CN116120458A - 抗tk1单克隆抗体组合物及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种抗TK1单克隆抗体组合物及其应用。所述抗TK1单克隆抗体组合物包括：第一抗TK1单克隆抗体，其能够识别TK1蛋白第70～85位氨基酸并与TK1蛋白第70～85位氨基酸中的任一位点结合；第二抗TK1单克隆抗体，其能够识别TK1蛋白第180～195位氨基酸并与TK1蛋白第180～195位氨基酸中的任一位点结合；所述第一抗TK1单克隆抗体与所述第二抗TK1单克隆抗体的个数比为1:1.0～2.0。通过抗TK1单克隆抗体组合物识别并结合TK1蛋白中的特异性位点，可增强该单克隆抗体的免疫特异性；包含所述抗TK1单克隆抗体组合物的试剂用于化学发光分析仪检测TK1蛋白时，可将TK1蛋白检测灵敏度提升至0.5pM，且重复性不高于10％。

Description

抗TK1单克隆抗体组合物及其应用
技术领域
本发明涉及TK1检测技术领域，具体涉及一种抗TK1单克隆抗体组合物及其应用。
背景技术
胸腺苷激酶(TK)属于脱氧核糖核苷酸激酶家族中的一种，可将TK分离为两种同工酶:胚胎TK和成人TK，前者大量存在于细胞质中，且研究发现其与细胞分裂有关，又称为细胞质TK(TK1)，后者存在于线粒体中，它的表达与细胞周期无关，又称为线粒体TK(TK2)。TK1是细胞周期依赖性标志物，高水平的TK1主要出现在胎儿组织或成人组织的增殖细胞中，如再生的肝脏、脾脏、胸腔积液、骨髓以及胎儿的脂肪组织，另外，在一些赘生性疾病(如恶性肿瘤以及某些病毒感染等)患者的血清和癌症细胞中TK1活性也很高。TK2产生在成人组织中，在胞质内合成后转运至线粒体，TK2的活性只有TK1的5％，大多存在于静止细胞中，在增殖细胞中也存在，但活性很低。虽然TK1和TK2均可以出现在增生和肿瘤细胞中，但病理水平95％以上为TK1活性，故绝大部分情况下提到的TK活性是指TK1活性。
人类的TK1蛋白由同源四聚体组成，每个亚基包含两个结构域：一个α/β结构域和一个小的含锌结构域，即活性蛋白具有四个活性位点。作为催化酶，TK1重要的底物结合位点和活性位点的位置处于α/β和含锌结构域之间。关键的底物结合位点有三处，一是胸苷结合的3个关键残基活性位点，Glu98，Phe128和Tyr181；二是磷酸基团与胸苷的相互作用的4个半胱氨酸锌离子结合位点，Cys153、Cys156、Cys185和Cys188；三是ATP的结合位点，发生在位置26-33，58-60和97-100。
TK1蛋白的研究及相关检测试剂的开发可为临床上体检筛查和预测早期肿瘤风险评估，预后生存评估，预后生存评估以及疗效监控与评估。
目前，TK1活性检测方法有放射性同位素标记法、蛋白质印迹法，免疫组织化学法，TK1浓度检测：酶联免疫吸附法、免疫印迹增强化学发光法但是酶联免疫法、免疫印迹增强化学发光法检测TK1浓度表现出耗时长、灵敏度低等缺陷，限制了TK1抗体及其检测试剂的推广应用。
发明内容
有鉴于此，本发明的主要目的在于提供一种抗TK1单克隆抗体组合物及其应用；所解决的技术问题是通过抗TK1单克隆抗体组合物识别并结合TK1蛋白中的特异性位点，可增强该单克隆抗体的免疫特异性；包含所述抗TK1单克隆抗体组合物的试剂用于磁微粒化学发光法仪检测TK1蛋白时，可将检测时间控制在30min内，同时可将TK1蛋白的检测灵敏度提升至0.5pM，且重复性不高于10％。
依据本发明提出的一种抗TK1单克隆抗体组合物，其包括：
第一抗TK1单克隆抗体，其能够识别TK1蛋白第70-85位氨基酸并能够结合TK1蛋白第70-85位氨基酸中的任一位点；
第二抗TK1单克隆抗体，其能够识别TK1蛋白第180-195位氨基酸并能够结合TK1蛋白第180-195位氨基酸中的任一位点；所述第一抗TK1单克隆抗体与所述第二抗TK1单克隆抗体的个数比为1:1.0-2.0。
本发明还提供前述的抗TK1单克隆抗体组合物在检测TK1蛋白中的应用。
本发明提出的一种生物素，其包被有如前述的第一抗TK1单克隆抗体组合物，本发明还提供第一抗TK1单克隆抗体组合物包被的生物素的制备方法，其包括以下步骤：
1)将生物素用PBS溶液溶解成5.5mg/ml，向生物素中加入第一抗TK1单克隆抗体组合物1mg；室温避光搅拌1h.
