부피%의 THF, 특히 약 31 부피% 내지 약 40 부피%의 THF), 또는 아세토니트릴(ACN) 및 물의 혼합물(약 30 부피% 내지 약 70 부피%의 아세토니트릴 및 특히 약 40 부피% 내지 약 65 부피%의 아세토니트릴)인 용리제로 용리시키는 단계; (초기 순도에 따라) 약 60% 초과, 바람직하게는 약 60% 내지 약 90%의 초기의 시로리무스를 함유하는 용리제의 적어도 주 분획(핵심부)을 수집하고, 임의로, 감소된 불순물을 갖는 시로리무스를 예를 들어 감압에서 산의 존재 하에, 예를 들어 주 분획(들)을 농축함에 의해, 주 분획으로부터 분리하고, 이에 따라 수득된 생성물을 임의로 회수하는 단계를 포함한다.
또다른 실시양태에서, 본 발명은 전술한 방법에 따라 제조된 시로리무스를 제공한다.
또다른 실시양태에서, 마크로라이드는 에베로리무스이다. 이 방법은 흡착 수지, 특히 거대망상 수지, 예컨대 Amberlite(등록상표) XAD 1180 및 Diaion HP 20의 로딩부의 존재 및 부재 하에, 에베로리무스의 용액을 포함하는 에베로리무스의 로딩 충전물을 제조하는 단계; 이 로딩 충전물을 용기 내부, 특히 칼럼 내부에 포함될 수 있는, 습식 흡착 수지, 특히 Amberlite(등록상표) XAD 1180 및 Diaion HP 20에 로딩하는 단계; 이 로딩부 및 흡착 수지를, 테트라히드로퓨란(THF) 및 물의 혼합물(약 20 부피% 내지 약 50 부피%의 THF, 특히 약 31 부피% 내지 약 40 부피%의 THF), 또는 아세토니트릴(ACN) 및 물의 혼합물(약 30 부피% 내지 약 70 부피%의 아세토니트릴 및 특히 약 40 부피% 내지 약 65 부피%의 아세토니트릴)인 용리제로 용리시키는 단계; (초기 순도에 따라) 약 60% 초과, 바람직하게는 약 60% 내지 약 90%의 초기의 에베로리무스를 함유하는 용리제의 적어도 주 분획(핵심부)을 수집하고, 임의로, 감소된 불순물을 갖는 에베로리무스를 예를 들어 감압에서 산의 존재 하에, 예를 들어 주 분획(들)을 농축함에 의해, 주 분획으로부터 분리하고, 이에 따라 수득된 생성물을 임의로 회수하는 단계를 포함한다.
또다른 실시양태에서, 본 발명은 전술한 방법에 따라 제조된 에베로리무스를 제공한다.
또다른 실시양태에서, 마크로라이드는 피메크로리무스이고, 적어도 불순물인 아스코마이신 및 디히드로타크로리무스의 수준은 감소된다. 기타 불순물의 수준도 감소된다. 이 방법은 흡착 수지, 특히 거대망상 수지, 예컨대 Amberlite(등록상표) XAD 1180 및 Diaion HP 20의 로딩부의 존재 및 부재 하에, 피메크로리무스의 용액을 포함하는 피메크로리무스의 로딩 충전물을 제조하는 단계; 이 로딩 충전물을 용기 내부, 특히 칼럼 내부에 포함될 수 있는, 습식 흡착 수지, 특히 Amberlite(등록상표) XAD 1180 및 Diaion HP 20에 로딩하는 단계; 이 로딩부 및 흡착 수지를, 테트라히드로퓨란(THF) 및 물의 혼합물(약 20 부피% 내지 약 50 부피%의 THF, 특히 약 31 부피% 내지 약 40 부피%의 THF), 또는 아세토니트릴(ACN) 및 물의 혼합물(약 30 부피% 내지 약 70 부피%의 아세토니트릴 및 특히 약 40 부피% 내지 약 65 부피%의 아세토니트릴)인 용리제로 용리시키는 단계; (초기 순도에 따라) 약 60% 초과, 바람직하게는 약 60% 내지 약 90%의 초기의 피메크로리무스를 함유하는 용리제의 적어도 주 분획(핵심부)을 수집하고, 임의로, 감소된 불순물을 갖는 피메크로리무스를 예를 들어 감압에서 산의 존재 하에, 예를 들어 주 분획(들)을 농축함에 의해, 주 분획으로부터 분리하고, 이에 따라 수득된 생성물을 임의로 회수하는 단계를 포함한다.
또다른 실시양태에서, 본 발명은 전술한 방법에 따라 제조된 피메크로리무스를 제공한다.
크로마토그래피 조건:
칼럼: ZORBAX SB-C18 75 x 4.6 ㎜; 3.5 ㎛
예비-칼럼: SymmetryShield RP18 3.9 x 20 ㎜; 5 ㎛
용리제: A: 200 ㎖의 아세토니트릴을 2000 ㎖ 부피 플라스크로 측량한 후, 증류수에 의해 부피를 2000 ㎖의 총 부피로 희석시킨다.
