CN1752105A - 卵黄免疫球蛋白的仿生亲和纯化方法 - Google Patents

卵黄免疫球蛋白的仿生亲和纯化方法 Download PDF

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CN1752105A CN 200510030657 CN200510030657A CN1752105A CN 1752105 A CN1752105 A CN 1752105A CN 200510030657 CN200510030657 CN 200510030657 CN 200510030657 A CN200510030657 A CN 200510030657A CN 1752105 A CN1752105 A CN 1752105A
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Abstract

一种卵黄免疫球蛋白的仿生亲和纯化方法，属于生物技术领域。本发明包括以下步骤：(1)基础层析介质与三氯三氮嗪反应活化后，分别与对氨基苯甲酸、以及酪氨酸和精氨酸反应，合成仿生亲和分离材料；(2)用上述合成的亲和层析介质制备成亲和层析柱，将含卵黄免疫球蛋白的样品流过该亲和层析柱，卵黄免疫球蛋白吸附在亲和层析柱上，冲洗亲和层析柱，不吸附在亲和层析柱上的杂蛋白被除去，然后变换缓冲液条件，再冲洗亲和层析柱，将结合的卵黄免疫球蛋白洗脱下来，得到纯化的卵黄免疫球蛋白。本发明能够高效率、低成本的大规模生产高纯度的卵黄免疫球蛋白。鸡卵黄免疫IgY的一步纯化的回收率＞50％，纯度＞99.5％。鸭IgY和IgY(ΔFc)的一步纯化的回收率＞55％，纯度＞75％。

Description

卵黄免疫球蛋白的仿生亲和纯化方法
技术领域
本发明涉及的是一种生物技术领域的方法，具体地说，是一种卵黄免疫球蛋白的仿生亲和纯化方法。
背景技术
鸟类、爬行类、两栖类和鱼类的卵黄中还含有IgY(蛋黄抗体或卵黄免疫球蛋白)，在鸭、鹅、海龟和肺鱼的卵黄中还发现了一种短的被剪切的IgY(ΔFc)(Immunol Today，1995，16(8)，392-8.)。在免疫诊断方面，由于IgY不激活补体、不结合类风湿因子、不与蛋白A、蛋白G、哺乳动物Fc受体和补体结合，与IgG几无交叉反应，故可作为免疫学实验检测工具，用于测定循环复合物、类风湿因子和补体等，减少假阳性(J Immunol Met，1992，156，79-83.)卵黄免疫球蛋白在分析、诊断、预防疾病和治疗疾病领域占有重要地位，卵黄免疫球蛋白与哺乳动物的抗体相比具有许多明显的优点，其规模化纯化技术工艺有显著的应用前景。
卵黄免疫球蛋白的纯化传统上一般先用水稀释法、氯仿抽提或辛酸抽提除去鸡卵黄中的脂类和脂蛋白，再经硫酸铵沉淀、硫酸葡聚糖沉淀或聚乙二醇沉淀得到的卵黄免疫球蛋白粗品，最后用层析方法，如亲硫吸附层析(含2-巯基吡啶)进一步纯化。由于工艺复杂，使IgY的纯化耗时、耗力、原料浪费、回收率低、成本高，不利于IgY的大规模生产和医药方面的应用。
