NO303287B1

NO303287B1 - DNA, DNA-fragment, rekombinant DNA, DNA-hybridisasjonsprobe, vertscelle, rekombinant peptid og immunogen sammensetning

Info

Publication number: NO303287B1
Application number: NO874750A
Authority: NO
Inventors: Rolf E Streeck; Stewart Cole
Original assignee: Pasteur Institut
Priority date: 1986-03-21
Filing date: 1987-11-13
Publication date: 1998-06-22
Also published as: DK175314B1; FI100057B; NO874750D0; JPH09117294A; US6344314B2; EP0243221B1; US5554538A; US20040132012A1; ES2039254T3; JPS63502798A; ATE76429T1; FI875082A; FI875082A0; US6107086A; JP2633275B2; DE3779175D1; US7063963B2; US6242250B1; WO1987005630A1; AU615159B2

Description

Foreliggende oppfinnelse vedrører DNA, DNA-hybridisasjonsprobe, vertscelle, rekombinant peptid og immunogen sammensetning.

DNA-produkter av papillomaviruset er betegnet som IP-2 (nå betegnet som HPV-33) i EP-PS nr. 85.402362.9 i november 29, 1985. Et plasmid inneholdende DNA av nevnte virus er avgitt til CNCM ("Collection nationale de- Culture de Micro-Orga-nismes" av the Pasteur Institute of Paris) under nr. 1-450.

Papillomavirusene er medlemmer av papovavirusfamilien og består av et genom med omtrent 7 900 basepar (bp) bestående av et kovalent lukket, sirkulært DNA-molekyl. Humane papillomaviruser (HPV) blir klassifisert på basis av deres DNA-sekvenshomologi (6) og nesten 40 typer er nå blitt beskrevet. En betydelig innsikt i HPV-biologien og deres befatning i humane sykdommer er blitt oppnådd ved bruk av molekylærbiologiske teknikker. En mulig rolle for HPV'er i humancancer var antatt etter deteksjonen av HPV DNA i svulster fra maligne overføringer av genitale vorter (33). Kloningen av to HPV genomer, HPV-16 og HPV-18 (3, 11) fra servikale karsinomer har stimulert forskningen i dette området som er av betydelig sosio-økonomisk viktighet. Disse virusene ble oppdaget i mer enn 70% av de undersøkte maligne genitale svulstene og i mange andre ble HPV-16 relaterte sekvenser oppdaget (3, 16, 33). Blant disse er HPV-33 som nylig ble klonet fra et invasivt servikalt karsinom med HPV-16 som probe under mindre stringente betingelser (1). I det foreliggende har vi bestemt DNA-sekvensen til HPV-33 og beskrevet dets slektskap til HPV-16. Når det gjelder papillomavirusene er HPV-33 unikt, da det inneholder en 78 bp tandem gjentagelse som ligner svært på forsterkeren til SV40 (4, 14).

Oppfinnelsen er basert på kloningstrategien som er beskrevet senere av genomet til HPV-33 som muliggjorde identifiseringen av bestemte DNA-sekvenser, mere bestemt de som utgjorde hybridiseringsprober, spesielt nyttig for deteksjon- av DNA til papillomavirusene relatert til HPV-33 i humant vev, hvor positive responser kan bli relatert til den mulige utviklin-gen I verten av invasive servikale karsinomer.

Referanse er i det følgende lavet til tegningene, hvorpå figurene gjelder resp.: Fig. la og lb. Nukleotid sekvens til HPV-33. Posisjon 1 på det sirkulære genomet korresponderer til en "Hpa-lik" sekvens funnet ved sammenligning med HPV-6b. Fig. 2. Distribusjon av hovedleserammen i HPV-33 genomet. Leserammene ble identifisert ved sammenligninger med andre HPV-sekvenser og stoppkodonene er representert med vertikale linjer. Beliggenheten av de unike restriksjonssetene er også indikert (S, Smal; E, EcoRV; B2, Bglll; Bl, Bgll) og de sansylige polyadinyleringssignalene (PA) for de tidlige og de sene transkriptene. I tillegg til disse ble 6 andre potensielle PA-sites (AATAAA) detektert ved posisjonene 862, 1215, 1221, 2666, 5837 og 6239. Fig. 3. Hovedtrekkene til det ikke-kodende område. Et område av det ikke-kodende område fra posisjonene 7500 til 114 er vist. 78 bp tandem gjentagelse er det satt en strek over og de områdene som ligner på det Z-DNA dannende element til SV-40 forsterkeren er indikert. Potensielle promoter-elementer er betegnet med stjerner og de 3 kopiene til 12 bp palindromet er innesluttet mellom to prikkede linjer.