2)反应结束用0.02M PB透析过夜，次日透析结束，收集溶液；
本发明提出一种碱性磷酸酶，其包被有如前述的第二抗TK1单克隆抗体组合物，本发明提出的第二抗TK1单克隆抗体组合物包被的碱性磷酸酶的制备方法，其包括以下步骤：
1)将100μl碱性磷酸酶加入到400μl 0.05M CB(PH 9.6),再加入40μl 25％的戊二醛，混匀，4摄氏度活化过夜；
2)将反应溶液在0.02M PB(PH 7.2)透析过夜，第二天收集溶液；
3)将1mg的第二抗TK1单克隆抗体组合物加入到活化过的碱性磷酸酶中，室温搅拌反应4个小时，将反应溶液在0.02M PB(PH 7.2)透析过夜，第二天收集溶液。
本发明还提供一种试剂，其包括R1试剂和R2试剂；其中，R1试剂为含有前述的第一抗TK1单克隆抗体包被的生物素、PB、NaCl、BSA、PEG6000和Proclin300的溶液；R2试剂为含有所述的第二抗TK1单克隆抗体包被的碱性磷酸酶、PB、NaCl、BSA和MgCl2,ZnCl2,Proclin300的溶液。
优选的，所述R1试剂中各组分含量如下：第一抗TK1单克隆抗体包被的生物素的浓度为0.1-0.2mg/ml，PB的浓度为0.02-0.1M，NaCl的浓度为0.9％-1.8％，BSA的浓度为0.5％-1.0％，PEG6000的浓度为1.0％-4.0％，Proclin300的浓度为0.1％-0.5％；其中PB的pH值为7.0-7.4；上述百分比为溶质的质量与PB溶液的体积之比，其中溶质的质量单位为克，PB溶液的体积单位为毫升。
优选的，所述R2试剂中各组分含量如下：第二抗TK1单克隆抗体包被的碱性磷酸酶的浓度为0.05-0.1mg/mL，PB的浓度为0.02-0.1M，NaCl的浓度为0.9％-1.8％，BSA的浓度为0.5％-1.0％，MgCl2-的浓度为0.05-0.1M,ZnCl2的浓度为0.05-0.1Mm,Proclin300的浓度为0.1％-0.5％；其中PB的pH值为7.0-7.4；上述百分比为溶质的质量与PB溶液的体积之比，其中溶质的质量单位为克，PB溶液的体积单位为毫升。
本发明提供一种如前述的试剂在检测TK1蛋白中的应用。
本发明的技术方案具有下列优点：
本发明所提供的抗TK1单克隆抗体组合物，其能够识别并结合TK1蛋白中的特异性位点，可增强该单克隆抗体的免疫特异性；应用所述抗TK1单克隆抗体制备TK1磁微粒化学发光检测试剂，使用该试剂检测TK1蛋白时，可将TK1蛋白的检测灵敏度提升至0.5pM，且检测重复性不高于10％，CV＝4.56％，准确度高；同时，使用该试剂在化学发光分析仪上检测TK1蛋白时，可将检测时间控制在30min内，相比酶联免疫方法学时间短，酶免通常需要2h以上；本发明提供的试剂R1和R2为液态，不需要固相载体，均相反应，灵敏度更高。
附图说明
图1为实施例中采用Logistic四参数拟合的标准曲线。
具体实施方式
为更进一步阐述本发明为达成预定发明目的所采取的技术手段及功效，以下结合附图及较佳实施例，对依据本发明提出的一种抗TK1单克隆抗体组合物及其应用，其具体实施方式、结构、特征及其功效，详细说明如后。
本发明提出一种抗TK1单克隆抗体组合物，其包括第一抗TK1单克隆抗体，其能够识别TK1蛋白第70-85位氨基酸并能够结合TK1蛋白第70-85位氨基酸中的任一位点；其还包括第二抗TK1单克隆抗体，其能够识别TK1蛋白第180-195位氨基酸并能够结合TK1蛋白第180-195位氨基酸中的任一位点；所述第一抗TK1单克隆抗体与所述第二抗TK1单克隆抗体的个数比原则上为1:1；从计量成本以及操作误差考虑，本发明限定所述第一抗TK1单克隆抗体与所述第二抗TK1单克隆抗体的个数比为1:1.0-2.0，也即二者在比例上允许有5％的波动。
所述第一抗TK1单克隆抗体与第二抗TK1单克隆抗体的长度大致为150-160kD，也即两种抗TK1单克隆抗体的分子量相差不大，为了方便计量，一般操作时会以重量比进行计量。