그 후, 100 ㎕의 50% 아세트산을 첨가한다.
B: 100 ㎕의 50% 아세트산을 2000 ㎖의 아세토니트릴에 첨가한다.
구배에 관한 표
시간 (분) 용리제 "A" (w/w) 용리제 "B" (w/w) 유속 (㎖/분)
0 60 40 2.3
15 55 45 2.3
25 30 70 1.8
25.1 60 40 1.8
27 60 40 1.8
유속: 2.3 ㎖/분
검출 파장: 210 ㎚
주입된 부피: 20 ㎕
샘플의 용매: 아세토니트릴
칼럼 유닛의 온도: 60℃
분석 시간: 27 분
타크로리무스의 보유 시간: 대략 14 분
불순물인 아스코마이신(RRT0.95) 및 디히드로타크로리무스(RRT1.25)의 보유 시간은 타크로리무스에 대한 상대치이고, 크로마토그램에서 피크의 전체 면적에 대해 상대적인 면적 백분율로서 표시된다.
불순물인 타크로리무스(RRT1.00)의 보유 시간은 아스코마이신에 대한 상대치이고, 크로마토그램에서 피크의 전체 면적에 대해 상대적인 면적 백분율로서 표시된다.
본 발명의 방법은 하기의 비제한적인 실시예에 의해 예시될 수 있다.
실시예 1
면적 백분율은 전술한 방법에 의해 수득된 HPLC 크로마토그램의 면적 백분율을 의미한다.
하기의 절차는 28℃ 내지 32℃에서 수행하였다.
칼럼(45 ㎝의 직경) 중 흡착 수지(Amberlite(등록상표) XAD 1180)의 층을 물:THF를 사용하여 칼럼을 충전(약 100 ℓ의 습식 흡착 수지)시키면서 제조하였다.
교반하면서 물(86 ℓ)을 아세토니트릴(10 ℓ) 중 타크로리무스(1227 ｇ)의 용액에 서서히 첨가하였고, 이때 흡착 수지(Amberlite(등록상표) XAD 1180; 9 ℓ)를 교반하면서 현탁시켰다. 사용된 타크로리무스는 약 2.6 면적%의 RRT0.95 및 약 2.9 면적%의 RRT1.25를 함유하였다. 물의 첨가가 완료되었을 때, 흡착 수지의 로딩 충전물을 여과에 의해 수집하였다.
이 수집된 로딩 충전물을 습식 흡착 수지층의 상부에 층으로서 로딩(병치)하였다.
먼저 칼럼을 THF/물(33 부피%의 THF)로 이루어진, 약 1800 ℓ의 제1 용리제로 용리시켰다. 그 후, 칼럼을 THF/물(40 부피%의 THF)로 이루어진 제2 용리제로 용리시켰다. 용리 속도는 약 11 내지 13 ℓ/시간(6.9 내지 8.2 ㎝/시간)이었다. 약 820 ｇ의 타크로리무스를 함유하는, 약 460 ℓ의 주 분획(67% 수율)을 수집하였다. 약 190 ｇ의 타크로리무스를 함유하는, 약 80 ℓ의 예비-분획도 수집하였다.
주 분획(460 ℓ)을 85%(460 ㎖)의 인산과 배합하였고, 감압에서 약 230 ℓ의 부피로 농축하였다. 이 농축물을 1일 간 상온에서 정치하였다. (주, 잇따른 시험에서 더 긴 보류 시간을 시도하였다. 수득된 결정은 본원에서 수득된 것보다 더 용이 하게 여과되었다). 결정을 헥산으로 세정하였고 40℃에서 건조시켰다.
주 분획으로부터 분리된 생성물은 약 0.1 면적%의 RRT0.95 및 약 1.7 면적%의 RRT1.25를 가졌다.
예비-분획으로부터 분리된 생성물은 약 3 면적%의 RRT0.95 및 약 0.3 면적%의 RRT1.25를 가졌다.
실시예 2
실시예 1의 일반적인 절차를 반복하여 용리제의 조성 및 유속의 효과 를 조사하였다.
이 실험을 통해, 본 발명자들은 용리의 유속을 감소시키면 크로마토그래피의 분리 효율을 증가시킬 수 있음을 입증하였다. 용리의 유속을 증가시키면 크로마토그래피의 효율이 감소하였다. (6.9 내지 8.2 ㎝/㎠.시간 대신) 25 ㎝/㎠.시간의 유량 속도은 효율의 유의한 감소를 초래하였으나, 실시예 1에서 기재되어 있는 품질을 갖춘 주 분획이 수집될 수 있었다.
또한, (33 부피% 대신) 34 부피%의 THF의 제1 용리제가 크로마토그래피의 수율을 증가시킴이 입증되었다. 수율은 69%이었다. 주 분획 중 불순물 RRT:0.95의 수준은 0.10 면적%이었다.
31 부피%의 THF를 갖는 용리제가 사용되는 경우, 타크로리무스의 용리 시간이 증가되었다. 상기 언급된 용리제의 농도(31 부피%, 33 부피%, 34 부피%, 40 부피%의 테트라히드로퓨란)는 용매의 농도를 증가시키지 않아도 타크로리무스의 용리에 유용함이 발견되었다.
