CN116814573B - 一种用于制备乳酸脱氢酶c的琥珀酰化位点特异性抗体的免疫原及其制备方法和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及免疫原制备和抗体检测技术领域，提供了一种用于制备乳酸脱氢酶C的琥珀酰化位点特异性抗体的免疫原及其制备方法和应用。所述免疫原包含一种琥珀酰化修饰多肽，所述琥珀酰化修饰多肽的氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示，所述氨基酸序列第12位的赖氨酸具有琥珀酰化修饰。本发明以琥珀酰化修饰多肽为免疫原制备的针对LDHC‑K317succ位点的特异性抗体具有高效价和高特异性的特性，可在体外和特异性识别精子中琥珀酰化修饰的LDHC，可用于特发性男性不育的精准诊疗试剂。
Description
技术领域
本发明涉及免疫原制备和抗体检测技术领域，尤其涉及一种用于制备乳酸脱氢酶C的琥珀酰化位点特异性抗体的免疫原及其制备方法和应用。
背景技术
弱精症病因复杂，但具体发病机制不明。因此，实现精准诊疗男性不育症有赖于对精子活力调控机制以及弱精症发生机制的深层次阐明。精子维持正常活力需要消耗足够能量，而糖酵解在精子能量合成中起到至关重要的作用。乳酸脱氢酶C(lactatedehydrogenase C，LDHC)是雄性生殖系统特异的糖酵解酶，其基因敲除导致雄性小鼠不育，精子ATP含量和活力显著降低。LDHC为精子贡献80％以上的乳酸脱氢酶活性。在精子活力低下病人精子中，检测到相较于正常人精子样本低水平的乳酸脱氢酶活性，因此LDHC及其活性是弱精子症诊疗的重要靶标之一。
在体细胞中，LDH活性被报道受新型蛋白质翻译后修饰——赖氨酸琥珀酰化(lysine succinylation，Ksucc)的调控。Ksucc是2011年被发现的一种重要的新型赖氨酸酰基化修饰，发生琥珀酰化的赖氨酸电荷从+1变成-1，引入琥珀酰基，导致蛋白质特性的改变，具有广泛的调控潜能，在三羧酸循环和糖酵解等物质和能量代谢过程中起重要作用，并与心血管疾病、神经疾病、肿瘤甚至新冠病毒感染密切相关。
研究发现LDHC第317位赖氨酸琥珀酰化修饰(LDHC-K317succ)能促进LDHC活性并且与弱精子症密切相关，而LDHC-K317succ作为维持乳酸脱氢酶活性的关键，可能是弱精症诊疗的重要靶标。但是目前对于检测LDHC-K317succ水平的检测手段有限。迫切需要一种通过简易操作的方法，检测精子中LDHC-K317succ水平，以评估乳酸脱氢酶活性，最终能够对男性不育患者进行精准诊疗。
发明内容
本发明的目的在于提供一种用于制备乳酸脱氢酶C的琥珀酰化位点特异性抗体的免疫原及其制备方法和应用，制备特异性识别LDHC-K317succ的抗体有助于开发弱精子症诊疗试剂，而找寻合适的免疫原是制备特异性抗体的关键。
为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：
本发明提供了一种琥珀酰化修饰多肽，所述琥珀酰化修饰多肽的氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示，所述氨基酸序列第12位的赖氨酸具有琥珀酰化修饰。
本发明还提供了一种包含所述琥珀酰化多肽的免疫原。
本发明还提供了一种免疫原的制备方法，包括如下步骤：
(1)合成琥珀酰化修饰多肽，并与钥孔血蓝蛋白交联，得到钥孔血蓝蛋白交联多肽；
(2)溶解钥孔血蓝蛋白交联多肽，并与弗氏完全佐剂震荡乳化，得到免疫原。
本发明还提供了一种所述琥珀酰化修饰多肽或所述免疫原或所述的制备方法得到免疫原在制备识别LDHC-K317succ的特异性抗体中的应用。
本发明还提供了一种特异性抗体的制备方法，包括如下步骤：
(1)将免疫原对实验动物进行背部多点皮下注射免疫；
(2)2～3周免疫一次，共注射3～5次；
(3)最后一次注射完6～8天后采血，分离纯化得到效价为256k～512k的特异性抗体；
所述皮下注射免疫的免疫原用量为200μg/次～400μg/次。
本发明还提供了一种所述特异性抗体的制备方法制备得到的识别LDHC-K317succ的特异性抗体。
本发明还提供了一种所述特异性抗体在制备用于检测LDHC-K317succ的试剂中的用途。
优选的，所述试剂用于LDHC-K317succ的体内或体外检测。
本发明还提供了一种所述特异性抗体在制备用于特发性弱精子症的诊断试剂中的用途。