上述TK1蛋白亚基的Uniprot(Universal Protein的英文缩写，是信息最丰富、资源最广的蛋白质数据库)识别号为K7ERV3，其分子量约为28.594kDa，共含有267个氨基酸，其氨基酸序列如下：
由上述氨基酸序列可见，所述TK1蛋白亚基的第70-85位氨基酸为RNTMEALPACLLRDVA，属于GDP结合域；所述TK1蛋白第180-195位氨基酸为GRRGGGMALPPSCPGP，属于磷酸基团与胸苷结合域。
所述抗TK1单克隆抗体组合物与TK1蛋白抗原结合时，第一抗TK1单克隆抗体需要与TK1蛋白抗原的第70-85位氨基酸中的任一位点结合，第二抗TK1单克隆抗体需要与TK1蛋白抗原的第180-195位氨基酸中的任一位点结合。
第一抗TK1单克隆抗体的靶点针对全部β3链和部分α2链，属于ATP结合位点的一部分，结构较为保守；并且β3链具有种属特异性，与细菌来源的TK存在明显差异。另外该靶点空间位置较裸露，有利于抗体结合。
第二抗TK1单克隆抗体的靶点针对全部β8链和α5链，参与胸苷的绑定和锌离子的结合，位于C末端结构域末端，结构保守。该靶点空间位置较裸露，有利于抗体结合。
两抗体在空间位置上相聚较远，避免了抗体之间可能发生的干扰，进一步提高了检测到特异性。
所述第一抗TK1单克隆抗体和第二抗TK1单克隆抗体同时与TK1蛋白抗原反应，形成“第一抗TK1单克隆抗体-TK1蛋白抗原-第二抗TK1单克隆抗体”的复合物，且反应时使所述第一抗TK1单克隆抗体和第二抗TK1单克隆抗体均过量投放，从而使几乎全部的TK1蛋白抗原均能够参与反应形成复合物，然后通过测量反应开始至反应预设时间之间的光强度变化值并与标准曲线比对，得到复合物的浓度值，也即TK1蛋白抗原的浓度值。
本发明的抗TK1单克隆抗体与TK1蛋白抗原结合时，其表位单一，特异性强，生成的“第一抗TK1单克隆抗体-TK1蛋白抗原-第二抗TK1单克隆抗体”复合物结构一致，不存在不同表位结合生成的复合物多样的情况，不存在多表位结合的假性数据，因此应用本发明的抗TK1单克隆抗体组合物进行TK1蛋白抗原浓度检测时，其检验结果准确，检测灵敏度可高达0.5pM。
本发明优选所述第一抗TK1单克隆抗体与所述第二抗TK1单克隆抗体的个数比为1:1，该种精准计量条件下的等量投放抗体，在反应时投放的抗体量在满足大于TK1抗原数量的基础上，会尽可能减少抗体的投放量，可以节约抗体的材料成本。
所述第一抗TK1单克隆抗体、第二抗TK1单克隆抗体与TK1蛋白抗原的结合位点可以通过测量OD 450值进行确认。上述抗TK1单克隆抗体组合物应用于TK1蛋白检测时具有较好的效果，检测灵敏度高达0.5pM，其在0.5pM的TK1蛋白抗原浓度水平下的检测重复性＜10％，检测快捷高效，30min之内即可获得检测结果。
本发明还提出一种磁微粒化学发光检测试剂，所述检测试剂生物素包被有前述的第一抗TK1单克隆抗体，碱性磷酸酶包被第二抗TK1单克隆抗体，两种组合后，可以用于配制TK1蛋白的检测试剂。
实施例1：试剂配制
配制R1试剂：
向浓度为20mM、pH值为7.2的PB溶液中加入NaCl、BSA、PEG6000和Proclin300，使各组分的质量体积百分含量如下：NaCl含量为0.9％、BSA含量为1％、PEG6000含量为2％和Proclin300含量为0.1％；上述的百分比浓度的单位为质量体积百分比，也即溶质的质量比上PB溶液的体积，其中溶质的质量单位为克，PB溶液的体积单位为毫升。
上述试剂中，所述BSA为牛血清白蛋白，目的是为了封闭生物素表面的裸露位点，以保护抗体免受液体中自由基的氧化而破坏；所述PEG6000中文名称为聚乙二醇6000，英文名称为Macrogol 6000，其在水或乙醇中易溶。所述Proclin300是一种防腐剂，其能够迅速穿透细胞膜，抑制对细胞呼吸至关重要的特定酶，适用于体外医学诊断。