이들 추가의 실험은 또한 물:테트라히드로퓨란:용매의 용리제 혼합물도 유효함을 입증하였다. 물:테트라히드로퓨란:용매의 용리제에 사용되는 시험된 용매는 메탄올, 아세토니트릴, 아세톤, n-프로판올 및 n-부탄올이었다. 모든 경우에 있어서, 적절한 품질이 수득되었다.
실시예 3
면적 백분율은 전술한 방법에 의해 수득된 HPLC 크로마토그램의 면적 백분율을 의미한다.
하기의 절차는 20℃ 내지 25℃에서 수행하였다.
칼럼(3.2 ㎝의 직경) 중 흡착 수지(Diaion SP 207)의 층을, 물을 사용하여 칼럼을 충전(약 550 ㎖의 습식 흡착 수지)하면서 제조하였다.
타크로리무스(7.2 ｇ)를 아세토니트릴(30 ㎖) 및 물(20 ㎖)의 혼합물에 용해시켰다. 타크로리무스는 약 2.6 면적%의 RRT0.95(아스코마이신) 및 약 2.9 면적%의 RRT1.25(디히드로타크로리무스)를 함유하였다.
타크로리무스 용액을 습식 흡착 수지층의 상부에 층으로서 로딩하였다.
칼럼을 아세토니트릴/물/인산(600:400:1)으로 이루어진, 약 8 ℓ의 용리제로 용리시켰다. 용리 속도는 90 ㎖/시간이었다.
32 내지 45 개의 분획을 배합하였다. 배합된 분획은 1.9 ｇ의 타크로리무스를 함유하였다. 배합된 분획의 불순물 함량은 약 2.9 면적%의 RRT0.95(아스코마이신) 및 약 1.2 면적%의 RRT1.25(디히드로타크로리무스)이었다.
전술한 정제 방법은 디히드로타크로리무스의 감소에 적절하다. 바람직하게 는, 용리제는 약 30% 내지 약 70%의 아세토니트릴 함량을 갖고, 약 40% 내지 약 65%의 아세토니트릴 함량이 바람직하다.
무기산 함량을 사용하여 크로마토그래피 시에 타크로리무스의 분해를 방지한다. 바람직하게는, 무기산은 인산이다. 바람직하게는, 인산 함량은 1 부의 용리제당 약 0.0005 부 내지 0.003 부이다.
전술한 정제 방법은 실시예 1 및 실시예 2에서 기재되어 있는 방법의 효율을 증가시킨다.
실시예 4
실시예 1에 따른 크로마토그래피를 위해 2개의 칼럼을 제조하였다. 크로마토그래피 이전에, 하기의 절차에 따라 타크로리무스를 함유하는 3000 ｇ의 활성 물질을 흡착 수지 XAD 1180 상에 흡착시켰다. 타크로리무스를 15 ℓ의 아세톤에 용해시켰다. 흡착 수지(33 ℓ)를 용액에 첨가하였고, 90 ℓ의 물을 지속적으로 교반하면서 용액/수지 혼합물에 서서히 첨가하였다. 흡착 수지의 로딩 충전물을 제1 칼럼에 포함된 흡착 수지의 상부에 층으로서 로딩(병치)하였다.
제1 칼럼을 테트라히드로퓨란:물의 혼합물(34 부피%의 THF)로 용리하였다. 용리 속도는 15 ℓ/시간이었다. 각각 20 ℓ의 분획을 수집하였다. 각 분획의 부피는 20 ℓ이었다. 35번째 분획의 용리 이후, 제2 칼럼을 제1 칼럼에 일련으로 연결(유동적으로 커플링)하였고, 이 일련의 칼럼 상에서 용리를 지속하였다.
95번째 분획이 용리된 후, 제1 칼럼을 분리하였고, 오로지 제2 칼럼 상에서만 용리를 지속하였다. 정제된, 적절한 분획을 배합하였다.
THF의 주 분획을 감압 하에 증발에 의해 배합된 분획으로부터 제거하였다. 농축물을 에틸아세테이트로 추출하였고, 이들 상을 분리하였다. 분리된 에틸아세테이트 상을 감압 하에 농축하였다(대략 1 부의 타크로리무스 및 1 부의 에틸아세테이트). 시클로헥산 및 물을 농축된 에틸 아세테이트 추출물에 서서히 첨가하였다. 침전된 타크로리무스를 0℃ 내지 30℃에서 혼합물로부터 회수하였다. 결정을 여과 및 건조하였다.
출발 물질은 대략 0.5 면적%의 아스코마이신(RRT 0.95) 및 대략 1.3 면적%의 디히드로타크로리무스(RRT 1.25)를 함유하였다. 생성된 결정은 0.1 면적% 미만의 아스코마이신 및 대략 0.4 면적%의 디히드로타크로리무스를 함유하였다.
