CN1970745B - 脂肪酶的仿生亲和纯化方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种脂肪酶的仿生亲和纯化方法，属于工业生物技术领域的。本发明包括下列步骤：(1)制备仿生亲和分离材料：首先用带氨基的基础层析介质与三氯三氮嗪进行反应，然后在50℃与烯丙胺反应，最后在95℃与环己胺反应，合成仿生亲和分离材料；(2)用仿生亲和分离材料纯化脂肪酶粗品：用上述制备的仿生亲和分离材料装入层析柱，得到亲和层析柱，随后将含脂肪酶的样品上至该亲和层析柱中，脂肪酶被柱中仿生亲和分离材料专一地吸附留在层析柱中，其它不能被吸附的蛋白随缓冲液流出，最后用洗脱缓冲液将脂肪酶从柱中专一洗脱下来，得到纯脂肪酶。本发明能够高效率、低成本的大规模生产高纯度的脂肪酶。
Description
技术领域
本发明涉及的是一种生物技术领域的规模化制备方法，特别是一种脂肪酶的仿生亲和纯化方法。
背景技术
脂肪酶是甘油酯水解酶(EC 3.1.1.3)，能够将甘油三酯水解成为脂肪酸和甘油，底物是水溶液难以溶解的长链脂肪酰酯。在水解和合成反应中，脂肪酶都表现出良好的立体和手性选择性质，可合成多种具有重要药物经济价值的特殊酯类化合物，在合成手性医药、农药和化学中间体产品中具有广泛用途。脂肪酶一般由微生物发酵生产，发酵液中脂肪酶与微生物分泌的其它蛋白和酶混合在一起，占总蛋白的10％以下。发酵液中常常还存在其它的酶，如蛋白酶，在最终脂肪酶产品中不去除会降解脂肪酶的肽链，并会缩短脂肪酶的使用寿命和循环周期。同时，与脂肪酶共存的还可能有其它底物专一性的酶，可能增加脂肪酶催化反应副产物的含量，降低目的手性产品的产率，加大产品后续分离纯化的技术难度和生产成本。此外，其它惰性杂蛋白的存在也会降低固定化材料的脂肪酶载量、增加固相材料的用量和成本，因此需要对脂肪酶进行纯化处理。
经对现有技术的文献检索发现，Gupta等在《Appl.Microbiol.Biotechnol.》(《应用微生物生物技术》，2005年67卷648-653页)上发表了题为“Single-steppurification of lipase from Burkholderia multivorans using polypropylenematrix”(“用聚丙烯基质从伯克霍尔德菌一步纯化脂肪酶”)的论文，提出如下技术方案：首先将含脂肪酶发酵液的pH调至9.0，上至装有多微孔聚丙烯树脂材料的层析柱中，室温孵育12小时，再用表面活性剂Triton X-100进行洗脱，用丙酮(50％，体积百分比)沉淀回收。但该方法存在着脂肪酶在层析柱中需要与吸附材料孵育12小时以上，树脂材料载量低，从而使生产效率难于提高等缺点。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术中的不足，提供一种脂肪酶的仿生亲和纯化方法，使其能够快速、简便、低成本、大批量纯化脂肪酶。
本发明是通过以下技术方案实现的，本发明以专一性识别脂肪酶的分离材料作为基础，其步骤如下：
(1)制备仿生亲和分离材料