配制R2缓冲液：
向浓度为20mM、pH值为7.2的PB溶液中加入NaCl、BSA和MgCl2,ZnCl2,Proclin300，使各组分的质量体积百分含量如下：NaCl含量为0.9％、BSA含量为1％,MgCl2含量为0.05M,ZnCl2含量为0.05mM和Proclin300含量为0.1％；上述的百分比浓度的单位为质量体积百分比，也即溶质的质量比上PB溶液的体积，其中溶质的质量单位为克，PB溶液的体积单位为毫升。
上述试剂中，所述BSA是牛血清白蛋白，又称第五组分，是牛血清中的一种白蛋白，包含583个氨基酸残基，功能与前述相同，不再赘述。MgCl2和ZnCl2是保护碱性磷酸酶的活性，Mg2+和Zn2+是碱性磷酸酶的活性中心金属离子，适当的添加有助于酶的活性稳定。
上述2株分别针对不同表位的抗TK1单克隆抗体的获取方法如下：
1)免疫原制备(TK1-KLH)
TK1偶联血蓝蛋白(KLH)：将11.7mg的外购TK1蛋白半抗原溶于350μL N,N-二甲基甲酰胺(DMF)中，在温水条件下溶解，然后准确称取21.2mg N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)、76.3mg N,N-二环已基碳二亚胺(DCC)依次加入上述溶液中，在室温条件下连续搅拌24h，有混浊物产生，在5℃，10000rpm/min条件下，离心5min，去除沉淀，吸取上清液缓，然后缓慢逐滴加入到50mg KLH已溶于5mL的PBS(0.01M，pH7.4)中，室温搅拌3h后，将此溶液转移到透析袋中，在4℃下、PBS缓冲液(pH 7.4，0.01mol/mL)中透析三天，最后测定其浓度并分装，贮存于-20℃冰柜中。
2)免疫程序
将100μgK1-KLH(TK1偶联的血蓝蛋白)与弗氏完全佐剂等体积充分混合，制备成200μL混悬液，注射入BALB/c小鼠(白变种实验室老鼠)后腿肌肉。
于小白鼠第一次注射混悬液的第14天、第28天、第35天，分别将100μg TK1-KLH(TK1偶联的血蓝蛋白)与弗氏不完全佐剂等体积充分混合，制备成200μL混悬液，注射入该BALB/c小鼠的后腿肌肉中进行加强免疫。在末次免疫的一周后进行采血。
在酶标板孔内包被200ng TK1蛋白，采用间接ELISA法检测血清中抗体效价，血清稀释106倍后OD值为1.085，随后进行冲击免疫，冲刺剂量为免疫原200μg，200μL混合液(免疫原与生理盐水的混合液)，3天后做细胞融合。
3)脾细胞制备
a)将冲刺免疫后的小鼠，应用摘除眼球法进行采血，收集血清并离心，上清液置于-20℃保存，备用。取血后拉颈处死小鼠。将小鼠置于75％酒精中浸泡5min灭菌。
同时，将不完全DMEM倒入四个平皿中，其中第四个平皿(内有筛网)严格移入10mL。然后取1mL PEG置于15mL离心管中，取15mL Free DMEM置于另一个15mL离心管中，37℃水浴待用。
b)消毒后取出小鼠，使小鼠左侧朝上并用大头针固定于超净台中的无菌解剖台上。
c)用解剖剪掀开左侧腹部皮肤、腹膜，按动物解剖的正规程序取出脾脏，置于已盛有约10mL不完全DMEM的培养皿中，洗涤并剪去脾脏四周的结缔组织。取脾脏时小心避免伤破肠胃，且保证脾脏完整，以免造成污染。
d)将脾脏移入另外两个盛有约10mL不完全DMEM的培养皿中清洗，最后移到第四个平皿的200目细胞筛网内。
e)使用弯钩小镊子夹住，用5mL一次性注射器的活塞轻轻研磨，使脾细胞透过筛网进入培养液中。当筛网上只剩结缔组织时，停止研磨。用移液管将细胞吹打成单细胞悬液，移入新的50mL无菌离心管中。
f)取10mL不完全DMEM清洗平皿和筛网，同样移至上述50mL离心管中，混匀此20mL，静置10min以沉降其中的结缔组织。
4)脾细胞与骨髓瘤细胞融合
在细胞融合前3天，扩大培养小鼠骨髓瘤细胞SP2/0并计数。
处死小鼠，分离小鼠脾脏，制备小鼠脾细胞悬液并计数。
