CZ293687B6 - Purifikační postup pro přípravu vysoce čistého cyklosporinu A a vysoce čistý cyklosporin A takto připravený - Google Patents
Purifikační postup pro přípravu vysoce čistého cyklosporinu A a vysoce čistý cyklosporin A takto připravený Download PDFInfo
- Publication number
- CZ293687B6 CZ293687B6 CZ19983814A CZ381498A CZ293687B6 CZ 293687 B6 CZ293687 B6 CZ 293687B6 CZ 19983814 A CZ19983814 A CZ 19983814A CZ 381498 A CZ381498 A CZ 381498A CZ 293687 B6 CZ293687 B6 CZ 293687B6
- Authority
- CZ
- Czechia
- Prior art keywords
- cyclosporin
- toluene
- liters
- chromatography
- process according
- Prior art date
Links
- PMATZTZNYRCHOR-CGLBZJNRSA-N Cyclosporin A Chemical compound CC[C@@H]1NC(=O)[C@H]([C@H](O)[C@H](C)C\C=C\C)N(C)C(=O)[C@H](C(C)C)N(C)C(=O)[C@H](CC(C)C)N(C)C(=O)[C@H](CC(C)C)N(C)C(=O)[C@@H](C)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](CC(C)C)N(C)C(=O)[C@H](C(C)C)NC(=O)[C@H](CC(C)C)N(C)C(=O)CN(C)C1=O PMATZTZNYRCHOR-CGLBZJNRSA-N 0.000 title claims abstract description 69
- 108010036949 Cyclosporine Proteins 0.000 title claims abstract description 69
- 229960001265 ciclosporin Drugs 0.000 title claims abstract description 65
- 229930105110 Cyclosporin A Natural products 0.000 title claims abstract description 64
- 238000000746 purification Methods 0.000 title claims description 16
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 title claims description 5
- YXFVVABEGXRONW-UHFFFAOYSA-N Toluene Chemical compound CC1=CC=CC=C1 YXFVVABEGXRONW-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 72
- 238000000034 method Methods 0.000 claims abstract description 42
- 239000000203 mixture Substances 0.000 claims abstract description 42
- 229930182912 cyclosporin Natural products 0.000 claims abstract description 39
- 238000004587 chromatography analysis Methods 0.000 claims abstract description 29
- VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N Silicium dioxide Chemical compound O=[Si]=O VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 20
- 239000012043 crude product Substances 0.000 claims abstract description 17
- 239000000741 silica gel Substances 0.000 claims abstract description 17
- 229910002027 silica gel Inorganic materials 0.000 claims abstract description 17
- CSCPPACGZOOCGX-UHFFFAOYSA-N Acetone Chemical compound CC(C)=O CSCPPACGZOOCGX-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 24
- XEKOWRVHYACXOJ-UHFFFAOYSA-N Ethyl acetate Chemical compound CCOC(C)=O XEKOWRVHYACXOJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 18
- UCOQITKXMNKTKF-MXGZYYNMSA-N (3s,6s,9s,12r,15s,18s,21s,24s,30s,33s)-33-[(e,1r,2r)-1-hydroxy-2-methylhex-4-enyl]-1,4,7,10,12,15,19,25,28,30-decamethyl-6,9,18,24-tetrakis(2-methylpropyl)-3,21-di(propan-2-yl)-1,4,7,10,13,16,19,22,25,28,31-undecazacyclotritriacontane-2,5,8,11,14,17,20,23 Chemical compound C\C=C\C[C@@H](C)[C@@H](O)[C@@H]1N(C)C(=O)[C@H](C(C)C)N(C)C(=O)[C@H](CC(C)C)N(C)C(=O)[C@H](CC(C)C)N(C)C(=O)[C@@H](C)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](CC(C)C)N(C)C(=O)[C@H](C(C)C)NC(=O)[C@H](CC(C)C)N(C)C(=O)CN(C)C(=O)[C@H](C)NC1=O UCOQITKXMNKTKF-MXGZYYNMSA-N 0.000 claims description 12
- XYKIUTSFQGXHOW-UHFFFAOYSA-N propan-2-one;toluene Chemical compound CC(C)=O.CC1=CC=CC=C1 XYKIUTSFQGXHOW-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 12
- ZNVBEWJRWHNZMK-SYOLRUPNSA-N (3s,6s,9s,12r,15s,18s,21s,24s,30s,33s)-33-[(e,1r,2r)-1-hydroxy-2-methylhex-4-enyl]-1,4,7,10,12,15,19,25,28-nonamethyl-6,9,18,24-tetrakis(2-methylpropyl)-3,21,30-tri(propan-2-yl)-1,4,7,10,13,16,19,22,25,28,31-undecazacyclotritriacontane-2,5,8,11,14,17,20,2 Chemical compound C\C=C\C[C@@H](C)[C@@H](O)[C@@H]1N(C)C(=O)[C@H](C(C)C)N(C)C(=O)[C@H](CC(C)C)N(C)C(=O)[C@H](CC(C)C)N(C)C(=O)[C@@H](C)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](CC(C)C)N(C)C(=O)[C@H](C(C)C)NC(=O)[C@H](CC(C)C)N(C)C(=O)CN(C)C(=O)[C@H](C(C)C)NC1=O ZNVBEWJRWHNZMK-SYOLRUPNSA-N 0.000 claims description 11
- 108010019594 cyclosporin D Proteins 0.000 claims description 11
- FWMBRFVXLUJFCT-WKHWYDSQSA-N (3s,6s,9s,12r,15s,18s,21s,24s,30s,33s)-30-ethyl-33-[(e,1r,2r)-1-hydroxy-2-methylhex-4-enyl]-1,4,7,10,12,15,25,28-octamethyl-6,9,18,24-tetrakis(2-methylpropyl)-3,21-di(propan-2-yl)-1,4,7,10,13,16,19,22,25,28,31-undecazacyclotritriacontane-2,5,8,11,14,17,20 Chemical compound CC[C@@H]1NC(=O)[C@H]([C@H](O)[C@H](C)C\C=C\C)N(C)C(=O)[C@H](C(C)C)N(C)C(=O)[C@H](CC(C)C)N(C)C(=O)[C@H](CC(C)C)N(C)C(=O)[C@@H](C)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](C(C)C)NC(=O)[C@H](CC(C)C)N(C)C(=O)CN(C)C1=O FWMBRFVXLUJFCT-WKHWYDSQSA-N 0.000 claims description 9
- ZSNYYEIGOZADKA-UHFFFAOYSA-N Cyclosporin L Natural products CCC1NC(=O)C(C(O)C(C)CC=CC)NC(=O)C(C(C)C)N(C)C(=O)C(CC(C)C)N(C)C(=O)C(CC(C)C)N(C)C(=O)C(C)NC(=O)C(C)NC(=O)C(CC(C)C)N(C)C(=O)C(C(C)C)NC(=O)C(CC(C)C)N(C)C(=O)CN(C)C1=O ZSNYYEIGOZADKA-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 9
- FWMBRFVXLUJFCT-UHFFFAOYSA-N Cyclosporin U Natural products CCC1NC(=O)C(C(O)C(C)CC=CC)N(C)C(=O)C(C(C)C)N(C)C(=O)C(CC(C)C)N(C)C(=O)C(CC(C)C)N(C)C(=O)C(C)NC(=O)C(C)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(C(C)C)NC(=O)C(CC(C)C)N(C)C(=O)CN(C)C1=O FWMBRFVXLUJFCT-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 9
- 238000011210 chromatographic step Methods 0.000 claims description 9
- 239000011877 solvent mixture Substances 0.000 claims description 9
- 238000010828 elution Methods 0.000 claims description 8
- OAMZXMDZZWGPMH-UHFFFAOYSA-N ethyl acetate;toluene Chemical compound CCOC(C)=O.CC1=CC=CC=C1 OAMZXMDZZWGPMH-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 6
- 238000010898 silica gel chromatography Methods 0.000 claims description 6
- 239000007858 starting material Substances 0.000 claims 1
- 239000002904 solvent Substances 0.000 abstract description 10
- 238000011097 chromatography purification Methods 0.000 abstract description 6
- OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N Methanol Chemical compound OC OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 54
- HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N Chloroform Chemical compound ClC(Cl)Cl HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 28
- 239000000047 product Substances 0.000 description 22
- 108010036941 Cyclosporins Proteins 0.000 description 15
- 239000012535 impurity Substances 0.000 description 13
- JTOKYIBTLUQVQV-QRVTZXGZSA-N (3s,6s,9s,12r,15s,18s,21s,24s,30s,33s)-30-[(1r)-1-hydroxyethyl]-33-[(e,1r,2r)-1-hydroxy-2-methylhex-4-enyl]-1,4,7,10,12,15,19,25,28-nonamethyl-6,9,18,24-tetrakis(2-methylpropyl)-3,21-di(propan-2-yl)-1,4,7,10,13,16,19,22,25,28,31-undecazacyclotritriacontan Chemical compound C\C=C\C[C@@H](C)[C@@H](O)[C@@H]1N(C)C(=O)[C@H](C(C)C)N(C)C(=O)[C@H](CC(C)C)N(C)C(=O)[C@H](CC(C)C)N(C)C(=O)[C@@H](C)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](CC(C)C)N(C)C(=O)[C@H](C(C)C)NC(=O)[C@H](CC(C)C)N(C)C(=O)CN(C)C(=O)[C@H]([C@@H](C)O)NC1=O JTOKYIBTLUQVQV-QRVTZXGZSA-N 0.000 description 12