실시예 5
타크로리무스를 물:테트라히드로퓨란(67 부피:33 부피)에 용해하였다. 수득된 용매 농도는 대략 30 ｇ/ℓ이었다. 이 용액을 흡착 수지 XAD 1180 상으로 옮겼다. 흡착 수지는 타크로리무스를 흡착하였다.
흡착 이후, 타크로리무스의 용리를 실시예 1에서와 같이 지속하였다.
실시예 6
타크로리무스를 물:테트라히드로퓨란(67 부피:33 부피)에 용해하였다. 수득된 용매 농도는 대략 30 ｇ/ℓ이었다. 이 용액을 흡착 수지 HP20 상으로 옮겼다. 흡착 수지는 타크로리무스를 흡착하였다.
흡착 이후, 타크로리무스의 용리를 실시예 1에서와 같이 지속하였다.
실시예 7
하기의 절차는 28℃ 내지 32℃에서 수행하였다.
칼럼(45 ㎝의 직경) 중 흡착 수지(Amberlite(등록상표) XAD 1180)의 층을 물:THF를 사용하여 칼럼을 충전(약 100 ℓ의 습식 흡착 수지)시키면서 제조하였다.
교반하면서 물(86 ℓ)을 아세토니트릴(10 ℓ) 중 아스코마이신(1227 ｇ)의 용액에 서서히 첨가하였고, 이때 흡착 수지(Amberlite(등록상표) XAD 1180; 9 ℓ)를 교반하면서 현탁시켰다. 사용된 아스코마이신은 RRT1.00(타크로리무스)를 함유하였다. 물의 첨가가 완료되었을 때, 흡착 수지의 로딩 충전물을 여과에 의해 수집하였다.
수집된 로딩 충전물을 습식 흡착 수지층의 상부에 층으로서 로딩(병치)하였다.
먼저 칼럼을 THF/물(33 부피%의 THF)로 이루어진, 약 1800 ℓ의 제1 용리제로 용리시켰다. 그 후, 칼럼을 THF/물(40 부피%의 THF)로 이루어진 제2 용리제로 용리시켰다. 용리 속도는 약 11 내지 약 13 ℓ/시간(6.9 내지 8.2 ㎝/시간)이었다. 아스코마이신을 함유하는, 약 460 ℓ의 주 분획을 수집하였다. 아스코마이신을 함유하는, 약 80 ℓ의 예비-분획도 수집하였다.
주 분획(460 ℓ)을 85%(460 ㎖)의 인산과 배합하였고, 감압에서 약 230 ℓ의 부피로 농축하였다. 농축물을 1일 간 상온에서 정치하였다. 결정을 헥산으로 세정하였고 40℃에서 건조시켰다.
실시예 8
실시예 1에 따른 크로마토그래피를 위하여 2개의 칼럼을 제조하였다.
크로마토그래피 이전에, 아스코마이신을 함유하는 3000 ｇ의 활성 물질을 하기의 절차에 따라 흡착 수지 XAD 1180 상에 흡착시켰다. 아스코마이신을 15 ℓ의 아세톤에 용해시켰다. 흡착 수지(33 ℓ)를 용액에 첨가하였고, 90 ℓ의 물을 지속적으로 교반하면서 용액/수지 혼합물에 서서히 첨가하였다. 흡착 수지의 로딩 충전물을 제1 칼럼에 포함된 흡착 수지의 상부에 층으로서 로딩(병치)하였다.
제1 칼럼을 테트라히드로퓨란:물의 혼합물(34 부피%의 THF)로 용리하였다. 용리 속도는 15 ℓ/시간이었다. 각각 20 ℓ의 분획을 수집하였다. 각 분획의 부피는 20 ℓ이었다. 35번째의 용리 이후, 제2 칼럼을 제1 칼럼에 일련으로 연결(유동적으로 커플링)하였고, 이 일련의 칼럼 상에서 용리를 지속하였다.
95번째의 분획이 용리된 이후, 제1 칼럼을 분리하였고, 용리를 오로지 제2 칼럼 상에서 지속하였다. 정제된, 적절한 분획을 배합하였다.
THF의 주 분획을 감압 하에 증발에 의해 배합된 분획으로부터 제거하였다. 농축물을 에틸아세테이트로 추출하였고, 이들 상을 분리하였다. 분리된 에틸아세테이트 상을 감압 하에 농축하였다(대략 1 부의 아스코마이신 및 1 부의 에틸아세테이트). 시클로헥산 및 물을 농축된 에틸 아세테이트 추출물에 서서히 첨가하였다. 침전된 아스코마이신을 0℃ 내지 30℃에서 혼합물로부터 회수하였다. 결정을 여과 및 건조하였다.
실시예 9
하기의 절차는 28℃ 내지 32℃에서 수행하였다.
칼럼(45 ㎝의 직경) 중 흡착 수지(Amberlite(등록상표) XAD 1180)의 층을 물 :THF를 사용하여 칼럼을 충전(약 100 ℓ의 습식 흡착 수지)시키면서 제조하였다.