Foreliggende oppfinnelse vedrører følgelig DNA, kjennetegnet ved at det har nukleotidsekvensen ifølge figurene IA og IB.

Det er videre beskrevet DNA-fragment bestående av en åpen leserammen, kjennetegnet ved at DNA-fragmentet er avledet fra det genome DNA til HPV-33 og selektert fra gruppen av fragmentene som strekker seg mellom de nukleotide ytter punktene definert under i relasjon til nukleotid-nummereringen i henholdsvis fig. la og lb.

76 - 556

543 - 864

867 - 2811

2 728 - 3 808 3 326 - 3 575 3 842 - 4 079 4 198 - 5 611 5 516 - 7 091

Foreliggende oppfinnelse vedrører også DNA-fragment som koder for et protein, kjennetegnet ved at DNA-fragmentet er utledet fra det genome DNA til HPV-33 og selektert fra gruppen av fragmenter som strekker seg mellom de nukleotide ytterpunktene som er definert under i relasjon til nukleotid-nummerering i henholdsvis fig. la og lb: 109 - 556 573 - 864 879 - 2811 2 749 - 3 808 3 326 - 3 575 3 842 - 4 079 4 210 - 5 611 5 594 - 7 091

Det er videre beskrevet DNA fragment kjennetegnet ved at det er avledet fra genomisk DNA til HPV 33 og rager mellom nukleotid ekstremitetene definert nedenfor i relasjon til nukleotidnummereringen i figurene la og IB: 1275-1307.

Det er også beskrevet DNA-fragment kjennetegnet ved at det er avledet fra det genomiske DNA til HPV33 og som rager mellom nukleotidekstremitetene definert nedenfor i relasjon til nukleotidnummereringen i figurene la og lb: 229-404.

Foreliggende oppfinnelse vedrører også rekombinant DNA, kjennetegnet ved at det kan replikere i en vertscelle, spesielt bakterier, slik som E. coli, som inneholder et innskudd bestående av et hvilket som helst av fragmentene som er definert i kravene 1 til 7 koblet med et fremmed DNA.

Det er også beskrevet DNA-hybridisasjonsprobe for deteksjon av viralt DNA, kjennetegnet ved at den inneholder et hvilket som helst fragment ifølge kravene 1 til 7 eller blir dannet fra den rekombinante DNA ifølge kravene 8 eller 9, eller fra en del derav.

Det er videre beskrevet vertscelle, kjennetegnet ved at den er transformert med rekombinant DNA ifølge krav 8 eller 9.

Oppfinnelsen vedrører også rekombinant peptid, kjennetegnet ved at aminosyresekvensen kan avledes fra DNA-fragmentet ifølge et hvilket som helst av kravene 1 til 7. Oppfinnelsen vedrører også immunogenisk sammensetning, kjennetegnet ved at den omfatter minst et rekombinant peptid ifølge krav 12.

Prefererte sekvenser er de som koder for hele proteiner, mer bestemt og respektivt de nukleotidsekvensene som har åpne leserammer som angitt nedenfor i tabell 1.

Betingelsene hvorpå DNA-sekvensanalysene ble utført er definert under "Materialer og metoder". Konklusjonene som ble trukket fra denne sekvensanalysen står under "Diskusjon".

MATERIALER OG METODER

DNA- sekvensanal. yser.