脾细胞与小鼠骨髓瘤细胞SP2/0按细胞数比例1：1混匀，离心后弃上清液。
低速涡旋状态下，缓慢滴加37℃预热的PEG4000，滴加数量同所弃上清液的体积。
于37℃条件下静置90s，再加入37℃预热的无血清DMEM培养基，滴加数量为PEG4000体积量的20倍。
静置10min后，离心，收集细胞，加入HAT培养基重悬细胞。
将融合后的细胞加入96孔细胞培养板，50μL/孔，置于37℃5％CO2细胞培养箱内培养，此后隔一天加一次。如果孔内液体已满，则先吸出液体，再加入新的培养液。在第七天开始观察细胞状态，在十天左右就能用HT培养液。取培养上清进行ELISA检测，一共得到6株抗TK1单克隆抗体，按照其在96孔细胞培养板上的横纵坐标分别将抗体编号计为1C3D7、1D7F7,3G9H2、3B6G7、3D2E7、和4C4F11。
5)抗TK1单克隆抗体结合抗原表位筛选
合成生物素标记的TK1蛋白片段多肽，测定抗人TK1单克隆抗体在TK1上的结合区域，本实施例设置结合区域分为四个区域，分别为P1(aa：1-69)、P2(aa：70-85)、P3(aa：86-179)、P4(aa：180-195)，P5(196-234)。采用ELISA方法分析抗TK1单克隆抗体的结合抗原表位，结果如表1所示。
表1抗TK1单克隆抗体结合表位筛选结果(OD450值)
由表1的测试数据可知，抗TK1单克隆抗体1C3D7和1D7F7与P2多肽片段的OD 450值分别为2.227和2.018，结合于P2，不与P1、P3、P4反应；3G9H2，3B6G7，3D2E7，4C4F11与P4多肽片段的OD 450值为2.011，2.009，2.155，2.136，结合于P4，不与P1、P2、P3反应；本实施例中筛选出的针对P2序列结合的抗TK1单克隆抗体为1C3D7和1D7F7号抗体，针对P4序列结合的抗TK1单克隆抗体为3G9H2，3B6G7，3D2E7，4C4F11号抗体。
6)抗体对筛选
将针对P2序列和P4序列的抗TK1抗体分别两两配对检测全长段的TK1蛋白。采用ELISA方法，筛选TK1抗体对，结果如下表2：
表2抗TK1单克隆抗体结合筛选结果(OD450)
3G9H2 3B6G7 3D2E7 4C4F11
1C3D7 0.427 0.118 2.112 0.324
1D7F7 1.713 0.189 1.883 0.247
由表2数据可知：1D7F7与3G9H2配对OD450值为1.713，3D2E7分别与1C3D7和1D7F7配对的OD450值为2.112和1.883，所以，此次筛选出三对配对抗体对分别是：1D7F7与3G9H2，3D2E7与1C3D7，3D2E7和1D7F7，鉴于3D2E7与1C3D7的OD450值最大，后期使用这一配对研究磁微粒化学发光体系的试剂。
实施例2：标准曲线建立
稀释TK1蛋白抗原，使其浓度分别为0pM、1pM、2pM、10pM、20pM、50pM，以上述稀释的TK1蛋白抗原作为校准品，分别计为S0、S1、S2、S3、S4、S5。
使用北京华科泰生物技术股份有限公司的Savant-2000全自动化学发光分析仪进行检测。R1试剂50μL、测试样本25μL和R2试剂50μL，检测结果如下表4所示。
表3实施例2的校准浓度和反应度
校准品编号 校准浓度(单位：pM) 反应度
S0 0 2286
S1 1 16775
S2 2 61897
S3 10 228546
S4 20 986313
S5 50 3003354
采用Logistic四参数进行曲线拟合，得到的标准曲线如附图1所示。标准曲线的方程如下：
y＝(4186746.0000–34701.4300)/[1+(x/33.9403)^(-2.3523)]+34701.4300
上述标准曲线的相关系数R为0.9997。
实施例3：灵敏度检测
将浓度为1pM的TK1蛋白抗原的校准品S1稀释2倍，使其浓度低至0.5pM。