교반하면서 물(86 ℓ)을 아세토니트릴(10 ℓ) 중 시로리무스(1227 ｇ)의 용액에 서서히 첨가하였고, 이때 흡착 수지(Amberlite(등록상표) XAD 1180; 9 ℓ)를 교반하면서 현탁시켰다. 사용된 시로리무스는 불순물을 함유하였다. 물의 첨가가 완료되었을 때, 흡착 수지의 로딩 충전물을 여과에 의해 수집하였다.
수집된 로딩 충전물을 습식 흡착 수지층의 상부에 층으로서 로딩(병치)하였다.
먼저 칼럼을 THF/물(33 부피%의 THF)로 이루어진, 약 1800 ℓ의 제1 용리제로 용리시켰다. 그 후, 칼럼을 THF/물(40 부피%의 THF)로 이루어진 제2 용리제로 용리시켰다. 용리 속도는 약 11 내지 약 13 ℓ/시간(6.9 내지 8.2 ㎝/시간)이었다. 시로리무스를 함유하는, 약 460 ℓ의 주 분획을 수집하였다. 시로리무스를 함유하는, 약 80 ℓ의 예비-분획도 수집하였다.
주 분획(460 ℓ)을 85%(460 ㎖)의 인산과 배합하였고, 감압에서 약 230 ℓ의 부피로 농축하였다. 농축물을 1일 간 상온에서 정치하였다. 결정을 헥산으로 세정하였고 40℃에서 건조시켰다.
실시예 10
실시예 1에 따른 크로마토그래피를 위하여 2개의 칼럼을 제조하였다.
크로마토그래피 이전에, 시로리무스를 함유하는 3000 ｇ의 활성 물질을 하기의 절차에 따라 흡착 수지 XAD 1180 상에 흡착시켰다. 시로리무스를 15 ℓ의 아세톤에 용해시켰다. 흡착 수지(33 ℓ)를 용액에 첨가하였고, 90 ℓ의 물을 지속적으 로 교반하면서 용액/수지 혼합물에 서서히 첨가하였다. 흡착 수지의 로딩 충전물을 제1 칼럼에 포함된 흡착 수지의 상부에 층으로서 로딩(병치)하였다.
제1 칼럼을 테트라히드로퓨란:물의 혼합물(34 부피%의 THF)로 용리하였다. 용리 속도는 15 ℓ/시간이었다. 각각 20 ℓ의 분획을 수집하였다. 각 분획의 부피는 20 ℓ이었다. 35번째의 용리 이후, 제2 칼럼을 제1 칼럼에 일련으로 연결(유동적으로 커플링)하였고, 이 일련의 칼럼 상에서 용리를 지속하였다.
95번째의 분획이 용리된 이후, 제1 칼럼을 분리하였고, 용리를 오로지 제2 칼럼 상에서 지속하였다. 정제된, 적절한 분획을 배합하였다.
THF의 주 분획을 감압 하에 증발에 의해 배합된 분획으로부터 제거하였다. 농축물을 에틸아세테이트로 추출하였고, 이들 상을 분리하였다. 분리된 에틸아세테이트 상을 감압 하에 농축하였다(대략 1 부의 시로리무스 및 1 부의 에틸아세테이트). 시클로헥산 및 물을 농축된 에틸 아세테이트 추출물에 서서히 첨가하였다. 침전된 시로리무스를 0℃ 내지 30℃에서 혼합물로부터 회수하였다. 결정을 여과 및 건조하였다.
실시예 11
하기의 절차는 28℃ 내지 32℃에서 수행하였다.
칼럼(45 ㎝의 직경) 중 흡착 수지(Amberlite(등록상표) XAD 1180)의 층을 물:THF를 사용하여 칼럼을 충전(약 100 ℓ의 습식 흡착 수지)시키면서 제조하였다.
교반하면서 물(86 ℓ)을 아세토니트릴(10 ℓ) 중 에베로리무스(1227 ｇ)의 용액에 서서히 첨가하였고, 이때 흡착 수지(Amberlite(등록상표) XAD 1180; 9 ℓ) 를 교반하면서 현탁시켰다. 사용된 에베로리무스는 불순물을 함유하였다. 물의 첨가가 완료되었을 때, 흡착 수지의 로딩 충전물을 여과에 의해 수집하였다.
수집된 로딩 충전물을 습식 흡착 수지층의 상부에 층으로서 로딩(병치)하였다.
먼저 칼럼을 THF/물(33 부피%의 THF)로 이루어진, 약 1800 ℓ의 제1 용리제로 용리시켰다. 그 후, 칼럼을 THF/물(40 부피%의 THF)로 이루어진 제2 용리제로 용리시켰다. 용리 속도는 약 11 내지 약 13 ℓ/시간(6.9 내지 8.2 ㎝/시간)이었다. 에베로리무스를 함유하는, 약 460 ℓ의 주 분획을 수집하였다. 에베로리무스를 함유하는, 약 80 ℓ의 예비-분획도 수집하였다.
주 분획(460 ℓ)을 85%(460 ㎖)의 인산과 배합하였고, 감압에서 약 230 ℓ의 부피로 농축하였다. 농축물을 1일 간 상온에서 정치하였다. 결정을 헥산으로 세정하였고 40℃에서 건조시켰다.