Kilden til HPV-33 sekvensert i denne studien var plasmid pl5-5 (1) som består av et Bglll linearisert HPV-33 genom klonet inn i et pBR322 derivat. Et bibliotek av et vilkårlige DNA-fragmenter (400-800 bp) var laget i M12mp8 (17) etter sonikering og ende-reparering av pl5-5, som beskrevet tidligere (28). DNA-sekvensering ble utført ved dideoksy-kjedetermineringsmetoden (19, 20) med modifikasjonene til Biggin et al. (2). Mesteparten av sekvensen fremkom på denne måten, selv om deler av det ikke-kodende område ikke ble funnet eller var underrepresentert i det M13 biblioteket (> 300 kloner). Sekvensen til dette området ble oppnådd direkte fra pl5-5 ved bruk av metoden til Smith (24). Kort beskrevet, restriksjonsfragmentene isolert fra 2 "komplementære" M13 kloner ble brukt til å starte DNA-syntese på templater som ble preparert fra pl5-5, som hadde blitt linearisert med et restriksjonsenzym og deretter behandlet med eksonuklease III (200 enheter/pmol DNA i 1 time ved 22"C).

Dataanalyser.

DNA-sekvensene ble skrevet og analysert med programmene til Staden (26, 27) som modifisert ved B. Caudron. Optimal oppsetting av DNA eller proteinsekvensene ble oppnådd ved bruk av algoritmen utviklet av Wilbur og Lipman (31).

RESULTATER OG DISKUSJON

Genomisk arrangement av HPV- 33

Den fullstendige 7909 nukleotidsekvensen til HPV-33, bestemt ved M13 shotgun-kloning/dideoksy-sekvensering, er presentert i fig. 1. I gjennomsnitt ble hver posisjon sekvensert 6,5 ganger. I samsvar med konvensjonene for andre papilloma-virussekvenser begynner nummereringen ved seter som ligner på oppdagelsessekvensen for Hpal i det ikke-kodende område.

En analyse av distribusjonen av nonsens-kodoner (fig. 2) viser at, slik det gjør i alle andre sekvenserte papillomaviruser, de 8 hovedåpne leserammer er lokalisert på den samme kjeden. Noen fellestrekk mellom HPV-33 og HPV type la, 6b og 16 sammen med cottontail rabbit papillomavirus og prototypen bovin papillomavirus, BPV-1, (5, 7, 8, 13, 21, 22) består i overlapping mellom den største åpne leserammen i den tidligere region, El og E2, og innsettingen av E4 innenfor seksjonen som koder for E2. Det interessante, er at Bglll- setet som er brukt i den molekylære kloningen av HPV-33 ligger innenfor E1/E2 overlappingen. En annen egenskap felles for alle papillomaviruser, unntatt BPV-1, er overlappingen mellom leserammene til LI og L2.. LI etterfølges av et 892 bp ikke-kodende område, som, analogt med BPV-1 (15, 29) uten tvil inneholder replikasjonsorigo og diverse transkripsjonene regulatoriske elementer. De viktigste karakteris-tika til HPV-33 genomet er summert i tabell 1.

Sammenligning av nukleotldsekvens med HPV- 16

HPV-16 er det eneste andre onkogene papillomaviruset som er isolert fra svulster i det ano-genitale området, som er blitt fullstendig sekvensert (22). Hovedtrekkene til HPV-33 ligner på HPV-16, med unntak av at HPV-16 har en avbrudt El leseramme. Alle kodende sekvenser i HPV-33, med unntagelse av E5, er noe kortere enn de tilsvarende i HPV-16. Dette medvirker til det faktum at det ikke-kodende område, mellom LI og E6 (fig. 2), er 76 bp lengre, dette medfører at genomene er nesten av konstant størrelse.

Da de åpne leserammene ble parvis sammenlignet (tabell 2) ble det oppdaget at El, E2, E6, E7, LI og L2 utviste mellom 65-75$ homolog!, mens E4 og E5 divergerte mere (omtrent 50% homologi). Disse funn bekrefter heterodupleksanalysen som ble utført tidligere (1). Et komparativt studium (8) av genproduktet til papillonavirus El viste at polypeptidet består av et NHg-terminalt segment med veldig variabel sekvens, og et COOH-terminalt område med en godt konservert primær struktur. Det lengste område med perfekt sekvenshomologi, 33 nukleotider (posisjoner 1275-1307, fig. 1) finnes nær 5'-enden av El' leserammen i et område som koder for det variable området til polypeptidet. Flere andre områder med fullstendig identitet (19-28 nukleotider) ble detektert andre steder i El, og også i E2, L2 og LI. Da mange av disse sekvensene ikke finnes i genomene til andre HPV'er, slik som HPV-la og HPV-6b, dette medfører muligheten av at de korresponderende oligonukleotidene kan bli produsert og brukt som diagnostiske hybridisasjonsprober ved screening av biopsin-materialer fra potensielle tumorigene lesjoner.