经对现有技术文献的检索发现，Giorgio Fassina在《层析杂质B系列》上发表的《利用一种新的合成配体亲和纯化鸡卵黄免疫球蛋白》论文(Affinitypurification of immunoglobulins from chicken egg yolk using a new syntheticligand，J Chromatogr B，2000，749：233-242.)。该论文利用一种多肽配基(TG19318)制备的亲和分离材料可以从去除脂类和脂蛋白的鸡卵黄溶液中提取IgY。在Bis-Tris[Bis(2-Hydroxyethyl)Imimotris(Hydroxymethyl)-Methane]缓冲体系纯化IgY，纯度可达95％。TG19318制备需要固相多肽合成和高效液相色谱纯化，再固定到介质上，步骤繁琐，成本高；TG19318本身是多肽性质不稳定，不能耐受在线清洗条件。虽然使用TG19318可以使复杂的IgY纯化工艺简化，但是以上缺点限制了TG19318用于大规模纯化应用。因此，在本领域，开发高效率、低成本、步骤简便的大规模生产卵黄免疫球蛋白的方法和材料能够促进产业化步伐。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术的不足，提供一种卵黄免疫球蛋白的仿生亲和纯化方法，使其克服卵黄免疫球蛋白大规模纯化中的缺点，在大规模分离纯化时，步骤少、成本低、效率高，利用卵黄免疫球蛋白专一的亲和配位体，可快速、简便、低成本、大批量纯化卵黄免疫球蛋白。
本发明是通过以下技术方案实现的，本发明以基础层析介质为原料制备仿生亲和分离材料，用制备的仿生亲和分离材料纯化卵黄免疫球蛋白及片段。
本发明包括以下步骤：
(1)基础层析介质与三氯三氮嗪反应活化后，分别与对氨基苯甲酸、以及酪氨酸和精氨酸反应，合成仿生亲和分离材料；
所述的步骤(1)，具体是指：以带氨基的基础层析介质，与三氯三氮嗪反应活化；或者用常规化学方法对不带氨基的基础层析介质进行活化，与氨水或氨基化合物反应后生成氨基后，再与三氯三氮嗪反应活化；
所述的不带氨基的基础层析介质包括：葡聚糖凝胶、交联的葡聚糖珠、烯丙基葡聚糖和N，N’-亚甲基双丙烯酰胺的交联共聚物、琼脂糖凝胶、琼脂糖与葡聚糖的交联共聚物、聚丙烯酰胺/琼脂糖复合物珠、纤维素珠和涂有化学活性基团的硅胶、多孔玻璃与陶瓷。
所述的常规化学方法是指：C.R.Lowe在《亲和色谱导论》(洛(C.R.Lowe)著；刘毓秀译，科学出版社，1983年5月第1版，第61-84页)中提到的基质活化与功能化方法，如：对于多糖基及含羟基的其它基质，可用卤化氰、三嗪(均二氯三嗪或三氯三嗪)、高碘酸氧化，环氧乙烷(1，4-二羟基正丁烷双缩水甘油醚)，环氧氯丙醇，环氧溴丙醇，双氮丙啶，二乙烯砜，苯醌类化合物如醌，溴乙酰溴进行活化和功能化；对于聚丙烯酰胺基质，可用无水乙二胺，酰肼化后水解，直接碱水解进行活化和功能化；对于硅胶、多孔玻璃与陶瓷可用硅烷化试剂进行活化和功能化；从而在基础层析介质上介绍需要的基团。
所述的仿生亲和分离材料是指含有4-氨基苯甲酸的结构，或者含有精氨酸的结构，或者含有酪氨酸的结构。
(2)用上述合成的亲和层析介质制备成亲和层析柱，将含卵黄免疫球蛋白的样品流过该亲和层析柱，卵黄免疫球蛋白吸附在亲和层析柱上，冲洗亲和层析柱，不吸附在亲和层析柱上的杂蛋白被除去，然后变换缓冲液条件，再冲洗亲和层析柱，将结合的卵黄免疫球蛋白洗脱下来，得到纯化的卵黄免疫球蛋白。
所述的步骤(2)中，亲和介质吸附免疫球蛋白的条件为pH4.5-9.0，离子强度为0.0-0.2M的缓冲液；洗脱条件为pH 2.0-12，离子强度为0.1-0.5M的缓冲液。
本发明既克服了亲和分离材料合成步骤繁琐，成本高，性质不稳定，不能耐受在线清洗条件的缺点，又减少了卵黄免疫球蛋白大规模纯化的步骤，降低生产成本，提高了纯化效率，使卵黄免疫球蛋白快速、简便、低成本、大批量纯化成为可能。鸡卵黄免疫IgY的一步纯化的回收率＞50％，纯度大于99.5％。鸭IgY和IgY(ΔFc)的一步纯化的回收率＞55％，纯度大于75％。
具体实施方式
实施例1
(1)制备分离材料。