실시예 12
실시예 1에 따른 크로마토그래피를 위한 2개의 칼럼을 제조하였다.
크로마토그래피 이전에, 에베로리무스를 함유하는 3000 ｇ의 활성 물질을 하기의 절차에 따라 흡착 수지 XAD 1180 상에 흡착시켰다. 에베로리무스를 15 ℓ의 아세톤에 용해시켰다. 흡착 수지(33 ℓ)를 용액에 첨가하였고, 90 ℓ의 물을 지속적으로 교반하면서 용액/수지 혼합물에 서서히 첨가하였다. 흡착 수지의 로딩 충전물을 제1 칼럼에 함유된 흡착 수지의 상부에 층으로서 로딩(병치)하였다.
제1 칼럼을 테트라히드로퓨란:물의 혼합물(34 부피%의 THF)로 용리하였다. 용리 속도는 15 ℓ/시간이었다. 각각 20 ℓ의 분획을 수집하였다. 각 분획의 부피는 20 ℓ이었다. 35번째의 용리 이후, 제2 칼럼을 제1 칼럼에 일련으로 연결(유동적으로 커플링)하였고, 이 일련의 칼럼 상에서 용리를 지속하였다.
95번째의 분획이 용리된 이후, 제1 칼럼을 분리하였고, 용리를 오로지 제2 칼럼 상에서 지속하였다. 정제된, 적절한 분획을 배합하였다.
THF의 주 분획을 감압 하에 증발에 의해 배합된 분획으로부터 제거하였다. 농축물을 에틸아세테이트로 추출하였고, 이들 상을 분리하였다. 분리된 에틸아세테이트 상을 감압 하에 농축하였다(대략 1 부의 에베로리무스 및 1 부의 에틸아세테이트). 시클로헥산 및 물을 농축된 에틸 아세테이트 추출물에 서서히 첨가하였다. 침전된 에베로리무스를 0℃ 내지 30℃에서 혼합물로부터 회수하였다. 결정을 여과 및 건조하였다.
실시예 13
하기의 절차는 28℃ 내지 32℃에서 수행하였다.
칼럼(45 ㎝의 직경) 중 흡착 수지(Amberlite(등록상표) XAD 1180)의 층을 제조하였고, 이때 물:THF를 사용하여 칼럼을 충전시켰다(약 100 ℓ의 습식 흡착 수지).
교반하면서 물(86 ℓ)을 아세토니트릴(10 ℓ) 중 피메크로리무스(1227 ｇ)의 용액에 서서히 첨가하였고, 이때 흡착 수지(Amberlite(등록상표) XAD 1180; 9 ℓ)를 교반하면서 현탁시켰다. 사용된 피메크로리무스는 불순물을 함유하였다. 물의 첨가가 완료되었을 때, 흡착 수지의 로딩 충전물을 여과에 의해 수집하였다.
수집된 로딩 충전물을 습식 흡착 수지층의 상부에 층으로서 로딩(병치)하였다.
먼저 칼럼을 THF/물(33 부피%의 THF)로 이루어진, 약 1800 ℓ의 제1 용리제로 용리시켰다. 그 후, 칼럼을 THF/물(40 부피%의 THF)로 이루어진 제2 용리제로 용리시켰다. 용리 속도는 약 11 내지 약 13 ℓ/시간(6.9 내지 8.2 ㎝/시간)이었다. 피메크로리무스를 함유하는, 약 460 ℓ의 주 분획을 수집하였다. 피메크로리무스를 함유하는, 약 80 ℓ의 예비-분획도 수집하였다.
주 분획(460 ℓ)을 85%(460 ㎖)의 인산과 배합하였고, 감압에서 약 230 ℓ의 부피로 농축하였다. 농축물을 1일 간 상온에서 정치하였다. 결정을 헥산으로 세정하였고 40℃에서 건조시켰다.
실시예 14
실시예 1에 따른 크로마토그래피를 위하여 2개의 칼럼을 제조하였다.
크로마토그래피 이전에, 피메크로리무스를 함유하는 3000 ｇ의 활성 물질을 하기의 절차에 따라 흡착 수지 XAD 1180 상에 흡착시켰다. 피메크로리무스를 15 ℓ의 아세톤에 용해시켰다. 흡착 수지(33 ℓ)를 용액에 첨가하였고, 90 ℓ의 물을 지속적으로 교반하면서 용액/수지 혼합물에 서서히 첨가하였다. 흡착 수지의 로딩 충전물을 제1 칼럼에 포함된 흡착 수지의 상부에 층으로서 로딩(병치)하였다.
제1 칼럼을 테트라히드로퓨란:물의 혼합물(34 부피%의 THF)로 용리하였다. 용리 속도는 15 ℓ/시간이었다. 각각 20 ℓ의 분획을 수집하였다. 각 분획의 부피는 20 ℓ이었다. 35번째의 용리 이후, 제2 칼럼을 제1 칼럼에 일련으로 연결(유동 적으로 커플링)하였고, 이 일련의 칼럼 상에서 용리를 지속하였다.