仿生亲和分离材料是通过三氮嗪结构骨架作为间臂分别固定烯丙胺和环己胺两个基团，首先用带氨基的基础层析介质与三氯三氮嗪进行反应，得到基础层析介质氨基二氯三氮嗪，然后在50℃温度下与烯丙胺反应得到1-基础层析介质氨基-2-胺丙烯一氯三氮嗪，最后在95℃温度下与环己胺反应，得到1-基础层析介质氨基-2-胺丙烯基-3-胺环己基三氮嗪，称为仿生亲和分离材料，这样，仿生亲和分离材料的关键是烯丙胺和环己胺两个基团通过三氮嗪结构骨架固定到氨基的基础层析介质上；
所述步骤(1)中，基础层析介质是葡聚糖凝胶、交联的葡聚糖珠、烯丙基葡聚糖-N，N’-亚甲基双丙烯酰胺的交联共聚分离材料、甲基丙烯酸聚合分离材料、琼脂糖凝胶、交联琼脂糖凝胶，琼脂糖与葡聚糖的交联共聚物、聚丙烯酰胺-琼脂糖复合物珠、纤维素珠或涂有化学活性基团的硅胶中的一种。
(2)用仿生亲和分离材料纯化脂肪酶粗品
用上述合成的仿生亲和分离材料装层析柱，用平衡缓冲液平衡后将含脂肪酶的原料上至该亲和层析柱中，脂肪酶被柱中仿生亲和分离材料专一地吸附留在层析柱中，其它不能被吸附的蛋白随缓冲液流出，最后用洗脱缓冲液将脂肪酶从柱中专一洗脱下来，得到纯脂肪酶。
所述步骤(2)中，脂肪酶的吸附条件为pH 5.0-8.0的缓冲液。
所述步骤(2)中，脂肪酶的洗脱条件为pH 1.0-3.0的缓冲液，或含有机溶剂，或含表面活性剂。
所述的洗脱缓冲液含有机溶剂，有机溶剂是指能够与水混溶的醇类和酮类，如甲醇、乙醇、丙醇、异丙醇、丁醇或丙酮。
所述的洗脱缓冲液含有表面活性剂，表面活性剂是指含疏水和亲水两种基团的分子，如斯潘20、斯潘40、斯潘60、斯潘65、斯潘80、斯潘85、吐温20、吐温21、吐温40、吐温60、吐温61、吐温65、吐温80、吐温81或吐温85。
所述的仿生亲和分离材料，其关键的配体结构是通过三氮嗪结构骨架作为间臂分别固定烯丙胺和环己胺两个基团。
所述的脂肪酶，其原料为天然微生物发酵，或通过基因工程技术改造的微生物发酵液，或菌体破碎液。
本发明合成了仿生亲和分离材料，该材料上的一个化学基团能够与脂肪酶分子发生专一和高度特异的、非共价和可逆的相互作用，从而使含脂肪酶的样品与仿生亲和分离材料接触时，能够与具有识别和结合能力的化学基团结合吸附在分离材料上，未结合的物质被溶液携带离开分离材料被除去。在不同条件下，如不同盐浓度，不同酸碱度的缓冲液与分离材料接触，吸附在分离材料上的脂肪酶可特异地从分离材料上解离下来，从而制备高纯度的脂肪酶。
本发明克服了现有脂肪酶生产技术中的缺点，使脂肪酶生产分离纯化时步骤少、生产周期短、成本低、效率高，利用脂肪酶专一的亲和分离材料，可快速、简便、低成本、大批量纯化制备脂肪酶。
具体实施方式
以下对本发明的实施例作详细说明：本实施例在以本发明技术方案为前提下进行实施，给出了详细的实施方式和过程，但本发明的保护范围不限于下述的实施例。
实施例1
取NH2-交联琼脂糖珠300ml，依次用5倍体积的1M NaCl，10倍体积蒸馏水充分洗涤后，抽干转移至反应器皿中，然后加入50ml冰水，在冰水浴中搅拌下加入冷丙酮溶解的三氯三氮嗪100g，其后用饱和NaHCO3调节和维持反应系统的pH在6.0-7.0之间，反应4小时后取出，依次用3×10倍交联琼脂糖珠体积的水/丙酮(体积比分别为0∶1，1∶3，1∶1，3∶1，1∶0)洗涤，得到1-氨基-交联琼脂糖珠-3，5-二氯-2，4，6-三氮嗪，共250ml.