取NH2-Sepharose(200ml)，用5倍体积的1M的NaCl洗涤，再用蒸馏水充分洗涤后，抽去水分，倒入反应器皿中，加入150ml的水，放于冰盐浴中预冷。待温度降至5℃，开始搅拌。用预冷丙酮溶解三氮嗪(40g)后加入反应容器中。用饱和NaHCO3使溶液的pH保持在6～7之间，5℃下反应3h，取出，3×10倍体积的水/丙酮(1∶1，1∶3，0∶1，1∶1，3∶1，1∶0)依次洗涤，得到1-氨基-Sepharose-3，5-二氯-2，4，6-三氮嗪(190ml)。
取1-氨基-Sepharose-3，5-二氯-2，4，6-三氮嗪(180ml)，称取氨基苯甲酸(20g)用去离子水(50ml)溶解，与1-氨基-Sepharose-3，5-二氯-2，4，6-三氮嗪B混匀，置于温度50℃中搅拌反应24小时。反应结束后，取出反应物，用3倍体积的NaCl，然后用10倍体积的蒸馏水洗涤。得到1-氨基Sepharose-3-氨基苯甲酸-5-氯-2，4，6-三氮嗪(160ml)。
取1-氨基Sepharose-3-氨基苯甲酸-5-氯-2，4，6-三氮嗪(50ml)，称取称取酪氨酸(10g)，用二甲亚砜和去离子水混合溶解，将溶液的pH调至5-8左右，较佳的pH7，倒入反应器与1-氨基Sepharose-3-氨基苯甲酸-5-氯-2，4，6-三氮嗪混合，放于温度为95℃的恒温环境下反应24小时。反应结束后，取出反应物，用4倍体积的NaCl，3体积二甲亚砜洗涤，然后用10倍体积的去离子水洗涤。得到1-氨基Sepharose-3-氨基苯甲酸-5-酪氨酸-2，4，6-三氮嗪亲和分离材料(43ml)，用20％乙醇储存待用。
取1-氨基Sepharose-3-氨基苯甲酸-5-氯-2，4，6-三氮嗪(50ml)，称取称取精氨酸(12g)，用二甲亚砜和去离子水混合溶解，将溶液的pH调至5-8左右，较佳的pH7，倒入反应器与1-氨基Sepharose-3-氨基苯甲酸-5-氯-2，4，6-三氮嗪混合，放于温度为90℃的恒温环境下反应24小时。反应结束后，取出反应物，用4倍体积的NaCl，3体积二甲亚砜洗涤，然后用10倍体积的去离子水洗涤。得到1-氨基Sepharose-3-氨基苯甲酸-5-精氨酸-2，4，6-三氮嗪亲和分离材料(45ml)，用20％乙醇储存待用。
(2)用亲和分离材料纯化鸡卵黄免疫IgY。
鸡蛋黄液∶蒸馏水∶氯仿＝1∶4∶1混合充分振荡，离心，吸出上清水相，弃去沉淀和氯仿。将1-氨基Sepharose-3-氨基苯甲酸-5-精氨酸-2，4，6-三氮嗪亲和分离材料(5ml)，装入层析柱(1.5×5.0cm)中。用20ml磷酸盐缓冲液(25mM，pH7.2，0.05M NaCl)平衡后，把15ml上述上清水相(调pH和电导率与磷酸盐缓冲液相同)加到柱上。用10ml磷酸盐缓冲液(25mM，pH7.2，0.05M NaCl)洗去未吸附的物质后，再用10ml 0.1M醋酸溶液(pH2.0)洗脱，收集洗脱组份。用10-15％的变性非还原SDS-PAGE检测抗体的纯度。鸡卵黄免疫IgY的-步纯化的回收率＞50％，纯度大于99.5％。
实施例2
(1)制备分离材料。
取NH2-Sepharose(200ml)，用5倍体积的1M的NaCl洗涤，再用蒸馏水充分洗涤后，抽去水分，倒入反应器皿中，加入150ml的水，放于冰盐浴中预冷。待温度降至5℃，开始搅拌。用预冷丙酮溶解三氮嗪(40g)后加入反应容器中。用饱和NaHCO3使溶液的pH保持在6～7之间，5℃下反应3h，取出，3×10倍体积的水/丙酮(1∶1，1∶3，0∶1，1∶1，3∶1，1∶0)依次洗涤，得到1-氨基-Sepharose-3，5-二氯-2，4，6-三氮嗪(190ml)。