Potensielle genprodukter.

Papillomavirus-genproduktene kan bli delt inn i de som en tror kun spiller en strukturell rolle, LI og L2, og de som kreves for viral propagering og opprettholdelse. Resultatene av sammenligningen av de sansynlige produktene av hovedlese-rammene fra HPV-33, 16 og 6b er summert i tabell 2. Som ventet er det stor identitet mellom de okogene HPVs-33 og 16, spesielt for de foreslåtte El, E6, E7, L2 og Ll-proteinene. Når konserverende substitusjoner bli inkludert, øker homologien mellom de to Ll-polypeptidene til 90%, dette tyder på at de korresponderende kapsidene må være antigent relaterte. I kontrast til dette, ble det detektert signifikant svakere homologier når analysene var utvidet til ' å inkludere den benign genitale vorte-dannende HPV-6b (tabell 2). En sammenligning av HPV-16 og HPV-6b proteinene viser noe mer homologi enn det som ble funnet med HPV-33, dette antyder en evolusjonært nærmere forbindelse.

Den lkke- kodete regionen.

Den ikke-kodete regionen til HPV-33 fremviser flere unike forhold og ligner bare svakt på dets homolog HPV-16. Lokalitet mellom LI stopp-kodon og inkludert det antatte polyadenyleringssignalet for de sene transkripsjonene er et område med 223 bp (posisjonene 7097-7320, fig. 1) som er uvanlig rikt på T + G ( 79%). Innenfor dette område er det 2 kopier av en 19 bp direkte gjentagelse (med en mismatch) og 7 kopier av motivet TTGTRTR (hvor R er A eller G). Det siste finnes også 7 ganger i det korresponderende område til HPV-16, dette antyder at det kan representere et gjenkjennings-sete for proteiner som er involvert i replikasjonen. En bør være klar over at begynnende replikasjonsgaf ler er blitt lokalisert i dette området til BPV-1 genomet (29) og at Epstein-Barr-virusets replikasjonsorigo består av en mengde repeterte sekvenser (32).

Et 12 bp palindrom (ACCG....CGGT) som finnes eksklusivt i det ikke-kodete området I alle undersøkte papillomavirusgenomene er nylig blitt rapportert av Dartmann et al. (9). Tre kopier ble funnet i HPV-33 genomet (fig. 3) og disse okkuperer de samme posisjonene i det ikke-kodete området til HPV-16. En rolle for pallindromet som et mulig kontrollsete for den tidlige promotoren ble foreslått (4, 9, 15) og en indirekte støtte for dette, er gitt ved at det ble oppdaget at de ikke-kodete regionene til HPV'ene, slik som HPV-33, ikke fremviser det tettsittende arrangementet av gjenkjenningssetene for den promoter-spesifike aktiveringsfaktoren Spl(12). Dette er i direkte kontrast til situasjonen i et annet papovavirus, SV40 (12, 14).

Det viktigste trekket til HPV-33 er en perfekt 78 bp tandem repeterende sekvens lokalisert 200 bp etter det antatte replikasjonsorigo (fig. 3). Ingen andre repeterende regioner på denne størrelse eller med denne sekvensen er blitt beskrevet i genomene til andre papillomaviruser. Den antatte tidlig promoter til HPV-33 er lokalisert omtrent 300 bp nedstrøms fra den tandem repeterte regionen og de karakteris-tiske promoterelementene kunne bli identifiserte (fig. 3). Størrelsen, posisjonen og arrangementet av den 78 bp repeterende sekvensen i HPV-33 genomet foreslår at de fungerer som forsterkere av den virale transkripsjonen. Tandemrepeterte sekvenser på 72, 73 og 68 bp er blitt lokalisert nær den tidlig promotorregionen til SV40 (4, 14), i LTR til moloney murine sarcoma virus (10), og i BK virusgenomet (23) og forsterker transkripsjonen fra PolII avhengige promotorer på en cis-aktiv måte. Fra mutagenese av SV40 forsterkeren (14, 30) og sekvenssammenligninger av karakteriserte transkripsjonene aktivatorer fremkom en consensus-forsterkersekvens. Denne strukturen ble ikke detektert i den 78 bp repeterte sekvensen, men en potensiell Z-DNA-dannende region ble oppdaget. Z-DNA er antatt å tiltrekke regulatoriske moleky-ler til eukaryote promotorer og et Z-DNA-antistoff bindings- sete er blitt demonstrert innenfor forsterkeren til SV40 (18). Sekvensen hvorpå dette antistoffet binder er også funnet, om enn med en enkel feilparing, i den antatte HPV-33 forsterkeren (posisjoner 7520-7527, 7599-7606, fig. 1, 3).