95번째의 분획이 용리된 이후, 제1 칼럼을 분리하였고, 용리를 오로지 제2 칼럼 상에서 지속하였다. 정제된, 적절한 분획을 배합하였다.
THF의 주 분획을 감압 하에 증발에 의해 배합된 분획으로부터 제거하였다. 농축물을 에틸아세테이트로 추출하였고, 이들 상을 분리하였다. 분리된 에틸아세테이트 상을 감압 하에 농축하였다(대략 1 부의 피메크로리무스 및 1 부의 에틸아세테이트). 시클로헥산 및 물을 농축된 에틸 아세테이트 추출물에 서서히 첨가하였다. 침전된 피메크로리무스를 0℃ 내지 30℃에서 혼합물로부터 회수하였다. 결정을 여과 및 건조하였다.

Claims (48)

  1. a) 불순물의 초기 수준을 갖는 마크로라이드의 로딩 충전물(loading charge)을 제공하는 단계,
    b) 이 로딩 충전물을 흡착 수지층에 로딩하는 단계,
    c) 이 로딩된 흡착 수지층을 테트라히드로퓨란 및 아세토니트릴 중에서 선택된 유기 용매 및 물을 포함하는 용리제로 용리시켜, 배출액을 수득하는 단계, 및
    d) 마크로라이드를 포함하는 배출액의 하나 이상의 분획을 수집하는 단계
    를 포함하여, 마크로라이드를 그 내부의 불순물로부터 분리하는 방법.
  2. 제1항에 있어서, 마크로라이드의 로딩 충전물은 흡착 수지의 로딩부를 더 함유하는 것인 방법.
  3. 제2항에 있어서, 로딩 충전물은 용액을 반용매와 배합시키는 것을 포함하는 단계에서 유기 용매 중의 이의 용액으로부터 로딩부 상에 증착되는 것인 방법.
  4. 제3항에 있어서, 유기 용매는 테트라히드로퓨란, 아세톤, 아세토니트릴, 메탄올, 에탄올, n-부탄올, n-프로판올, 이소-프로판올, 에스테르 및 쌍극성 비양성자성 용매로 이루어진 군 중에서 선택된 것인 방법.
  5. 제4항에 있어서, 유기 용매는 테트라히드로퓨란, 아세톤 및 아세토니트릴로 이루어진 군 중에서 선택된 것인 방법.
  6. 제3항에 있어서, 반용매는 물, 직선형 또는 분지형 알칸, 또는 시클로알칸으로 이루어진 군 중에서 선택된 것인 방법.
  7. 제6항에 있어서, 반용매는 물인 것인 방법.
  8. 제3항에 있어서, 배합된 반용매에 대한 배합된 용액의 비율은 40% 이하인 것인 방법.
  9. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 마크로라이드를 하나 이상의 분획으로부터 분리하는 단계를 더 포함하며, 여기서 마크로라이드는 불순물의 초기 수준보다 낮은 불순물의 최종 수준을 갖는 것인 방법.
  10. 제9항에 있어서, 분리 단계는 감압 및 약 70℃ 이하의 온도에서 하나 이상의 분획을 농축시키는 단계를 포함하는 것인 방법.
  11. 제10항에 있어서, 온도는 약 60℃ 이하인 것인 방법.
  12. 제10항에 있어서, 압력은 약 760 mmHg인 것인 방법.
  13. 제10항에 있어서, 농축 이전에, 하나 이상의 분획을 무기산과 배합시키는 단계를 더 포함하는 것인 방법.
  14. 제13항에 있어서, 무기산은 인산인 것인 방법.
  15. 제13항에 있어서, 산의 양은 용리제의 리터당 1 ㎖ 내지 약 10 ㎖인 것인 방법.
  16. 제9항에 있어서, 분리 단계는 반용매를 용리제의 하나 이상의 분획과 배합시키는 단계를 포함하는 것인 방법.
  17. 제16항에 있어서, 배합 이전에, 배출액의 하나 이상의 분획은 감압에서 농축되는 것인 방법.
  18. 제1항 내지 제17항 중 어느 한 항에 있어서, 흡착 수지는 거대망상 수지인 것인 방법.
  19. 제18항에 있어서, 거대망상 수지는 Amberlite(등록상표) XAD 수지 및 Diaion 흡착 수지로 이루어진 군 중에서 선택된 것인 방법.
  20. 제19항에 있어서, 거대망상 수지는 Amberlite(등록상표) XAD 1180인 것인 방법.
  21. 제1항 내지 제20항 중 어느 한 항에 있어서, 흡착 수지층은 칼럼 내에 한정되는 것인 방법.
  22. 제1항 내지 제21항 중 어느 한 항에 있어서, 하나 이상의 분획으로 수집되는 배출액의 부피는 로딩 충전물 중 초기에 존재한 마크로라이드의 약 60 중량% 내지 약 90 중량%를 포함하는 것인 방법.