取1-氨基-Sepharose-3，5-二氯-2，4，6-三氮嗪(180ml)，称取氨基苯甲酸(20g)用去离子水(50ml)溶解，与1-氨基-Sepharose-3，5-二氯-2，4，6-三氮嗪B混匀，置于温度50℃中搅拌反应24小时。反应结束后，取出反应物，用3倍体积的NaCl，然后用10倍体积的蒸馏水洗涤。得到1-氨基Sepharose-3-氨基苯甲酸-5-氯-2，4，6-三氮嗪(160ml)。
取1-氨基Sepharose-3-氨基苯甲酸-5-氯-2，4，6-三氮嗪(50ml)，称取称取酪氨酸(10g)，用二甲亚砜和去离子水混合溶解，将溶液的pH调至5-8左右，较佳的pH7，倒入反应器与1-氨基Sepharose-3-氨基苯甲酸-5-氯-2，4，6-三氮嗪混合，放于温度为95℃的恒温环境下反应24小时。反应结束后，取出反应物，用4倍体积的NaCl，3体积二甲亚砜洗涤，然后用10倍体积的去离子水洗涤。得到1-氨基Sepharose-3-氨基苯甲酸-5-酪氨酸-2，4，6-三氮嗪亲和分离材料(43ml)，用20％乙醇储存待用。
取1-氨基Sepharose-3-氨基苯甲酸-5-氯-2，4，6-三氮嗪(50ml)，称取称取精氨酸(12g)，用二甲亚砜和去离子水混合溶解，将溶液的pH调至5-8左右，较佳的pH7，倒入反应器与1-氨基Sepharose-3-氨基苯甲酸-5-氯-2，4，6-三氮嗪混合，放于温度为90℃的恒温环境下反应24小时。反应结束后，取出反应物，用4倍体积的NaCl，3体积二甲亚砜洗涤，然后用10倍体积的去离子水洗涤。得到1-氨基Sepharose-3-氨基苯甲酸-5-精氨酸-2，4，6-三氮嗪亲和分离材料(45ml)，用20％乙醇储存待用。
(2)用1-氨基Sepharose-3-氨基苯甲酸-5-精氨酸-2，4，6-三氮嗪亲和分离材料纯化鸭IgY和IgY(ΔFc)。
鸭蛋黄液∶蒸馏水＝1∶6混合充分振荡，4℃静置6个小时，离心，吸出上清水相。将1-氨基Sepharose-3-氨基苯甲酸-5-精氨酸-2，4，6-三氮嗪亲和分离材料(5ml)，装入层析柱(1×5.0cm)中。用50ml磷酸盐缓冲液(25mM，pH7.2，0.03M NaCl)平衡后，把20ml上述上清水相(调pH和电导率与磷酸盐缓冲液相同)加到柱上。用5ml磷酸盐缓冲液(25mM，pH7.2，0.03M NaCl)洗去未吸附的物质后，再用5ml 0.1M醋酸溶液洗脱，收集洗脱组份。用10-15％的变性非还原SDS-PAGE检测抗体的纯度。鸭IgY和IgY(ΔFc)的一步纯化的回收率＞55％，纯度大于75％。
实施例3
(1)制备分离材料。
取NH2-Sepharose(200ml)，用5倍体积的1M的NaCl洗涤，再用蒸馏水充分洗涤后，抽去水分，倒入反应器皿中，加入150ml的水，放于冰盐浴中预冷。待温度降至5℃，开始搅拌。用预冷丙酮溶解三氮嗪(40g)后加入反应容器中。用饱和NaHCO3使溶液的pH保持在6～7之间，5℃下反应3h，取出，3×10倍体积的水/丙酮(1∶1，1∶3，0∶1，1∶1，3∶1，1∶0)依次洗涤，得到1-氨基-Sepharose-3，5-二氯-2，4，6-三氮嗪(190ml)。
取1-氨基-Sepharose-3，5-二氯-2，4，6-三氮嗪(180ml)，称取氨基苯甲酸(20g)用去离子水(50ml)溶解，与1-氨基-Sepharose-3，5-二氯-2，4，6-三氮嗪B混匀，置于温度50℃中搅拌反应24小时。反应结束后，取出反应物，用3倍体积的NaCl，然后用10倍体积的蒸馏水洗涤。得到1-氨基Sepharose-3-氨基苯甲酸-5-氯-2，4，6-三氮嗪(160ml)。