取烯丙胺80ml用去离子水100ml混合，加入含1-氨基-交联琼脂糖珠-3，5-二氯-2，4，6-三氮嗪240ml中混匀，然后用饱和NaHCO3调节和维持反应pH在6.0-7.0之间，置于温度50℃中搅拌反应24小时，反应结束后，将交联琼脂糖珠依次用10倍体积蒸馏水充分洗涤，得到1-氨基-交联琼脂糖珠-3-胺丙烯基-5-氯-2，4，6-三氮嗪240ml，待用。
取环己胺90ml用去离子水150ml混合，加入含1-氨基-交联琼脂糖珠-3-胺丙烯基-5-氯-2，4，6-三氮嗪200ml中混匀，然后用饱和NaHCO3调节和维持反应pH在6.0-7.0之间，置于温度95℃中搅拌反应24小时，反应结束后，将交联琼脂糖珠依次用3x10倍交联琼脂糖珠体积的去离子水充分洗涤，得到1-氨基-交联琼脂糖珠-3-胺丙烯基-5-胺环己基-2，4，6-三氮嗪200ml，用30％乙醇保存，待用。
调含粗脂肪酶的酵母发酵液pH至7.0，然后从中取0.5ml上样至预先用10倍体积磷酸钠缓冲液(10mM磷酸钠，pH7.0)平衡好的装1-氨基-交联琼脂糖珠-3-胺丙烯基-5-胺环己基-2，4，6-三氮嗪亲和分离材料的层析柱(5ml)中，用10ml磷酸钠缓冲液(10mM磷酸钠，pH7.0)洗去未结合的物质，再用1.5ml 0.1M醋酸洗脱，收集得到纯化脂肪酶。取纯化脂肪酶溶液4μl加至含192μl pH8.0、1M TrisCl和4μl 25mM对硝基苯酚葵酸酯(用DMSO配制)的对硝基苯酚酯测定脂肪酶活反应体系中，混匀，室温反应10min，加100μl无水乙醇终止反应，测光吸收A405nm，根据对硝基苯酚标准浓度的光吸收A405nm曲线计算反应体系生成的对硝基苯酚，再计算样品每分钟分解硝基苯酚葵酸酯产生对硝基苯酚的μg数，即酶活力单位(U)。用Lowry法测定蛋白含量，以聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)分析脂肪酶蛋白纯度。实验结果表明：纯化的脂肪酶总活力达到20U，纯度达到85％。
实施例2
调含天然微生物发酵得到的粗脂肪酶样品pH至7.0，然后从中取0.5m上样至预先用10倍体积磷酸钠缓冲液(10mM磷酸钠，pH7.0)平衡好的装1-氨基-交联琼脂糖珠-3-胺丙烯基-5-胺环己基-2，4，6-三氮嗪亲和分离材料的层析柱(5ml)中，用10ml磷酸钠缓冲液(10mM磷酸钠，pH8.0)洗去未结合的物质，再用1.5ml 0.1M醋酸-醋酸钠缓冲溶液(pH3.0，含0.1％吐温80)洗脱，收集得到纯化脂肪酶。按照实施例1中的方法测定脂肪酶活力。实验结果表明：纯化的脂肪酶总活达到25U，纯度达到88％。
实施例3
取NH2-葡聚糖凝胶150ml，依次用5倍体积的1M NaCl，10倍体积蒸馏水充分洗涤后，抽干转移至反应器皿中，加入40ml冰水，在冰水浴中搅拌下加入冷丙酮溶解的三氯三氮嗪50g，用饱和NaHCO3调节和维持反应系统的pH在6.0-7.0之间，反应4小时后取出，将葡聚糖凝胶依次用3×10倍葡聚糖凝胶体积的水/丙酮(体积比分别为0∶1，1∶3，1∶1，3∶1，1∶0)洗涤，得到1-氨基-葡聚糖凝胶-3，5-二氯-2，4，6-三氮嗪120ml。
取烯丙胺40ml用去离子水50ml混合，加至1-氨基-葡聚糖凝胶-3，5-二氯-2，4，6-三氮嗪120ml中混匀，用饱和NaHCO3调节和维持反应pH在6.0-7.0之间，置于50℃条件下搅拌反应24小时，反应结束后，依次用10倍体积蒸馏水充分洗涤，得到1-氨基-葡聚糖凝胶-3-胺丙烯基-5-氯-2，4，6-三氮嗪110ml，待用。