- JTOKYIBTLUQVQV-UHFFFAOYSA-N Cyclosporin C Natural products CC=CCC(C)C(O)C1N(C)C(=O)C(C(C)C)N(C)C(=O)C(CC(C)C)N(C)C(=O)C(CC(C)C)N(C)C(=O)C(C)NC(=O)C(C)NC(=O)C(CC(C)C)N(C)C(=O)C(C(C)C)NC(=O)C(CC(C)C)N(C)C(=O)CN(C)C(=O)C(C(C)O)NC1=O JTOKYIBTLUQVQV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 12
- 108010019248 cyclosporin C Proteins 0.000 description 12
- VLKZOEOYAKHREP-UHFFFAOYSA-N n-Hexane Chemical compound CCCCCC VLKZOEOYAKHREP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 12
- 239000003480 eluent Substances 0.000 description 10
- YMWUJEATGCHHMB-UHFFFAOYSA-N Dichloromethane Chemical compound ClCCl YMWUJEATGCHHMB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 9
- 239000002699 waste material Substances 0.000 description 9
- RTZKZFJDLAIYFH-UHFFFAOYSA-N Diethyl ether Chemical compound CCOCC RTZKZFJDLAIYFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 8
- 238000001704 evaporation Methods 0.000 description 8
- 230000008020 evaporation Effects 0.000 description 8
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 7
- 238000000855 fermentation Methods 0.000 description 7
- 230000004151 fermentation Effects 0.000 description 7
- 238000012856 packing Methods 0.000 description 7
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 7
- FDSGHYHRLSWSLQ-UHFFFAOYSA-N dichloromethane;propan-2-one Chemical compound ClCCl.CC(C)=O FDSGHYHRLSWSLQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 238000004128 high performance liquid chromatography Methods 0.000 description 6
- QWXYZCJEXYQNEI-OSZHWHEXSA-N intermediate I Chemical compound COC(=O)[C@@]1(C=O)[C@H]2CC=[N+](C\C2=C\C)CCc2c1[nH]c1ccccc21 QWXYZCJEXYQNEI-OSZHWHEXSA-N 0.000 description 6
- 239000000463 material Substances 0.000 description 6
- PNEYBMLMFCGWSK-UHFFFAOYSA-N aluminium oxide Inorganic materials [O-2].[O-2].[O-2].[Al+3].[Al+3] PNEYBMLMFCGWSK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 239000004480 active ingredient Substances 0.000 description 4
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 4
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 4
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 4
- 238000004809 thin layer chromatography Methods 0.000 description 4
- QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N Acetic acid Chemical compound CC(O)=O QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 239000012141 concentrate Substances 0.000 description 3
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 3
- XELZGAJCZANUQH-UHFFFAOYSA-N methyl 1-acetylthieno[3,2-c]pyrazole-5-carboxylate Chemical compound CC(=O)N1N=CC2=C1C=C(C(=O)OC)S2 XELZGAJCZANUQH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 239000003208 petroleum Substances 0.000 description 3
- 238000011069 regeneration method Methods 0.000 description 3
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 3
- OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N Carbon Chemical compound [C] OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241000123975 Trichoderma polysporum Species 0.000 description 2
- 230000001363 autoimmune Effects 0.000 description 2
- 230000000052 comparative effect Effects 0.000 description 2
- 239000000470 constituent Substances 0.000 description 2
- 238000013461 design Methods 0.000 description 2
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 2
- 238000001914 filtration Methods 0.000 description 2
- 239000012467 final product Substances 0.000 description 2
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 2
- 239000003960 organic solvent Substances 0.000 description 2
- 230000000144 pharmacologic effect Effects 0.000 description 2
- 238000001953 recrystallisation Methods 0.000 description 2
- 230000008929 regeneration Effects 0.000 description 2
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- WSLDOOZREJYCGB-UHFFFAOYSA-N 1,2-Dichloroethane Chemical compound ClCCCl WSLDOOZREJYCGB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 208000023328 Basedow disease Diseases 0.000 description 1
- 206010009900 Colitis ulcerative Diseases 0.000 description 1
- 241000875119 Cylindrocarpon lucidum Species 0.000 description 1
- 208000015023 Graves' disease Diseases 0.000 description 1
- 102000000588 Interleukin-2 Human genes 0.000 description 1
- 108010002350 Interleukin-2 Proteins 0.000 description 1
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 201000004681 Psoriasis Diseases 0.000 description 1
- 208000034189 Sclerosis Diseases 0.000 description 1
- 230000024932 T cell mediated immunity Effects 0.000 description 1
- 230000006052 T cell proliferation Effects 0.000 description 1
- 241001149964 Tolypocladium Species 0.000 description 1
- 241001149960 Tolypocladium inflatum Species 0.000 description 1
- 201000006704 Ulcerative Colitis Diseases 0.000 description 1
- 239000013543 active substance Substances 0.000 description 1
- 239000000654 additive Substances 0.000 description 1
- 230000001476 alcoholic effect Effects 0.000 description 1
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 1
- 239000002518 antifoaming agent Substances 0.000 description 1
- 230000003115 biocidal effect Effects 0.000 description 1
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 1
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 1
- RCTFHBWTYQOVGJ-UHFFFAOYSA-N chloroform;dichloromethane Chemical compound ClCCl.ClC(Cl)Cl RCTFHBWTYQOVGJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- WYJQVXRGLXLWMZ-UHFFFAOYSA-N chloroform;dichloromethane;ethanol Chemical compound CCO.ClCCl.ClC(Cl)Cl WYJQVXRGLXLWMZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000004140 cleaning Methods 0.000 description 1
- 238000010924 continuous production Methods 0.000 description 1
- 125000004122 cyclic group Chemical group 0.000 description 1
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 1
- 238000011161 development Methods 0.000 description 1
- 230000018109 developmental process Effects 0.000 description 1
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 1
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 1
- 239000013583 drug formulation Substances 0.000 description 1
- LJQKCYFTNDAAPC-UHFFFAOYSA-N ethanol;ethyl acetate Chemical compound CCO.CCOC(C)=O LJQKCYFTNDAAPC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000012259 ether extract Substances 0.000 description 1
- 239000000284 extract Substances 0.000 description 1
- 230000002349 favourable effect Effects 0.000 description 1
- 239000000945 filler Substances 0.000 description 1
- 239000000706 filtrate Substances 0.000 description 1
- 230000000855 fungicidal effect Effects 0.000 description 1
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 1