取1-氨基Sepharose-3-氨基苯甲酸-5-氯-2，4，6-三氮嗪(50ml)，称取称取酪氨酸(10g)，用二甲亚砜和去离子水混合溶解，将溶液的pH调至5-8左右，较佳的pH7，倒入反应器与1-氨基Sepharose-3-氨基苯甲酸-5-氯-2，4，6-三氮嗪混合，放于温度为95℃的恒温环境下反应24小时。反应结束后，取出反应物，用4倍体积的NaCl，3体积二甲亚砜洗涤，然后用10倍体积的去离子水洗涤。得到1-氨基Sepharose-3-氨基苯甲酸-5-酪氨酸-2，4，6-三氮嗪亲和分离材料(43ml)，用20％乙醇储存待用。
取1-氨基Sepharose-3-氨基苯甲酸-5-氯-2，4，6-三氮嗪(50ml)，称取称取精氨酸(12g)，用二甲亚砜和去离子水混合溶解，将溶液的pH调至5-8左右，较佳的pH7，倒入反应器与1-氨基Sepharose-3-氨基苯甲酸-5-氯-2，4，6-三氮嗪混合，放于温度为90℃的恒温环境下反应24小时。反应结束后，取出反应物，用4倍体积的NaCl，3体积二甲亚砜洗涤，然后用10倍体积的去离子水洗涤。得到1-氨基Sepharose-3-氨基苯甲酸-5-精氨酸-2，4，6-三氮嗪亲和分离材料(45ml)，用20％乙醇储存待用。
(2)用1-氨基Sepharose-3-氨基苯甲酸-5-酪氨酸-2，4，6-三氮嗪亲和分离材料纯化鸡卵黄免疫IgY。
鸡蛋黄液∶蒸馏水∶氯仿＝1∶4∶1混合充分振荡，离心，吸出上清水相，弃去沉淀和氯仿。将1-氨基Sepharose-3-氨基苯甲酸-5-酪氨酸-2，4，6-三氮嗪亲和分离材料(5ml)，装入层析柱(1.5×5.0cm)中。用20ml磷酸盐缓冲液(25mM，pH7.5，0.05M NaCl)平衡后，把15ml上述上清水相(调pH和电导率与磷酸盐缓冲液相同)加到柱上。用10ml磷酸盐缓冲液(25mM，pH7.5，0.05M NaCl)洗去未吸附的物质后，再用10ml 0.1M醋酸溶液洗脱，收集洗脱组份。用10-15％的变性非还原SDS-PAGE检测抗体的纯度。鸡卵黄免疫IgY的一步纯化的回收率＞50％，纯度大于95％。
实施例4
(1)制备分离材料
取NH2-Sepharose(200ml)，用5倍体积的1M的NaCl洗涤，再用蒸馏水充分洗涤后，抽去水分，倒入反应器皿中，加入150ml的水，放于冰盐浴中预冷。待温度降至5℃，开始搅拌。用预冷丙酮溶解三氮嗪(40g)后加入反应容器中。用饱和NaHCO3使溶液的pH保持在6～7之间，5℃下反应3h，取出，3×10倍体积的水/丙酮(1∶1，1∶3，0∶1，1∶1，3∶1，1∶0)依次洗涤，得到1-氨基-Sepharose-3，5-二氯-2，4，6-三氮嗪(190ml)。
取1-氨基-Sepharose-3，5-二氯-2，4，6-三氮嗪(180ml)，称取氨基苯甲酸(20g)用去离子水(50ml)溶解，与1-氨基-Sepharose-3，5-二氯-2，4，6-三氮嗪B混匀，置于温度50℃中搅拌反应24小时。反应结束后，取出反应物，用3倍体积的NaCl，然后用10倍体积的蒸馏水洗涤。得到1-氨基Sepharose-3-氨基苯甲酸-5-氯-2，4，6-三氮嗪(160ml)。