  23. 제1항 내지 제22항 중 어느 한 항에 있어서, 용리제의 유속은 약 25 ㎝/h 미만인 것인 방법.
  24. 제23항에 있어서, 용리제의 유속은 약 15 ㎝/h 미만인 것인 방법.
  25. 제1항 내지 제24항 중 어느 한 항에 있어서, 마크로라이드는 타크로리무스(tacrolimus), 아스코마이신(ascomycin), 시로리무스(sirolimus), 에베로리무스(everolimus), 및 피메크로리무스(pimecrolimus)로 이루어진 군 중에서 선택된 것 인 방법.
  26. 제25항에 있어서, 마크로라이드는 타크로리무스인 것인 방법.
  27. 제26항에 있어서, 용리제는 약 20 부피% 내지 약 50 부피%의 테트라히드로퓨란을 갖는, 테트라히드라퓨란 및 물의 혼합물을 포함하는 것인 방법.
  28. 제27항에 있어서, 용리제는 약 31 부피% 내지 약 40 부피%의 테트라히드로퓨란을 갖는 것인 방법.
  29. 제28항에 있어서, 용리제는 약 33 부피% 내지 약 35 부피%의 테트라히드로퓨란을 갖는 것인 방법.
  30. 제26항에 있어서, 용리제는 약 30 부피% 내지 약 70 부피%의 아세토니트릴을 갖는, 아세토니트릴 및 물의 혼합물을 포함하는 것인 방법.
  31. 제30항에 있어서, 용리제는 약 40 부피% 내지 약 65 부피%의 아세토니트릴을 갖는 것인 방법.
  32. 제1항 내지 제31항 중 어느 한 항에 있어서, 용리제는 1 부피부의 용리제당 약 0.003 부피부 이하의 무기산을 포함하는 것인 방법.
  33. 제32항에 있어서, 무기산은 인산인 것인 방법.
  34. 제25항에 있어서, 마크로라이드는 아스코마이신인 것인 방법.
  35. 제25항에 있어서, 마크로라이드는 시로리무스인 것인 방법.
  36. 제25항에 있어서, 마크로라이드는 에베로리무스인 것인 방법.
  37. 제25항에 있어서, 마크로라이드는 피메크로리무스인 것인 방법.
  38. 제2항 내지 제37항 중 어느 한 항에 있어서, 로딩 충전물은 재순환 시스템 중 흡착 수지의 로딩부 상에 로딩되는 것인 방법.
  39. 제1항에 있어서, 하나 이상의 추가의 흡착 수지층은 단계 b의 흡착 수지층에 연결되는 것인 방법.
  40. 제39항에 있어서, 추가의 일련의 용리제의 분획 이후 단계 b의 수지층이 분리되는 것인 방법.
  41. a) 불순물인 아스코마이신 및 디히드로타크로리무스의 초기 수준을 갖는 타크로리무스의 로딩 충전물을 거대망상 수지인 흡착 수지의 로딩부 상에 제공하는 단계,
    b) 타크로리무스의 로딩 충전물을 갖는 이 로딩부를 흡착 수지층에 병치시키는 단계,
    c) 로딩부 및 이에 병치된 층을 테트라히드로퓨란 및 아세토니트릴 중에서 선택된 유기 용매 및 물을 포함하는 용리제로 용리시켜, 배출액을 수득하는 단계,
    d) 용리제의 하나 이상의 분획을 수집하는 단계, 및
    e) 불순물인 아스코마이신 및 디히드로타크로리무스의 최종 수준을 갖는 타크로리무스를 하나 이상의 분획으로부터 분리하는 단계로서, 여기서 불순물인 아스코마이신 및 디히드로타크로리무스의 최종 수준은 이들 불순물의 초기 수준보다 낮은 것인 단계
    를 포함하여, 타크로리무스를 그 내부의 불순물인 아스코마이신 및 디히드로타크로리무스로부터 분리하는 방법.
  42. 제41항에 있어서, 용리제는 약 20 부피% 내지 약 50 부피%의 테트라히드로퓨란을 갖는, 테트라히드로퓨란 및 물의 혼합물을 포함하는 것인 방법.
  43. 제42항에 있어서, 용리제는 약 31 부피% 내지 약 40 부피%의 테트라히드로퓨 란을 갖는, 테트라히드로퓨란 및 물의 혼합물을 포함하는 것인 방법.
  44. 제43항에 있어서, 혼합물은 약 33 부피% 내지 약 35 부피%의 테트라히드로퓨란을 갖는 것인 방법.
  45. 제41항에 있어서, 용리제는 약 30 부피% 내지 약 70 부피%의 아세토니트릴을 갖는, 아세토니트릴 및 물의 혼합물을 포함하는 것인 방법.
  46. 제45항에 있어서, 용리제는 약 40 부피% 내지 약 65 부피%의 아세토니트릴을 갖는 것인 방법.
  47. 제41항에 있어서, 용리제는 용리제의 부피부당 약 0.003 부피부 이하의 무기산을 더 포함하는 것인 방법.
  48. 제47항에 있어서, 무기산은 인산인 것인 방법.
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