- 210000002216 heart Anatomy 0.000 description 1
- 238000010438 heat treatment Methods 0.000 description 1
- 208000014951 hematologic disease Diseases 0.000 description 1
- 230000028996 humoral immune response Effects 0.000 description 1
- 230000001506 immunosuppresive effect Effects 0.000 description 1
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 1
- 230000002757 inflammatory effect Effects 0.000 description 1
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 1
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 1
- 210000003734 kidney Anatomy 0.000 description 1
- -1 lipid compounds Chemical class 0.000 description 1
- 238000011068 loading method Methods 0.000 description 1
- 210000004072 lung Anatomy 0.000 description 1
- 230000008018 melting Effects 0.000 description 1
- 238000002844 melting Methods 0.000 description 1
- 239000002207 metabolite Substances 0.000 description 1
- 125000002496 methyl group Chemical group [H]C([H])([H])* 0.000 description 1
- 239000005445 natural material Substances 0.000 description 1
- 230000003287 optical effect Effects 0.000 description 1
- 239000012074 organic phase Substances 0.000 description 1
- 239000002245 particle Substances 0.000 description 1
- 239000012071 phase Substances 0.000 description 1
- 206010039073 rheumatoid arthritis Diseases 0.000 description 1
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 1
- 238000001179 sorption measurement Methods 0.000 description 1
- 229910001220 stainless steel Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000010935 stainless steel Substances 0.000 description 1
- 238000012916 structural analysis Methods 0.000 description 1
- 125000001424 substituent group Chemical group 0.000 description 1
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 1
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K7/00—Peptides having 5 to 20 amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof
- C07K7/64—Cyclic peptides containing only normal peptide links
- C07K7/645—Cyclosporins; Related peptides
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P29/00—Non-central analgesic, antipyretic or antiinflammatory agents, e.g. antirheumatic agents; Non-steroidal antiinflammatory drugs [NSAID]
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
- A61P37/02—Immunomodulators
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Public Health (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Immunology (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Rheumatology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Pain & Pain Management (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
- Nitrogen And Oxygen Or Sulfur-Condensed Heterocyclic Ring Systems (AREA)
- Treatment Of Liquids With Adsorbents In General (AREA)
- Saccharide Compounds (AREA)
- Silicon Compounds (AREA)
- Separation Using Semi-Permeable Membranes (AREA)
Abstract
Postup chromatografického čištění cyklosporinu A ze surového produktu, obsahujícího cyklosporinovou směs, s použitím kolony naplněné silikagelem a aplikací vícestupňové chromatografické metody na koloně, plněné normální silikagelovou fází, ve směsi rozpouštědel obsahující jako hlavní složku toluen, a vysoce čistý cyklosporin A takto připravený.ŕ
Description
Vynález se týká postupu chromatografické čištění cyklosporinu A ze surového produktu, obsahujícího směs cyklosporinu, za použití kolony plněné silikagelem a aplikací vícestupňové chromatografie na koloně plněné normální silikagelovou fází za použití směsí rozpouštědel, obsahující jako hlavní složku toluen.
Dosavadní stav techniky
Cyklosporiny jsou cyklické undekapeptidy, které jsou na několika místech N-methylované. U většiny z nich byla potvrzena farmakologická účinnost. Zatím je známo 25 členů této skupiny, a jsou označovány písmeny A až Z. Jako první z nich byl získán z přírodního materiálu cyklosporin A, který byl izolován z kultivační půdy kmene Tolypocladium inflatum Gams (Helv. Chim. Acta 59, 1075 (1976). Nejprve byla tato sloučenina známa jako slabé fungicidní antibiotikum, později ale upoutala pozornost pro svůj imunosupresivní účinek (J. F. Borel a spol.: Immunology 32, 1017 (1977). Pro tuto svojí vlastnost se používala hlavně při heterotransplantacích (plic, srdce, ledvin, kostní dřeně nebo kůže). Farmakologické studie ukázaly, že tato sloučenina inhibuje jak humorální tak celulámí imunitní odpovědi tím, že zabraňuje proliferaci T-buněk a přerušuje syntézu interleukinu-2. Později se ukázalo, že sloučenina je účinná i při různých typech autoimunních a zánětlivých onemocnění, jako jsou autoimunní hematologické choroby, ulcerózní kolitida, Gravesova Choroba, roztroušená skleróza, psoriáza a revmatická artritida. Byly též činěny pokusy s léčbou infekcí způsobených protozoy a s léčbou nádorů. Důležitost této skupiny sloučenin ukazuje fakt, že je možno připravit mnoho syntetických příbuzných sloučenin vnesením různých aminokyselin a substituentů do molekuly (viz například patentové spisy EP 56782, CH 630062 a EP 29122).
Většina cyklosporinů se připravuje fermentací. Jako příklady použitých kultur je možno uvést mikroorganizmy Cylindrocarpon Lucidum Booth (patentový spis CH 589 716), Trichoderma polysporum Rifai (patentový spis CH 603 790), nebo Tolypocladium varium (patentový spis HU 201 577). Po skončení fermentace se získá cyklosporinová směs, která podle charakteru pochodu může obsahovat různé nečistoty (přísady v kultivační půdě, odpěňovací prostředek, metabolity apod.).
Obvykle se produkt izoluje z fermentační směsi extrakčními pochody. Může se to provést tak, že se mycelium oddělí od fermentačního roztoku odstředěném nebo filtrací, pak se aktivní složku vylouží z mycelia methanolem nebo acetonem a filtrát se extrahuje rozpouštědly, která se nemísí s vodou. Při jiném známém způsobu se neprovede filtrace a celá fermentační směs se extrahuje s vodou nemísitelným organickým rozpouštědlem a organický extrakt se pak odpaří ve vakuu. Při extrakci organickým rozpouštědlem se však do organické fáze extrahují i sloučeniny lipidového charakteru a při dalším čištění působí potíže. K jejich odstranění byly vypracovány některé postupy (například švýcarský patentový spis CH 589 716, nebo vyložená německá patentová přihláška DE 2455859), při kterých po odstranění extrakčního rozpouštědla se odparek rozpustí ve vodném methanolu a pak se extrahuje několikrát stejným objemem petroletheru. Petroletherické extrakty se spojí a cyklosporiny se z nich získají vodným methanolem. Aktivní složka se pak mnohonásobnou extrakcí spojené vodně-methanolické fáze převede do ethylenchloridu, jenž se pak promyje vodou a odpaří k suchu. Surový produkt, získaný výše uvedeným způsobem, obsahuje cyklosporiny a může se účinněji čistit jednou z následujících chromatografických metod.