Den antatte HPV-33 forsterker viser ingen utstrakt sekvenshomologi til de godt karakteriserte forsterkerne eller til andre papillomavirus-regulatoriske regioner. Men, det er nylig blitt demonstrert at et forsterkerlignende element er lokalisert i den ikke-kodete regionen til BPV-1 og at det krever E2-produktet for å bli aktivert (25). Disse funnene støtter vårt framlegg om at den 78 bp tandem repeterte sekvensen kan ha forsterkningsfunksjoner og kan indikere at den relative lave homologien (tabell 2) mellom E2-proteinene til HPV-33 og 16 reflekterer en spesifisitet for de korresponderende forsterker/regulatoriske områdene.

Sekvensene som er av spesiell interesse korresponderer til den åpne leserammen til E6, E7, El, E2, E4, E5, L2, LI.

Oppfinnelsen vedrører også bruken av disse sekvensene som hybridiseringsprober, enten de som er brukbare for deteksjon av andre papillomaviruser, grupper av papillomaviruser-prober inneholdende deler eller hele åpne leserammer korresponderende til LI - eller de som er mere virus-spesif ike, f.eks. prober som inneholder deler eller hele av den korresponderende åpne leserammen.

Den relateres også til andre prober som detekterer sub-grupper av papillomaviruser, spesielt prober for deteksjon av virusene som kan bli relatert til viktige sykdomsklasser, f.eks. viruser assosiert med svulster. Som eksempel på en av de nevnte probene bør den nevnes som inneholder sekvensen mellom nukleotidene 1275 og 1307 i hht. nummereringen av nukleotidene i fig. IA, IB.

Oppfinnelsen vedrører også alle nevnte DNA-sekvenser, når de er merket på en passende måte, f.eks. en radioaktiv enzyma-tisk eller Immunofluorescensmerking.

DNA som er fremkommet fra det virale genomet og som bærer nukleotider som modifiserte med en kjemisk gruppe som kan bli oppdaget av antistoffer, danner også deler av oppfinnelsen. Det er velkjent at slike DNA kan bli dannet ved nick-transla-sjon ved tilstedeværelse av nukleotider som er modifiserte deretter. Dette DNA danner spesielt verdifulle hybridiseringsprober som, når de blir hybridisert til en DNA prepara-sjon inneholdende den søkte komplementære kjeden, kan bli detektert med de antistoffene som er nevnt ovenfor.

Oppfinnelsen vedrører også diagnostiske metoder pr. se. Egnede metoder blir eksemplifiserte senere.

Flere hybridiseringsmetoder kan brukes. F.eks. spot-hybridi-seringsmetoden innbefatter etter denaturering av DNA, avsetting av en alikvot av DNA på film (nitrocellulose eller Genescreenplus), hybridiseringen av hver film under de vanlige betingelsene med en probe, og deteksjonen av det radioaktive hybridet ved kontakt mellom hybridiseringsfilmen og den radiografiske filmen. En annen mulighet er replikerte kulturhybridiseringer som involverer agarosegelelektroforese-separasjon av DNA fragmenter som fremkommer etter behandling av DNA med restriksjonsenzymer, og overføringer av fragmentene etter alkalisk denaturering på filmene (nitrocellulose eller Genescreenplus) og deres hybridisering under vanlige betingelser med forskjellige probeblandinger. Dannelsen av de radioaktive hybridene blir igjen detektert ved kontakt mellom hybridiseringsflimene og de radiografiske filmene. Probene i oppfinnelsen kan bl.a. bli brukt for å detekterer de relevante virusene (eller dets DNA), i preparering bestående av biopsier av celler som fås ved skraping av en lesjon, eller av biopsiseksjoner fiksert med Carnoy's mikstur (etanol, kloroform, eddiksyre 6:3:1) og lagt i paraffin.