本发明以琥珀酰化修饰多肽为免疫原制备的针对LDHC-K317succ位点的特异性抗体具有高效价和高特异性的特性。利用该抗体筛选人精子样本，发现它可在体外和人精子中特异性识别第317位赖氨酸琥珀酰化修饰的LDHC，并且精子中LDHC-K317succ水平与精子前向运动和弱精子症密切相关。制备特异性识别LDHC-K317succ的抗体有助于开发弱精子症诊疗试剂，而找寻合适的免疫原是制备特异性抗体的关键，对进一步研究制备弱精症的诊疗靶点和制备男性避孕药具有重要意义。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据提供的附图获得其他的附图。
图1为实施例1中琥珀酰化修饰多肽的质谱分析图；
图2为实施例1中非修饰多肽的质谱分析图；
图3为实施例1中LDHC-K317succ位点特异性抗体的纯度鉴定结果；(M:蛋白质分子质量标准，不同条带的分子量标注在左侧；1为LDHC-K317succ抗体的纯度鉴定结果；2为非琥珀酰化修饰多肽对LDHC-K317succ抗体进行反筛纯化后的纯度鉴定结果。1和2中55kDa大小的蛋白为抗体重链条带)；
图4为实验例1中LDHC-K317succ抗体的特异性检测结果；
图5为实验例1中LDHC-K317succ抗体在体外和精子中识别琥珀酰化修饰的LDHC的验证；(A为利用LDHC-K317succ抗体进行免疫印迹实验在体外检测精子总蛋白中LDHC-K317succ；B为利用LDHC-K317succ抗体进行免疫荧光实验在检测人精子中LDHC-K317succ；标尺为5μm)；
图6为实验例2中LDHC-K317succ水平与精子前向运动和弱精子症的相关性。(A为利用LDHC-K317succ抗体进行免疫印迹实验检测正常人和弱精子症精子中LDHC-K317succ相对含量。差异显著性用studentt-test分析，***P<0.001。B为采用斯皮尔曼相关系数分析评估精子前向运动和LDHC-K317succ相对含量之间的相关性。当P值<0.05时，认为具有显著性)。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明提供的技术方案进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。
实施例1
识别LDHC-K317succ的特异性抗体的设计和制备
1、多肽序列的分析与设计
利用DNAstar软件对LDHC的氨基酸进行抗原表位分析，评估其亲水性、抗原性、表面可能性、柔性区等指数，综合考虑氨基酸类别、分布、结构复杂程度、易氧化难度、合成难度、小鼠与人的同源性等，并且根据发生琥珀酰化修饰的LDHC第317位赖氨酸前后氨基酸序列进行评估，最终确定LDHC上306-318位13个氨基酸作为合成多肽的序列，对应序列为306-INLNSEEEALFKK-318。
分别合成第12位赖氨酸被琥珀酰化修饰的多肽(INLNSEEEALFKsuccK(如SEQ IDNO：1所示)，其质谱分析结果如图1所示，分子量为1737.85)和非修饰多肽(INLNSEEEALFKK，其质谱分析结果如图2所示，分子量为1637.85)。
利用合成的琥珀酰化修饰多肽与钥孔血蓝蛋白(KLH)交联，得到KLH交联多肽。
2、免疫动物
选择两只新西兰白兔(2.5kg重)作为免疫动物，用400μL浓度为0.01mol/L的磷酸缓冲液溶解KLH交联多肽，与弗氏完全佐剂等体积比例混合，充分震荡乳化，将乳化好的免疫原用于皮下免疫，在兔子背部多点注射免疫，共免疫4次，每2周免疫1次，400μg/次。最后一次注射完7天后，取耳动脉血，使用间接ELISA方法，确定抗体效价，待效价大于1/50,000时，采血制备并纯化抗体。
3、抗体纯化
(1)将巯基胶与步骤1中合成的琥珀酰化修饰多肽偶联制备成抗原亲和纯化层析柱，将所得抗血清与PBS等量混合后缓慢上样，待抗体结合后用甘氨酸洗脱缓冲液洗脱，即得到所需纯化抗体，将其命名为LDHC-K317succ抗体，立即在PBS中进行4℃透析过夜，隔日进行纯度，浓度和效价测定；
间接ELISA检测纯化后LDHC-K317succ抗体的效价如表1所示：LDHC-K317succ抗体针对琥珀酰化修饰多肽的效价为512K，针对非琥珀酰化多肽的效价为128K。
对纯化后的LDHC-K317succ抗体进行SDS-PAGE电泳，考马斯亮蓝染色，如图3所示，图3中1所示为LDHC-K317succ抗体的纯度鉴定结果，可得知的是1中只有一条主带，纯度较高，所以纯度在85％以上。抗体浓度通过BCA法测定后浓度为0.4mg/mL。