- 1 CZ 293687 B6
Podle postupu popsaného v americkém patentovém spisu US 4 117 118 se cyklosporinová směs nejprve přenese na kolonu Sephadexu LH-20 a eluuje se methanolem. Pak se chromatografuje na koloně kysličníku hlinitého ve směsi toluenu a ethylacetátu (15 %) a pak na koloně silikagelu ve směsi chloroformu a ethanolu (2 %). I přes tuto opakovanou chromatografií není výsledný produkt čistý, aleje směsí cyklosporinu A a B.
Podobný chromatografický postup je popsán mezi jiným v americkém patentovém spisu US 4 215 199, kde se hrubé čištění provádí na koloně silikagelu a jako eluentu se použije směs chloroformu a methanolu (v objemovém poměru 98:2). Eluát se pak odpaří k suchu, odparek se rozpustí v methanolu a chromatografuje se na koloně Sephadexu LH-20 s methanolem jako eluentem. Eluované frakce se odpaří k suchu a odparek se rozpustí ve směsi chloroformu a methanolu (objemový poměr 98:2) a opět se podrobí chromatografií na silikagelu. Cyklosporin A se eluuje jako první. Odpařením příslušných dalších frakcí se získají čisté složky.
Podle německého patentového spisu DD 298276 se olejovitý surový produkt rozpustí v malém množství chloroformu a pak se chromatografuje na koloně kysličníku hlinitého s použitím chloroformu jako eluentu. Frakce, obsahující cyklosporin A, se odpaří ve vakuu, rozpustí v chloroformu a chromatografují se na podobné koloně s chloroformem jako eluentem. Frakce, které obsahují aktivní látku, se opět odpaří ve vakuu. K odparku se přidá hexan a cyklosporin A se krystaluje. Produkt se promyje hexanem, vysuší se a nakonec se rekrystaluje ze směsi etheru a hexanu nebo acetonu.
Podle maďarského patentového spisu HU 201577 se surový produkt, získaný po odpaření, může přečistit na koloně silikagelu elucí směsí chloroformu a methanolu s postupně se zvyšující koncentrací methanolu. Chromatografický postup začíná s čistým chloroformem a pokračuje zvyšováním koncentrace methanolu v eluentu po 0,5 % (objemových) krocích. Cyklosporin A se eluuje chloroformem obsahujícím 2 % objemová methanolu, cyklosporin B chloroformem obsahující 2,5 % objemových methanolu a cyklosporin C chloroformem obsahujícím 3 % objemová methanolu. Odpařením příslušných frakcí se pak získají jednotlivé složky.
Výše uvedené prostupy popisují hlavně fermentační procedury, vedoucí k cyklosporinu, kde hlavním cílem purifikačních kroků je identifikace získaného produktu. Produkt je tedy izolován jen v malém množství a jsou udány pouze fyzikální a chemické charakteristiky, aniž by byly publikovány údaje o čistotě produktu a množství nečistot, které obsahuje.
Riieger a spol. (Helv. Chim. Acta 59(4), 1075-1092 (1976)) izolovali pro identifikaci a strukturní analýzu malá množství čistého cyklosporinu A a C opakovanou chromatografií a jinými čisticími postupy. Podle této publikace surový produkt, získaný fermentací Trichoderma polysporum Riafai a obsahující hlavně cyklosporin A a C, se zbaví tuku methanolem a petroletherem. Po odpaření se zbytek rozpustí v chloroformu a chromatografuje se gradientovou elucí směsí chloroformu a methanolu (v objemovém poměru 98,5:1,5). Čistý krystalický cyklosporin A se získá další chromatografií. Frakce, obsahující cyklosporin A, se rozpustí v methanolu a chromatografuje se na koloně Sephadexu LH-20 s použitím methanolu jako eluentu. Hlavní frakce se odpaří, odparek se rozpustí v toluenu a chromatografuje na oxidu hlinitém za eluce toluenem s rostoucí koncentrací kyseliny octové. Krystalický produkt se získá po odpaření příslušných frakcí a přečištění aktivním uhlím v alkoholickém roztoku.
Čisticí postup, použitelný v průmyslovém měřítku, je popsán v americkém patentovém spisu US 5382655. Podle tohoto postupu surový produkt, obsahující různé cyklosporinové složky, se podrobí tepelnému zpracování předtím, než se chromatografuje na koloně silikagelu ve směsích chloroform-dichlormethan-ethanol a chloroform-ethylacetát-ethanol. Získaný produkt se podrobí další chromatografií a rekrystalizaci, čímž se obdrží čistý produkt, použitelný pro přípravu injekčních forem.
-2CZ 293687 B6
Čištění surového produktu, obsahujícího směs cyklosporinů, je velmi obtížné, protože nečistoty mají podobné chemické struktury a mají velmi podobné chromatografické charakteristiky jako hlavní produkt, cyklosporin A. Uvedené postupy potvrzují, že bez ohledu na použitou směs rozpouštědel dochází kpřekryvu chromatografických pásů a že pro získání žádaných složek v čistém stavu jsou nutné další chromatografické nebo jiné purifikační kroky. Dosud známé čisticí postupy se obecně vyznačují nejen tím, že vyžadují velká množství rozpouštědel, ale také tím, že je nutno použít tří až čtyř různých typů rozpouštědel nebo jejich směsí a dvou až tří typů kolonových náplní. V důsledku toho je při výrobě nutno použít několik typů chromatografických technik a regeneračních metod, což činí potíže při vývoji jednoduchých, reprodukované zvládnutelných a ekonomických technologií v průmyslovém měřítku.
Z ekologického hlediska jsou nežádoucí chlorovaná rozpouštědla a stále více států se snaží omezit jejich použití.
Co se týče materiálu pro náplň kolon, použití oxidu hlinitého jako náplně pro průmyslové použití je velmi problematické, protože díky jeho malému specifickému povrchu je zátěž a separační schopnost takových kolon velmi malá. Dále není kysličník hlinitý vhodný pro průmyslové využití proto, že je tuhý a křehký, a proto vyžaduje speciální zařízení a technologii, která nemůže být použita v často vyprazdňovaných nerezových kolonách, které se běžně používají v chemickém průmyslu.
Náplně typu Sephadexu jsou velmi drahé a v případě cyklosporinových směsí je jejich účinnost velmi omezena, protože molekuly dělených sloučenin mají velmi podobnou velikost.
Podstata vynálezu
Podstata předloženého vynálezu spočívá ve vývoji chromatografické purifikační metody, která je snadno použitelná v průmyslovém měřítku a pomocí které je možno vyrábět cyklosporin A, obsahující mnohem méně nečistot než dosud, čímž se dosáhne větší bezpečnosti při použití v medicíně.
Cílem byl vývoj takové chromatografické purifikační technologie, která by vyžadovala jen jeden typ rozpouštědlové směsi a jeden typ kolonové náplně.
Jako kolonová náplň byl zvolen silikagel, a to pro své výhodné vlastnosti, jako je velký specifický povrch, vysoká pórovitost, příznivá sorpční schopnost, snadná manipulace a relativně nízká cena.
K. této náplni bylo nutno nalézt ideální metodu a ideální směs rozpouštědel, které by byly vhodné pro vysoce selektivní separaci cyklosporinových složek.