De nevnte nukleotid sekvensene kan bli satt inn i vektorer, for dannelse av modifiserte vektorer som, når introdusert i egnede vertsceller, kan bli transkribert og hvor det er hensiktsmessig, kan DNA sekvensen bli translatert for dannelse av de korresponderende proteinene som kan bli isolert fra vertens cellulære ekstrakter. Det er mulig for mennesker som er trenet i kunsten, å selektere de mest hensiktsmessige vektorene, særlig i relasjon til den verten som blir transformert. Vektorer består bl.a. av plasmider eller fag som selekteres både med hensyn på deres mulighet for replikasjon i de korresponderende prokaryote cellene (eller gjærcellene) og ved å tillate ekspressjon av de DNA sekvensene som de inneholder.

Oppfinnelsen relateres også til rekombinante DNA inneholdende et innskudd bestående av en DNA-sekvens som korresponderer til et hvilket som helst av de åpne leserammene som er definert ovenfor, eller deler av disse, som er konstruert på en måte som tillater ekspressjon av innskuddet i eukaryote celler, spesielt celler til varmblodige dyr. Passende DNA-rekombinante er genetisk konstruert, slik at innskuddet blir satt under kontroll av et viralt eller en eukaryot promoter som oppdages av polymerasene til de selekterte cellene og som videre innbefatter passende polyadenyleringsseter nedstrøms for innskuddet.

Som eksempel vises det til at oppfinnelsen vedrører rekombinante DNA inneholdende et hvilket som helst av de åpne leserammer som er innført og som er satt under kontroll av en promotor fra genomet til SV40-viruset. Slike rekombinante DNA - eller vektorer - kan bli brukt til å transformere høyere eukaryote celler, spesielt celler fra pattedyr (bl.a. Vero-celler). Oppfinnelsen vedrører videre deler av de DNA-sekvensene som er identifisert ovenfor, som når de blir innført i lignende vektorer, kan kode for deler av de korresponderende proteinene som har lignende immunologiske egenskaper som de som blir kodet for hele nukleotidsekvensen som er nevnt ovenfor. Likheten i immunologiske egenskaper kan bli oppdaget ved at de korresponderende polypeptidene som blir produsert av den relevante verten, blir oppdaget av antistoffene som tidligere ble dannet mot proteinene som ble produsert av de cellene som tidligere var transformert med vektorer som inneholder hele DNA-sekvensen som ble nevnt ovenfor.

Det sier seg selv at oppfinnelsen også vedrører en hvilken som helst nukleotid sekvens som er relatert til de foran-stående og som kan bli dannet, i hvert fall delvis syntetisk, og hvor nukleotidene kan variere innenfor dens genetiske kode, i den utstrekning disse variasjonene ikke medfører en vesentlig modifisering av de polypeptide sekvenser som blir kodet av de slik-modifiserte nukleotide sekvensene.

Oppfinnelsen vedrører også selve proteinet og polypeptidene som ble renset og gjort tilgjengelig ved de ovenfor nevnte metodene. Disse polypeptidene, når produsert i en passende vert, kan enten bli ervervet fra cellene, bl.a. etter ødeleggelse av deres cellevegger, eller fra mediet til kulturen av cellene når de blir utskilt I mediet, avhengig av det celle-DNA-rekombinante systemet som er brukt. De ervervede polypeptidene kan deretter blir renset ved hjelp av vanlige opprensningsprosedyrer. En bør vite at "renset" i denne sammenhengen betyr en renhet sgrad som gir seg til uttrykk ved at det rensede proteinet når det blir kjørt i en SDS-PAGE, elektroforese gir et eneste detekterbart bånd, ved f.eks. Western blot.

De ervervede virale proteinene, mere bestemt de strukturelle proteiner, som ble ervervet p.g.a. ekspressjonen av de nevnte DNA-sekvensene i E. coli, kan bli brukt til in vitro deteksjon av antistoffene mot de papillomavirusene som det er sansynlig å detektere i vevsprøver fra pasienter som kan ha blitt infektert med papillomavirus.