使用北京华科泰生物技术股份有限公司的Savant-2000全自动化学发光分析仪进行检测。R1试剂50μL、测试样本25μL和R2试剂50μL；重复检测10次，记录检测结果如下表5所示。
表4实施例3的检测结果
测试序号 检测结果单位：(pM)
1 0.5111
2 0.5301
3 0.5332
4 0.4921
5 0.4717
6 0.5
7 0.5222
8 0.4831
9 0.5109
10 0.4703
平均值M 0.502
SD 0.023
CV 4.56％
由上述表4的测试数据可见，共重复检测10次，其中最大值0.5332pM,最小值0.4703pM，平均值M为0.502pM，总体标准差SD为0.023，重复性CV为4.56％。
上述平均值M为检测结果的算术平均值，在excel中的函数符号为AVERAGE(检测结果1，检测结果2，……)。
上述SD为给定样本的标准偏差函数，能反映一个数据集相对于平均值(mean)的离散程度，是用来计算研究对象的标准差，在excel中的函数符号为STDEV(检测结果1，检测结果2，……)。
所述重复性CV是指相对标准偏差，是用检测数据的标准偏差和平均值的比值计算而得，一般检测仪器对重复性的要求为小于10％。
通过表4测试数据可知，本发明提供的抗TK1单克隆抗体(3D2E7)包被生物素，将其用R1缓冲液稀释到合适浓度，本发明提供的抗TK1单克隆抗体(1C3D7)包被碱性磷酸酶，将其用R2缓冲液稀释到合适浓度，R1和R2试剂一起用于检测浓度为0.5pM的TK1蛋白抗原样本时，其重复性CV，也即变异系数低，仅为4.56％，不高于10％，说明本发明提供的TK1化学发光试剂的灵敏度可达0.5pM。
本实施例的检测方法检测TK1蛋白抗原浓度时，其耗时小于30min。
实施例4：试剂盒空白限研究：
取浓度为0pM的校准品基质S0用试剂盒检测20次，20次检测结果的浓度值的平均值M与标准差SD，以平均值加两倍标准差M+2SD对应的浓度值为空白限：结果如下表5
表5实施例4的结果
U1 0.023
U2 0.0184
U3 0.0452
U4 0.0313
U5 0.0222
U6 0.0329
U7 0.0144
U8 0.0062
U9 <0.0001
U10 0.0233
U11 0.0182
U12 0.0022
U13 0.0191
U14 0.0184
U15 0.0424
U16 0.0399
U17 0.0407
U18 0.0416
U19 0.0337
U20 0.0486
M 0.027
SD 0.013
M+2SD 0.054
结果表明：试剂盒的空白限为0.054pM。
实施例5：试剂盒特异性研究：
取可能的交叉反应物质，用试剂盒检测，每个交叉反应物检测三次重复，计算三次浓度的平均值，并计算平均浓度与原浓度的比值，作交叉反应率。结果如下：
结果表明:试剂盒与交叉物几乎无交叉反应。
实施例6：试剂盒检测样本研究：
用试剂盒检测健康人的血清样本，结果如下：
编号 检测浓度
1 0.3689
2 0.5538
3 0.6571
4 0.4992
5 0.4033
6 0.5503
7 0.548
8 0.3764
9 0.4755
10 0.5985
用试剂盒检测临床诊断癌症患者的真实血清样本。结果如下：
结果说明：试剂盒检测的临床诊断癌症患者的样本浓度值明显高于健康人的样本浓度，试剂盒的准确度高，明确区分阴阳性。
参考文献
[1]Dario Segura-Stefan Lutz,Christian Monnerjahn,Manfred Konradand Arnon Lavie.Binding of ATP to TK1-like Enzymes Is Associated with aConformational Change in the Quaternary Structure.J.Mol.Biol.(2007)369,129-141.