Pokusy ukázaly, že tento cíl může být realizován vícestupňovou chromatografií na koloně silikagelu a elucí směsí rozpouštědel, jejíž hlavní složkou je toluen. Překvapivě bylo nalezeno, že i cyklosporinů U a L, které jsou cyklosporinů A nejbližší, mohou být separovány třístupňovou chromatografií na silikagelové koloně elucí toluenem, obsahujícím aceton. Řečené složky se liší od cyklosporinů A pouze methylovou skupinou.
Podle prvního příkladu patentové přihlášky č. WO 94/16091 se také používá směs toluenu a acetonu, ale vjednostupňové chromatografií. Získaný produkt se rekrystaluje ze směsi etheru a hexanu (výtěžek 66,6 %). Optická rotace produktu je sice dostatečná, ale teplota tání je výrazně nižší než je uvedeno v literatuře, což naznačuje, že produkt není čistý, a že tedy dokonce i rekrystalizací vznikne produkt o nízké čistotě a v nízkém výtěžku.
-3 CZ 293687 B6
Postup podle předloženého vynálezu je vhodný pro separaci nejběžnějších nečistot jako cyklosporinu B a cyklosporinu C, které jsou nejvíce zastoupeny, a navíc i cyklosporinů D, U a L, které se vyskytují ve stopách. Obsah cyklosporinů B a C v konečném produktu cyklosporinu A, získaném postupem podle vynálezu, je méně než 0,02 % hmotnostního, zatímco obsah cyklo5 sporinů L, U a D je pod 0,05 % hmotnostního.
Předmět předkládaného vynálezu je zlepšený postup pro čištění cyklosporinu A ze surového produktu, obsahujícího směs cyklosporinů, který umožňuje výrobu extrémně čistého cyklosporinu A ve velkém měřítku, pomocí chromatografícké metody na koloně silikagelu, a to víceío stupňové chromatografie a použitím směsí rozpouštědel, obsahující jako hlavní složku toluen.
Dalším novým rysem postupu podle vynálezu je to, že se používá extrémně vysoká zátěž kolony. Při běžných chromatografiích není množství násady na kolonu větší než 5 až 10 % náplně kolony, a pro cyklosporiny je to ještě méně.
Vícestupňová chromatografie, směs rozpouštědel s toluenem jako hlavní složkou a vysoká kolonová zátěž spolu navzájem souvisí a žádaného vysoce čistého produktu je možno dosáhnout pouze jejich kombinací.
Při postupu podle vynálezu se používá s výhodou 2 až 4 za sebou jdoucích chromatografických 20 stupňů, s výhodou tří stupňů.
Přetížení kolony je největší v prvním chromatografíckém stupni, ale dobré oddělení aktivní složky od nečistot umožňuje přetížit kolonu i v následujících dvou stupních chromatografie.
Při čištění podle vynálezu je výhodné používat směs toluen-aceton, obsahující nejvýše 30 % objemových acetonu.
Jiné výhodné provedení postupu podle vynálezu je použití směsi toluen-ethylacetát, ve které je koncentrace ethylacetátu nižší než 35 % objemových.
Při čištění postupem podle vynálezu je výhodné alespoň jednou použít gradientovou eluci.
Pokusy ukázaly, že pro čištění cyklosporinové směsi podle vynálezu je výhodné použít 10 až 30 % objemových, lépe 13 až 18 % objemových acetonu, a 10 až 35 % objemových nebo 15 až 35 20 % objemových ethylacetátu.
Podle jiného provedení podle vynálezu se v případě třístupňové chromatografie provádí eluce toluenem obsahujícím 15 % objemových acetonu nebo 18 % objemových ethylacetátu. V prvním stupni se oddělí hlavní podíl cyklosporinu C, ve druhém stupni se odstraní větší část cyklosporinů 40 B, L a U, a konečně ve třetím stupni se obsah cyklosporinů L a U a jiných neidentifikovaných nečistot může snížit pod 0,05 % hmotnostního. Zatímco ztráta cyklosporinu A v prvním stupni je minimální, v předních frakcích druhé a třetí chromatografie se odstraní značné množství cyklosporinu A spolu s cyklosporinem D, který je mu velmi podobný. Tento podíl cyklosporinu A se může získat zpět ve velmi čisté formě ve čtvrtém stupni.
Pro porovnání je v následující tabulce uveden obsah nečistot v cyklosporinu A podle USP standardu, obsah nečistot v injekčním lékovém prostředku SANDIMMUN® a obsah nečistot v cyklosporinu A, který byl připraven postupem podle vynálezu.
| Nečistota | USP standard | SANDIMMUN® | Příklad 1 |
| Cyklosporin C | - | 0,17 | 0,05 |
| Cyklosporin B | - | 0,21 | 0,05 |
| Neidentifikované sloučeniny | 0,09 | 0,35 | 0,05 |
| Cyklosporin L | 0,05 | 0,35 | 0,05 |
-4CZ 293687 B6
Nečistota
Cyklosporin U
Cyklosporin D
USP standard
0,12
SANDIMMUN® Příklad 1
0,05
0,05
Z uvedených údajů je zřejmé, že kvalita cyklosporinu A získaného podle předloženého vynálezu podstatně převyšuje parametry injekčního preparátu SANDIMMUN® a převyšuje dokonce i požadavky USP.
Postup podle vynálezu se dá aplikovat na čištění surového produktu v malém i ve velkém měřítku.
Vedle toho, že postup podle vynálezu poskytuje čistý cyklosporin A, má i nezanedbatelné technologické přednosti. Protože se používá pouze jeden typ technologické metody (chromatografie), je čisticí pochod jednotně proveditelný, nadto je ho možno opakovat a může být převeden na kontinuální proces. Dále je postup vynálezu speciálně výhodný v tom, že se ve všech třech chromatografíckých stupních používá pouze jeden typ směsi rozpouštědel, a proto je regenerace kolonových náplní i rozpouštědel jednodušší.
Další zvláštní výhodu má postup vtom, že v prvním chromatografickém kroku zůstanou na koloně sloučeniny se silnou afinitou k náplni, což se velmi usnadní regeneraci kolonových náplní v dalších dvou stupních.
Vynález je ilustrován následujícími příklady, aniž by se jimi omezoval jakkoliv jeho rozsah.
Srovnávací příklad (příklad 4) ukazuje, že při použití směsi dichlormethan-aceton, která byla dosud běžně užívána jako eluent ve známých postupech, ani třístupňová chromatografie neposkytla produkt o kvalitě srovnatelné s kvalitou konečného produktu, získaného postupem podle vynálezu.
Příklady provedení vynálezu
Příklad 1
Čištění surového cyklosporinového produktu třístupňovou chromatografií s použitím směsi toluen-aceton jako eluentu
Složení výchozí surové cyklosporinové směsi:
Cyklosporin A Cyklosporin B Cyklosporin C Cyklosporin L Cyklosporin U Cyklosporin D
60,9 % hmotnostních
11,2 % hmotnostních
8,3 % hmotnostních
1,79 % hmotnostních
1,58 % hmotnostních
1,25 % hmotnostních
Stupeň 1
Chromatografie se provádí na dvou chromatografíckých kolonách s pláštěm, zapojených v sérii. Každá z nich má obsah 8 listrů, průměr 10 cm a délku 100 cm. Každá kolona obsahuje 3,95 kg silikagelu (Měrek Kieselgel, velikost částic 0,04-0,063 mm)V prvé chromatografii obsahují obě kolony nový silikagel, v další chromatografii se prvá kolona odpojí a připojí se k ní druhá kolona, obsahující čerstvou silikagelovou náplň. V každé další chromatografii se použije jenom jedna nová kolona.