取1-氨基Sepharose-3-氨基苯甲酸-5-氯-2，4，6-三氮嗪(50ml)，称取称取酪氨酸(10g)，用二甲亚砜和去离子水混合溶解，将溶液的pH调至5-8左右，较佳的pH7，倒入反应器与1-氨基Sepharose-3-氨基苯甲酸-5-氯-2，4，6-三氮嗪混合，放于温度为95℃的恒温环境下反应24小时。反应结束后，取出反应物，用4倍体积的NaCl，3体积二甲亚砜洗涤，然后用10倍体积的去离子水洗涤。得到1-氨基Sepharose-3-氨基苯甲酸-5-酪氨酸-2，4，6-三氮嗪亲和分离材料(43ml)，用20％乙醇储存待用。
取1-氨基Sepharose-3-氨基苯甲酸-5-氯-2，4，6-三氮嗪(50ml)，称取称取精氨酸(12g)，用二甲亚砜和去离子水混合溶解，将溶液的pH调至5-8左右，较佳的pH7，倒入反应器与1-氨基Sepharose-3-氨基苯甲酸-5-氯-2，4，6-三氮嗪混合，放于温度为90℃的恒温环境下反应24小时。反应结束后，取出反应物，用4倍体积的NaCl，3体积二甲亚砜洗涤，然后用10倍体积的去离子水洗涤。得到1-氨基Sepharose-3-氨基苯甲酸-5-精氨酸-2，4，6-三氮嗪亲和分离材料(45ml)，用20％乙醇储存待用。
(2)用亲和分离材料纯化卵黄免疫IgY。
鸡蛋黄液∶蒸馏水∶氯仿＝1∶4∶1混合充分振荡，离心，吸出上清水相，弃去沉淀和氯仿。将1-氨基Sepharose-3-氨基苯甲酸-5-精氨酸-2，4，6-三氮嗪亲和分离材料(5ml)，装入层析柱(1.5×5.0cm)中。用20ml磷酸盐缓冲液(25mM，pH4.5)平衡后，把15ml上述上清水相(调pH和电导率与磷酸盐缓冲液相同)加到柱上。用10ml磷酸盐缓冲液(25mM，pH4.5)洗去未吸附的物质后，再用10ml 0.1M甘氨酸-盐酸溶液(pH1.0)洗脱，收集洗脱组份。用10-15％的变性非还原SDS-PAGE检测抗体的纯度。鸡卵黄免疫IgY的一步纯化的回收率约35％，纯度大于90％。
实施例5
(1)制备分离材料
取NH2-Sepharose(200ml)，用5倍体积的1M的NaCl洗涤，再用蒸馏水充分洗涤后，抽去水分，倒入反应器皿中，加入150ml的水，放于冰盐浴中预冷。待温度降至5℃，开始搅拌。用预冷丙酮溶解三氮嗪(40g)后加入反应容器中。用饱和NaHCO3使溶液的pH保持在6～7之间，5℃下反应3h，取出，3×10倍体积的水/丙酮(1∶1，1∶3，0∶1，1∶1，3∶1，1∶0)依次洗涤，得到1-氨基-Sepharose-3，5-二氯-2，4，6-三氮嗪(190ml)。
取1-氨基-Sepharose-3，5-二氯-2，4，6-三氮嗪(180ml)，称取氨基苯甲酸(20g)用去离子水(50ml)溶解，与1-氨基-Sepharose-3，5-二氯-2，4，6-三氮嗪B混匀，置于温度50℃中搅拌反应24小时。反应结束后，取出反应物，用3倍体积的NaCl，然后用10倍体积的蒸馏水洗涤。得到1-氨基Sepharose-3-氨基苯甲酸-5-氯-2，4，6-三氮嗪(160ml)。
取1-氨基Sepharose-3-氨基苯甲酸-5-氯-2，4，6-三氮嗪(50ml)，称取称取酪氨酸(10g)，用二甲亚砜和去离子水混合溶解，将溶液的pH调至5-8左右，较佳的pH7，倒入反应器与1-氨基Sepharose-3-氨基苯甲酸-5-氯-2，4，6-三氮嗪混合，放于温度为95℃的恒温环境下反应24小时。反应结束后，取出反应物，用4倍体积的NaCl，3体积二甲亚砜洗涤，然后用10倍体积的去离子水洗涤。得到1-氨基Sepharose-3-氨基苯甲酸-5-酪氨酸-2，4，6-三氮嗪亲和分离材料(43ml)，用20％乙醇储存待用。