表1：纯化抗体(过琥珀酰化多肽柱子)检测结果
(2)将巯基胶与上述步骤1中合成的非琥珀酰化多肽偶联制备成抗原亲和纯化层析柱，将上述纯化的LDHC-K317succ抗体缓慢上样，收集上样流出液即为去除交叉反应后的LDHC-K317succ抗体，立即在PBS中进行4℃透析过夜，隔日进行纯度，浓度和效价测定。
间接ELISA检测去除交叉反应后的LDHC-K317succ抗体的效价如表2所示：去除交叉反应后的LDHC-K317succ抗体针对琥珀酰化多肽效价大于1024K，针对非琥珀酰化多肽效价在16K。抗体针对琥珀酰化多肽的效价大于非琥珀酰化多肽效价的50倍，说明该抗体的特异性好。
对去除交叉反应后的LDHC-K317succ抗体进行SDS-PAGE电泳，考马斯亮蓝染色，如图3中2所示利用非琥珀酰化修饰多肽对(1)中的LDHC-K317succ抗体进行反筛纯化后的纯度在85％以上，抗体浓度通过BCA法测定后浓度为0.52mg/mL，其稀释1024000倍以后，仍然可以识别琥珀酰化多肽，因此0.52mg/ml÷1024000＝0.5ng/mL，所以，计算出抗体针对琥珀酰化多肽检测灵敏度为0.5ng/mL。
表2去除交叉反应后的LDHC-K317succ抗体的检测结果
实施例2
使用实施例1中去除交叉反应后的LDHC-K317succ抗体，利用斑点杂交的实验检测了该抗体的特异性，如图4所示，结果显示该抗体能识别实施例1中步骤1合成的低至1ng的LDHC-K317succ多肽，并与非修饰的多肽无交叉反应，证明该抗体具有较好的特异性。
实验例1
1、LDHC-K317succ抗体在体外和精子中识别琥珀酰化修饰的LDHC
取4例正常人精液，每例精液分别取2mL小心上样于装有5mL HTF培养基(购自于瑞典Vitrolife公司)的50mL离心管底部，将离心管倾斜45°放置于37℃二氧化碳培养箱(5％体积比CO2)中上游1h后，取4mL上清液于500g室温离心5min后，去上清，沉淀分别用200μL体细胞裂解液(0.2％SDS,0.5％TritonX-100)裂解体细胞后，然后用含1×蛋白酶抑制剂混合液和1×去乙酰化酶抑制剂混合液的RIPA缓冲液(50mM Tris-HCl，0.5％NP-40，100mMNaCl，1mM EDTA，pH 8.0)冰上裂解精子2h后，12,000g，4℃离心10min后，取含有精子总蛋白的上清，用BCA法测定精子总蛋白浓度，四份正常人精子总蛋白浓度为：3.45μg/μL，3.82μg/μL，2.75μg/μL和4.12μg/μL。
2、免疫印迹检测精子总蛋白中LDHC-K317succ
取20μg精子总蛋白通过10％的SDS-PAGE分离后，通过湿转法将蛋白转运到PVDF膜上，用含5％脱脂奶粉的TBST封闭液处理PVDF膜，25℃，80rpm转速的摇床上封闭1h，再用TBST清洗膜，10min/遍，共3遍；
加入1：10000体积比TBST稀释的实施例1得到的去除交叉反应后LDHC-K317succ抗体，4℃，50rpm转速的摇床上封闭过夜；孵育结束后，用TBST洗膜，5min每遍，共6遍。
PVDF膜再与1：10000体积比TBST稀释的HRP标记的羊抗兔二抗，25℃，80rpm转速的摇床上孵育1h后，用TBST洗膜，5min每遍，共6遍，最后PVDF膜浸泡于TBST中；
按1：1的比例在离心管中混匀ECL试剂盒中的A液与B液，将混合液覆盖在膜上，避光显色，然后通过化学发光凝胶成像系统曝光拍照记录；
如图5A所示，LDHC-K317succ抗体能在体外特异识别人精子总蛋白中第317位赖氨酸琥珀酰化修饰的LDHC。
3、免疫荧光检测人精子中LDHC-K317succ
用0.01％多聚赖氨酸溶液铺满共聚焦平皿底部凹槽处，静置10min，回收液体，于37℃烘干，用双蒸水清洗2遍，晾干；
取实验例1的步骤2中的上游法纯化后的1×106个正常人精子，用4％多聚甲醛室温固定10min，PBS缓冲液重悬后，500g室温离心5min，用100μL PBS缓冲液重悬后涂布在处理好的平皿底部凹槽处，37℃静置20min，吸去多余的悬液，用PBS轻轻清洗3遍，每遍2-3min，在显微镜下观察精子是否已吸附牢于平皿底部；平皿中加入PBST(含有0.5％TritonX-100的PBS)孵育15min通透精子；
吸去PBST，加入封闭液(含有5％BSA、0.05％Triton X-100的PBS)室温下封闭60min；用封闭液按照1：100体积比稀释实施例1制备的LDHC-K317succ抗体200μL，于4℃下，50rpm转速摇床孵育过夜；