-5CZ 293687 B6
Příprava surového produktu
4,1 kg surového produktu o čistotě 60,9 % hmotnostních se rozpustí v 15 litrech toluenu. Získá se tak 19 listů roztoku, který se přivádí na vrch první kolony přes filtr rychlostí 2,4 litrů/hod. Po nanesení se materiál eluuje směsí acetonu-toluen v objemovém poměru 13:87, až objem eluátu z druhé kolony činí 39 litrů. Obsah cyklosporinu v eluentu je analyzován chromatografii na tenké vrstvě (TLC). Frakce, které neobsahují cyklosporin, se jímají jako odpad. Po zjištění cyklosporinu v eluátu se jímá 28 litrů eluátu jako hlavní frakce. Takto získaný meziprodukt I obsahuje 3,23 kg sušiny.
Složení je následující:
Cyklosporin A Cyklosporin B Cyklosporin C Cyklosporin L Cyklosporin U Cyklosporin D % hmotnostních
10,1 % hmotnostních
1.6 % hmotnostních
1.7 % hmotnostních
1,5 % hmotnostních
1,3 % hmotnostních
Výtěžek počítaný na cyklosporin A je 97 %.
Stupeň 2
Separace se provádí na 1 metr dlouhé osmilitrové koloně s pláštěm, která obsahuje 3,95 kg silikagelu (Měrek Kieselgel 60; 0,015-0,040 mm).
Asi 3 litry roztoku meziproduktu I, získaného v prvním stupni a obsahujícího 370 g sušiny, se aplikují na kolonu rychlostí 2,4 litrů/hod a pak se promyjí 1 litrem toluenu.
Po aplikaci na kolonu se materiál eluuje 10 litry směsi aceton-toluen (v objemovém poměru 15:85) a pak 20 litry směsi aceton-toluen (v objemovém poměru 25:75). Do objemu 17 listrů eluátu je průtok eluentu 2,4 litrů/hod a po 18 litrech se zvýší na 5 litrů/hod. Jednotlivé frakce se analyzují TLC. Frakce od 1 až do 11 litrů jsou odpad, frakce 12-19 litrů jsou považovány za kritické a jsou z nich odebrány vzorky, které se analyzují HPLC. Podle analýzy se považují za přední frakci, nebo se spojí s hlavními frakcemi. Po odpaření přední frakce se získá 80 g suchého materiálu. Frakce 20-25 litrů se spojí jako hlavní frakce. Frakce 26-31 litrů se považují opět za kritické a po analýze se buď spojí s hlavní frakcí nebo se považují za zadní frakci.
Hlavní frakce, která se takto získá, se odpaří k suchu ve filmové odparce spojené s vibračním míchadlem. Získá se tak 234 g (80 %) meziproduktu II o následujícím složení:
Cyklosporin A Cyklosporin U Cyklosporin L Cyklosporin B Cyklosporin D Cyklosporin C % hmotnostních
1,2 % hmotnostních
0,7 % hmotnostních <0,1 % hmotnostních
0,5 % hmotnostních
0,1 % hmotnostních
Stupeň 3
Chromatografie se provede na kolonách stejné konstrukce a geometrických parametrů jak jsou popsány v prvním a druhém stupni.
-6CZ 293687 B6
Z meziproduktu II, získaného ve stupni 2, se připraví 1,7 litru toluenového roztoku, obsahujícího
220 g suchého materiálu, a tento roztok se uvádí na vrch kolony rychlostí 2,4 Iitrů/hod. Pak se promyje 1 litrem toluenu.
Kolona se eluuje 20 litry směsi aceton-toluen v objemovém poměru 15:85 a pak 20 litry směsi aceton-toluen v objemovém poměru 25:75. Do 31 litrů eluátu je průtok 2,4 litrů/hod a od 32 litrů se zvýší na 5 litrů/hod. Prvních 18 litrů je odpad, frakce 19-23 litrů jsou přední kritické frakce I. Vzorky frakcí se analyzují HPLC na obsah sušiny a nečistot a podle výsledku analýzy se považují za přední frakci nebo se spojí s hlavní frakcí. Frakce 29-38 litrů se spojí jako hlavní frakce. Frakce 39-41 litrů se jímají po litrových porcích a jsou považovány za kritické frakce II. Podle výsledků analýzy se buď spojí s hlavní frakcí nebo se považují za zadní frakci.
Po odpaření k suchu se celkem získá 70 g přední frakce.
Spojená hlavní frakce po odpaření k suchu poskytne 157 g čistého cyklosporinu ve výtěžku 75 %. Složení produktu je následující:
Cyklosporin A Cyklosporin L Cyklosporin U Cyklosporin D Cyklosporin B Cyklosporin C
99,6 % hmotnostních <0,05 % hmotnostních <0,05 % hmotnostních <0,05 % hmotnostních <0,02 % hmotnostních <0,02 % hmotnostních
Příklad 2
Chromatografické čištění surového cyklosporinového produktu ve čtyřech stupních na koloně silikagelu s pevným dnem s použitím směsí toluen-aceton nebo toluen-ethylacetát
Surový cyklosporinový produkt se přečistí třístupňovou chromatografií, jak je popsáno v příkladu
1. Přední frakce, získané ve třech chromatografických stupních, se přečistí ve čtvrtém stupni s použitím směsi toluen-ethylacetát.
Stupeň 4
Konstrukce a geometrické parametry chromatografické kolony jsou stejné jako je popsáno v příkladu 1. Kolona je naplněna silikagelem Měrek Kieselgel 60 (0,015-0,040 mm), jak je popsáno v příkladu 1.
260 g koncentrátu získaného z předních frakcí se rozpustí ve 2,5 litrech toluenu a roztok se nanese na kolonu rychlostí 2,4 litrů/hod. Koncentrát obsahuje 80,6 % hmotnostních cyklosporinu A a 4,2 % hmotnostních cyklosporinu D. Po promytí 1 litrem toluenu se kolona eluuje 20 litry směsi ethylacetát-toluen (v objemovém poměru 17:83) rychlostí 2,4 litrů/hod a pak 40 litry směsi ethylacetát-toluen (v objemovém poměru 28:72).
Frakce 1 až 19 litrů jsou odpad. Frakce 20-25 litrů se podle výsledku HPLC analýzy buď považují za odpad nebo se spojí s hlavní frakcí. Frakce 26-35 litrů se jímají jako hlavní frakce. Frakce 36-42 litrů se podle výsledků HPLC analýzy buď spojí s hlavní frakcí nebo se považují za odpad. Hlavní frakce (frakce 23-42 litrů) se odpaří k suchu, čímž se získá 195 g (výtěžek 75 %) cyklosporinu A o čistotě 99,6 % hmotnostních následujícího složení:
Cyklosporin A 99,6 % hmotnostních
Cyklosporin D <0,05 % hmotnostních
Cyklosporin U
Cyklosporin L
Příklad 3
Chromatografické čištění surového cyklosporinového produktu ve dvou stupních na koloně silikagelu s pevným dnem s použitím směsi toluen-aceton
Cyklosporinový surový produkt se přečistí jak je popsáno ve stupni 1 v příkladu 1. Získá se cyklosporinový meziprodukt I stejné kvality, jaká je uvedena v příkladu 1. Dále se postupuje následovně:
Stupeň 2
Na kolonu se aplikují 3 litry roztoku meziproduktu I, obsahujícího 370 g suchého materiálu, a to rychlostí 2,4 litrů/hod. Pak se vzorek promyje jedním litrem toluenu.