取环己胺45ml用去离子水100ml混合，加至1-氨基-葡聚糖凝胶-3-胺丙烯基-5-氯-2，4，6-三氮嗪80ml中混匀，用饱和NaHCO3调节和维持反应pH在6.0-7.0之间，置于温度95℃中搅拌反应24小时，反应结束后，将葡聚糖凝胶依次用3x10倍葡聚糖凝胶体积的去离子水充分洗涤，得到1-氨基-葡聚糖凝胶-3-胺丙烯基-5-胺环己基-2，4，6-三氮嗪80ml，用30％乙醇(体积百分比)保存，待用。
调基因工程技术改造的酵母发酵液粗脂肪酶样品pH至7.0，取30ml上样至预先用10倍体积磷酸钠缓冲液(10mM磷酸钠，pH7.0)平衡好的装有实施例3合成的1-氨基-葡聚糖凝胶-3-胺丙烯基-5-胺环己基-2，4，6-三氮嗪亲和分离材料的层析柱(50ml)中，用10ml磷酸钠缓冲液(10mM磷酸钠，pH7.0)洗去未结合的物质，再用10ml醋酸(0.1M)洗脱，收集得到纯化脂肪酶。按照实施例1中的方法测定脂肪酶活力。实验结果表明：纯化的脂肪酶总活力1200U，纯度89％。
实施例4
调含粗脂肪酶的酵母发酵液pH至7.0，取30ml上样至预先用10倍体积磷酸钠缓冲液(10mM磷酸钠，pH7.0)平衡好的装实施例3合成的1-氨基-葡聚糖凝胶-3-胺丙烯基-5-胺环己基-2，4，6-三氮嗪亲和分离材料的层析柱(50ml)中，用10ml磷酸钠缓冲液(10mM磷酸钠，pH5.0)洗去未结合的物质，再用10ml醋酸(0.1M，用盐酸调pH至1.0)洗脱，收集得到纯化脂肪酶。按照实施例1中的方法测定脂肪酶活力。实验结果表明：纯化的脂肪酶总活力800U，纯度70％。
实施例5
取NH2-甲基丙烯酸聚合分离材料250ml，依次用5倍体积的1M NaCl，10倍体积蒸馏水充分洗涤后，抽干转移至反应器皿中，然后加入40ml冰水，在冰水浴中搅拌下加入冷丙酮溶解的三氯三氮嗪70g，用饱和NaHCO3调节和维持反应系统的pH在6.0-7.0之间，反应4小时后取出，依次用3×10倍层析材料体积的水/丙酮(体积比分别为0∶1，1∶3，1∶1，3∶1，1∶0)混合溶液洗涤，得到1-氨基-NH2-甲基丙烯酸聚合分离材料-3，5-二氯-2，4，6-三氮嗪220ml。
取烯丙胺60ml用去离子水50ml混合，加入含1-氨基-甲基丙烯酸聚合分离材料-3，5-二氯-2，4，6-三氮嗪200ml中混匀，然后用饱和NaHCO3调节和维持反应pH在6.0-7.0之间，置于温度50℃中搅拌反应24小时，反应结束后，将层析材料依次用10倍体积蒸馏水充分洗涤，得到1-氨基-甲基丙烯酸聚合分离材料-3-胺丙烯基-5-氯-2，4，6-三氮嗪180ml，待用。
取环己胺80ml用去离子水150ml混合，加至1-氨基-甲基丙烯酸聚合分离材料-3-胺丙烯基-5-氯-2，4，6-三氮嗪160ml中混匀，然后用饱和NaHCO3调节和维持反应pH在6-7之间，置于温度95℃中搅拌反应24小时，反应结束后，将反应后的层析材料依次用3x10倍层析材料体积的去离子水充分洗涤，得到1-氨基-甲基丙烯酸聚合分离材料-3-胺丙烯基-5-胺环己基-2，4，6-三氮嗪135ml，用30％乙醇保存，待用。
调含粗脂肪酶的酵母发酵液pH至7.0，取20ml上样至预先用10倍体积磷酸钠缓冲液(10mM磷酸钠，pH7.0)平衡好的装有实施例5合成的1-氨基-甲基丙烯酸聚合分离材料-3-胺丙烯基-5-胺环己基-2，4，6-三氮嗪亲和分离材料的层析柱(10ml)中，用10ml磷酸钠缓冲液(10mM磷酸钠，pH7.0)洗去未结合的物质，再用10ml含50％乙醇的(体积百分比)、0.05M醋酸洗脱，收集得到纯化脂肪酶.按照实施例1中的方法测定脂肪酶活力.实验结果表明：纯化的脂肪酶总活力491U，纯度95％.