[2]Welin,M.,Kosinska,U.,Mikkelsen,N.E.,Carnrot,C.,Zhu,C.,Wang,L.etal..Structures of thymidinekinase 1of human and mycoplasmic origin.Proc.NatlAcad.Sci.USA,(2004)101,17970–17975.
[3]Birringer,M.S.,Claus,M.T.,Folkers,G.,Kloer,D.P.,Schulz,G.E.&Scapozza,L..Structure of a type II thymidine kinase with bound dTTP.FEBSLetters,(2005)579,1376–1382。

Claims (10)

1.一种抗TK1单克隆抗体组合物，其特征在于：其包括：
第一抗TK1单克隆抗体，其能够识别TK1蛋白第70～85位氨基酸并与TK1蛋白第70～85位氨基酸中的任一位点结合；
第二抗TK1单克隆抗体，其能够识别TK1蛋180～195位氨基酸并与TK1蛋白第180～195位氨基酸中的任一位点结合；
所述第一抗TK1单克隆抗体与所述第二抗TK1单克隆抗体的个数比为1:1.0～2.0。
2.如权利要求1所述的抗TK1单克隆抗体组合物在检测TK1蛋白中的应用。
3.一种生物素，其特征在于：其包被有如权利要求1所述的第一抗TK1单克隆抗体。
4.如权利要求3所述的生物素的制备方法，其特征在于：包括以下步骤：
1)将生物素用PBS溶液溶解成5.5mg/ml，向生物素中加入如权利要求1所述的第一抗TK1单克隆抗体1mg；室温避光搅拌1h.
2)反应结束用0.02MPB透析过夜，次日透析结束，收集溶液即得。
5.一种碱性磷酸酶，其特征在于：其包被有权利要求所述的第二抗TK1单克隆抗体。
6.一种如权利要求5所述的碱性磷酸酶的制备方法，其特征在于：包括以下步骤：
1)将100μl碱性磷酸酶加入到400μl0.05MCB，PH9.6,再加入40μl25％的戊二醛，
混匀，4摄氏度活化过夜；
2)将反应溶液在0.02MPB，PH7.2透析过夜，第二天收集溶液；
将1mg的第二抗TK1单克隆抗体加入到活化过的碱性磷酸酶中，室温搅拌反应4个小时，将反应溶液在0.02MPB，PH7.2透析过夜，第二天收集溶液即得。
7.一种试剂，其特征在于：包括R1试剂和R2试剂；其中，R1试剂为含有如权利要求3所述的第一抗TK1单克隆抗体包被的生物素、PB、NaCl、BSA、PEG6000和Proclin300的溶液；R2试剂为含有如权利要求5所述的第二抗TK1单克隆抗体包被的碱性磷酸酶、PB、NaCl、BSA和MgCl2,ZnCl2,Proclin300的溶液。
8.根据权利要求7所述的试剂，其特征在于：其中所述R1试剂中各组分含量如下：第一抗TK1单克隆抗体组合物包被的生物素的浓度为0.1～0.2mg/ml，PB的浓度为0.02～0.1M，NaCl的浓度为0.9％～1.8％，BSA的浓度为0.5％～1.0％，PEG6000的浓度为1.0％～4.0％，Proclin300的浓度为0.1％～0.5％；其中PB的pH值为7.0～7.4。
9.根据权利要求7所述的试剂，其特征在于：其中所述R2试剂中各组分含量如下：第二抗TK1单克隆抗体组合物包被的碱性磷酸酶的浓度为0.05～0.1mg/mL，PB的浓度为0.02～0.1M，NaCl的浓度为0.9％～1.8％，BSA的浓度为0.5％～1.0％，MgCl2的浓度为0.05～0.1M,ZnCl2的浓度为0.05～0.1Mm,Proclin300的浓度为0.1％～0.5％；其中PB的pH值为7.0～7.4。
10.一种如权利要求7所述的试剂在检测TK1蛋白中的应用。
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