Kolona se eluuje 10 litry směsi aceton-toluen (v objemovém poměru 15:85) a pak 20 litry směsi aceton-toluen (v objemovém poměru 25:75). Do 17 litrů eluátu je průtok 2,4 litrů/hod, od 18 litrů je průtok 5 litrů/hod.
Podle TLC a HPLC analýzy jsou frakce 1-11 litrů odpad, frakce 12-20 litrů jsou přední frakce, frakce 21-24 litrů jsou hlavní frakce a frakce od 25 litrů výše jsou zadní frakce. Frakce vymyté 25 acetonem jsou odpad.
Hlavní frakce se spojí a odpaří k suchu, čímž se získá 114 g cyklosporinu A ve výtěžku 41 % a v téže kvalitě, jaká je uvedena v příkladu 1.
Příklad 4
Srovnávací příklad čištění surového produktu třístupňovou chromatografií s použitím směsi d ich lormethan-aceton
Složení výchozího surového cyklosporinového produktu je následující (stejné jako v příkladu 1):
Cyklosporin A
Cyklosporin B
Cyklosporin C
Cyklosporin L
Cyklosporin U
Cyklosporin D
60,9 % hmotnostních
11,2 % hmotnostních
8,3 % hmotnostních
1,79 % hmotnostních
1,58 % hmotnostních
1,25 % hmotnostních
Stupeň 1
Chromatografické vybavení a náplň jsou stejné jako v příkladu 1. Najeden pár kolon, zapojených v sérii, se aplikuje 4,1 kg surového produktu o čistotě 60,9 % v 15 litrech dichlormethanu.
Po aplikaci se kolona eluuje dichlormethanem rychlostí 2,4 litrů/hod a jímá se 35 litrů eluátu.
Frakce 1-10 litrů jsou odpad, frakce 11-35 litrů se považují za hlavní frakci. Takto získaný meziprodukt I obsahuje 2,9 kg sušiny a 75 % hmotnostních aktivní složky.
-8CZ 293687 B6
Stupeň 2
Chromatografícké vybavení a náplň jsou tytéž jako v příkladu 1.
Na vrch kolony se aplikují 3 litry meziproduktu I, obsahujícího 350 g sušiny, rychlostí
2,4 litrů/hod. Eluce se provádí 10 litry směsi aceton-dichlormethan (v objemovém poměru 1:9), pak 25 litry směsi aceton-dichlormethan (v objemovém poměru 2:8), a nakonec acetonem. Průtok je 2,4 litrů/hod.
Podle HPLC analýzy je objem přední frakce 13 litrů, objem hlavní frakce 22 litrů a objem zadní frakce 11 litrů. Hlavní frakce (22 litrů) se odpaří k suchu, čímž se získá 220 g meziproduktu II o čistotě 91 %.
Stupeň 3
Chromatografícké vybavení a náplň jsou tytéž jako je popsáno v příkladu 1.
Na kolonu se aplikuje dichlormethanový koncentrát 220 g meziproduktu II rychlostí 2,4 litrů/hod. Eluce se provádí rychlostí 2,4 litrů/hod, a to 20 litry směsi aceton-dichlormethan (v objemovém poměru 1:9), pak 30 litry směsi aceton-dichlormethan (v objemovém poměru 2:8) a nakonec acetonem.
Prvních 26 litrů eluátu se považuje za přední frakce, dalších 26 litrů za hlavní frakci a konečně 11 litrů za zadní frakce.
Hlavní frakce (26 litrů) se odpaří k suchu, čímž se získá 140 g meziproduktu III, který' má následující složení:
Cyklosporin A 98,6 % hmotnostních
Cyklosporin U 0,6 % hmotnostních
Cyklosporin D 0,3 % hmotnostních
Cyklosporin L 0,2 % hmotnostních
Cyklosporin B 0,1 % hmotnostních
Cyklosporin C 0,1 % hmotnostních
Claims (13)
1. Purifikační postup pro přípravu vysoce čistého cyklosporinu A ze surového produktu, obsahujícího cyklosporinovou směs, pomocí chromatografícké metody na silikagelové koloně, vyznačující se tím, že se použije vícestupňová chromatografie ve směsi rozpouštědel, obsahující jako hlavní složku toluen.
2. Postup podle nároku 1, vyznačující se tím, že se provedou 2 až 4 následné chromatografícké stupně.
3. Postup podle nároku 1, vyznačující se tím, že se provedou 3 následné chromatografické stupně.
4. Postup podle nároku 1, vyznačující se tím, že se jako směs rozpouštědel použije směs toluen-aceton.
-9CZ 293687 B6
5. Postup podle nároku 4, vyznačující se tím, že se použije toluen, obsahující nejvýše 30 % acetonu.
6. Postup podle nároku 1, vyznačující se tím, že se jako směs rozpouštědel použije 5 směs toluen-ethylacetát.
7. Postup podle nároku 6, vyznačující se tím, že se použije toluen, obsahující nejvýše 35 % objemových ethylacetátu.
10
8. Postup podle nároku 1, vyznačující se tím, že se nejméně v jednom chromatografickém stupni použije gradientově eluce.
9. Vysoce čistý cyklosporin A, obsahující méně než 0,05 % hmotnostních cyklosporinu L, cyklosporinu U a cyklosporinu D a méně než 0,02 % hmotnostních cyklosporinu B a cyklo-
15 sporinu C, připravený postupem podle nároku 1.
10. Postup v průmyslovém měřítku pro čištění cyklosporinu A z cyklosporinové směsi, obsahující surový produkt, s použitím chromatografické metody na silikagelové koloně, který se vyznačuje tím, že se použije vícestupňové chromatografie na koloně s normální fází
20 silikagelu ve směsi rozpouštědel, obsahující jako hlavní složku toluen.
11. Postup podle kteréhokoliv z nároků 1 nebo 10, který se vyznačuje tím, že cyklosporinová směs, použitá jako výchozí materiál chromatografie, se před chromatografií zahřeje na 80 až 120 °C.
12. Postup podle kteréhokoliv z nároků 1 nebo 10, který se vyznačuje tím, že se použije toluenu s obsahem 10 až 30 % acetonu.
13. Postup podle kteréhokoliv z nároků 1 nebo 10, který se vyznačuje tím, že se 30 použije toluenu s obsahem 10 až 35 % objemových ethylacetátu.