取1-氨基Sepharose-3-氨基苯甲酸-5-氯-2，4，6-三氮嗪(50ml)，称取称取精氨酸(12g)，用二甲亚砜和去离子水混合溶解，将溶液的pH调至5-8左右，较佳的pH7，倒入反应器与1-氨基Sepharose-3-氨基苯甲酸-5-氯-2，4，6-三氮嗪混合，放于温度为90℃的恒温环境下反应24小时。反应结束后，取出反应物，用4倍体积的NaCl，3体积二甲亚砜洗涤，然后用10倍体积的去离子水洗涤。得到1-氨基Sepharose-3-氨基苯甲酸-5-精氨酸-2，4，6-三氮嗪亲和分离材料(45ml)，用20％乙醇储存待用。
(2)用亲和分离材料纯化卵黄免疫IgY。
鸡蛋黄液∶蒸馏水∶氯仿＝1∶4∶1混合充分振荡，离心，吸出上清水相，弃去沉淀和氯仿。将1-氨基Sepharose-3-氨基苯甲酸-5-精氨酸-2，4，6-三氮嗪亲和分离材料(5ml)，装入层析柱(1.5×5.0cm)中。用20ml磷酸盐缓冲液(25mM，pH9.0，0.2M NaCl)平衡后，把15ml上述上清水相(调pH和电导率与磷酸盐缓冲液相同)加到柱上。用10ml磷酸盐缓冲液(25mM，pH9.0，0.2MNaCl)洗去未吸附的物质后，再用10ml 0.1M甘氨酸-氢氧化钠溶液(pH12.0，0.5M NaCl)洗脱，收集洗脱组份。用10-15％的变性非还原SDS-PAGE检测抗体的纯度。鸡卵黄免疫IgY的一步纯化的回收率约45％，纯度大于85％。

Claims (9)

1.一种卵黄免疫球蛋白的仿生亲和纯化方法，其特征在于，以基础层析介质为原料制备仿生亲和分离材料，用制备的仿生亲和分离材料纯化卵黄免疫球蛋白及片段。
2.根据权利要求1所述的卵黄免疫球蛋白的仿生亲和纯化方法，其特征是，包括以下步骤：
(1)基础层析介质与三氯三氮嗪反应活化后，分别与对氨基苯甲酸、以及酪氨酸和精氨酸反应，合成仿生亲和分离材料；
(2)用上述合成的亲和层析介质制备成亲和层析柱，将含卵黄免疫球蛋白的样品流过该亲和层析柱，卵黄免疫球蛋白吸附在亲和层析柱上，冲洗亲和层析柱，不吸附在亲和层析柱上的杂蛋白被除去，然后变换缓冲液条件，再冲洗亲和层析柱，将结合的卵黄免疫球蛋白洗脱下来，得到纯化的卵黄免疫球蛋白。
3.根据权利要求2所述的卵黄免疫球蛋白的仿生亲和纯化方法，其特征是，所述的步骤(1)中，以带氨基的基础层析介质，与三氯三氮嗪反应活化。
4.根据权利要求2所述的卵黄免疫球蛋白的仿生亲和纯化方法，其特征是，所述的步骤(1)中，用常规化学方法对不带氨基的基础层析介质进行活化，与氨水或氨基化合物反应后生成氨基后，再与三氯三氮嗪反应活化；所述的不带氨基的基础层析介质包括：葡聚糖凝胶、交联的葡聚糖珠、烯丙基葡聚糖和N，N’-亚甲基双丙烯酰胺的交联共聚物、琼脂糖凝胶、琼脂糖与葡聚糖的交联共聚物、聚丙烯酰胺/琼脂糖复合物珠、纤维素珠和涂有化学活性基团的硅胶、多孔玻璃与陶瓷。
5.根据权利要求1或2所述的卵黄免疫球蛋白的仿生亲和纯化方法，其特征是，所述的仿生亲和分离材料是指含有4-氨基苯甲酸的结构。
6.根据权利要求1或2所述的卵黄免疫球蛋白的仿生亲和纯化方法，其特征是，所述的仿生亲和分离材料是指含有精氨酸的结构。
7.根据权利要求1或2所述的卵黄免疫球蛋白的仿生亲和纯化方法，其特征是，所述的仿生亲和分离材料是指含有酪氨酸的结构。
8.根据权利要求2所述的卵黄免疫球蛋白的仿生亲和纯化方法，其特征是，所述的步骤(2)中，亲和介质吸附免疫球蛋白的条件为pH 4.5-9.0，离子强度为0.0-0.2M的缓冲液。
9.根据权利要求2所述的卵黄免疫球蛋白的仿生亲和纯化方法，其特征是，所述的步骤(2)中，洗脱条件为pH 2.0-12，离子强度为0.1-0.5M的缓冲液。
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