实施例6
调脂肪酶生产菌南极假丝酵母菌体破碎液pH至7.0，取20ml上样至预先用10倍体积磷酸钠缓冲液(10mM磷酸钠，pH7.0)平衡好的装有实施例5合成的1-氨基-甲基丙烯酸聚合分离材料-3-胺丙烯基-5-胺环己基-2，4，6-三氮嗪亲和分离材料的层析柱(10ml)中，用10ml磷酸钠缓冲液(10mM磷酸钠，pH7.0)洗去未结合的物质，再用10ml含50％乙醇的(体积百分比)、0.05M醋酸洗脱，收集得到纯化脂肪酶。按照实施例1中的方法测定脂肪酶活力。实验结果表明：纯化的脂肪酶总活力560U，纯度93％。
本发明的上述各个实施例从上样至获得高纯脂肪酶操作简单，时间少于5小时，只需要一步层析操作，生产成本低。利用分离材料与脂肪酶之间的高度专一的相互作用实现纯化的目的，不受生产规模的影响，因此很容易放大进行批量生产。
Claims (8)
1.一种脂肪酶的仿生亲和纯化方法，其特征在于，包括下列步骤：
(1)制备仿生亲和分离材料
首先用带氨基的基础层析介质与三氯三氮嗪进行反应，得到基础层析介质氨基二氯三氮嗪，然后在50℃温度下与烯丙胺反应得到1-基础层析介质氨基-2-胺丙烯一氯三氮嗪，最后在95℃温度下与环己胺反应，得到1-基础层析介质氨基-2-胺丙烯基-3-胺环己基三氮嗪，称为仿生亲和分离材料；
(2)用仿生亲和分离材料纯化脂肪酶粗品
用上述制备的仿生亲和分离材料装层析柱，随后将含脂肪酶的样品上至该亲和层析柱中，脂肪酶被柱中仿生亲和分离材料专一地吸附留在层析柱中，其它不能被吸附的蛋白随缓冲液流出，最后用洗脱缓冲液将脂肪酶从柱中专一洗脱下来，得到纯脂肪酶。
2.根据权利要求1所述的脂肪酶的仿生亲和纯化方法，其特征是，所述的仿生亲和分离材料，其配体结构是通过三氮嗪结构骨架作为间臂分别固定烯丙胺和环己胺两个基团。
3.根据权利要求1所述的脂肪酶的仿生亲和纯化方法，其特征是，步骤(1)中，所述的基础层析介质是葡聚糖凝胶、NH2-交联琼脂糖珠或甲基丙烯酸聚合分离材料。
4.根据权利要求1所述的脂肪酶的仿生亲和纯化方法，其特征是，在步骤(2)中，所述的洗脱缓冲液为1.5mL的浓度为0.1M的醋酸。
5.根据权利要求1所述的脂肪酶的仿生亲和纯化方法，其特征是，在步骤(2)中，所述的洗脱缓冲液为1.5mL的浓度为0.1M的醋酸-醋酸钠缓冲溶液，pH3.0，含0.1％的吐温80。
6.根据权利要求1所述的脂肪酶的仿生亲和纯化方法，其特征是，在步骤(2)中，所述的洗脱缓冲液为10mL浓度为0.1M的醋酸。
7.根据权利要求1所述的脂肪酶的仿生亲和纯化方法，其特征是，在步骤(2)中，所述的洗脱缓冲液为10mL浓度为0.1M的醋酸，用盐酸调pH至1.0。
8.根据权利要求1所述的脂肪酶的仿生亲和纯化方法，其特征是，在步骤(2)中，所述的脂肪酶，其原料为天然微生物发酵液、通过基因工程技术改造的微生物发酵液或菌体破碎液。
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