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| HU9700645A HU223054B1 (hu) | 1997-03-25 | 1997-03-25 | Tisztítási eljárás nagytisztaságú ciklosporin A előállítására |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CZ381498A3 CZ381498A3 (cs) | 1999-02-17 |
| CZ293687B6 true CZ293687B6 (cs) | 2004-07-14 |
Family
ID=89994909
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CZ19983814A CZ293687B6 (cs) | 1997-03-25 | 1998-03-23 | Purifikační postup pro přípravu vysoce čistého cyklosporinu A a vysoce čistý cyklosporin A takto připravený |
Country Status (22)
| Country | Link |
|---|---|
| EP (1) | EP0920447B1 (cs) |
| JP (1) | JP2000511939A (cs) |
| AT (1) | ATE223434T1 (cs) |
| AU (1) | AU737260B2 (cs) |
| BG (1) | BG64215B1 (cs) |
| CA (1) | CA2255062C (cs) |
| CZ (1) | CZ293687B6 (cs) |
| DE (1) | DE69807635T2 (cs) |
| DK (1) | DK0920447T3 (cs) |
| ES (1) | ES2180159T3 (cs) |
| HK (1) | HK1020740A1 (cs) |
| HU (1) | HU223054B1 (cs) |
| IL (1) | IL126871A0 (cs) |
| NO (1) | NO322211B1 (cs) |
| NZ (1) | NZ332718A (cs) |
| PL (1) | PL194252B1 (cs) |
| PT (1) | PT920447E (cs) |
| RU (1) | RU2182577C2 (cs) |
| SK (1) | SK283672B6 (cs) |
| UA (1) | UA58511C2 (cs) |
| WO (1) | WO1998042734A1 (cs) |
| YU (1) | YU49468B (cs) |
Families Citing this family (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| EP2151450A1 (de) * | 2008-07-29 | 2010-02-10 | Sandoz AG | Verfahren zur Aufarbeitung von mikrobiologisch hergestellten zyklischen Oligopeptiden |
| DE102009037551A1 (de) * | 2009-08-17 | 2011-02-24 | MAX-PLANCK-Gesellschaft zur Förderung der Wissenschaften e.V. | Cyclosporinderivate |
| HUP1500502A2 (en) | 2015-10-26 | 2017-04-28 | Rotachrom Tech Kft | Process for the purification of cyclosporin-a |
| CN114653350A (zh) * | 2022-02-25 | 2022-06-24 | 江苏九阳生物制药有限公司 | 一种环孢素a层析硅胶的再生方法 |
Family Cites Families (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| HU213553B (en) * | 1992-05-25 | 1997-07-28 | Biogal Gyogyszergyar | Process for isolating of cyclosporin-a |
| FI92334C (fi) * | 1992-12-30 | 1994-10-25 | Leiras Oy | Menetelmä syklosporiinien tuottamiseksi ja menetelmässä käytettävä uusi Tolypocladium-kanta |
| KR100304324B1 (ko) * | 1994-10-13 | 2001-11-22 | 김용규 | 사이클로스포린a의제조방법 |
-
1997
- 1997-03-25 HU HU9700645A patent/HU223054B1/hu not_active IP Right Cessation
-
1998
- 1998-03-23 AU AU68482/98A patent/AU737260B2/en not_active Ceased
- 1998-03-23 DK DK98913969T patent/DK0920447T3/da active
- 1998-03-23 AT AT98913969T patent/ATE223434T1/de not_active IP Right Cessation
- 1998-03-23 WO PCT/HU1998/000029 patent/WO1998042734A1/en active IP Right Grant
- 1998-03-23 CZ CZ19983814A patent/CZ293687B6/cs not_active IP Right Cessation
- 1998-03-23 IL IL12687198A patent/IL126871A0/xx unknown
- 1998-03-23 PT PT98913969T patent/PT920447E/pt unknown
- 1998-03-23 DE DE69807635T patent/DE69807635T2/de not_active Expired - Fee Related
- 1998-03-23 SK SK1618-98A patent/SK283672B6/sk unknown
- 1998-03-23 YU YU53598A patent/YU49468B/sh unknown
- 1998-03-23 CA CA002255062A patent/CA2255062C/en not_active Expired - Fee Related
- 1998-03-23 EP EP98913969A patent/EP0920447B1/en not_active Expired - Lifetime
- 1998-03-23 NZ NZ332718A patent/NZ332718A/xx unknown
- 1998-03-23 PL PL98330142A patent/PL194252B1/pl not_active IP Right Cessation
- 1998-03-23 UA UA98116251A patent/UA58511C2/uk unknown
- 1998-03-23 ES ES98913969T patent/ES2180159T3/es not_active Expired - Lifetime
- 1998-03-23 JP JP10545312A patent/JP2000511939A/ja not_active Ceased
- 1998-03-23 RU RU98123499/04A patent/RU2182577C2/ru active
- 1998-11-10 BG BG102911A patent/BG64215B1/bg unknown
- 1998-11-24 NO NO19985483A patent/NO322211B1/no not_active IP Right Cessation
-
1999
- 1999-12-09 HK HK99105786A patent/HK1020740A1/xx not_active IP Right Cessation
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| DE69807635D1 (de) | 2002-10-10 |
| EP0920447B1 (en) | 2002-09-04 |
| DE69807635T2 (de) | 2003-08-07 |
| PT920447E (pt) | 2002-11-29 |
| PL330142A1 (en) | 1999-04-26 |
| UA58511C2 (uk) | 2003-08-15 |
| NO985483D0 (no) | 1998-11-24 |
| HU9700645D0 (en) | 1997-05-28 |
| CZ381498A3 (cs) | 1999-02-17 |
| BG102911A (en) | 1999-09-30 |
| YU53598A (en) | 1999-11-22 |
| ATE223434T1 (de) | 2002-09-15 |
| DK0920447T3 (da) | 2002-12-16 |
| CA2255062A1 (en) | 1998-10-01 |
| EP0920447A1 (en) | 1999-06-09 |
| AU737260B2 (en) | 2001-08-16 |
| RU2182577C2 (ru) | 2002-05-20 |
| NO322211B1 (no) | 2006-08-28 |
| PL194252B1 (pl) | 2007-05-31 |
| HU223054B1 (hu) | 2004-03-01 |
| CA2255062C (en) | 2008-06-17 |
| HUP9700645A2 (hu) | 1999-06-28 |
| HUP9700645A3 (en) | 2001-11-28 |
| AU6848298A (en) | 1998-10-20 |
| ES2180159T3 (es) | 2003-02-01 |
| NO985483L (no) | 1998-11-24 |
| JP2000511939A (ja) | 2000-09-12 |
| SK283672B6 (sk) | 2003-11-04 |
| WO1998042734A1 (en) | 1998-10-01 |
| BG64215B1 (bg) | 2004-05-31 |
| HK1020740A1 (en) | 2000-05-19 |
| IL126871A0 (en) | 1999-09-22 |
| SK161898A3 (en) | 1999-05-07 |
| NZ332718A (en) | 2000-04-28 |
| YU49468B (sh) | 2006-05-25 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| US5709797A (en) | Method of isolating cyclosporins | |
| EP0056782B1 (en) | Novel cyclosporins | |
| KR101514904B1 (ko) | 사이클릭 리포펩타이드 화합물 또는 그의 염의 정제방법 | |
| CZ285518B6 (cs) | Způsob čištění cyklosporinu A | |
| EP0373260B1 (en) | Cyclosporin derivatives with modified "8-amino acid" | |
| US6306306B1 (en) | Chromatographic process for obtaining highly purified cyclosporin A and related cyclosporins | |
| EP0801686B1 (en) | Process for preparing cyclosporin a | |
| CZ293687B6 (cs) | Purifikační postup pro přípravu vysoce čistého cyklosporinu A a vysoce čistý cyklosporin A takto připravený | |
| US6423233B1 (en) | Purification process | |
| KR100496929B1 (ko) | 시클로스포린의정제방법 | |
| HRP980604A2 (en) | Purification process | |
| CN101031654A (zh) | 结晶他克莫司的分离方法 | |
| US20110124575A1 (en) | Method for processing microbiologically produced cyclic oligopeptides | |
| CA2108655A1 (en) | Supercritical co2 extraction of cyclosporin a | |
| KR100341355B1 (ko) | 사이클로스포린a의제조방법 | |
| HU213934B (en) | Process for isolation of cyclosporin a |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PD00 | Pending as of 2000-06-30 in czech republic | ||
| MM4A | Patent lapsed due to non-payment of fee |
Effective date: 20100323 |