第二天去掉一抗稀释液，用PBST(含有0.05％TritonX-100的PBS)洗涤6遍，5min每遍，充分洗去未结合的抗体，加入200μL封闭液1：200体积比稀释的绿色荧光染料DyLight488标记的羊抗兔二抗，室温下，在50rpm转速摇床上避光孵育1h；吸去液体，PBS洗涤6遍，5min每遍，加入200μL 0.5μmol/L的细胞核荧光染料DAPI至平皿中，覆盖皿底，静置15min；
吸去DAPI稀释液，用PBS洗涤3遍，每遍5min，向皿中加入PBS覆盖，在激光共聚焦下观察结果并拍照记录；
如图5B所示，LDHC-K317succ抗体组在人精子主段观察到明显的绿色荧光，这证明该抗体能特异识别人精子中第317位赖氨酸琥珀酰化修饰的LDHC。
实验例2
评估LDHC-K317succ水平与精子前向运动和弱精子症的相关性
1、收集人精子样本
使用计算机辅助精子分析仪检测精液样本的精子参数，参照第五版《人类精液实验室检验手册》(由世界卫生组织2010年颁布)将精液样本分为正常精子组(精液参数正常且1年内有生育史的男性)和弱精症精子组(精子数量正常、前向性运动率低于32％的1年以上不育史的男性)。收集25例正常人和25例弱精子症精液样本。
2、按照实验例1的方法分别提取精子中的总蛋白以及利用免疫印迹检测精子总蛋白中LDHC-K317succ。
3、LDHC-K317succ相对定量
使用Image J软件分析免疫印迹最后ECL显色的目的条带的灰度值，LDHC-K317succ相对定量用LDHC-K317succ的灰度值除以内参ACTIN的灰度值来进行相对定量。
4、统计分析
使用GraphPad Prism5.0软件，两组数据间差异性比较均采用student t-test检验。采用斯皮尔曼相关系数分析评估精子前向运动和LDHC-K317succ相对含量之间的相关性。当P值<0.05时，认为具有显著性。
如图6A所示，LDHC-K317succ在正常人精子中相对含量显著高于弱精子症精子中的相对含量(P<0.001)，并且精子中LDHC-K317succ与精子前向运动率呈现正相关(P<0.001，r＝0.522，图6B)。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
Claims (4)
1.一种琥珀酰化修饰多肽免疫原，其特征在于，所述琥珀酰化修饰多肽是在如SEQ IDNO：1所示氨基酸序列的基础上，对第12位的赖氨酸进行琥珀酰化修饰得到；
所述免疫原的制备方法，包括如下步骤：
(1)合成琥珀酰化修饰多肽，并与钥孔血蓝蛋白交联，得到钥孔血蓝蛋白交联多肽；
(2)溶解钥孔血蓝蛋白交联多肽，并与弗氏完全佐剂震荡乳化，得到免疫原。
2.一种如权利要求1所述的免疫原的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
(1)合成琥珀酰化修饰多肽，并与钥孔血蓝蛋白交联，得到钥孔血蓝蛋白交联多肽；
(2)溶解钥孔血蓝蛋白交联多肽，并与弗氏完全佐剂震荡乳化，得到免疫原。
3.一种如权利要求1所述的免疫原或按照权利要求2所述的制备方法得到免疫原在制备识别LDHC-K317succ的特异性抗体中的应用。
4.一种如权利要求3所述的应用中的特异性抗体的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
(1)将免疫原对实验动物进行背部多点皮下注射免疫；
(2)2～3周免疫一次，共注射3～5次；
(3)最后一次注射完6～8天后采血，分离纯化得到效价为256k～512k的特异性抗体；
所述皮下注射免疫的免疫原用量为200μg/次～400μg/次。
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| PB01 | Publication | ||
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| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
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| GR01 | Patent grant | ||
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