Disse rensede polypeptidene kan deretter bli brukt til dannelsen av de korresponderende antistoffene, som igjen kan bli brukt ved in vitro diagnostisering av tilstedeværelse av virale polypeptider i en biologisk væske, spesielt i et serum eller en vevskultur fra en pasient. Som i det foregående, relaterer oppfinnelsen til deler av de ovenfor definerte polypeptidene, spesielt de som blir gjenkjent av de samme antistoffene, eller i motsatt fall, kan utløse en in vivo produksjon av antistoffene som gjenkjenner hele proteinene.

Det må forstås at oppfinnelsene relateres også spesifikt til de spesielle peptidene som blir kodet av DNA-områdene som det ble spesielt referert til i den foregående redegjørelsen og som er blitt funnet å være av spesiell interesse.

Oppfinnelsen relateres også til intergene sekvenser som er av spesiell interesse, spesielt den 78 bp sekvensen. Denne sekvensen er av spesiell interesse som et mulig innskudd i eukaryote vektorer, spesielt i en posisjon oppstrøms for promotoren og nedstrøms for det sete hvor transkripsjonen av genet eller nukleotidsekvensen, den transkripsjon som er søkt blir initiert i den relevante verten.

BIBLIOGRAFI

Claims

1. DNA,karakterisert vedat det har nukleotidsekvensen ifølge figurene la og lb.

2. DNA-fragment bestående av en åpen leseramme,karakterisert vedat DNA-fragmentet er avledet fra det genome DNA til HPV-33 og selektert fra gruppen av fragmentene som strekker seg mellom de nukleotide ytterpunktene definert under i relasjon til nukleotid-nummereringen i henholdsvis fig. la og lb. 76 - 556 543 - 864 867 - 2811

2 728 - 3 808

3 326 - 3 575

3 842 - 4 079

4 198 - 5 611

5 516 - 7 091

3. DNA-fragment som koder for et protein,karakterisert vedat DNA-fragmentet er utledet fra det genome DNA til HPV-33 og selektert fra gruppen av fragmenter som strekker seg mellom de nukleotide ytterpunktene som er definert under i relasjon til nukleotid-nummerering i henholdsvis fig. la og lb: 109 - 556 573 - 864 879 - 2811

2 749 - 3 808

3. 326 - 3 575

3 842 - 4 079

4 210 - 5 611

5 594 - 7 091

4 . Fragment ifølge krav 1 eller 3,karakterisertved at det er et klonet fragment.

5. Fragment Ifølge krav 2 eller 3,karakterisertved at det er et syntetisk eller et semi-syntetisk DNA.

6. DNA-fragment,karakterisert vedat det er avledet fra genomisk DNA til HPV 33 og rager mellom nukleotid ekstremitetene definert nedenfor i relasjon til nukleotidnummereringen i figurene la og IB:

1275-1307.

7. DNA-fragment,karakterisert vedat det er avledet fra det genomiske DNA til HPV33 og som rager mellom nukleotidekstremitetene definert nedenfor i relasjon til nukleotidnummereringen i figurene la og lb:

229-404.

8. Rekombinant DNA,karakterisert vedat det kan replikere i en vertscelle, spesielt bakterier, slik som E. coli, som inneholder et innskudd bestående av et hvilket som helst av fragmentene som er definert i kravene 1 til 7 koblet med et fremmed DNA.

9. Rekombinant DNA ifølge krav 8,karakterisertved at det er en vektor, hvor det nevnte innskuddet er replikerbart med nevnte vektor.

10. DNA-hybridisasjonsprobe for deteksjon av viralt DNA,karakterisert vedat den inneholder et hvilket som helst fragment ifølge kravene 1 til 7 eller blir dannet fra den rekombinante DNA ifølge kravene 8 eller 9, eller fra en del derav.

11. Vertscelle,karakterisert vedat den er transformert med rekombinant DNA ifølge krav 8 eller 9.

12. Rekombinant peptid,karakterisert vedat aminosyresekvensen kan avledes fra DNA-fragmentet ifølge et hvilket som helst av kravene 1 til 7.

13. Immunogenisk sammensetning,karakterisertved at den omfatter minst et rekombinant peptid ifølge krav 12.